FI119433B - Rekombinanttihiivat glukoosin ja ksyloosin tehokasta fermentointia varten - Google Patents

Description

ι 119433

Rekombinanttihiivat glukoosin ja ksyloosin tehokasta fermentointia varten - Rekombi-nantjäst för effektiv fermentering av glukos och xylos

Esillä olevan keksintö kohdistuu yleisesti geneettisesti valmistettuihin hiivoihin, jotka 5 pystyvät samanaikaisesti fermentoimaan selluloosabiomassan kaksi pääsokeriaines-osaa, glukoosin ja ksyloosin etanoliksi. Erityisesti esillä olevan keksinnön kohteena on tällaiset hiivat, jotka voidaan konstruoida kloonaamalla ksyloosireduktaasigeeni, ksyli-tolidehydrogenaasigeeni ja ksylulokinaasigeeni hiivoissa, jotka pystyvät fermentoimaan glukoosin etanoliksi.

10

Tuoreet tutkimukset ovat osoittaneet etanolin olevan ihanteellinen autojen polttoneste. Sitä voidaan käyttää sellaisenaan puhtaana polttoaineena (100 % etanoli) tai seoksena bensiinin kanssa erilaisina konsentraatioina.

15 Etanolin käyttö lisänä tai bensiinin korvaavana voi vähentää monien valtioiden riippuvuutta ulkomaisesta tuontiöljystä ja tuo uudistuvan polttoaineen kuljetukseen. Edelleen etanoli on osoittautunut puhtaammaksi polttoaineeksi, joka vapauttaa ympäristöön paljon vähemmän saasteita kuin tavanomainen bensiini. Esimerkiksi on havaittu, että hapetettujen ainesten käyttö bensiinissä voi alentaa haitallisen saasteen hiili-20 monoksidin päästöjä ilmaan. Bensiinin happipitoisuuksien lisäämiseksi viime aikoina käytetyistä useista hapettimista etanolilla on korkein happipitoisuus. The United States • ·

Environmental Protection Agency (EPÄ) on osoittanut, että bensiini sekoitettuna 10 % • · · : etanolilla alentaa hiilimonoksidipäästöjä noin 25 % - 30 %.

• · 25 Tähän päivään asti fermentoimalla valmistetun teollisen alkoholin lähtöaineena on käy- • · · V : tetty sokereita sokeriruoösta tai -juurikkaasta, tärkkelystä maissista tai muita ravinto kasveja.

• · • · · • · * • · · · *.··* Kuitenkin nämä maatalouden kasvit ovat liian kalliita polttoaine-etanolin suurmittakaa- 30 vaisen tuotannon lähtöaineena.

• · · • · • ♦ ··· .·!·. Kasvibiomassa on houkutteleva lähtöaine etanolipolttoaineen valmistuksessa fermen- * * ♦ • · : toimalla, koska se on uusiutuva ja sitä on saatavana alhaisilla kustannuksilla ja suuris- • · · * · sa määrissä. Ajatus käyttää maatalouden biomassan sokereista mikrobisesti fermen- 2 119433 toimalla valmistettua alkoholia on syntynyt ainakin kaksi vuosikymmentä sitten. Pääasialliset selluloosamateriaaleista fermentoimiskykyiset sokerit ovat glukoosi ja ksyloosi (glukoosin suhde ksyloosiin on noin 2 tai 3:1). Kaikista toivottavimmat selluloosamate-riaalien fermentaatiot tietysti muuntaisivat täydellisesti sekä glukoosin että ksyloosin 5 etanoliksi. Valitettavasti vieläkään ei ole yksittäistä tunnettua mikro-organismia, joka pystyy fermentoimaan tehokkaasti sekä glukoosin että ksyloosin.

Hiivoja, erityisesti Saccharomvces. on perinteisesti käytetty fermentoimaan glukoosi-pohjaisia lähtöaineita etanoliksi, ja ne ovat edelleen parhaita mikro-organismeja 10 muuntamaan glukoosi etanoliksi. Kuitenkin näiden glukoosia fermentoivien hiivojen on todettu, ei pelkästään olevan kyvyttömiä fermentoimaan ksyloosia, mutta myös kyvyttömiä käyttää pentoosisokeria kasvuun. Kuitenkin nämä glukoosia fermentoivat hiivat voivat käyttää ksyluloosia kasvuun ja fermentointiin (kuvio 1), vaihtelevalla tehokkuudella. Esimerkiksi S. cerevisiae fermentoi ksyluloosia erittäin huonosti samalla kun 15 Schizosaccharomvces-laiit tekevät sen melko tehokkaasti (Chiang et ai., 1981; Lastick et ai., 1989).

Vaikka glukoosia fermentoivat hiivat ovat kyvyttömiä käyttämään ksyloosia sekä kasvuun että fermentointiin, on olemassa monia luonnon hiivoja, jotka pystyvät käyttä-20 mään ksyloosia aerobiseen kasvuun, mutta eivät pysty fermentoimaan ksyloosia eta-noliksi. Nämä ksyloosia käyttävät/ei-fermentoivat hiivat ovat riippuvaisia kahdesta ent- • · syymistä - ksyloosireduktaasista ja ksylitolidehydrogenaasista - ksyloosin muuntami- « · * :·: : seksi ksyluloosiksi. Nämä hiivat ovat erilaisia kuin suurin osa muita bakteereita, jotka **" ovat riippuvaisia yhdestä entsyymistä - ksyloosi-isomeraasista - ksyloosin muuntami- « *.i.: 25 seksi suoraan ksyluloosiksi (kuvio 1). Hiiva ksyloosireduktaasi ja ksylitolidehydroge- • · · :·: : naasi vaativat toimiakseen myös kofaktoreita; ksyloosireduktaasi on riippuvainen NADPH:sta sen kofaktorina ja ksylitolidehydrogenaasi on riippuvainen NAD:sta sen • · *·ν kofaktorina. Sen sijaan bakteeriksyloosi-isomeraasi ei vaadi kofaktoria ksyloosin suo- ·*· *···* raan muuntamiseen ksyluloosiksi (kuvio 1).

30 •

Kaksi vuosikymmentä sitten yritettiin kovasti löytää uusia hiivoja, jotka pystyvät te- .*!·, hokkaasti fermentoimaan sekä glukoosin että ksyloosin etanoliksi. Vaikkakaan tällaista • · : ihanteellista hiivaa ei löydetty, yritykset päättyivät menestyksekkäästi. Esimerkiksi • ·· • · muutamien hiivojen todettiin olevan, ei pelkästään kykeneviä käyttämään ksyloosia 119433 3 aerobiseen kasvuun, vaan myös fermentoimaan ksyloosin etanoliksi (Toivola et ai., 1984; Dupreez ja van der Walt, 1983), vaikkakaan mikään näistä ksyloosia fermentoi-vista hiivoista ei ollut täydellisen tehokas fermentoimaan ksyloosia etanoliksi (Jeffries, 1985). Lisäksi nämä hiivat ovat kykenemättömiä fermentoimaan tehokkaasti glukoosia. 5

Ksyloosia fermentoivista hiivoista kolme lajia Pachvsolen tannophilus (Toivola et ai., 1984) , Candida shehatae (Dupreez ja van der Walt, 1983), ja Pichia stipitis (Grootjen et ai., 1990) ovat erittäin tunnettuja. P. stipitis ia C. shihatae fermentoivat ksyloosia paremmin kuin muut ksyloosia fermentoivat hiivat (Grootjen et ai., 1990). Kuitenkin 10 parhaimmatkin ksyloosia fermentoivat hiivat eivät ole kovinkaan tehokkaita fermentoimaan ksyloosia ja ne ovat myös erittäin tehottomia fermentoimaan glukoosia (Jeffries, 1985) .

Viime vuosikymmenenä yritettiin myös geneettisesti muuntaa perinteiset glukoosia 15 fermentoivat hiivat, erityisesti S. cerevisiae. rekombinantti-DNA-tekniikalla. Alussa yritykset keskitettiin ksyloosi-isomeraasigeenin kloonaukseen hiivaan, jotta saataisiin osoitettua sen kyky muuntaa ksyloosi suoraan ksyluloosiksi kofaktoreista riippumatta. Kuitenkin nämä yritykset ovat olleet menestyksettömiä, koska erilaisia bakteeriksyloo-si-isomeraaseja koodaavat geenit ovat kyvyttömiä johtamaan aktiivisen entsyymin 20 synteesiä S. cerevisiaeissa (Rosenfeld et ai., 1984; Ho et ai., 1983; Sarthy et ai., *.i.: 1987; Wilhelm ja Hollenberg, 1984; Amore et ai., 1989).

• · « · · • ·· « * ··* :·' : Parina viime vuotena pyrkimykset hiivojen, erityisesti S. cerevisiae. geneettiseen vai- mistukseen ksyloosin fermentoimiseksi on keskitetty ksyloosireduktaasia (Takama et *·ί·* 25 ai., 1991; Hallborn et ai., 1991; Strasser et ai., 1990), ksylitolidehydrogenaasia (Koet- »·· *·* ‘ ter et ai., 1990; Hallborn et ai., 1990) ja ksylulokinaasia (Stevis et ai., 1987; Chang ja

Ho, 1988; Ho ja Chang, 1989; Deng ja Ho, 1990) koodaavien geenien kloonaukseen.

• · *·*·* S. cerevisiae ia muut glukoosia fermentoivat hiivat eivät sisällä havaittavaa ksyloosire- • · · *···* duktaasi- tai ksylitolidehydrogenaasiaktiivisuutta, mutta kaikki näyttävät sisältävän 30 ksyiulokinaasiaktiivisuutta. Täten glukoosia fermentoivat hiivat voivat kaikki fermentoi-da ksyluloosia, mutta tekevät sen vaihtelevalla tehokkuudella (Deng ja Ho, 1990).

• · • * · * t i : Viime aikoina KÖetter et ai. (1990), Strasser et ai. (1990) ja Hallborn et ai. (1990; * ·

1991) ovat kloonanneet sekä ksyloosireduktaasi- että ksylitolidehydrogenaasigeeniä S

119433 4 cerevisiaeissa. Kuitenkaan nämä geneettisesti valmistetut hiivat eivät vieläkään pysty tehokkaasti fermentoimaan ksyloosia. Esimerkiksi nämä hiivat ovat kyvyttömiä fermen-toimaan enemmän kuin 2 % ksyloosista. Lisäksi ne tuottavat suuren määrän ksylitolia ksyloosista (Hallborn et ai., 1990; Köetter ja Ciriacy, 1993), mikä hävittää arvokkaan 5 ksyloosisubstraatin halutusta fermentoivasta reitistä etanoliksi.

