UA48125C2 - Рекомбінантні дріжджі (варіанти), рекомбінантна молекула днк, вектор, спосіб одержання рекомбінантних дріжджів, спосіб зброджування ксилози до етанолу, спосіб зброджування глюкози до етанолу - Google Patents

Abstract

Описані рекомбінантні дріжджі, що містять гени, які кодують ксилозоредуктазу, ксилитдегідрогеназу і ксилулокіназу, і молекули ДНК, вектори і способи, застосовні для одержання таких дріжджів. Рекомбінантні дріжджі ефективно зброджують ксилозу до етанолу, і кращі дріжджі здатні одночасно зброджувати глюкозу і ксилозу до етанолу, тим самим цілком використовуючи переваги цих двох джерел цукру, за їх наявності в сільськогосподарській біомасі.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится, в общем, к создаваемьм методами генной инженерии дрожжам, 2 способньім одновременно сбраживать два основньх сахарньїх компонента целлюлозной биомассь, глюкозу и ксилозу, до зтанола. Более конкретно, настоящее изобретение касается таких дрожжей, которье могут бьіть созданьі клонированием гена ксилозоредуктазьі, гена ксилитдегидрогеназьй и гена ксилулокиназьії в дрожжах, способньїх сбраживать глюкозу зтанола.

Недавние исследования показали, что зтанол является идеальньім жидким топливом для автомобилей. Он 70 может использоваться непосредственно как чистоє топливо (10095 зтанол) или в виде смеси с бензином в различньїх концентрациях.

Применение зтанола в качестве добавки или для заменьі бензина или заменителя бензина может снизить зависимость многих наций от импорта нефти, и также обеспечить возобновляемое топливо для транспорта.

Кроме того, доказано, что зтанол представляет собой более чистое топливо, вбіделяющее гораздо меньшее 72 количество загрязняющих веществ в окружающую среду, чем обьчньй бензин. Например, бьло показано, что использование оксигенированьїх веществ в бензине может уменьшать вьброс в воздух окиси углерода, вредного загрязняющего вещества. Среди нескольких оксигенаторов, применяемьх в настоящее время для повьішения содержания кислорода в бензине, зтанол имеет найвьісшее содержание кислорода. Агентство охраньї окружающей средь! (ЕРА) (США) показало, что в случае бензина, смешанного с 1095 зтанола, вьіброс окиси углерода снижаєется примерно на 25 - 30905.

До сих пор сьірьеем для получения промьшленного зтанола посредством сбраживания служили сахара из сахарного тростника или сахарной свекльі, крахмал из кукурузьії или других продовольственньїх культур. Однако зти сельскохозяйственнье культурь! слишком дороги, чтобьі использовать их как сьірье при широкомасштабном производстве топливного зтанола. с 29 Растительная биомасса является привлекательньм исходньім продуктом для производства Го) зтанола-горючего посредством сбраживания, потому что она является возобновляемой и доступной в больших количествах при малой стоимости. Концепция использования спирта, продуцируемого микробньм сбраживанием Сахаров из сельскохозяйственной биомассь!, появилась, по крайней мере, два десятилетия назад. Основньми сбраживаемьми сахарами из целлюлозньхх материалов являются глюкоза и ксилоза, (с о равньм приблизительно 2 или З к 1 отношением глюкозь! к ксилозе). Найболее предпочтительньюе способь! су сбраживания целлюлозньїх материалов должнь, конечно, полностью превращать и глюкозу, и ксилозу в зтанол.

К сожалению, даже теперь не имеется ни одного известного природного микроорганизма, способного на -- зффективное сбраживание и глюкозь!, и ксилозь. Ге)

Дрожжи, в частности Засспаготусевз. традиционно использовались для сбраживании сьірья на основе глюкозь, и они по-прежнему остаются найлучшим микроорганизмом для превращения глюкозь в зтанол. М

Однако, как бьіло установлено, зти сбраживающие глюкозу дрожжи оказались неспособньми не только сбраживать ксилозу, но и использовать пентозу для роста. Тем не менее, зти сбраживающие глюкозу дрожжи могут использовать ксилулозу для роста и сбраживания (фиг. 1), хотя и с различной зффективностью. «

Например, 5. сегемізІае сбраживаєт ксилулозу очень слабо, в то время как видьі Зспігозасспаготусез делают З зто вполне зффективно (Чанг и др., 1981; Ластик и др., 1989). с Несмотря на то, что сбраживающие глюкозу дрожжи неспособнь, использовать ксилозу ни для роста, ни для з» сбраживанийи, существует много природньїх дрожжей, которніе могут использовать ксилозу для азробного роста, но не в состояниий сбраживать ее до зтанола. Зти потребляющие, но не сбраживающие ксилозу дрожжи для превращения последней в ксилулозу используют два фермента: ксилозоредуктазу и ксилитдегидрогеназу. Зти дрожжи отличаются от большинства бактерий, которне для прямого превращения ксилозьі в ксилулозу е используют единственньй фермент - ксилозоиздмеразу (фиг. 1). Для своего действия ксилозоредуктаза и о ксилитдегидрогеназа дрожжей нуждаются в кофакторах; в качестве кофактора ксилозоредуктазь! вьіступает никотинамидаденин-динуклеотидфосфат (восстановленная форма) (МАЮОРН), в то время как кофактором - ксилитдегидрогеназьі является никотинамидаденин-динуклеотид (МАЮ). Наоборот, бактериальная ка 20 ксилозоизомераза не требуєт никакого кофактора для прямого преобразования ксилозь в ксилулозу (фиг. 1).

Два десятилетия назад много усилий бьіло затрачено на попьітки вьіявления новьїх дрожжей, способньх сл зффективно сбраживать как глюкозу, так и ксилозу до зтанола. Хотя такие идеальнье дрожжи не бьіли найдень, усилия исследователей имели некоторьій успех. Например, бьіло обнаружено, что некоторье дрожжи способнь! не только использовать ксилозу для азробного роста, но и сбраживать ее до зтанола (Тойвола и др., 1984; 29 Дуприз и ван дер Вальт, 1983), хотя ни одни из зтих сбраживающих ксилозу дрожжей не обеспечивали ее

ГФ) полного сбраживания до зтанола (Джеффрис, 1985). Кроме того, зти дрожжи не обеспечивают зффективного сбраживания глюкозь. о Из числа сбраживающих ксилозу дрожжей подробно бьли изученьії три вида: РаспузоЇїеп (аппорпПиз5 (Тойвола и др., 1984), Сапаіда зпепайае (Дуприз и ван дер Вальт, 1983), и Ріспіа зріз (Гроотьен и др., 60 1990). Р. зріз и С. зпепйаїае сбраживают ксилозу лучше, чем другие также сбраживающие ее дрожжи (Гроотьен и др., 1990). Тем не менее, даже лучшие сбраживающие ксилозу дрожжи не очень зффективнь! в зтом отношений и крайне незффективнь в сбраживаний глюкозьі (Джеффрис, 1985).

В течение последнего десятилетия бьіли предпринять! попьітки генетической модификации традиционньх сбраживающих глюкозу дрожжей, в частности 5. сегемізІае при помощи технологии рекомбинантньїх ДНК. бо Первоначальньюе усилия бьіли сконцентрированьі на клонирований гена ксилозоизомеразьі в дрожжах для придания им способности превращать ксилозу непосредственно в ксилулозу без кофакторов. Однако зти попьїтки бьіли безуспешньми, т.к. геньї, коюодирующие различнье бактериальнье ксилозоизомеразь, не способнь осуществлять контроль синтеза активного фермента в 5. сегемізіае (Розенфельд и др., 1984; Хо и др., 1983;

Сарти и др., 1987; Вильгельм и Голленберг, 1984; Амор и др., 1989).

В последние годьі усилия в области генной инженерии, связаннье с созданием дрожжей, в частности, 5. сегемівІіае. способньїх сбраживать ксилозу, сосредоточились на клонирований генов, кодирующих ксилозоредуктазу (Такайна и др., 1991; Холлборн и др., 1991; Штрассер, и др., 1990), ксилитдегидрогеназу (Кеттери др., 1990; Холлборн и др., 1990), и ксилулокиназу (Стевис и др., 1987; Чанг и Хо, 1988; Хо и Чанг, 7/0 1989; Денг и Хо, 1990). З. сегемівіае и другие сбраживающие глюкозу дрожжи не отличаются сколько-либо заметной ксилозоредуктазной или ксилитдегидрогеназной активностью, но все проявляют ксилулокиназную активность. Так, все сбраживающие глюкозу дрожжи могут сбраживать ксилозу, но делают зто с разной зффективностью (Денг и Хо, 1990).

Недавно Кеттер и др. (1990), Штрассер и др. (1990, и Холлборн и др. (1990, 1991) клонировали ген 7/5 Ксилозоредуктазь и ген ксилитдегидрогеназу в 5. сегемівіае. Однако, зти полученнье с помощью методов генн" й инженерии дрожжи все еще не могут зффективно сбраживать ксилозу. На! оимер, зти дрожжи смогли обеспечить сбраживание не более 295 ксилозьі. Кроме того, они продуцируют большие количества ксилита из ксилозьі (Холлборн и др., 1990; Кеттер и Кирьяси, 1993), что отнимаєт ценньй субстрат - ксилозу из метаболизма сбраживания до зтанола.

Обширнье предшествующие исследования в зтой области, описаннье вьіше, показьвшвают, что, вопреки обьединенньм и длительньм усилиям многочисленньїх исследователей, дрожжи, способнье зффективно сбраживать глюкозу и ксилозу до зтанола, получень! не бьіли. Таким образом, остается потребность в таких дрожжах и в способах их получения и применения. Данное изобретение направлено на удовлетворение зтих потребностей. с

Краткое изложение сущности изобретения

Особенность зтого изобретения заключаєтся в обнаружениий того, что новье дрожжевье штаммьї, і) способнье зффективно сбраживать только ксилозу или ксилозу одновременно с глюкозой, могут бьіть создань! с помощью рекомбинантньх ДНК и методов клонирования генов. В частности, зти методьі! использовали для создания новьїх рекомбинантньїх дрожжей, содержащих клонированньюе гень ксилозоредуктазь (ХК), ю зо Ксилитдегидрогеназьі (ХО) и ксилулокиназь! (ХК), которье бьіли слитьї с промоторами, не ингибируемьми присутствием глюкозь. с

Таким образом, один из предпочтительньїх вариантов осуществления изобретения обеспечиваєт получение - де рекомбинантного дрожжевого штамма, содержащего введеннье геньї, кодирующие ксилозоредуктазу, ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу, и способного сбраживать ксилозу до зтанола. Зтот рекомбинантньй со дрожжевой штамм, в предпочтительном варианте, способен также сбраживать глюкозу до зтанола, но в более «г предпочтительном варианте получают такие дрожжевье штаммь!, которье могут зффективно сбраживать зти два сахара одновременно до зтанола, и у которьїх геньі ХК, ХО и ХК слить! с промоторами, не ингибируемьми присутствием глюкозь и которье не требуют ксилозь! для индукции.

Другой предпочтительньій вариант изобретения обеспечивает получение рекомбинантного дрожжевого « штамма, содержащего геньі, кодирующие ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу, причем зти геньі слитьі сне /7-З с ингибируемьми глюкозой промоторами и зти дрожжи способньі сбраживать ксилозу до зтанола. Зтот рекомбинантньй дрожжевой штамм также способен, в предпочтительном варианте сбраживать глюкозу до ;» зтанола.

Другие предпочтительнье варианть! осуществления изобретения касаются реагентов, применимьх для получения рекомбинантньїх дрожжей данного изобретения. Так, данное изобретение обеспечиваєт также ї5» получение молекульь рекомбинантной ДНК, содержащей геньії, кодирующие ксилозоредуктазу, ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу. Изобретение, наряду с зтим обеспечивает получение вектора, со содержащего геньї, кодирующие ксилозоредуктазу; ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу. В зтих реагентах - геньії, предпочтительно слить! с промоторами, которье не ингибируются глюкозой и также не требуют ксилозь для индукций, с целью рационального получения рекомбинантньїх дрожжей, способньхх одновременно о сбраживать глюкозу и ксилозу до зтанола. с Другой предпочтительньій вариант осуществления данного изобретения обеспечивает способ получения рекомбинантньїх дрожжей, способньїх сбраживать ксилозу до зтанола. Зтот способ предусматривает стадию введения ДНК в дрожжи для того, чтобьі дрожжи имели введеннье геньі, кодирующие ксилозоредуктазу, в Ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу. В предпочтительном варианте, зти геньі сольются с не ингибируемьми глюкозой промоторами для обеспечения возможности одновременного сбраживания глюкозь! и ксилозь! до (Ф, зтанола. Вьігодно одновременное введение всех трех генов, например, с применением реагентов данного ка изобретения, обсужденньймх вьіше.

Другие предпочтительнье вариантьї осуществления изобретения обеспечивают способь! сбраживания бо глюкозь и ксилозьі до зтанола. Зти способьі предусматривают стадию сбраживания средь), содержащей ксилозу или глюкозу, рекомбинантньм штаммом дрожжей, содержащим введеннье гень), кодирующие ксилозоредуктазу, ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу. Желательно, чтобь зти три гена слились с не ингибируемьми глюкозой промоторами и чтобьі! среда содержала как глюкозу, так и ксилозу, чтобь! обеспечить одновременное сбраживание ксилозь и глюкозь! до зтанола. 65 Предпочтительнье дополнительнье варианть! осуществления, отличительнье особенности и преимущества зтого изобретения будут очевидньіми из следующего далее описания.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 является схематическим изображением ферментов, связанньїх с ранними стадиями метаболизма ксилозь! в бактериях и дрожжах;

Фиг. 2 показьваеєт нуклеотидную последовательность и вьшведенную из онее аминокислотную последовательность гена ксилулокиназьь дрожжей, в том числе 5- и 3'-фланкирующие последовательности.

Инициирующий и терминирующий кодоньі подчеркнутьі. Возможнье регуляторнье последовательности в 5 и 3З--нсекодирующих областях указань!ї стрелками;

Фиг. З показьіваєт геньї, клонированнье на плазмиде рі ЗК15, и рестрикционную карту зтой плазмидьі; 70 Фиг. 4 представляеєт геньї, клонированнье на плазмиде руСКтт!0, и рестрикционную карту зтой плазмидьі;

Фиг. 5 показьіваєт геньії, клонированньсе на плазмиде рі МН21, и рестрикционную карту зтой плазмидь;

Фиг. 6А показьіваєет НРІ С (ЖХВР)-хроматограмму бродильного бульона, полученного сбраживанием ксилозь! рекомбинантньми дрожжами ЗС(рі МН21) (5. сегемізІае. содержащий введенньєе геньі ХК, и ХО и ХК), в течение (І) 2 дней и (ІЇ) 4 дней;

Фиг. 6В показьшваеєт НРІ С-хроматограмму бродильного бульона, полученного сбраживанием ксилозь! с рекомбинантньми дрожжами зС(ріІМНІ3 - 32) (5. сегемізІае, содержащий введенньсе геньі ХК и ХО, но не содержащий гена ХК) в течение (І)2 дней и ІЇ) 6 дней;

Фиг. 6С показьтваєт НРІ С-хроматограмму бродильного бульона, полученного сбраживанием ксилозь! не Модифицированньми методами генной инженерии дрожжами 5. сегемізіае (не содержащими генов ХК, ХО или

ХЮ) в течение (І) 2 дней и (ІЇ) 7 дней, как описано далее в примере 6;

Фиг. 7 показьіваєт геньії, клонированнье на плазмиде рі МНЗЗ, и рестрикционную карту зтой плазмидь;

Фиг. 8А показьвваєт НРІ С-хрс "атограмму бродильного бульона, полученного сбраживанием содержащей глюкозу и ксилозу средьй (1095 и 595, соответственно) не модифицированньм методами генной инженерийи сч ов шШтаммом дрожжей 1400 (не содержащим введенньїх генов ХК, ХО или ХК) в течение (І) 0 дней, (ІЇ) 2 дней, как описано далее в примере 8; і)

Фиг. 88 показьівает НРІ С-хроматограмму родильного бульона, полученного сбраживанием содержащей глюкозу и ксилозу средь (1095 и 595, соответственно) рекомбинантньми дрожжами 1400 (рі МНЗ3) (штамм дрожжей 1400, содержащий введенньєе геньі ХК, ХО и ХК), в течение (І) О дней и (Ії) 2 дней, как описано далее в ю зо примере 8;

Фиг. 9 является схематической диаграммой, представляющей в общих чертах конструирование рВінезсгірі ІІ с

К(-) содержащей клонированнье геньі ХК, ХО и ХК: бьіли сконструировань! четьіре таких плазмидь: рКе(-)- "п

КК-А"ВК-КО-1; рк5(-)-КК-А"К-КО-2;. рк5(-)-КК-АК-КО-3; и рк5(-)-КК-АК-КО-4, как описано далее в примере 4.