Edellä hahmoteltu alan laaja tausta havainnollistaa, että keskitetyistä ja pitkällisistä tutkimuksista huolimatta, sekä glukoosia että ksyloosia tehokkaasti etanoliksi fermentoimaan kykeneviä hiivoja ei ole löydetty. Eli on olemassa tarve tällaisille hiivoille ja 10 menetelmille niiden valmistamiseksi kuten myös käytölle. Näille tarpeille on esillä oleva keksintö kohdistettu.

Tämän keksinnön piirre kohdistuu havaintoon, että uudet hiivakannat, jotka pystyvät tehokkaasti fermentoimaan ksyloosia yksinään tai samanaikaisesti glukoosin kanssa, 15 voidaan luoda käyttämällä rekombinanatti-DNA:ta ja geeniä kloonaavia tekniikoita. Erityisesti näitä tekniikoita on käytetty luomaan uusia rekombinanttihiivoja, jotka sisältävät kloonattuja ksyloosireduktaasi* (XR), ksylitolidehydrogenaasi- (XD) ja ksyluloki-naasi- (XK) geenejä, jotka fuusioituvat promoottoreihin, jotka eivät inhiboidu glukoosin läsnä ollessa.

20 *

Eli eräs keksinnön edullinen suoritusmuoto on rekombinanttihiivakanta, joka sisältää • « lisättyjä ksyloosireduktaasia, ksylitolidehydrogenaasia ja ksylulokinaasia koodaavia «·φ v : geenejä ja joka pystyy fermentoimaan ksyloosin etanoliksi. Rekombinanttihiivakanta pystyy mieluummin fermentoimaan myös glukoosin etanoliksi ja vielä mieluummin 25 tällaiset hiivakannat, jotka pystyvät tehokkaasti fermentoimaan nämä kaksi sokeria «·· V * samanaikaisesti etanoliksi, saadaan aikaan kun XR-, XD- ja XK-geenit fuusioituvat promoottorehin, jotka eivät inhiboidu glukoosin läsnä ollessa eivätkä vaadi ksyloosia • · :.v induktioon.

• · • • * ··· 30 Eräs edullinen keksinnön suoritusmuoto on rekombinanttihiivakanta, joka sisältää ksy- loosireduktaasia, ksylitolidehydrogenaasia ja ksylulokinaasia koodaavia geenejä, jossa .·*.·. mainitut geenit fuusioituvat ei-glukoosi-inhiboituihin promoottoreihin ja jossa mainittu • · .·. : hiiva pystyy fermentoimaan ksyloosin etanoliksi. Rekombinanttihiivakanta pystyy mie- • ·· • · luummin fermentoimaan glukoosin etanoliksi.

c 119433

Vielä eräs keksinnön edullinen suoritusmuoto kohdistuu reagensseihin, jotka ovat hyödyllisiä valmistettaessa keksinnön rekombinanttihiivoja. Täten esillä olevan keksinnön kohteena on myös rekombinantti-DNA-molekyyli, joka sisältää ksyloosireduktaasia, ksylitolidehydrogenaasia ja ksylulokinaasia koodaavia geenejä. Keksinnön kohteena on 5 myös vektori, joka sisältää ksyloosireduktaasia, ksylitolidehydrogenaasia ja ksylulokinaasia koodaavia geenejä. Näissä reagensseissa geenit ovat mieluummin fuusioituneet promoottoreihin, jotka eivät inhiboidu glukoosilla eivätkä vaadi ksyloosia induktioon, kuten myös pystyvät tarkoituksenmukaisesti valmistamaan rekombinanttihiivoja, jotka kykenevät samanaikaisesti fermentoimaan glukoosin ja ksyloosin etanoliksi.

10

Eräs toinen esillä olevan keksinnön edullinen suoritusmuoto on menetelmä saada re-kombinanttihiiva, joka pystyy fermentoimaan ksyloosin etanoliksi. Tähän menetelmään kuuluu vaihe, jossa DNA lisätään hiivaan hiivan saamiseksi lisättynä ksyloosireduktaasia, ksylitolidehydrogenaasia ja ksylulokinaasia koodaavilla geeneillä. Mieluummin nä-15 mä geenit fuusioituvat ei-glukoosi-inhiboituihin promoottoreihin, jotta saataisiin aikaan glukoosin ja ksyloosin samanaikaisen fermentointi etanoliksi. Lisäksi kaikki kolme geeniä voidaan lisätä samanaikaisesti esimerkiksi käyttämällä edellä kuvattuja keksinnön reagensseja.

20 Vielä eräs keksinnön edullinen suoritusmuoto on menetelmät fermentoida ksyloosi tai :.i.: glukoosi etanoliksi. Keksinnön menetelmiin kuuluu vaihe, jossa ksyloosia sisältävä tai • · glukoosia sisältävä väliaine fermentoidaan rekombinanttihiivakannalla, joka sisältää ··· : lisättyjä ksyloosireduktaasia, ksylitolidehydrogenaasia ja ksylulokinaasia koodaavia geenejä. On toivottavaa, että kolme lisättyä geeniä ovat fuusioituneet ei-glukoosi-25 inhiboituihin promoottoreihin, ja että medium sisältää sekä glukoosia että ksyloosia ··· v : niin, että saadaan aikaan ksyloosin ja glukoosin samanaikainen fermentoituminen eta noliksi.

• · • · · • · * • · ·»·

Muita keksinnön edullisia suoritusmuotoja, ominaisuuksia ja etuja ilmenee seuraavassa 30 selityksessä.

·* · • · • · .V. Kuvio 1 on kaavamainen diagrammi entsyymeistä liittyen ksyloosin metabolismin ensi- • · · : vaiheisiin bakteereissa ja hiivoissa.

• ·« • · 119433 6

Kuvio 2 esittää hiiva ksylulokinaasigeenin nukleotidisekvenssin ja dedusoidun aminohapposekvenssin mukaan lukien sen 5'- ja 3'-viereiset sekvenssit. Initiaatiokodoni ja stoppikodoni on alleviivattu. Mahdolliset kontrollisekvenssit ei-koodaavilla alueilla 5' ja 3' on osoitettu nuolin.

5

Kuvio 3 esittää kloonattuja geenejä ja plasmidin pLSKIS restriktiopiirroksen.

Kuvio 4 esittää kloonattuja geenejä ja plasmidin pUCKmlO restriktiopiirroksen.

10 Kuvio 5 esittää kloonattuja geenejä ja plasmidin pLNH21 restriktiopiirroksen.

Kuvio 6A on fermentointiliemen HPLC-kromatogrammi, joka fermentointiliemi saatiin fermentoimalla ksyloosi rekombinanttihiivalla SC (pLNH21) f S. cerevisiae. joka sisälsi lisättyjä XR-, XD- ja XK-geenejä) (I) 2 päivää; ja (II) 4 päivää.

15

Kuvio 6B on fermentointiliemen HPLC-kromatogrammi, joka fermentointiliemi saatiin fermentoimalla ksyloosi rekombinanttihiivalla SC (pLNH13-32) (S. cerevisiae. ioka sisälsi lisättyjä XR- ja XD-geenejä, mutta ei XK-geenejä) (I) 2 päivää; ja (II) 6 päivää.

20 Kuvio 6C on fermentointiliemen HPLC-kromatogrammi, joka fermentointiliemi saatiin * • · · ’·»* fermentoimalla ksyloosi rakentamattomalla S. cerevisiae-hiivalla (ei sisällä yhtään lisät- *· *! tyä XR-, XD- tai XK-geeniä) (I) 2 päivää; ja (II) 7 päivää, edelleen kuten esimerkissä 6 ··· *·* * on kuvattu.

• · • · · *···* 25 Kuvio 7 esittää kloonattuja geenejä ja plasmidin pLNH33 restriktiopiirroksen.

9 · 9 9 · « • I t •

Kuvio 8A on fermentointiliemen HPLC-kromatogrammi, joka fermentointiliemi saatiin • · * · '·*·* fermentoimalla glukoosia ja ksyloosia sisältävä medium (vastaavasti 10 % ja 5 %) • * · '“** rakentamattomalla hiivakannalla 1400 (ei sisällä yhtään lisättyä XR-, XD- tai XK- • 30 geeniä) (I) 0 päivää; ja (II) 2 päivää, edelleen kuten esimerkissä 8 on kuvattu.

• · · • · • · • · ·

Kuvio 8B on fermentointiliemen HPLC-kromatogrammi, joka fermentointiliemi saatiin • 9 fermentoimalla glukoosia ja ksyloosia sisältävä medium (vastaavasti 10 % ja 5 %) • · 119433 7 rekombinanttihiivalla 1400 (pLNH33) (hiiva 1400 sisälsi lisättyjä XR-, XD- ja XK-geenejä) (I) 0 päivää; ja (II) 2 päivää, edelleen kuten esimerkissä 8 on kuvattu.

Kuvio 9 on kaavamainen diagrammi, joka hahmottelee pBluescript II KS(-):n konstruk-5 tion, joka sisälsi kloonattuja XR-, XD- ja XK-geenejä: neljä tällaista plasmidia konstruoitiin: pKS(-)-KK-A*R-KD-l; pKS(-)-KK-A*R-KD-2; pKS(-)-KK-AR-KD-3; ja pKS(-)-KK-AR-KD-4, edelleen kuten on kuvattu esimerkissä 4.

Kuvio 10 esittää ehjän ksylitolidehydrogenaasigeenin ja promoottorittoman XD:n suo-10 ran amplifikaation P. stipitis kromosomaalisesta DNA:sta polymeraasiketjureaktio (PCR)-tekniikalla; vasemmalta kuja 1: molekyylimerkit BamHI-EcoRI lyhennetty 1 DNA; kuja 2: Pichia ksylitolidehydrogenaasigeeni (ehjä); kuja 3: Pichia ksylitolidehyd-rogenaasigeeni (promoottoriton); ja kuja 4: molekyylimerkit, Haelll lyhennetty φΧ DNA.

15

Kuvio 11 on kaavio hiiva ksylulokinaasigeenin sekventoimiseen käytetyistä strategioista.

Kuvio 12 on kaavamainen diagrammi, joka esittää plasmidin pLNH21 konstruktion.

20 • ·*·

Kuvio 13 on fermentointiliemen HPLC-kromatogrammi, joka fermentointiliemi saatiin • · · *; *· fermentoimalla seos, jossa on glukoosia (10 %) ja ksyloosia (5 %) S. cerevisiae SC:lla *·' ] (pLNH13-32) (sisältää ainoastaan XR- ja XD-geenejä) (I) 0 päivää; (II) 2 päivää; ja (III) 5 päivää.

• · · 25 ··· • · · '·* ’ Kuvio 14 on fermentointiliemen HPLC-kromatogrammi, joka fermentointiliemi saatiin fermentoimalla seos, jossa on glukoosia (10 %) ja ksyloosia (5 %) rakentamattomalla • · · *·*·* Pichia stipitisilla (I) 0 päivää; (II) 3 päivää; ja (III) 5 päivää.