Фиг. 10 показьвает прямую амплификацию интактного гена ксилитдегидрогеназь и не содержащего со зв промотора гена ХО из хромосомной ДНК Р. З Прв посредством полимеразной реакции цепи; расщепления «Е

Ватні-ЕсокКІ 5. ДНК; дорожка 2: Ген (интактньій) ксилитдегидрогеназьь штамма Ріспіа; дорожка 3: Ген (не содержащий промотора) ксилитдегидрогеназьь штамма Ріспіа; и дорожка 4: Молекулярнье маркерні, расщепленная Наеїіїїфх ДНК; «

Фиг. 11 дает диаграмму стратегий, использованньїх для секвенирования гена ксилулокиназьі! дрожжей;

Фиг. 12 является схематической диаграммой, представляющей в общих чертах конструирование плазмидь! - с ріг МНнаг1; ц Фиг. 13 показьівает НРІ С-хроматограмму бродильного бульона, полученного сбраживанием смеси глюкозь "» (1095) и ксилозь (5965) штаммом 5. сегемевзіае ЗС (рі МН13З - 32) (содержащий только геньі ХК и ХО) в течение (І) 0 дней; (ІЇ) 2 дней и (ІІІ) 5 дней;

Фиг. 14 показьівает НРІ С-хроматограмму бродильного бульона, полученного сбраживанием смеси глюкозь т» (1095) и ксилозь! (595) не модифицированньіми методами генной инженерии дрожжами Рісніа зіПрв, в течение (І) О дней; (ІЇ) З дней и (ІІІ) 5 дней.

Ме Подробное описание изобретения - С целью облегчения понимания принципов изобретения, далее, будут описаньі, некоторьіе варианть! его осуществления и для зтого будет применен специальньй язьк. Тем не менее, должно бьіть понятно, что зто о описание не предназначено для ограничения обьема изобретения, и подобнье изменения, дальнейшие сл модификации и приложения принципов изобретения, какие иллюстрируются здесь, должнь! бьіть очевиднь специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение.

Данное изобретение обеспечивает возможность получения рекомбинантньїх дрожжей, молекул ДНК и векторов, содержащих геньі ХК, ХО и ХК. Хорошо известно, что такие геньі, встречаются в разнообразньх микроорганизмах и, действительно, как обсуждалось вьіше, многочисленнье геньі ХК, ХО и ХК бьіли і) идентифицировань и вьіделень!ї. Конкретньій источник зтих генов не является критическим для разнообразньх іме) аспектов применения зтого изобретения; скорее, будут пригодньї любье ДНК, кодирующие белки (ферментьї), обладающие ксилозоредуктазной активностью (способностью превращать Ю-ксилозу в ксилитол с МАЮОРН или бо (никотинамидоденин-динуклеотидом восстановленньм (МАН) в качестве" кофактора), ксилитдегидрогеназной активностью (способностью превращать ксилитол в О-ксилулозу с (никотинамидодениндинуклеотидом (окисленная форма МАЮЖ)) в качестве кофактора) или ксилулозокиназной активностью (способностью превращать ЮО-ксилулозу в О-ксилулозо-5-фосфат). Зти геньї могут бьіть полученьі в виде встречающихся в природе генов или модифицированьі, например, путем присоединения, заменьії или деления оснований во 65 встречающемся в природе гене до тех пор, пока кодируемьїй белок еще обладаєт ХК, ХО или ХК активностью.

Подобньм же образом, зти геньі или их части могут бьіть полученьі синтетически известньіми способами,

опять-таки, пока полученная ДНК кодирует белок с необходимой ХК, ХО или ХК активностью.

Например, пригодньіми источниками генов ХК или ХО являются ксилозоокисляющие дрожжи, такие как

Сапа!їда зненайаеє, Ріснпіа зріз. РаспузоїЇеп (аппорпПив5, пригодньіми источниками генов ХК являются указаннье

Вьіше ксилозоокисляющие дрожжи, а таюке ксилозонеокисляющие дрожжи из рода Засспаготусев, например, 5. сегемізвІае, из рода ЗспІгозасспаготусевз. например, ЗспІгозасспаготусез ротре. и такие бактерии, как

Езспегісніа соїІ. ВасіІйивз зрр.. Зігеріютусез зрр. и т.д. Представляющие интерес геньі могут бьіть получень из зтих источников при помощи общепринятьїх методик. Например, с зтой целью можно использовать гибридизацию, комплементацию или полимеразную реакцию цепи (РСК). 70 Конкретньїй ген ХК, использованньій в исследованиях заявителей, клонировали из Р. зріз при помощи (РСК) (Чен и Хо, 1993). Олигонуклеотидьі, необходимье для амплификации ХК из хромосомной ДНК при помощи РСК, синтезировали согласно опубликованной последовательности гена ХК Р. зПріз (Такама и др., 1991). Амплифицированньй ген ХК сначала клонировали и хранили в плазмиде руОсС19. Затем клонированньй ген ХК сливали с различньіми промоторами, в том числе промоторами гена ТКР5 дрожжей (Залкин и Яновский, 7/5 1982) и гена алкогольдегидрогеназь І (АОС) дрожжей (Айнмерер, 1983; Бенетцен и Холл, 1982).

Ген ХО, использованньій в исследованиях заявителей, также клонировали из Р. зПрнз при помощи РСК.

Олигонуклеотидьі, необходимье для амплификации ХО из хромосомной ДНК Ріспіа, синтезировали в соответствии с опубликованной последовательностью гена ХО Ріспіа (Кеттер и др., 1990). Амплифицированньй ген Х также сначала клонировали и хранили в рИОС19. Затем зтот ген последовательно сливали с 2о гликолитическими промоторами гена пируваткиназь (РУК) дрожжей (Бурке и др., 1983) и геном глицеральдегид-3-фосфодегидрогеназь (зро) дрожжей (Холланд и Холланд, 1979).

Заявители клонировали три различньїх гена ХК из 5. сегемівіае (Хо и Чанг, 1989), Р. їаппорпПиз (Стевис и др., 1987) и Е. соїЇ и установили, что все три гена могут зффективно зкспрессироваться в 5. сегемівіае после слияния с дрожжевь!м вьісокозффективньім промотором. В иллюстративной работе, представленной здесь, с Мспользовали клонированньїй ген ксилулокиназь! З. сегемівіае. Для правильного слияния гена ХК дрожжей с подходящим промотором, проанализировали полную нуклеотидную последовательность гена ХК 5. сегемівіає. в і) том числе его 5- и 3-некодирующую последовательность и она представлена на фиг. 2.

Большое разнообразие промоторов пригодно для применения в зтом изобретении. Вообще говоря, следует применять совместимье с дрожжами промоторь, способнье регулировать транскрипцию генов ХК, ХО или ХК. У зо Такие промоторь доступнь из многих известньйх источников, в том числе дрожжей, бактерий и других клеточньх источников. Предпочтительно, промоторьі, применяемьсе в зтом изобретенийи, должнь! бьіть зффективньми, не с ингибируемьми глюкозой, не требующими для индукции ксилозьі. В зтом отношений, термин "зффективньй" «- промотор, используемьйй в данном описаний, относится к промотору, обеспечивающему вьісокий уровень транскрипции слитого гена. Промоторь!ї с такими характеристиками также широко доступньї, и их применение в со з5 данном изобретении, согласно изложенньім здесь обьяснениям, будет находиться в компетенции специалиста с «г обьічной квалификацией, так же как и слияние промоторов с генами ХК, ХО и ХК, клонирование продуктов слияния промотор/ген в подходящих векторах и применение зтих векторов для трансформации дрожжей. Все зти манипулирования могут бьіть вьіполненьі при помощи общепринятьїх методов генной инженерии, хорошо известньх в зтой области и в литературе. «

Более конкретно, в иллюстративной работе, описьіваемой здесь, ген ХК ксилулокиназьі дрожжей сливали сота) с промоторами из алкогольдегидрогеназьь (АЮОСІ) дрожжей, гена пируваткиназьі (РУИК) дрожжей, гена ТКР5 . дрожжей и т.д. ХК, слитьій с промотором ТКР5Б, применяли для конструирования рі МН2І1 (фиг. 5), а ХК, слитьй с и?» промотором РУК, применяли для конструирования РІ МНЗЗ (фиг. 7).

Слияние генов ХК, ХО, и ХК с интактньмми промоторами из АОСІ, РУК, СРО, и т.д. вбіполняли клонированием

Как фрагмента, содержащего специфический промотор, так и структурного гена ХК, ХО, и ХК на одной из їх плазмид Вінпезстірі К5 (Стратаген, Ла Джола, Калифорния), с последующим удалением нежелательньмх (лишних) нуклеотидов сайт-специфическим мутагенезом (Кункель и др., 1987). Таким образом, изобретение обеспечиваеєт со также получение нескольких производньїх рВіцевсгірі І К5(-з (именуемьх далее ркКа(-)), содержащих - клонированньй ХО (слитьіїй с" промотором пируватгидрогеназь), ХК (слитьій с промотором АОСІ), и ХК (слитьй 5р б промотором пируваткиназь!)). Зти рекомбинантнье плазмидьі! обозначеньі как рке(-3 КО-АК (или А"К) -КК. о Четьре такие плазмидь! бьіли сконструированьі, как представлено в общих чертах на фиг. 9. Зти плазмидь сп имеют сходнье, но не идентичнье структурьі. ХК, ХО, и ХК (или КО-АК (или А"К) -КК), клонированнье на зтих плазмидах, могут бьіть отделеньї от исходной плазмидь! рк5(-) расщеплением одной рестрикционной Хпої

Геньі ХК, ХО, и ХК, слитье с подходящими промоторами, клонировали затем на рі5К15 (фиг. З) или ов рОСКтіо (фиг. 4). РІЗК15, производное рі-Х1о - 14 (Стевис и Хо, 1985), представляєт собой низкокопийную плазмиду с числом копий приблизительно, 10 в дрожжах (5. сегемівіае). Она содержит репликон 2у дрожжей, іФ) которьій позволяет зтой плазмиде автономно реплицироваться в 5. сегемізІае и близкородственньїх видах. ко РІ ЗК15 содержит таюке ген устойчивости к генетицину (канамицину) (Кт) и ген устойчивости к ампициллину (Ар и таюке атр/), которне служат в качестве селективньїх маркеров в 5. сегемізіае и других дрожжах. РІ З5К15 60 содержит также ген ХК, слитьій с дрожжевьм промотором ТКР5. Таким образом, геньі ХК и ХО, слитье с подходящими 5'-некодирующими последовательностями, содержащими подходящие промоторь, встраивали в р 5КІ5, для демонстрации воздействия полученньїх плазмид на сбраживание ксилозьї дрожжами. Для сравнения влияния присутствия различньїх генов на сбраживание ксилозьї дрожжами, плазмиду, содержащую только ХК и ХО, применяли для трансформации 5. сегемізІдае и полученнье дрожжи использовали для 65 сравнительного сбраживания. Результатьі сбраживания ксилозьї немодифицированньмми генной инженерией дрожжами 5. сегемізІае. дрожжами, содержащими клонированнье ХК, ХО, и ХК (ЗС(рі МН21)) и дрожжами,

содержащими клонированньсе ХК, ХО, но не ХК гень (ЗС(рі МН13 - 32)), показань! на фиг. бА, 68, и 6.

РОСсКт?!10 представляет собой мультикопийную плазмиду (т.е. плазмиду с числом копий, приблизительно, 50 и более) с числом копий до 100 в 5. сегемізіае РОСКт10 является производной от риСе, содержащей идентичньй репликон 2щ и геньі Кт Ки Ар", присутствующие в рі З5К15. Зти специфические фрагментьї ДНК служат в качестве репликона и маркеров для отбора (селективньїх маркеров), которне позволяют плазмиде автономно реплицироваться в 5. сегемізІдае (и в родственньїх дрожжах), а также позволяют отличить трансформанть! дрожжей, содержащие зту плазмиду, от нетрансформированньмх клеток-хозяев.

Заявители сконструировали рекомбинантнье плазмидь! на основе рОСКтт?!10, содержащие те же самье гень 70 ХК, ХО и ХК, слитье с подходящими 5-некоюодирующими последовательностями, содержащими подходящие промоторь. Зти векторьї предназначеньь для трансформации всех штаммов 5. сегемівіде и штаммов родственньїх видов. Не требуются специальнье мутанть! в качестве реципиентньїх штаммов. Таким образом, такие плазмидьі, как ріМНЗЗ (фиг. 7), а также рі/МН21 (фиг. 5), можно применять для трансформации промьішленньїх дрожжей 5. сегемізіІае и других штаммов.

Трансформацию дрожжей производньми рі 5К15, либо рОСКтт0 проводили злектропорацией по методу, описанному Беккером и Гуарентом (1991). Аутентичнье дрожжевье трансформантьї, содержащие производнье різК15 или руСКт!10, вьіделяли, как описано далее. Кт В. присутствующий в зтих плазмидах, служил в качестве первичного селективного маркера, которьій наделяет любье клетки-хозяева, получающие одну из зтих плазмид, устойчивостью к гораздо более вьісокой концентрации генетицина, присутствующего в среде. Однако, некоторне дрожжевье клетки можно индуцировать для приобретения устойчивости к такому же уровню генетицина, которьій переносят трансформантьі, содержащие зти плазмидьі. Позтому не всякая устойчивая к генетицину колония является истинньім трансформантом. Сообщалось, что Ар " может бьть зкспрессирован в

З. Сегемівіає, но 5. сегемівІде устойчив к ампициллину без присутствия Ар М. Таким образом, Ар" не может служить в качестве селективного маркера для опосредуемой плазмидами трансформации дрожжей. Тем не с 29 менеє, дрожжи, содержащие вьсокозкспрессируемьшй Ар", будут продуцировать достаточное количество Ге) пенициллиназьь и обеспечивать возможность идентификации колоний, содержащих такие дрожжи, на специальньх чашках с твердой средой при помощи теста на пенициллиназу (Шевалье и Зйгле, 1979).

Последний тест обеспечивал способ идентификации истинньїх трансформантов 5. сегемізіае и других дрожжей среди устойчивьїх к генетицину колоний. юю

Сбраживание ксилозьі (или ксилозьі и глюкозьї) проводили с применением рекомбинантньх дрожжей по су данному изобретению при аназробньїх условиях, как описано в примерах 6 - 9. Потребление Сахаров (ксилозь и глюкозьї) и образование зтанола и других продуктов, таких как ксилит, контролировали во время сбраживания - посредством отбора проб и анализа их при помощи НРІ С, как описано далее в примере 6. с

Например, рі МН21 (фиг. 5) использовали, для трансформации 5. сегемізІае. Полученньій трансформант, содержащий рі МН21, обозначали ЗС(рі МН2І1) и он мог сбраживать 595-ю ксилозу почти полностью до зтанола в З течение 2 - 4 дней, как показано на фиг. бА.