• · • · ··· ·· ; *.· 30 Keksinnön periaatteiden ymmärtämisen edistämiseksi viitataan sen erityisiin suoritus- muotoihin ja erityistä kieltä käytetään kuvaamaan sama. On kuitenkin ymmärrettävää, että keksinnön piiriin ei kuulu rajoituksia, edelleen tässä havainnollistettujen muun- • * j\: noksien ja keksinnön hakemusten periaatteiden harkitaan normaalisti tapahtuvan alan ammattimiehelle, johon keksintö kuuluu.

119433 8

Esillä olevaan keksintöön kuuluu rekombinanttihiivoja, DNA-molekyylejä ja vektoreita, jotka sisältävät XR-, XD- ja XK-geenejä. Tällaiset geenit ovat hyvin tunnettuja laajoilla alueilla mikro-organismeja, ja itse asiassa edellä on identifioitu ja eristetty monia XR-, XD- ja XK-geenejä. Näiden geenien erityinen alkuperä ei ole olennainen tämän keksin-5 nön laajoissa näkökannoissa; ennemmin mitkä tahansa DNA:ta koodaavat proteiinit (entsyymit), joilla on ksyloosireduktaasiaktiivisuutta (kyky muuntaa D-ksyloosi ksylitoliksi NADPH:n tai NADH:n ollessa kofaktorina), ksylitolidehydrogenaasiaktiivisuutta (kyky muuntaa ksylitoli D-ksyluloosiksi NAD+:n ollessa kofaktorina) tai ksylulokinaasi-aktiivisuutta (kyky muuntaa D-ksyluloosi D-ksyluloosi-5-fosfaatiksi) ovat sopivia. Näitä 10 geenejä voidaan saada sellaisenaan esiintyvistä geeneistä tai ne voidaan muuntaa esimerkiksi lisäämällä, substituoimalla tai poistamalla emäkset sellaisenaan esiintyvistä geeneistä niin kauan kuin koodatulla proteiinilla on vielä XR-, XD- tai XK-aktiivisuutta. Samalla tavoin voidaan geenit ja niiden osat tuottaa synteettisesti tunnetuilla tekniikoilla jälleen niin kauan kuin saatu DNA koodaa proteiinia, joka omaa haluttua XR-, 15 XD- tai XK-aktiivisuutta.

Esimerkiksi sopivia XR- ja XD-geenien lähteitä ovat ksyloosia hyödyntävät hiivat kuten Candida shehatae. Pichia stipitis. Pachvsolen tannoohilus. sopivia XK-geenien lähteitä ovat edellä mainitut ksyloosia hyödyntävät hiivat kuten myös ksyloosia ei-hyödyntävät 20 hiivat kuten ne, jotka kuuluvat sukuun • ♦ · '·:·[ Saccharomvces. esimerkiksi S. cerevisiae. suku • · ·

Schizosaccharomvces. esimerkiksi Schizosaccharomvces pombe. ja bakteerit kuten t t · '·* | Escherichia coli. Bacillus-laiit. Streptomvces-laiit. jne. Haluttuja geenejä voidaan saada näistä lähteistä käyttämällä tavanomaisia menetelmiä. Tähän tarkoitukseen voidaan ( * « *···* 25 käyttää esimerkiksi hybridisaatiota, komplementointia tai PCR-tekniikkaa.

• · · * · ·

Hakijan tutkimuksissa käytetty erityinen XR-geeni kloonattiin P. stiDitis.sta Polymerase i » ·

Chain Reaction (PCR):lla (Chen ja Ho, 1993). Oligonukleotidit, joita tarvitaan XR:n • t ’·;** amplifikaatioon kromosomaalisesta DNA:sta PCR:lla, syntetisoitiin P. stipitis XR-geeni n ·· : *·· 30 julkaistun sekvenssin (Takama et ai., 1991) mukaisesti. Amplifioitu XR kloonattiin en- • •t sin ja varastoitiin plasmidiin pUC19. Sitten kloonattu XR fuusioitiin erilaisiin promootio- ϊ Y; reihin mukaan lukien hiiva-TRP5-geenin (Zalkin ja Yanofsky, 1982) ja hiiva-alkoholide- • * hydrogenaasi I geenin (ADC1) (Ammerer, 1983; Bennetzen ja Hall, 1982) promootto- * · rit.

119433 9

Hakijan tutkimuksissa käytetty XD-geeni kloonattiin P. stipitis:sta PCR:lla. Oligonukle-otidit, joita tarvitaan XD:n amplifikaatioon Pichia kromosomaalisesta DNA:sta, syntetisoitiin Pichia XD-geenin julkaistun sekvenssin (Köetter et ai., 1990) mukaisesti. Ampli-fioitu XD kloonattiin ensin ja varastoitiin plasmidiin pUC19. Sitten geeni fuusioitiin pe-5 rakkain hiivapyruvaattikinaasigeenin (PYK) (Burke et ai., 1983) ja hiivaglyseraldehydi- 3-fosfodehydrogenaasigeenin (GPD) (Holland ja Holland, 1979) glykolyyttisiin pro-moottoreihin.

Hakijat ovat kloonanneet kolme erilaista XK-geeniä, jotka ovat peräisin S. cerevi-10 §iäg:sta (Ho ja Chang, 1989), P. tannophilus:sta (Stevis et ai., 1987) ja E coli:sta ja ovat todenneet, että kaikki kolme geeniä voidaan tehokkaasti ilmaista S. cerevisiae:na erittäin tehokkaisiin hiivapromoottoreihin fuusioinnin jälkeen. Kloonattua S. cerevisiae ksylulokinaasigeeniä käytettiin tässä esitettyyn havainnollistavaan työhön. Hiiva XK-geenin asianmukaisen fuusion edesauttamiseksi sopivaan promoottoriin analysoitiin S 15 cerevisiae XK-geenin täydellinen nukleotidisekvenssi mukaan lukien sen 5' ja 3’ ei-koodaavaa sekvenssiä ja se on esitetty kuviossa 2.

Monet eri promoottorit ovat sopivia tämän keksinnön käyttöön. Laajasti puhuen käytetään hiivaan sekoittuvia promoottoreita, jotka pystyvät kontrolloimaan XR-, XD- tai XK-20 geenien transkriptiota. Tällaisia promoottoreita on saatavana monista eri lähteistä mu- • t · *«*! kaan lukien hiivat, bakteerit ja muut solulähteet. Keksinnössä käytetyt promoottorit • * * *· " ovat mieluummin tehokkaita, ei-glukoosi-inhiboituja promoottoreita, jotka eivät tarvit- • · · *** ' se ksyloosia induktioon. Tämä huomioonottaen "tehokas" promoottori tässä käytettynä * * viittaa promoottoriin, joka edellyttää fuusioidun geenin korkeatasoista transkriptiota.

• · · *·“* 25 Tällaisia ominaisuuksia omaavia promoottoreita on laajasti saatavana, ja niiden käyttö • · « esillä olevassa keksinnössä, tässä annetuissa opeissa, kuuluu alan tavanomaisen ammattilaisen soveltamisalaan, kuten promoottoreiden fuusio XR-, XD- ja XK-geeneihin, • t · promoottori/geeni-fuusiotuotteiden kloonaus sopiviin vektoreihin ja vektoreiden käyttö • · *·;** hiivan muuntamiseksi. Kaikki nämä manipulaatiot voidaan suorittaa käyttämällä tavan- I *·· 30 omaisia geneettisiä insinööritekniikoita, jotka tunnetaan hyvin alalla ja kirjallisuudessa.

• · • · ··· *

Vielä erityisemmin kuvattaessa tässä hakijan havainnollistavaa työtä, hiivaksyIuloki- • m naasigeeni, XK, on fuusioitunut promoottoreihin hiiva-alkoholidehydrogenaasigeenistä • « (ADC1), hiivapyruvaattikinaasigeenistä (PYK), hiiva-TRP5-geenistä, jne. XK:n fuusioi- 119433 ίο tumista TRP5-promoottoriin käytettiin pLNH21:n konstruoimiseksi (kuvio 5) ja XK:n fuusioitumista PYK-promoottoriin käytettiin pLNH33:n konstruoimiseksi (kuvio 7).

XR:n, XD:n ja XK:n fuusio ehjiin promoottoreihin ADCl:sta, PYK:sta, GPD:sta, jne., 5 suoritettiin kloonaamalla sekä fragmentti, joka sisälsi erityisen promoottorin, että XR:n, XD:n tai XK;n strukturaalinen geeni yhdessä Bluescript KS-plasmideista (Strata-gene, La Jolla, CA), minkä jälkeen poistettiin ylimääräiset ei-halutut nukleotidit erityisaseman mutageneesillä (Kunkel et ai., 1987). Täten keksintöön kuuluu myös useita pBluescript II KS(-)- (tämän jälkeen pKS(-)) johdannaisia, jotka sisältävät kloonatun 10 XD:n (fuusioitu pyruvaattidehydrogenaasipromoottoriin), XR:n (fuusioitu ADCl-pro-moottoriin), ja XK:n (fuusioitu pyruvaattikinaasipromoottoriin). Nämä rekombinantti-plasmidit on nimetty pKS(-):ksi, KD-AR (tai A*R) -KK:ksi. Neljä tällaista plasmidia konstruoitiin, kuten on esitetty kuviossa 9. Näillä plasmideilla on samanlaiset, mutta ei identtiset rakenteet. Näihin plasmideihin kloonatut XR, XD ja XK (tai KD-AR (tai A*R) -15 KK) voidaan erottaa toisesta pKS(-)-plasmidista yksittäisellä XhoI restriktiodigestiolla.