В качестве дополнительного примера, ріМНЗЗ (фиг. 7) использовали для трансформации дрожжевого штамма 1400, которьій близкородственен 5. сегемізІае и обладаєт вьсокой устойчивостью к спирту и « температуре (Демур и др., 1989; Демур, 1990). Полученнье генетическим конструированием дрожжи, - 70 обозначеннье индексом 1400 (РІ МНЗЗ3), могут сбраживать 1095-ю глюкозу и 596-ю ксилозу полностью до зтанола с в течение 2 - 4 дней, не требуя вьісокой плотности клеток, как показано на фиг. 8А и 88. з» РІМНЗЗ в отношений сбраживания ксилозьії является более зффективной плазмидой, чем рі МН, т.к. представляет собой мультикопийную плазмиду более вьісокого уровня. Кроме того, ХК в рі МНЗЗ слит с более зффективньм промотором, чем ХК в ріМН21. 5. сегемізІае трансформировали также плазмидой рі МНЗ3, обозначенной ЗС(рі МНЗ3). Хотя ЗС(рі МНЗ3) гораздо более зффективна при сбраживаний ксилозь! или смесей ве ксилозь!ї и глюкозьі, чем ЗС(рі МН21), бьіло обнаружено, что 1400 (рі МНЗ3) при сбраживании смесей глюкозь и (ее) ксилозьії превосходит ЗС(РІ МНЗ3). Таким образом, отдельнье штаммь!ї влияют на зффективность сбраживания.

Подобно 5. сегемізіІае. не модифицированньій методами генной инженерии штамм 1400 не может использовать - или сбраживать ксилозу (одну или в смеси глюкозь и ксилозьї), как показано на фиг. 88. ка 250 В общем, результать! зтих проб на сбраживание демонстрируют, что необходимо, чтобь! дрожжи содержали три введенньїх гена, ХК, ХО и ХК, должньім образом слитьїх с подходящими промоторами (предпочтительно, сл зффективньми гликолитическими или иньіми промоторами, которье не ингибируются глюкозой и не требуют ксилозьі для индукции) и координировано зкспрессировали зти геньї, наделяя дрожжи способностью сбраживать ксилозу только до зтанола, а не других побочньїх продуктов, таких, например, как ксилит.

Далее, результатьї демонстрируют важность клонирования гена ксилулокиназь (ХК) в дополнениек ХК и ХО,

ГФ) для того, чтобьї заставить дрожжи зффективно сбраживать ксилозу, в частности, одновременно сбраживать как юю глюкозу, так и ксилозу при их присутствиий в одной и той же среде, такой, например, как гидролизать целлюлозной биомассь. Подобно ХК и ХО, клонированньій ген ХК должен бьїть, предпочтительно, слит с подходящим зффективньм гликолитическим или иньім промотором, которьій не ингибируется глюкозой и не 60 требует ксилозьї для индукции.

Заявители установили также, что дрожжи, содержащие лишь клонированнье гень ХК и ХО, могут сбраживать до зтанола только глюкозу, но не ксилозу при одновременном присутствии в культурной среде обоих зтих Сахаров (см. фиг. 13). Кроме того, результать! заявителей показьивают, что любье дрожжи, в том числе и сбраживающие ксилозу, например, Р. зірінз и С. зпІнай(ае. должнь! содержать геньї ХК, ХО и ХК, слитье 69 с промоторами, которье не ингибируются присутствием глюкозьі и не требуют применения ксилозь! для индукции, чтобьі обладать способностью сбраживать как глюкозу, так и ксилозу до зтанола в случае одновременного присутствия обоих зтих сахаров в культурной среде. фиг. 13 показьвваєт, что 5. сегемівіае и родственнье видь, содержащие только клонированнье геньі ХК и ХО, слитье с соответствующими

Ппромоторами, могут сбраживать до зтанола только глюкозу, но не ксилозу, в случае присутствия обоих зтих сахаров в культурной среде. Подобньм образом, фиг. 14 показьшвает, что не модифицированнье методами генной инженериий дрожжи Р. З ПрІїв5. содержащие свой собственнье геньі ХК, ХО, и ХК, могут сбраживать ксилозу в том случае, когда зтот сахар является единственньім источником углерода в среде (результать! не показань), но они не могут сбраживать ксилозу, в том случаеє, когда в одной и той же среде в качестве 7/0 источника углерода одновременно присутствуют как глюкоза, так и ксилоза.

Следует понимать, что в случае дрожжей, обладающих низкими уровнями ксилулокиназной активности, введение гена ХК служит двум целям. Одна из них состоит в повьішений уровня активности фермента. Вьісокие уровни активности ХК важнь! для преимущественного сбраживания до зтанола ксилозьі, в противоположность ксилиту. Другая цель состоит в том, чтобьі поместить зтот ген под контроль зффективного промотора, которьй /5 не должен иингибироваться присутствием глюкозь. Хорошо известно, что природнье натуральнье микроорганизмь!, в том числе дрожжи, не могут использовать другие сахара для роста и сбраживания, если в культурной среде присутствует глюкоза. Глюкоза будет ингибировать синтез ферментов, необходимьїх для метаболизации молекул других сахаров (так назьіваемьй "глюкозньій" зффект). Позтому промоторь! из генов для синтеза ферментов, метаболизирующих молекульь Сахаров, за исключением глюкозь), не являются 2о предпочтительньми, поскольку они не будут обеспечивать одновременного сбраживания двух основньх сахаров. Кроме того, работой заявителей бьіло установлено, что рост клеток также является необходимьм условием для индукции. Таким образом, промоторь), требующие присутствия ксилозьі для индукции, не пригодньї для зкспрессии ХК, ХО или ХК.

Для облегчения дальнейшего понимания данного изобретения и его преимуществ дань! следующие далее с 2г5 примерь. Следует понимать, что зти примерь, по своей природе, являются иллюстративньми и не ограничивают обьем изобретения. і)

Пример 1

Синтез генов ХК и ХО при помощи РСК

Синтез. интактного или не содержащего промотора гена ХК при помощи РСК бьл описан ранее (Чен и Хо, ю зо 1993). Для синтеза ХО при помощи РСК синтезировали, в соответствий с нуклеотидной последовательностью

ХО (Кеттер и др., 1990) три олигонуклеотида, представленнье ниже: с

Олигонуклеотид І: РГСТАСАССАСССТААСТСО «-

Олигонуклеотид ІІ: РСАСАСААТТААААТОА

Олигонуклеотид П: роОбАТССАСТАТАСТСОАДО со

Олигонуклеотидь! | и ІЇ применяли для синтеза интактного гена ХО, а олигонуклеотидьі ІЇ и ЇЇ применяли для «Е синтеза, не содержащего промотора ХО, как показано на фиг. 10. Вначале интактньій ген ХО и не содержащий промотора ген ХО клонировали в плазмиде рК5(-). Затем интактньій ХО субклонировали на рОоСКтт?0 (фиг. 4) и полученную плазмиду рОСКт10-ХО использовали для трансформации 5. сегемізІае злектропорацией, как описано в примере 5. Трансформантьь дрожжей использовали для определения ксилитдегидрогеназной « 70 активности, чтобь! показать, что клонированньй ген является интактньм и может зкспрессироваться в з. в с сегемівіає.

Пример 2 ;» Слияние не содержащего промотора гена ХО с промотором гена пируваткиназьі дрожжей

Слияние гена ХО с РрК бьло вьібрано для иллюстрации точного слияния метаболизирующих ксилозу генов с

Мнтактньми промоторами при помощи сайт-направленного мутагенеза. Зтими промоторами являются либо ї5» гликолитические промоторьі, либо промоторьі, которье не ингибируются присутствием глюкозьі в культурной среде и не требуют присутствия ксилозь! для индукции. со Фрагмент промотора пируваткиназь! дрожжей от -910 до 23 (Бурке и др., 1983) синтезировали при помощи - РСК, как описано в примере 1 для синтеза гена ХО. Как фрагмент РркК, так и не содержащий промотора ген ХО субклонировали на плазмиде рКкз(-) и нежелательнье нуклеотидь! между РрК и интактньмм структурньїм геном ю ХО удаляли сайт-специфическим мутагенезом по методу Кункеля (Кипкеї, 1987). Полученньій слитьїй ген сп содержит фрагмент от -910 до -1 промотора из гена пируваткиназьй и нуклеотид от ї-1 до 1963 из гена ХО

Ріснпіа. Полученную плазмиду рке(-), содержащую РркК-хо (или КО) обозначили как рк(-) -КО или рКО2.

Пример З 5Б Анализ нуклеотидной последовательности гена ксилулокиназь! дрожжей

О клонированиий фрагмента дрожжевой ДНК (5. сегемівІае) 7,0 т.п.н., содержащего ген ксилулокиназь

Ф) дрожжей, сообщалось ранее (Хо и Чанг, 1989). Посредством субклонирования ген ХК помещали, на фрагмент ка 2,4 т.п.н. Последовательность нуклеотидов фрагмента 2,4 т.п.н. била подвергнута анализу. 5'-некодирующий участок содержит 345 нуклеотидов, транслируемьй участок содержит 2118 нуклеотидов, кодируемая геном ХК, бо имеет 591 аминокислоту, как показано на фиг. 2. Стратегия, примененная для секвенирования гена ХК, показана на фиг. 11.

Пример 4

Конструирование интактного промотора АОСІ

Плазмида рМАБб (Аммерер, 1983) содержит промотор дрожжевой алкогольдегидрогеназь ! (Радосі)- 65 Заявители использовали в работе зтот промотор для модификации некоторьх генов. Р досі біл слит с ХК и полученньїй ген бьіл обозначен как РдрсІ-ХК или АК. Тем не менее, зтот Рдрсі не является интактньім и не содержит нуклеотидь от -1 до -14 интактного промотора АОСІ (Бенетцен и Холл, 1982). Участок гена от -1 до -14, обьічно очень важен для регуляции синтеза белка. Любой ген, слитьій с таким промотором, должен полагаться на его первоначальньй генетический сигнал для регуляции синтеза белкового продукта.

Для лучшей регуляции зкспрессии зтого гена, слитого с промотором АОСІ, заявители использовали сайт-специфический мутагенез для добавления отсутствующих нуклеотидов (от -1 до -14) к промотору АОСІ, клонированному на рМАБб. Новьій интактньй промотор АЮСІ бьл обозначен, как Р"дрсі- Зтот промотор использовали для модификации ХК и полученньй ген бьіл назван Р"дрсІ-ХК или АК.

Пример 5 70 Конструирование плазмидь рі МН21 (также обозначенной как рі ЗК15-КО-АК) и трансформация 5. Сегемівіае и штамма 1400 плазмидой рі МН21

Конструирование рі МН21 представлено в общем виде на фиг. 12. рі МН21 применяли для трансформации 5. сегемізІае и штамма - 1400 злектропорацией при следующих условиях. 5О0мл дрожжевьїх клеток, вьиіращенньх до ранней логарифмической фазьї роста (Кіей Оп (КО) (единиць! Клетта, КЕ) 130)), центрифугировали для /5 удаления средьі, промьівали"щваждь! холодной водой, один раз холодньім 1М сорбитом и суспендировали в 200мкл 1М сорбита. бОомкл зтих клеток переносили в предварительно стерилизованную пластиковую пробирку на 4мл (с крьішкой), к которой добавляли 0,1 - їмкг плазмидной ДНК. 5Омкл полученньїх клеток и плазмидную смесь пипетировали в предварительно охлажденную кювету генного импульсного генератора с промежутком между злектродами 0,2см и содержимое в кювете подвергали действию импульсов генного импульсного 2о генератора с импульсньім контроллером (ВіоКад) при 2,0кВ, 25мкФ, 200Ом.

В кювету сразу же добавили О,5мл МЕРО (195 дрожжевой зкстракт, 295 пептон, 2906 глюкоза). Содержимое кюветь! переносили в новую стерилизованную пластиковую пробирку на 4мл и инкубировали при З30"С в течение 1 часа. 10О0мкл клеток вьісевали в чашки с агаром, содержащие ХЕРО и ЗОмкг/мл 5418 (генетицина). Бьістро растущие колонийи отбирали и перепечатьівали на другую чашку, содержащую ту же самую среду. Отобраннье с ов Колонии подвергали пробе на ампициллин (Шевалье и Зийгле, 1979), пока не идентифицировали положительную колонию. Описанньй вьше способ злектропорации основан на способе, сособщенном Беккером и Гуарентом і) (1971). Наш способ отбора устойчивьх к (3418 трансформантов очень зффективен, и большая часть отобранньїх колоний, перепечатанньх на чашки, содержащие МЕРО с 5Омкг/мл 5418, дала положительньй результат при постановке пробьї на пенициллиназу. ю зо Трансформацию штамма 1400 плазмидой рі МН21 или другими плазмидами проводили по методу, сходному с вьішеописанньім, за исключением того, что зти клетки вьіращивали не до 130, а до 140 - 190 КЕ, и чашки с с

ЖЕРО для первичного отбора трансформантов после злектропорации содержали не 50, а 40мкг/мл генетицина - де (9418). Трансформация штамма 1400 по вьшеописанному методу бьла не такой зффективной, как трансформация 5. сегемівіає. со

Пример 6 «Е

Сбраживание ксилозьі сконструированньми дрожжами ЗзС(рімМна2г1), зС(рі МН13-32), и не модифицированньїми методами генной инженерийи исходньми дрожжами 5. сегемівіае

Зти три штамма дрожжей культивировали на обогащенной среде ХЕРО азробно при идентичньїх условиях (ЗС(ріМнН 13-32) конструировали трансформацией 5. сегемізІіае плазмидой рі МНІ13-32, содержащей только « комбинации геньі ХК и ХО промотор). Затем зти дрожжевьсе клетки использовали для сбраживания 590 кКсСИлЛОзьЬІ па) с на среде МЕР (195 дрожжевой зкстракт, 295 пептон) аназробно при идентичньїх условиях. Потребление ксилозь! и образование зтанола и ксилита прослеживали во время сбраживания путем отбора проб через определеннье ;» промежутки времени и анализа их при помощи НРІ С при следующих условиях.

Пробьї, содержащие бродильньй бульон (0,бмл - 1,Омл), отбирали из культур и хранили в 1,5мл пробирках Зппендорфа. Клетки и другие остатки сначала удаляли центрифугированием. Затем супернатант фильтровали їх с применением стерильньїх азродисковьїх (СеІтап Зсіепсев), 0,2 или 045мм, фильтр-насадок для шприцев.

Полученньій фильтрат из каждой пробьї анализировали на содержание зтанола, глюкозь, ксилозь! и ксилита при со помощи жидкостной хроматографии вьісокого разрешения (НРІС, ЖХВР) с применением системь! Нігасні! в - соответствии со следующими условиями. єКолонка: Атіпех НРХ-87С, 300 х 7.вмм де єПодвижная фаза: вода сп єРасход: О,8мл/мин єДетектирование: детектор НіІгасні І -3350 КІ єТемпература: 807"С єОбьем нанесения: 20мкл

Результатьї, представленньсе на фиг. бА, 68, и 6С (пики зтанола на зтих и других рисунках на самом деле в (Ф, 2,5 раза меньше, чем они должнь! бьть, из-за чувствительности прибора), показьивают, что только ка сконструированнье дрожжи ЗС(РІ МН21), содержащие клонированньюе геньі ХК, ХО и ХК, могут сбраживать вьісокие концентрации ксилозьі (590) до зтанола, чего не могут делать неийизмененнье методами генной бо инженерии исходнье дрожжи 5. сегемівІае. а таюке сконструированнье ЗС(рІМН 13-32), которьіе содержат только клонированньсе ХК и ХО и не содержат ХК. ЗС(рі МНІ13) сбраживаєт ксилозу, в основном, до ксилита.