Sitten sopiviin promoottoreihin fuusioidut XR-, XD ja XK-geenit kloonattiin pLSK15:ta (kuvio 3) ja pUCKmlO:een (kuvio 4). pLSKIS, pLX10-14:n johdannainen (Stevisja Ho, 1985), on alhaisen kopionumeron plasmidi kopionumerolla noin 10 hiivassa (S. cere-20 visiaeT Se sisältää hiiva-2p-replikonin, joka mahdollistaa plasmidin replikoitumisen i » · automaattisesti S. cerevisiae:een ja lähisukulaislajeihin. pLSK15 sisältää myös geneti- • · · siini (kanamysiini) resistanssigeenin (KmR) ja ampisilliini resistanssigeenin (ApR ja myös • ♦ · '·* ‘ ampr), jotka tarjoavat valikoiman ilmaisimia S. cerevisiae:ssa ja muissa hiivoissa.

pLSK15 sisältää myös XK-geenin fuusioituna hiiva TRP-promoottoriin. Täten XR- ja XD- • · · 25 geenit fuusioituna sopivaan 5'-ei-koodaaviin sekvensseihin, jotka sisältävät sopivia • · * *·* * promoottoreita, liitettiin pLSK15:een saatujen plasmidien tehokkuuden havainnollista miseksi hiivan ksyloosifermentoinnissa. Erilaisten geenien läsnäolon tehokkuuden ver- • » · taamiseksi hiivan ksyloosifermennoinnissa, ainoastaan XR:n ja XD:n sisältävää plasmi- • · *·;·* dia käytettiin myös S. cerevisiae:n muuntamiseksi, ja saatua hiivaa käytettiin vertaile- ·· • *·* 30 vissa fermentoinneissa. Ksyloosin fermentoinnin rakentamattomalla S. cerevisiae:lla.

kloonatun XR:n, XD:n ja XK:n (SC(pLNH21)) sisältävällä hiivalla, ja kloonattuja XR- ja •Yi XD-, mutta ei XK- (SC(pLNH 13-32)) geenejä sisältävällä hiivalla, tulokset on esitetty • · kuviossa 6A, 6B ja 6C.

t · Π 119433 pUCKmlO (kuvio 4) on korkean kopionumeron plasmidi (ts. plasmidi, jonka kopio-numero on noin 50 tai enemmän) kopionumerolla lähellä 100 S. cerevisiae:ssa. pUCKmlO on pUC9-johdannainen, joka sisältää identtisen 2p-replikonin, ja KmR- ja ApR-geenit ovat läsnä pLSK15:ssa. Nämä erityiset DNA-fragmentit toimivat replikoni- ja 5 selektiomerkitsijöinä, jotka mahdollistavat plasmidin replikoitumisen automaattisesti S cerevisiae:een (ja sukulaishiivoihin) ja mahdollistavat myös plasmidin sisältävien hiiva-transformaattien erottamisen transformoimattomista isäntäsoluista.

Hakijat ovat konstruoineet plICKmlO-pohjaisia rekombinanttiplasmideja, jotka sisältä-10 vät saman XR:n, XD:n ja XK:n fuusioituneena sopiviin 5' ei-koodaaviin sekvensseihin, jotka sisältävät sopivia promoottoreita. Näiden vektoreiden on tarkoitus olla hyödyllisiä muunnettaessa kaikki S. cerevisiae-kannat ja sukulaislajien kannat. Erityisiä mutantte-ja ei vaadita toimimaan resipienttikantoina. Tällaisia plasmideja kuten pLNH33 (kuvio 7) kuten myös pLNH21 (kuvio 5), voidaan käyttää teollisen S. cerevisiae:n ja muiden 15 kantojen muuntamiseksi.

Hiivan transformaatio joko pLSKIS- tai pUCKmlO-johdannaisilla suoritetaan elektropo-raatiolla käyttäen yleisesti menetelmää, jonka on kuvannut Becker ja Guarente (1991). Autenttiset hiivatransformaatit, jotka sisältävät joko pLSKIS- tai pUCKmlO-johdan-20 naisia, eristettiin alla kuvatulla tavalla. Plasmideissa oleva KmR toimii primaarisena se- • f 9 lektiomerkitsijänä, joka esittää mitä tahansa isäntäsolua saaden yhden näistä plasmi- • · ♦ ;m‘! deista, joka on resistenssi paljon suuremmille konsentraatioille mediumissa olevalle • 9 9 *·* \ genetisiinille.

• · • · · 25 Kuitenkin jotkut hiivasolut voidaan indusoida muuttumaan resistenssiksi transformaatin 9 9 9 saman tason genetisiinille, joka sisältää plasmidin. Täten kaikki genetisiiniresistenssit , , kolonit eivät ole oikeita transformaatteja. On raportoitu, että ApR voidaan ilmaista 9 9 9 cerevisiae:na. mutta jälkimmäinen on resistenssi ampisilliinille ilman ApR:n läsnäoloa.

• 9 *·;·* Täten ApR ei voi toimia selektiomerkitsijänä hiivaplasmidi-välitteiselle transformaatiolle.

*· : *· 30 Kuitenkin hiivat, jotka sisältävät selvästi imaistun ArR:n, tuottavat riittävästi penisilli- • •91 naasia ja mahdollistavat kolonien indentifioimisen, jotka sisältävät tällaisia hiivoja eri- ·*·*· tylsissä kiinteissä levyissä pensillinaasitestissä (Chevallier ja Aigle, 1979). Jälkimmäi- • * ·*·,· seen testiin kuuluu tekniikka, joka indentifioi todelliset S. cerevisiae:n transformaatio ja • · """ muut hiivat genetisiiniresitensseistä koloneista.

119433 12

Hiivan ksyloosifermentointi (tai ksyloosi ja glukoosi) suoritettiin käyttämällä keksinnön rekombinanttihiivoja anaerobisissa olosuhteissa, kuten on kuvattu esimerkeissä 6-9. Sokerien (ksyloosi ja glukoosi) kulutusta, ja etanolin ja muiden tuotteiden kuten ksylitolin muodostusta seurattiin fermentoinnin aikana ottamalla näytteitä ja analysoimalla 5 ne HPLC:lla kuten esimerkissä 6 on kuvattu.

Esimerkiksi pLNH21:ä (kuvio 5) käytettiin S. cerevisiae:n transformoimiseksi. Saatu transformaatti, joka sisälsi pLNH21, on nimetty SC(pLNH21):ksi, ja se voi fermentoida 5 % ksyloosin melkein kokonaan etanoliksi 2 - 4 päivässä kuten on havainnollistettu 10 kuviossa 6A.

Lisäesimerkkinä, pLNH33:a (kuvio 7) käytettiin transformoimaan hiivakanta 1400, joka on läheistä sukua S. cerevisiae:lle ia sillä on korkea alkoholin ja lämpötilan sietokyky (D'Amore et ai., 1989; D'Amore, 1990). Saatu geneettisesti valmistettu hiiva, nimetty 15 1400(pLNH33):ksi, voi fermentoida 10 % glukoosin ja 5 % ksyloosin kokonaan etano liksi 2 - 4 päivässä ilman suuria solutiheyksiä kuten kuvioissa 8A ja 8B on esitetty.

pLNH33 on tehokkaampi plasmidi kuin pLNH21 ksyloosin fermentoinnissa, koska se on korkeamman kopionumeron plasmidi. Edelleen XK pLNH33:ssa on fuusioitu tehok- , 20 kaampaan promoottoriin kuin XK pLNH21:ssa. S. cerevisiae on myös transformoitu • · · *··*] pLNH33:lla, nimetty SC(pLNH33):ksi. Vaikka SC(pLNH33) on paljon tehokkaampi fer- • · · **,/ mentoitaessa ksyloosia tai ksyloosin ja glukoosin seoksia kuin SC(pLNH21), • · · *·* [ l400(pLNH33):n on todettu olevan tehokkaampi fermentoitaessa glukoosin ja ksyloo sin seoksia kuin SC(pLNH33). Täten yksittäiset kannat vaikuttavat myös fermentoinnin • ♦ · 25 tehokkuuteen. Samalla lailla kuin S. cerevisiae. rakentamatonta kantaa 1400 ei voida • i t käyttää tai fermentoida ksyloosia (yksinään tai yhdessä glukoosin ja ksyloosin seoksen . , kanssa) kuten on esitetty kaaviossa 8B.

• · · ♦ ♦ ♦ • ♦ ··· • · *·;*' Yleisesti näiden fermentointitestien tulokset osoittavat, että on välttämätöntä, että ; *·· 30 hiiva sisältää kolmea lisättyä geeniä, XR, XD ja XK, jotka on kunnolla fuusioitu sopiviin «·· promoottoreihin (mieluummin tehokkaat glykolyyttiset ja muut promoottorit, jotka ei 9 vät ole mukana glukoosin inhiboinnissa eivätkä vaadi ksyloosia induktioon) ja käyttää :*·.· tasavertaisesti näitä geenejä, jotta hiiva pystyy fermentoimaan ksyloosin vain etanolik- • · si eikä muiksi sivutuotteiksi kuten ksylitoliksi.

13 1 1 9433

Tulokset osoittavat ksylulokinaasigeenin (XK) kloonauksen tärkeyden XR:n ja XD:n lisäksi, jotta hiivat fermentoivat ksyloosin tehokkaasti, erityisesti fermentoivat sekä glukoosin että ksyloosin samanaikaisesti kun ne ovat läsnä samassa mediumissa, kuten selluloosabiomassan hydrolysaatissa. Samalla lailla kuin XR ja XD, kloonattu XK on 5 mieluummin fuusioitu sopivaan tehokkaaseen glykolyyttiseen tai muuhun promoottoriin, joka ei ole mukana glukoosin inhiboinnissa ja jota ei tarvita ksyloosin induktioon.

Hakijat ovat myös todenneet, että hiiva, joka sisältää juuri kloonatun XR:n ja XD:n voi fermentoida glukoosin, mutta ei ksyloosia etanoliksi, kun molemmat näistä sokereista 10 on yhdessä läsnä kasvualustassa (katso kuvio 13). Lisäksi hakijoiden tulokset osoittavat, että on välttämätöntä mille tahansa hiivalle mukaan lukien ksyloosia fermentoivat hiivat kuten P. stipitis ia C. shihatae sisältää XR:n, XD:n ja XK:n fuusioituna promoot-toreihin, jotka eivät ole inhiboituneet glukoosin läsnäollessa eivätkä vaadi ksyloosin käyttöä induktiossa sekä glukoosin että ksyloosin fermentoimisen mahdollistamiseksi 15 etanoliksi, kun molemmat näistä sokereista ovat yhdessä läsnä kasvualustassa. Kuvio 13 havainnollistaa, että S. cerevisiae ia sukulaislajit, jotka sisältävät ainoastaan kloonattuja XR- ja XD-geenejä fuusioituna sopiviin promoottoreihin, voivat ainoastaan fer-mentoida glukoosin, mutta eivät ksyloosia, etanoliksi kun molemmat sokerit ovat läsnä kasvualustassa. Samalla lailla kuvio 14 havainnollistaa, että rakentamaton P. stipits.

20 joka sisältää sen alkuperäisen XR:n, XD:n ja XK:n, voi fermentoida ksyloosin kun jäi- • · * *·:·* kimmäinen on ainoa mediumin hiililähde (tuloksia ei esitetty), mutta ei voi fermentoida • * · *· *: ksyloosia kun molemmat glukoosi ja ksyloosi hiililähteinä ovat läsnä samassa mediu- ·*# · '·* * missä.