Пример 8

Зффективное сбраживание вьісоких концентраций глюкозьї и ксилозьї дрожжами 1400 (рі МНЗ3) до зтанола

Смесь глюкозь и ксилозь! (приблизительно 1095 глюкозь! и 5905 ксилозьї) сбраживалась при помощи штаммов 65 1400 и 1400 (рі МНЗЗ3) при идентичньїх условиях. Зти дрожжи хранили на чашках с агаром, содержащим подходящие Средь, и инокулировали непосредственно из чашек с агаром в 5Хбмл среду ХЕРО (1956 дрожжевой зкстракт, 2956 пептон, 296 глюкоза) в колбе Зрленмейера на 250мл, имеющей боковое плечо, позволяющее непосредственно наблюдать рост культур дрожжей при помощи колориметра Клетта. Культурьі инкубировали на качалке при З0"С и 200об/мин при азробньїх условиях.

Когда клетки достигали плотности клеток средней логарифмической фазь! роста (400 единиц Клетта), в каждую колбу добавляли 12, мл (4095) глюкозь! и 6,25мл (40905) ксилозьі. После основательного смешивания мл культурной смеси отбирали из колбьі, как пробу при времени 0. Затем колбу герметизировали при помощи обертки Загап для аназробного сбраживания. Тмл пробь! бродильного бульона (с некоторьім количеством клеток) отбирали через определеннье промежутки времени (каждье 24 часа) для использования в качестве 7/0 проб для измерения содержания сахара и зтанола в бульоне во время брожения. Содержание зтанола, глюкозь и ксилита в пробах анализировали при помощи НРІ С, как описано в примере 6. Результатьї, представленнье на фиг. 8А - 88, показьівают, что созданнье методами генной инженерии дрожжи 1400 (рі МНЗ3) могут сбраживать 1095 глюкозу и 595 ксилозу до зтанола одновременно в течение 2 - 4 дней, не нуждаясь в вьісОКОой плотности клеток. С другой стороньі, исходньій штамм 140Омог превращать в зтанол только глюкозу, но не ксилозу. 7/5 Сбраживание проводили при нормальньх условиях, без специальной средь, специального рН и без необходимости роста дрожжей до достижения вьісокой плотности клеток. Таким образом, генетически сконструированнье дрожжи 1400 (рі МНЗ3), содержащие геньі ХК, ХО, и ХК, слитье с гликолитическими промоторами и клонированнье на мультикопийной плазмиде руОСКт?!10, могут одновременно сбраживать вьісокие концентрации как глюкозь), так и ксилозьії до зтанола в течение 2 - 4 дней с образованием очень 2о Ннебольшого количества ксилита в качестве побочного продукта.

Пример 9

Пробное сбраживание ксилозьі/глюкозьї с помощью сконструированньїх дрожжей ЗС(рі МН 13-32) Повторяли процедуру сбраживания примера 8, за исключением того, что в качестве сбраживающего организма использовали 5. сегемізІае ЗС(рі МН13-32), содержащий только геньі ХК и ХО). Результатьі, представленнье на сч г фиг. 13, показьівают, что такие полученнье методами генной инженерийи дрожжи, содержащие только геньі ХК и

ХО, могут сбраживать только глюкозу, но не ксилозу, в случае присутствия обоих Сахаров в сбраживаемой і) среде.

Пример 10

Пробное сбраживание ксилозьиглюкозьі с помощью не модифицированньх методами генной инженерий мМ зо дрожжей

Повторяли процедуру сбраживания примера 8, за исключением того, что в качестве сбраживающего с организма использовали не модифицированньй методами генной инженериий микроорганизм Рісніа вИрків. - пе

Пробьї бродильного бульона анализировали посредством НРІ С после сбраживания в течение (І) 0 дней, (ІІ) З дней и (І) 5 дней. Результатьї, представленнье на фиг. 14, показьшвают, что Р. зПрнв могут сбраживать со з5 только глюкозу, но не ксилозу, в случає присутствия обоих сахаров в одной и той же среде. «г

Хотя изобретение бьіло проиллюстрировано рисунками и подробно описано в предшествующем описаний, и то и другое следует рассматривать как иллюстративньй, но не ограничивающий обьема изобретения материал.

При зтом следует понимать, что показань! и описань! только предпочтительнье варианть! осуществления, и что все изменения и модификации, входящие в обьем изобретения, следует считать защшищенньми. «

Ссьілки з с Следующие ссьлки, в определах, в которьїх они обеспечивают методические или инье детали,

Й дополнительньсе к изложенньїм здесь, специально включень! здесь в виде ссьлок. и?» Аттвегег, С., "Ехргезвіоп ої депез Іп уеаві изіпд (пе АОСІ ргоотоїег", Меїпоавз Іп Епгутої. 101, 192 - 201 (1983).

Атоге, К., М. УМІНе!т, апа С. Р. НоїПепрегдо, "Те Тептепіайоп ої хуїозе: Ап апаїувзів ої (Ше ехргезвіоп ої ВасШив апа АсіІпоріапез хуїозе Ізвотегазе депез Іп уеаз", Аррі. Місгобріо!. ВіІогесппої!., 30(4), 351 - 357 (1989). їх ВесКег, О., апа ЇЇ. Спцагепівє, "Нідп ейісіепсу ігапеїогптайоп ої уеаві ру еїІесігорогайоп", Меїйпоадв Іп

Епгутої. 194, 182 - 186 (1991). со Веппеїгеп, 9У. Її. апа В. 0. НаїЇ, "Тйе ргітагу вігисіцге ої (Ше басспаготусевз сегемівІае депе ог аїЇсопої - депудгодепазе 1," У). Віої. Спет., 257(6.), 3018 - 3025 (1982).

ВигКе, К. Г.,Р. Текатр-ОЇІвоп, апа К. Маїйіагіап, "Те Ізоїайоп, апа зедцепсе ої (Ше ругима(їе Кіпазе депе ю | Засспаготусез сігімівіає," 9. ВіІоЇ. Спет. 250(4) 2193 - 2201 (1983). сп Спапо, 5... апа М.М. Но, "Сіопіпд (Пйе уеавзі хуїшШоКІпазе депе їог (Ше Ітргометепі ої хуозе

Теппепіайоп." Аррі. Віоспет Віогеснпої. 17, 313 - 318 (1988).

Спеп, 2пепддао, апа М.М. Но, "Сіопіпд апа Ітргоміпд їШйте ехргезвіоп ої Ріспіа вірне хуозе гедисіазе дв Чепе Іп Засспаготусез сегемівіае," Аррі. Віоспет. Віогеспао)|., 39 - 40, 135 - 147 (1993).

СпемаШег, М. КК. апа М. Аїдіеє, "Оцаїйанме десеснцоп ої репісіШпазе ргодисей ру уеаві звігаІп5

Ф) саггу!пд спіІтегіс уеавзі-сої! ріазтіавз," РЕВЗ І еЧЦегв, 108(1) 179 - 184 (1979). ка Спіапо, І-С, Н-М. Нвіао, Р. Р. Оепо, І-Р. Спет, апа с. Т. Твао. "ЕЄ(апо! ргодисЦоп їйот хуозе Бу епгутіс ІзотегігаЦоп апа уеаві ТеппепіайЙоп," ВіІогеснпої. Вісепо., 11, 263 - 274 (1981). во СШАтоге, С. 0О., І. КиззеїЇ, апа С. С. е(емагії, "ЗеіесйПоп апа орітігайоп ої уеазі зиМаріе їтог еїйапої ргодисЦоп аї 40"С," Епг. Місгобіої. Тесппої., 11, 411 (1989).