• IMI • · * · * *“;* 25 On ymmärrettävää, että hiivoilla, joilla on alhaisen tason ksylulokinaasiaktiivisuutta • · · lisättynä XK-geenillä, on kaksi tarkoitusta. Toinen on parantaa entsyymiaktiivisuuden tasoa. XK-aktiivisuuden korkeat tasot ovat tärkeitä vielä edullisemmalle ksyloosin hiiva- • · « fermentoinnille etanoliksi vastakohtana ksylitolille. Toinen on asettaa geeni tehokkaan • · *·;·* promoottorin kontrollille, joka ei inhiboidu glukoosin läsnä ollessa. On hyvin tunnettua, • · ; *·· 30 että luontaiset villintyyppiset mikro-organismit mukaan lukien hiivat, eivät käytä muita

Mf sokereita kasvuun ja fermentointiin, jos glukoosi on läsnä kasvualustassa. Glukoosi ·*.*. inhiboi muiden sokerimolekyylien metabolointiin vaadittavien entsyymien synteesiä • · ·*·,· (nk. "glukoosi"-ilmiö). Täten geenien promoottorit sokerimolekyylien synteesiä varten • · metaboloiden entsyymejä, glukoosia lukuun ottamatta, eivät ole edullisia, koska niille 119433 14 ei kuulu kahden kylläisen sokerin samanaikainen fermentointi. Lisäksi hakijoiden työ on osoittanut, että solukasvu on ratkaisevaa induktiossa. Täten ksyloosia induktioon vaativat promoottorit eivät ole edullisia XR:n, XD:n tai XK:n ilmaisussa.

5 Seuraavat esimerkit on esitetty keksinnön ymmärtämisen helpottamiseksi. On ymmärrettävää, että nämä esimerkit ovat luonnollisesti havainnollistavia eivätkä rajoittavia.

Esimerkki 1 10 XR- ia XD-aeenien syntetisointi PCR;lla

Ehjän ja promoottorittoman XR:n synteesi PCR:l!a on aiemmin kuvattu (Chen ja Ho, 1993). XD:n synteesiä varten PCR:a käyttäen syntetisoitiin kolme oligonukleotidia XD:n nukleotidisekvenssin (Köetter et ai., 1990) mukaisesti ja ne on listattu alla: 15

Oligonukleotidi I: pTCTAGACCACCCTAAGTCG

Oligonukleotidi II: pCACACAATTAAAATG A

Oligonukleotidi III: pGGATCCACTATAGTCGAAG

20 Oligonukleotideja I ja II käytettiin syntetisoimaan ehjä XD-geeni, ja oligonukleotideja • · · II ja lii käytettiin syntetisoimaan promoottoriton XD, kuten kuviossa 10 on esitetty.

• · ·

Ehjä XD ja promoottoriton XD kloonattiin ensin pKS(-)-plasmidiin. Sitten ehjä XR sub- • · · *·* ] kloonattiin pUCKmlO (kuvio 4), ja saatua plasmidia pUCKmlO-XD käytettiin S. cere- visiaem transformoimiseksi elektroporatiolla, kuten esimerkissä 5 on kuvattu. Hiiva- • * 25 transformaatteja käytettiin ksylitolidehydrogenaasiaktiivisuuden määrittämiseksi ha- • · « vainnollistamaan sitä, että kloonattu geeni on ehjä ja voidaan ilmaista S. cerevi-siae:ssa.

• t • * · • · · • · · · *”·’ Esimerkki 2 j**.. 30 ··« 1 Promoottorittoman XD-aeenin fuusio hiivapyruvaattikinaasiaeenipromoottoriin • · • · · • · · • · XD-geenin fuusio PPK:hen valittiin havainnollistamaan ksyloosin tarkkaa fuusiota meta- • · boloiden geenejä ehjiin promoottoreihin erityisaseman mutageneesilla. Nämä pro- 119433 15 moottorit ovat joko glykolyyttisiä promoottoreita tai promoottoreita, jotka eivät inhi-boidu glukoosin läsnä ollessa kasvualustassa eivätkä vaadi ksyloosin läsnäoloa induktiossa.

5 Hiivapyruvaattikinaasin promoottorifragmentti -910 - +23 (Burke et ai., 1983) syntetisoitiin PCR:lla, kuten esimerkissä 1 on kuvattu XD-geenin synteesille. Sekä PPK-frag-mentti että promoottoriton XD-geeni subkloonattiin pKS(-)-plasmidiin, ja ei-halutut nukleotidit PPK:n ja ehjän XD-rakenteellisen geenin välillä poistettiin erityisaseman mu-tageneesilla Kunkelin menetelmän (Kunkel, 1987) mukaisesti. Saatu fuusioitu geeni 10 sisältää -910 - -1 promoottorifragmenttia pyruvaattikinaasigeenistä ja +1 - +1963 nukleotidia Pichia XD-geenistä. Saatu pKS(-)-plasmidi, joka sisältää PPK-XD (tai KD) on nimetty pKS(-)-KD:ksi tai pKD2:ksi.

Esimerkki 3 15

Hiivaksvlulokinaasiaeenin nukleotidisekvenssin analyysi 7,0 kb hiivan (S.cerevisiael DNA-fragmentin, joka sisältää hiivaksylulokinaasigeenin, kloonaus on esitetty aikaisemmin (Ho ja Chang, 1989). XK-geeni on subkloonaamalla 20 sijoitettu 2,4 kb fragmenttiin. 2,4 kb fragmentin nukleotidisekvenssi on analysoitu. 5' • a a ei-koodaava alue sisältää 345 nukleotidia, käänteinen alue sisältää 2118 nukleotidia ja • a a XK:lla koodatulla ksylulokinaasilla on 591 aminohappoa kuten kuviossa 2 on esitetty.

I » I

*·*j XK-geenin jaksottamiseen käytetty strategia on esitetty kuviossa 11.

• · taa *···* 25 Esimerkki 4 aa# a a a a a a a

Ehiän ADCl-promoottorin konstruktio • a a • * a a a ··· • a *·;·* Plasmidi pMA56 (Ammerer, 1983) sisältää hiiva-alkoholidehydrogenaasi I promoottorin *4 : ’·· 30 (Padci)· Hakijat ovat käyttäneet tätä promoottoria työssään joidenkin geenien modifioi- • •a miseksi. Esimerkiksi Padci on fuusioitu XR:ään, ja saatu geeni on nimetty PADcrXR:ksi ·*·*· tai AR:ksi. Kuitenkin tämä Padci ei ole ehjä eikä sisällä ehjän ADCl-promoottorin -1 - • a :*·,· -14 nukleotidia (Bennetzen ja Hall, 1982). Geenin -1 - -14-alue on tavallisesti erittäin « a merkittävä proteiinisynteesin kontrollissa. Minkä tahansa tällaiseen promoottoriin fuu- 16 1 1 9433 sioituneen geenin täytyy luottaa sen alkuperäiseen geneettiseen signaaliin kontrolloitaessa sen proteiinituotteen synteesiä.

ADCl-promoottoriin fuusioituneen geenin paremman kontrollin ilmaisemiseksi hakijat 5 ovat käyttäneet erityisaseman mutageneesiä puuttuvien nukleotidien (-1 - -14) lisäämiseksi pMA56:een kloonattuun ADCl-promoottoriin. Uusi ehjä promoottori on nimetty P*ADCl:ksi. Tätä promoottoria on käytetty XR:n modifioimiseksi, ja saatu geeni on nimetty pADCl-XR:ksi tai A*R:ksi.

10 Esimerkki 5

Plasmidin PLNH21 (tunnettu mvös pLSK15-KD-AR:na) konstruktio ia S. cerevisiae:n ia 1400:n transformoin^ pLNH21;llä 15 pLNH21:n konstruktio on esitetty kuviossa 12. pLNH21:tä käytettiin S. cerevisiae:n ja kannan 1400 transformoimiseksi elektroporaatiolla seuraavissa olosuhteissa. 50 ml varhaiseen log-vaiheeseen kasvatettuja hiivasoluja (Klett Unit (KU) 130), sentrifugoitiin mediumin poistamiseksi, pestiin kahdesti kylmällä vedellä, kerran kylmällä IM sorbitolilla ja suspendoitiin uudelleen 200 piissä IM sorbitolia. 60 pl soluja siirrettiin 4 ml:n 20 esisteriloituun muoviputkeen (kannella) ja siihen lisättiin 0,1 pg -1 pg plasmidi • · · DNAita. 50 pl saatuja soluja ja plasmidiseos pipetoitiin esijäähdytettyyn geenipulseri- • · · kuvettiin, jossa oli 0,2 emin elektrodiväli, ja kuvetin sisältö saatettiin sykkeeseen syke- *·* ] kontrollerilla (BioRad) 2,0 KV, 25 pF, 200 ohm.

*···· • * · *;;;* 25 Kuvettiin lisättiin välittömästi 0,50 ml YEPDia (1 % hiivauutetta, 2 % peptonia ja 2 % • · * glukoosia). Kuvetin sisältö siirrettiin uuteen 4 ml:n steriloituun muoviputkeen ja inku- , . boitiin 30°C:ssa tunnin ajan. 100 pl soluja asetettiin agarlevyille, jotka sisälsivät * · · YEPDia ja 50 pg/ml G418:a (genetisiini). Nopeasti kasvavat kolonit valittiin ja replikoi- • * tiin toiselle levylle, joka sisälsi samaa mediumia. Valitut kolonit saatettiin ampisiliiini- • · : *·· 30 testiin (Chevallier ja Aigle, 1979) kunnes saatiin identifioitua positiivinen tapaus. Edellä • * · kuvattu elektroporaatiomenetelmä perustuu Beckerin ja Guaranteen (1971) esityk- seen. Meidän menetelmä valita G418 resistenssit transformaatit on erittäin tehokas, ja :*·.· suurin osa valituista koloneista, jotka oli replikoitu YEPDitä plus 50 pg/ml G418:a sisäl- • · täviin levyihin olivat positiivisia penisillinaasitesteissä.

119433 17

Kannan 1400 transformaatio pLNH21:lla tai muilla plasmideilla suoritettiin käyttäen edellä kuvattua menetelmää paitsi, että solut kasvoivat 140-190 KU mieluummin kuin 130 KU, ja YEPD-levyt transformaattien alkuperäisessä valinnassa elektroporaation jälkeen sisälsivät 40 pg/ml genetisiiniä G418 mieluummin kuin 50. Kannan 1400 trans-5 formaatio edellä kuvatulla tavalla ei ole yhtä tehokas kuin S. cerevisiaem transformaatio.

Esimerkki 6 10 Ksvloosin fermentaatio tuotetulla SCfpLNH2D:lla. SC(pLNH13-32):lla ia tuottamattomalla alkuperällä S. cerevisiae Nämä kolme hiivaa viljeltiin rikkaassa mediumissa YEPD aerobisesti samanlaisissa olosuhteissa (SC(pLNH13-32) konstruoitiin transformoimalla S. cerevisiae pLNH13-32:ksi 15 nimetyllä plasmidilla, joka sisältää ainoastaan XR- ja XD-geeni/promoottori-yhdistel-mät). Sitten näitä hiivasoluja käytettiin fermentoimaan 5 % ksyloosi YEP (1 % hiivauu-tetta, 2 % peptonia) -mediumissa anaerobisesti myös samanlaisissa olosuhteissa. Ksy-loosin kulutusta ja etanolin ja ksylitolin muodostusta seurattiin fermentoinnin aikana ottamalla näytteitä sopivin välein ja analysoimalla ne HPLC:lla seuraavissa olosuhteis-20 sa.

• · · • · · ··· * · *: Viljelmistä poistetut näytteet, jotka sisälsivät fermentointilientä (0,6 ml -1,0 ml), pi- • · · *·* * dettiin 1,5 ml:n Eppendorf-putkissa. Solut ja muut jäännökset poistettiin ensin sentri- ‘ * fugoimalla. Supernatantti suodatettiin edelleen käyttämällä steriiliä aerodiskiä (Gelman *·:·* 25 Sciences), 0,2 tai 0,45 mm, ruiskusuodattimia. Kustakin näytteestä saadusta suodok- • · · • · · v * sesta analysoitiin sen etanoli-, glukoosi-, ksyloosi- ja ksylitolipitoisuudet suurtehones- tekromatografialla (HPLC) käyttämällä Hitachi-systeemiä seuraavissa olosuhteissa.

t » • · » * · · • · • · · '···* Pylväs: Aminex HPX-87C, 300 x 7,8 mm 30 Liikkuva faasi: vesi •

Virtausnopeus: 0,8 ml/min Tunnistus: Hitachi L-3350 RI-ilmaisin • * · • ·

Lämpötila: 80°C

• ·

Injektiotilavuus: 20 pl 119433 18

Kuviossa 6A, 6B ja 6C esitetyt tulokset (etanolipiikit näissä ja muissa kuviossa ovat todellisuudessa 2 1/2 kertaa pienemmät kuin niiden pitäisi olla instrumentin herkkyyden vuoksi) havainnollistavat, että ainoastaan tuotettu hiiva SC(pLNH21), joka sisältää kloonatun XR:n, XD:n ja XK:n, voi fermentoida ksyloosin (5 %) suuret konsentraatiot 5 etanoliksi, ei tuottamaton osa S. cerevisiae eikä tuotettu SC(pLNH13-32), joka sisältää ainoastaan kloonatun XD:n ja XR:n, ei XK:ta. SC(pLNH13-32) fermentoi ksyloosin suurimmaksi osaksi ksylitoliksi.

Esimerkki 8 10

Sekä glukoosin että ksyloosin korkeiden konsentraatioden tehokas fermentointi 1400fpLNH33^:lla etanoliksi

Seos, jossa on glukoosia ja ksyloosia (noin 10 % glukooosia ja 5 % ksyloosia) fermen-15 toitiin kannalla 1400 ja 1400(pLNH33) samanlaisissa olosuhteissa. Nämä hiivat pidettiin agarlevyillä, jotka sisälsivät sopivat mediumit ja istutettiin suoraan agarlevyistä 50 ml:n YEPD mediumiin (1 % hiivauutetta, 2 % peptonia ja 2 % glukoosia) 250 ml:n Erlenmeyer-pullossa, joka oli varustettu sivuputkella, joka mahdollistaa hiivaviljelmien kasvun suoran tarkkailun Klett-kolorimetrillä. Viljelmiä inkuboitiin ravistimessa 30°C:ssa 20 ja 200 rpm aerobisesti.

• · · * · · • ti · *: Kun solutiheys saavutti keskilog-vaiheen (400 Klett-yksikköä), 12,5 ml (40 %) glukoo- • · · *·* : siä ja 6,25 ml (40 %) ksyloosia lisättiin kuhunkin kolviin. Sekoitettiin hyvin, minkä jäi- m : " keen kolvista poistettiin 1 ml viljelyseosta nollanäytteen saamiseksi. Sitten kolvi suljet- *·;·* 25 tiin Saran-päällyksellä fermentoinnin suorittamiseksi anaerobisesti. Fermentointiliemen ** *·* * 1 ml:n näytteet (joidenkin solujen kanssa) poistettiin sopivin välein (joka 24. tunti) liemen sokeri- ja etanolipitoisuuksien mittaamiseksi näytteistä fermentoinnin aikana.

• · *·*·’ Näytteiden etanoli-, glukoosi-, ksyloosi- ja ksylitolipitoisuudet analysoitiin HPLCrlla, ··· • m *···* kuten esimerkissä 6 on kuvattu. Kuviossa 8A ja 8B esitetyt tulokset havainnollistavat, 30 että geneettisesti tuotettu hiiva 1400(pLNH33) voi fermentoida 10 % glukoosin ja 5 % ksyloosin etanoliksi samanaikaisesti 2-4 päivässä vaatimatta suurta solutiheyttä. Toi-saalta toinen kanta 1400 voi muuntaa ainoastaan glukoosin etanoliksi, mutta ei ksy- • · loosia. Fermentointi suoritettiin normaaleissa olosuhteissa ilman erityistä mediumia, • · eritystä pH:ta ja myös vaatimatta hiivan kasvua korkeaksi solutiheydeksi. Täten ge- 119433 19 neettisesti tuotettu 1400(pLNH33), joka sisältää XR:n, XD:n ka XK:n, kaikki fuusioituna glykolyyttisiin promoottoreihin ja kloonattuna suuri kopionumeroiseen plasmidiin pUCKmlO, voi fermentoida suuria konsentraatioita sekä glukoosia että ksyloosia samanaikaisesti etanoliksi 2 - 4 päivässä, jolloin saadaan ainoastaan hieman ksylitolia 5 sivutuotteena.

Esimerkki 9

Yritys fermentoida ksvloosi/alukoosi tuottamattomalla Pichia stipitis:lla 10

Esimerkin 8 fermentointimenetelmä toistettiin paitsi, että käytettiin tuottamatonta Pichi stipitis:sta fermentoivana organismina. Fermentointiliemen näytteet analysoitiin HPLC:lla (I) 0 päivää; (II) 3 päivää; ja (III) 5 päivää fermentoinnin jälkeen. Kuviossa 14 esitetyt tulokset havainnollistavat, että P. stipitis voi fermentoida ainoastaan glu-15 toosin, mutta ei ksyloosia kun molemmat näistä sokereista ovat läsnä mediumissa.

Samalla kun keksintöä on havainnollistettu ja kuvattu yksityiskohtaisesti piirustuksissa ja edellisessä kuvauksessa, saman harkitaan olevan havainnollistava ja ei-rajoittava piirre, on ymmärrettävää, että ainoastaan edullinen suoritusmuoto on esitettyjä ku-20 vattu ja että kaikki vaihtelut ja muunnokset, jotka kuuluvat keksinnön henkeen toivo- • · · *;!·1 taan suojattavan.

• · 1 • · · • · ···

Viitteet • · • · · *.·.1 25 Seuraavat viitteet, siinä laajuudessa kun esimerkkimenetelmä ja muut yksityiskohdat • · · vaativat täydennyksenä tässä esitetyille, on erityisesti lisätty tähän viitteeksi.

· • · · ';!2 Ammerer, G., "Expression of genes in yeast using the ADC1 promoter," Methods in

Enzymol. 101, 192-201 (1983).

30 2 * 1 1 :.,.i Amore, R., M. Wilhelm, ja C. P. Hollenberg, ’The fermentation of xylose: An analysis of the expression of Bacillus and Actinoplanes xylose isomerase genes in yeast," Appi. Microbiol. Biotechnol., 30(4), 351-357 (1989).

• · 20 119433

Becker, D., ja L. Guarante, "High effeciency transforamtion of yeast by electroporation," Methods in Enzymol. 194, 182-186 (1991).

Bennetzen, J. L ja B. D. Hall, "The primary structure of the Saccharomyces cerevisiae 5 gene for alcohol dehydrogenase I," 1 Biol. Chem., 257(6), 3018-3025 (1982).

Burke, R. L, P. Tekamp-Olson, ja R. Najaria, "The isolation, characterization, and sequence of the pyruvate kinase gene of Saccharomyces cerevisiae," 1 Biol. Chem. 258(4), 2193-2201 (1983).

10

Chang, S.F. ja N.W.Y. Ho, "Cloning the yeast xylulokinase gene for the improvement of xylose fermentation." Appi. Biochem Biotechnol. 17, 313-318 (1988).

Chen, Zhengdao, ja N.W.Y. Ho., "Cloning and improving the expression of Pichia stipi-15 t|s xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae." Appi. Biochem. Biotechnol., 39-40, 135-147 (1993).

Chevallier, M. R. ja M. Aigle, "Qualitative detection of penicillinase produced by yeast strains carrying chimeric yeast-coli plasmids," FEBS Letters, 108(1) 179-184 (1979).

20

Chiang, L-C, H-Y. Hsiao, P. P. Ueng, L-F. Chem, ja G. T. Tsao. "Ethanol production • · from xylose by enzymic isomerization and yeast fermentation," Biotechnol. Bioeng., »·« : 11, 263-274 (1981).

• · 25 D'Amore, C. G., I. Russelll, ja G. G. Stewart, "Selection and optimization of yeast suit- ·· *·1 1 able for ethanol production at 40°C," Enz. Microbiol. Tecnol., 11, 411 (1989).

· · :-v D'Amore, T., C. 3. Panchal, I. Russell, ja G. G. Stewart, "A study of ethanol tolerance « · · *·»1 in yeast: Critical Reviews," Biotechnol., 9, 287 (1990).

30 •

Deng, X. X. ja N.W.Y. Ho, "Xylulokinase activity in various yeasts including Saccha-romvces cerevisiae containing the cloned xylulokinase gene, "Appi. Biochem. Biotech-nol., 24-25, 193 (1990).

21 1 1 9433

DuPreez, 3. C. ja J. P. van der Walt, "Fermentation of D-xylose to ethanol by a strain by Candida shehatae." Biotechnol. Lett., 5, 357-362 (1983).

Grootjen, D.RJ, R.G.J.M. van der Ians, ja K. Ch.A.M. Luyben, "Effects of the aeration 5 rate on the fermentation of glucose and xylose by Pichia stipitis CBS 5773, Enzyme Microb. Technol., 12, 20-23 (1990).

Hallborn, 3., M. Walfridsson, U. Airaksinen, H. Ojamo, B. Hahn-Hagerdahl, M. Penttilä, ja S. Keränen, "Xylitol production by recombinant Saccharomyces cerevisiae, 10 Bio./Technol., 9,1090 (1991).

Ho, N.W.Y., ja S-F. Chang, "Cloning of yeast xylulokinase gene by complementation of E. coli and yeast mutations," Enzyme Microb. Tecnol., 11,417 (1989).

15 Ho, N.W.Y., P. Stevis, S. Rosenfeld, 3.3. Huang, ja G. T. Tsao, "Expression of E. coli xylose isomerase gene by a yeast promoter," Biotehnology and Bioenginering Symposium, No. 13, 245-250 (1983).

Holland, 3. P. ja M. 3. Holland, "The primary structure of a glyseraldehyde-3-phosphate 20 dehydrogenase gene from Saccharomyces cerevisiae," 3. Biol. Chem. 253(19) 9839-9845 (1979).

* · • · · • ** • ·

Ml » · I

*·' * 3effries, T. W., "Emerging technology for fermenting D-xylose: Trends in biotechnol- ogy 3(8), 208-212 (1985).

• · · *·:·* 25 • * * *·* * 3effries, T. W., "Utilization of xylose by bacteria, yeasts, and fungi," Adv. in Biochem.

Engr. Biotechnol. 27,1-32 (1983).

• · · • · · • » ··· • · *·*·* Köetter, P., R. Amore, C. P. Hollenberg, ja M. Ciriacy, "Isolation and characterization of f*·* 30 the Pichia stipitis xylitol dehydrogenase gene, XYL2, and concentration of a xylose- ί.,.ί utilizing Saccharomyces cerevisiae transformant," Curr. Genet., 18, 493-500 (1990).

• t • · · • « · • * Köetter, P. ja M. Ciriacy, "Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae," Appi.

Microbiol. Biotechnol., 38, 776-783 (1993).

* I

119433 22

Kunkel, T. A., J. P. Roberts, ja R. a. Zakour, "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection," Methods Enzymol., 154, 367-382 (1987).

Lastick, S., M. Y. Tucker, J. R. Beyett, G. R. Noll, ja K. Grohmann. "Simultaneous fer-5 mentation and isomerization of xylose to ethanol," Apll. Microbiol. Biotechnol., 30, 574-579 (1989).

Rosenfeld, S., P. Stevis, ja N.W.Y. Ho, "Cloning and characterization of the xyl genes from E. coli." Mol. Gen. Genetics, 194,410-415 (1984).

10

Sarthy, A. V., et al., "Expression of the E. coli xylose isomerase gene in S. cerevisiae. Appi. Environ. Microb., 53, 1996-2000 (1987).

Stevis, P. A., J. J. Huang, N.W.Y. Ho, "Cloning of the pachvsolen tannophilus xylulo-15 kinase gene by complementation in Escherichia coli." Appi Environ. Micro.(53) 1, 2975-2977 (1987).

Stevis, P. A. ja N.W.Y. Ho, "Overproduction of D-xylose isomerase in E. coli by Cloning the D-xylose Isomerase gene", Enzvme Microb. Technol.. Vol. 7, s. 592-296 (1985).

20 · · *·”] Strasser, A.W.M., C. P. Hollenberg, M. Ciriacy, P. Köetter, R. Amore, M. Piontek, ja J.

• · ·

Hagedorn, "Cloning of yeast xylose reductase and xylitol dehydrogenase genes and • · · their use,” saksalainen patenttihakemus (1990).

···· · * · * 1 1 *”·1 25 Takuma, S., N. Nakashima, M. Tantirungkij, S. Kinoshita, H. Okada, T. Seku, ja T. Yo- • t · *·' 1 shidam "Isolation of xylose reductase gene of Pichia stipitis and its expression in Sac- charomyces cerevisiae, "Appi. Biochem. Biotechnol., 27-28, 327 (1991).

• · » • « · • · ♦ ·· *···1 Toivola, A., D. Yarrow, E. van den Bosch, J. P. van Dijken, ja W. A. Scheffers. "Alco- • 1·· 30 holic fermentation of D-xylose by yeasts," Appi. Environ. Microbiol., 47(6), 1221-1223 O (1984).

« • · • · · • · · • · · • · · • ·♦ • · 119433 23

Wilhelm, M., ja C. P. Hollenberg, "Selective cloning of Bacillus subtilis xylose isomerase and xylulokinase in E. coli genes by lS5-mediated expression," the EMBO Journal 3, 2555-2560 (1984).

5 Zalkin, H. ja C. Yanofsky, J. Biol. Chem. 257,1491-1500, (1982).

(1) Yleistä tietoa: (i) Hakija: Nancy Ho ja George T. Tsao (ii) Keksinnön otsikko: Rekombinanttihiivat glukoosin ja ksyloosin tehokasta fer- 10 mentointia varten (iii) Sekvenssien määrä: 1 (iv) Vastaava osoite: (A) Thomas Q. Henry (B) katu: Bank One Tower, Suite 3700, 111 Monument Circle 15 (C) Kaupunki: Indianapolis (D) Osavaltio: Indiana

(E) Maa: USA

(F) Postinumero: 46204 (v) Tietokoneella luettava muoto: 20 (A) Apuvälineen tyyppi: disketti, 3,50 tuumaa, muisti 1,4 Mb

(B) tietokone: COMPAQ

:.*·· (C) käyttöjärjestelmä: MSDOS

:T: (D) ohjelmisto: ASCII

*i‘” (vi) hakemustiedot: :.1.ί 25 (A) hakemusnumero: 08/148,581 (B) hakupäivä: 8.11.1993 (C) luokitus: • * v.: (vii) aikaisemman hakemuksen tiedot: ei ole ··· (viri) asiamiehen tiedot: 30 (A) nimi: Thomas Q. Henry .***· (B) rekisteröintinumero: 28,309 ♦ ·· βΛβ (C) viite/yhteenvetonumero: PUR17/18 • · »\ (ix) teleliikennetiedot: " (A) puhelin: (317) 634-3456 24 1 1 9433 (B) telefax: (317) 637-7561 (2) Tiedot Seq ID No. l:lle (i) sekvenssin ominaispiirteet 5 (A) pituus: 2467 emäsparia (B) tyyppi: nukleotidiaminohappo (C) säikeisyys: kaksois (D) topologia: lineaarinen

(ii) molekyylityyppi: genoominen DNA

10 (XI) sekvenssin kuvaus: SEQ ID No. 1: GGATCCAAGA CCATTATTCC ATCAGAATGG AAAAAAGTTT AAAAGATCAC 50 GGAGATTTTG TTCTTCTGAG CTTCTGCTGT CCTTGAAAAC AAATTATTCC 100 GCTGGCCGCC CCAAACAAAA ACAACCCCGA TTTAATAACA TTGTCACAGT 150 ATTAGAAATT TTCTTTTTAC AAATTACCAT TTCCAGCTTA CTACTTCCTA 200 TAATCCTCAA TCTTCAGCAA GCGACGCAGG GAATAGCCGC TGAGGTGCAT 250 AACTGTCACT TTTCAATTCG GCCAATGCAA TCTCAGGCGG ACGAATAAGG 300 ie GGGCGCTCTC GAGAAAAACA AAAGGAGGAT GAGATTAGTA CTTTA ATG TTG 351

Met Leu 1 TGT TCA GTA ATT CAG AGA CAG ACA AGA GAG GTT TCC AAC ACA 393

Cys Sei: Vei Ile Gin Arg Gin Thr Arg Glu Vai Ser Asn Thr 5 10 15 ATG TCT TTA GAC TCA TAC TAT CTT GGG TTT GAT CTT TCG ACC 435

Met Ser Leu Asp Ser Tyr Tyr Leu Gly Phe Asp Leu Ser Thr 20 20 25 30 • · · CAA CAA CTG AA A TGT CTC GCC ATT AAC CAG GAC CTA AAA ATT 4 77 i*\j Gin Gin Leu Lys Cys Leu Ala Ile Asri Gin Asp Leu Lys Ile I..* 35 40 I · · • · · * , GTC CAT TCA GAA ACA GTG GAA TTT GAA AAG GAT CTT CCG CAT 519 *!**i Vai His Ser Glu Thr Vai Glu Phe Glu Lys Asp Leu Pro His . 45 50 55 • ♦ · ***** 25 ,···. TAT CAC ACA AAG AAG GGT GTC TAT ATA CAC GGC GAC ACT ATC 561 V * Tyr His Thr Lys Lys Gly Vai Tyr lie His Gly Asp Thr Ile 60 65 70 GAA TGT CCC GTA GCC ATG TGG TTA GGG GCT CTA G AT CTG GTT 603 **’·* Glu Cys Pro Vai Ala Met Trp Leu Gly Ala Leu Asp Leu vai ·**· 75 80 85 ··· -n CTC TCG AAA TAT CGC GAG GCT AAA TTT CCA TTG AAC AAA GTT 64 5 S ** -50 Leu Ser Lys Tyr Arg Glu Ala Lys Phe Pro Leu Asn Lys Vai .·**. 90 95 100 • i

»M

ATG GCC GTC TCA GGG TCC TGC CAG CAG CAC GGG TCT GTC TAC 687 V.* Met Ala Val Ser Gly Ser Cys Gin Gin His Gly Ser Vai Tyr .·, : 105 110

• M

• · 119433 25 TGG TCC TCC CAA GCC GAA TCT CTG TTA GAG CAA TTG AAT AAG 729

Tip Ser Ser Gin Ala Glu Ser Leu Leu Glu Gin Leu Asn Lys 115 120 125 AAA CCG GAA AAA GAT TTA TTG CAC TAC GTG AGC TCT GTA GCA 771 c Lys Pro Glu Lys Asp Leu Leu His Tyr Vai Ser Ser Val Ala 3 130 135 140 TTT GCA AGG CAA ACC GCC CCC AAT TGG CAA GAC CAC AGT ACT B13

Phe Ala Arg Gin Thr Ala Pro Asn Trp Gin Asp His Ser Thr 14 5 150 155 GCA AAG CAA TGT CAA GAG TTT GAA GAG TGC ATA GGT GGG CCT B55

Ala Lys Gin Cys Gin Glu Phe Glu Glu Cys lie Gly Gly Pro 160 165 170 10 GAA AAA ATG GCT-CAA TTA ACA GGG TCC AGA GCC CAT TTT AGA 89 7

Glu Lys Met Ala Gin Leu Thr Gly Ser Arg Ala His Phe Ary

175 ISO

TTT ACT GGT CCT CAA' ATT CTG AAA ATT GCA CAA TTA GAA CCA 939

Fhe Thr Gly Pro Gin l.le Leu Lys lie Ala Gin Leu Glu Pro 1Θ5 190 200 ,,- GAA GCT TAC GAA AAA ACA AAG ACC ATT TCT TTA GTG TCT AAT 981 3 Glu Ala Tyr Glu Lys Thr Lys Thr He Ser Leu Val Ser Asn 205 210 215 ΊΤΤ TTG ACT TCT ATC TTA GTG GGC CAT CTT GTT GAA TTA GAG 1023

Phe Leu Thr Ser He Leu Val Gly His Leu Val Glu Leu Glu 220 225 230 GAG GCA GAT GCC TGT GGT ATG AAC CTT TAT GAT ATA CCT GAA 1065

Glu Ala Asp Ala Cys Gly Met Asn Leu Tyr Asp He Ary Glu 20 235 240 245 • · · AGA AAA TTC ATG TAT GAG CTA CTA CAT CTA ATT GAT AGT TCT 1107 ΐ *.· Arg Lys Phe Met Tyr Glu Leu Leu His Leu He Asp Ser Ser !..* 250 255 • · ♦ t · t TCT AAG GAT AAA ACT ATC AGA CAA AAA TTA ATG AGA GCA CCC 1149 *·"** Ser Lys Asp Lys Thr He Arg Gin Lys Leu Met Arg Ala Pro . .·. 260 265 270 ··· 25 ATG AAA AAT TTG ATA GCG GGT ACCA TCT GTA AA TAT TTT ATT 1191 V * Met Lys Asn Leu He Ala Gly Thr He Cys Lys Tyr Phe He 275 280 285 GAG AAG TAC GGT TTC AAT ACA AAC TGC AAG GTC TCT CCC ATG 1233 ·*·* Glu Lys Tyr Gly Phe Asn Thr Asn Cys Lys Val Ser Pro Met ϊ*"ϊ 290 300 305 ··· f·» 30 ··· • · • * • a · * · • · · a a a • · e a • · · • ·· • * 119433 26 ACT GGG GAT ATT TTA GCC ACT ATA TGT TCT TTA CCC CTG CGG 1275

Thr Gly Asp Asn Leu Ala Thr lie Cys Ser Leu Pro Leu Arg 310 320 325 AAG AAT GAC GTT CTC GTT TCC CTA GGA ACA AGT ACT ACA GTT 1317

Lys Asn Asp Val Leu Val Ser Leu Gly Thr Ser Thr Thr Val 5 330 335 CTT CTG GTC ACC GAT AAG TAT CAC CCC TCT CCG AAC TAT CAT 1359

Leu Leu Val Thr Asp Lys Tyr His Pro Ser Pro Asn Tyr His 340 345 350 CTT TTC ATT CAT CCA ACT CTG CCA AAC CAT TAT ATG GGT ATG 1401

Leu Phe lie His Pro Thr Leu Pro Asn His Tyr Mel: Gly Met 355 360 365 ^ ATT TGT TAT TGT AAT GGT TCT TTG GCA AGG GAG AGO ATA AGA 14 4 3 lie Cys Tyr Cys Asn Gly Ser Leu Ala Arg Glu Arg IJe Arg 370 375 380 GAC GAG TTA AAC AAA GAA CGG GAA AAT AAT TAT GAG AAG ACT 1485

Asp Glu Leu Asn Lys Glu Arg Glu Asn Asn Tyr Glu Lys Thr 385 390 400 AAC GAT TGG ACT CTT TTT AAT CAA GCT GTG CTA GAT GAC TCA 1527 3 Asn Asp Trp Thr Leu Phe Asn Gin Ala Val Leu Asp Asp Ser 405 410 GAA AGT AGT GAA AAT GAA TTA GGT GTA TAT TTT CCT CTG GGG 1569

Glu Ser Ser Glu Asn Glu Leu Gly Val Tyr Phe Pro Leu Gly 415 420 425 GAG ATC GTT CCT AGC GTA AAA GCC ATA AAC AAA AGG GTT ATC 1611

Glu lie Val Pro Ser Vai Lys Ala He Asn Lys Arg Val lie 20 430 435 440 • * * Γ*\ TTC AAT CCA AAA ACG GGT ATG ATT GAA AGA GAG GTG GCC AAG 1653 »/·· Phe Asn Pro Lys Thr Gly Met He Glu Arg Glu Val Ala Lys ... 445 450 455 ♦ · · • · « TTC AAA GAC AAG AGG CAC GAT GCC AAA AAT ATT GTA GAA TCA 169 5 • * Phe Lys Asp Lys Arg His Asp Ala Lys Asn He Val Glu Ser . 460 465 470 ··· 25 :*··. CAG GCT TTA AGT TGC AGG GTA AGA ATA TCT CCC CTG CTT TCG 1737 • Gin Ala Leu Ser Cys Arg Val Arg lie Ser Pro Leu Leu Ser 475 480 v!: GAT TCA AAC GCA AGC TCA CAA CAG AGA CTG AAC GAA GAT ACA 1779

Asp Set Asn Ala Ser Ser Gin Gin Arg Leu Asn Glu Asp Thr 485 490 495 !**·· 30 ATC GTG MG T1"1 GAT TAC GAT GAA TCT CCG CTG CGG GAC TAC 1021

He Val Lys Phe Asp Tyr Asp Glu Ser Pro Leu Arg Asp Tyr \,.S 500 505 510 • » • · · t · · • · .·.: \ ·: 119433 27 CTA AAT AAA AGG CCA GAA AGG ACT TTT TTT GTA GGT GGG GCT 1863

Leu Asn Lys Arg Pro Glu Arg Thr Phe Phe Vai Gly Gly Ala 515 520 525 TCT AAA AAC GAT GCT ATT GTG AAG AAG TTT GCT CAA GTC ATT 1905 ς Ser Lys Asn Asp Ala Ile Vai Lys Lys Plie Ala Gin Vai He 530 535 540 GGT GCT ACA AAG GGT AAT TTT AGG CTA GAA ACA CCA AAC TCA 1947

Gly Ala Thr Lys Gly Asn Phe Arg Leu Glu Thr Pro Asn Ser 545 550 TGT GCC CTT GGT GGT TGT TAT AAG GCC ATG TGG TCA TTG TTA 1989

Cys Ala Leu Gly Gly Cys Tyr Lys Ala Met Trp Ser Leu Leu 1Q 555 560 565 TAT GAC TCT AAT AAA ATT GCA GTT CCT TTT GAT AAA TTT CTG 2031

Tyr Asp Ser Asn Lys, lie Ala Vai Pro Phe, Asp Lys Phe Leu 570 ' 575 580 AAT GAC AAT TTT CCA TGG CAT GTA ATG GAA AGC ATA TCC GAT 2073

Asn Asp Asn Phe Pro Trp His Vai Met Glu Ser lie Ser Asp 585 590 595 15 GTG GAT AAT GAA AAT TGG ATC GCT ATA ATT CCA AGA TTG TCC 2115

Vai Asp Asn Glu Asn Trp Ile Ala He He Pro Arg Leu Ser 600 605 610 CCT TAAGCGAACT GGAAAAGACT CTCATCTAAA ATATGTTTGA ATAATTTATC 2168 Pro ATGCCCTGAC AAGTACACAC AAACACAGAC ACATAATATA CATACATATA 2218 TATATATCAC CGTTATTATG CGTGCACATG ACAATGCCCT TGTATGTTTC 2268 no GTATACTGTA GCAAGTAGTC ATCATTTTGT TCCCCGTTCG GAAAATGACA 2318 , .·. AAAAGTAAAA TCAATAAATG AAGAGTAAAA AACAATTTAT GAAAGGGTGA 23 68 ·.!.* GCGACCAGCA ACGAGAGAGA CAAATCAAAT TAGCGCTTTC CAGTGAGAAT 2418 I ATAAGAGAGC ATTGAAAGAG CTAGGTTATT GTTAAATCAT CTCGAGCTC 24 67 • ·· • · 999 • * · • * · m • · * • · · ··· 25 «·· i * * • · · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 999 9 99 9 9 S ·· ··· • · • · 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 1 9 9 9 9 9 99 9 9

Claims (16)

1. Rekombinanttihiiva, tunnettu siitä, että se sisältää ksyloosireduktaasia, ksylitolide-hydrogenaasia ja ksylulokinaasia koodaavia lisättyjä geenejä ksyloosin fermentoimi- 5 seksi etanoliksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rekombinanttihiiva, tunnettu siitä, että hiiva on tehokas myös fermentoitaessa glukoosi etanoliksi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen rekombinanttihiiva, tunnettu siitä, että hiiva on sukua Saccharomyces.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen rekombinanttihiiva, tunnettu siitä, että mainitut geenit ovat fuusioituneet ei-glukoosi-inhiboituihin promoottoreihin, ja hiiva on tehokas 15 fermentoitaessa samanaikaisesti glukoosi ja ksyloosi etanoliksi.

5. Rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää ksyloosireduktaasia, ksylitolidehydrogenaasia ja ksylulokinaasia koodaavia geenejä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, , ,·, että rekombinantti-DNA-molekyyli on läsnä vektorissa, joka on tehokas transformoita- • · · essa hiivaa. • 14 • e • φ * 4 4 4

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, • * 25 että mainitut geenit ovat fuusioituneet ei-glukoosi-inhiboituihin promoottoreihin. iti 444 444 14 4

* * 8. Menetelmä saada rekombinanttihiiva, joka on tehokas fermentoitaessa ksyloosi eta- , , noliksi, tunnettu siitä, että lisätään DNA hiivaan niin, että saadaan aikaan hiiva, jossa 4 4 4 on lisättynä ksyloosireduktaasia, ksylitolidehydrogenaasia ja ksylulokinaasia koodaavia » · *·;·* 30 geenejä. ·· • · * 4· «

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu lisätty .v. DNA sisältää ksyloosireduktaasia, ksylitolidehydrogenaasia ja ksylulokinaasia koodaavia geenejä. • ' ·· • 4 29 1 1 9433

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu hiiva on sukua Saccharomyces.

11. Menetelmä fermentoida ksyloosi tai glukoosi etanoliksi, tunnettu siitä, että fer-5 mentoidaan ksyloosia ja glukoosia sisältävä mediumi rekombinanttihiivalla, joka sisältää ksyloosireduktaasia, ksylitolidehydrogenaasia ja ksylulokinaasia koodaavia lisättyjä geenejä ja joka on tehokas fermentoitaessa ksyloosi tai glukoosi etanoliksi.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mediumi sisäl-10 tää sekä ksyloosia että glukoosia, ja hiiva on tehokas fermentoitaessa sekä ksyloosia että glukoosi etanoliksi.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiiva on sukua Saccharomyces. 15

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut geenit ovat fuusioituneet ei-glukoosi-inhiboituihin promoottoreihin, ja hiiva on tehokas fermentoitaessa samanaikaisesti glukoosi ja ksyloosi etanoliksi.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rekombinanttihiiva, tunnettu siitä, että mainitut , .·. geenit ovat fuusioituneet ei-glukoosi-inhiboituihin promoottoreihin ja jossa mainittu • · · ^ .·"· hiiva on tehokas fermentoitaessa ksyloosi etanoliksi. • ·· • » ··· • · ♦ • · · m[tt.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen rekombinanttihiiva, tunnettu siitä, että mainit- * · t #.t 25 tu hiiva on myös tehokas fermentoitaessa glukoosi etanoliksi. φ · · ··» *·· * » · • · 1 • • # # • · · • · ··· • • · • · 1 ·· • · « · · »·« ♦ » • · • · · • · t · 1 • · · • · • 1 · * «t • 1 119433 30