СШАтоге, Т., С. у. РапснаїЇ, І. КиввеїЇ, апа (5.0. Бема, "А вішду ої еф(Шйапо! ісіегапсе Іп о уеєавзб;

СтШсаї! Кеміемув," Віогеснппо)Ї., 9, 287 (1990).

Оепа, Х. Х. апа М.МУ.М. Но, "ХуїшоКіІпазе асіИмну Іп магіоиз уеавів ІпсіцаІпд Засспаготусевз сегемівіае 65 сопіа|Іпіпд (пе сіопейд хуІшоКІпазе депе," Аррі. Оіоспет. Віоїеснпої., 24 - 25, 193 (1990).

ОиРгеел, 9. С. апа 9. Р. мап дег УУаїб "Регтепіайоп ої ЮО-хуїозе (о еф(Шапо! ру а вігаїп Бу Сапаїда зпепайае," Віогесппої. І ек., 5, 357 - 362 (1983).

СгооЦеп, О.К.)., К.С.).М. мап дег Іапз, апа К. СпП.А.М. І уреп, "ЕПесів ої (Ше аегайоп гаїе оп (пе

ТеппепіайНоп ої діосозе апа хуїозе Бу Рісніа віршів СВБ 5773, Епгуте Містгоб. Тесппо)., 12, 20 - 23 (1990).

НаїЇрогп, 3., М. УУангіавззоп, ОО. АїІгаквіпеп, Н. Оіато, В. Напп-Надегааі, М. Репціа, апа 5. Кегапеп, "ХуШої! ргодисіЦоп Бу гесотріпапі Засспаготусез сегемівіає, Віо./Тесппо)ї., 9, 1090 (1991).

Но, М.МУ.М., апа 5-Р. Спапо, "Сіопіпуд ої уеазі хуїшоКІпазе депе Бу соптріетепіацйоп ої Е. соїЇ апа уеаві тиацопв, Епгуте Місгоб. Тесппої., 11, 417 (1989).

Но, ММУ/М., Р. Біемів, 5. НозептеЇд, 9. У. Ниапод, апа с. Т. Твао, "Ехргезвіоп ої Е. сої! хуїозе Івотегазе 7/0 Зепе Бу а уеаві рготогїег," Віоїесппоіоду апа Віоепдіпегіпд Зутровішт, Мо. 13, 245 - 250 (1983).

Ноїїапа, 9. Р. апа М. 9. НоПапа, "Те ргітагу вігисішге ої а діусегаідепуде-3-рпозрпайе адаепуадгодепазе депе їот Засспаготусез сегемівіає," У. ВІоЇ. Спет. 253(19) 9839 - 9845 (1979).

Уейтгіев, Т. МУ., "ЕтегаІпд Їесппоіоду Тог Теппепіїпо О-хуїозе: Тгепаз Іп Біотесппоіоду З(8), 208 - 212 (1985).

Уейпев, Т. МУ. "ОШИ2анцоп ої охуозе ру расіега, уеавзів, апа по!" Айм. Іп о Віоспет. ЕпоГ. 7/5 Віоїеснпої. 27, 1 - 32 (1983).

Кцецег, Р., К. Атоге, С. Р. НоПепрегд, апа М. Сігіасу, "Івоїайоп апа спагасіегігайоп ої (Пе Рісніа зПріїв хуїйо! депудгоодепазе депе, ХУ12, апа сопвігисЦоп ої а хуозе-ШШІ2Іпд Зассппготусевз сегемівіае ігапатогтапі," Сигт. Сепеї., 18, 493 - 500 (1990).

Кцецег, Р. апа М. Сігіасу, "Хуовзе Теппепіайоп Бу бЗасспаготусевз сегемівіае Аррі. МісгобіоїЇ. Віоїесппо)., 38, 776 - 783 (1993).

КипКкеії, Т. А., У. Р. Кобрегів, апа ейпісіепі 5Не-зресмс тшадепевзів м/йпоші рпепоїуріс зеїІесЦоп,"

Меїнодз Епгутої, 154, 367 - 382 (1987).

Гавнск, 5., М. М. ТисКкег, У. К. Веуей, с. МК. МоїЇ, апа К. ОгоПтапп. "ЗітиМапеоивз Тегтепіайоп апа

Івотегіг2анНоп ої хуїовзе ю еПпапої "Аррі. Місгобіої. Віоїесппо)!., 30, 574 - 579 (1989). сч

Козепієїй, 5., Р. 5іемів, апа М.М/.М. Но, "Сіопіпд апа спагасіегігайоп ої (Ше ху! депез їйот БЕ. сої"

Мої. Сеп. Сепейсв, 194, 410 - 415 (1984)3/ і) зайву, А. М., еї аїЇ.,, "Ехргезвіоп ої (Ше Є. сої! хуїозе Ізотегазе депе Іп 5, сегемізіае, Аррі. Епмігоп.

Місгорб., 53, 1996 - 2000 (1987).

Зіемів, Р. А., У. У. Ниапо, М.МУ.М. Но, "Сіопіпу ої (Ше распузоїеп іаппорпн5 хуїшіоКіпазе депе БУ зо зо ботріетепіайноп Іп Евспегісніа сої!" Аррі Епмігоп. Місго.(53) 1, 2975 - 2977 (1987).

Зіемів, Р. А. апа М.МУ.М. Но, "ОмегргодиснПоп ої О-хуїозе Ізотегазе Іп Е. соїЇ Бу Сіопіпд (Ше ЮО-хуозе с

Івоїпегазе депе", Еплуте Місгор. Тесппої., Мої. 7, рр. 592 - 596 (1985). «-

Зігаззег, АМУ.М., С. Р. НоПепрего, М. Сігпасу, Р. КцецЦег, К. Атоге, М. РіопіеК, апа у. Надедопт, "Сіопіпд ої уеавзі хуїозе гедисіазе апа хушої! депудгодепазе депез апа (Пеїг изе," Сегтап раїепі арріїсайоп (1990). со

ТаКита, 5., М. МпКазпіІта, М. ТапігипоКіІ), 5. КіпозпМа, Н. ОКада, Т. ЗекКкіІ, апа Т. МовзпІда, "Івоїайоп ої «Е хуїозе гедисіазе депе ої Ріспіа вПрнів апа 8 ехргезвіоп Іп Засспаготусевз сегемівіае, "Аррі. Віоспет.

Віогеснпої., 27-28, 327 (1991).

Тоїмоїа, А., О. Матому, Е. мап деп Возсп, У. Р. мап ОііКеп, апа МУ. А. ЗспейПегв. "АІсопоїЇс Теппепіайоп ої О-хуїозе ру уеавів," Аррі. Епмігоп. Місгобіо!., 47(6), 5 1221 - 1223 (1984). «

ММПйет, М. апа С. Р. НоМеппего, "Зеїесіме сіопіпуд ої Васійиз 5ИирНІв хурзе Ізотегаве апи сту с хуЇшіоКіІпазе Іп Е. соїЇ депез Бу І55-теаіагеа ехргезвіоп," (пе ЕМВО дШоишгпаї, 3, 2555-2560 (1984).

Й 7аїкІп, Н. апа С. МапоївКу, У. ВіоІЇ. Спет. 257, 1491 - 1500 (1982). и?» (1) Информация общего характера: (І) Заявитель: Ненси Хо и Джорж Т. Цао (І) Название изобретения: Рекомбинантнье дрожжи для зффективного сбраживания глюкозь и ксилозь! їх (І) Числовая последовательность (Ім) Адрес для переписки: со (А) Адресат: Томас К. Генри - (В) Улица: Вапк Опе Томег, ЗЦМе 3700, 111 Мопитепі Сігсіе (С) Город: Индианаполис ю (0) Штат: Индиана сп (Е) Страна: США (Р) Почтовьй индекс: 46204 (М) Машиночитаемьій носитель: дискета 3,5 дюйма, 1,4 мегабайта 5Б (В) Компьютер: СОМРАО (С) Операционная система: М5-0О5

Ф) (О) Кодировка: АЗСІЇ ка (мМ) Сведения о заявке: (А) Мо заявки: 08/148,581 во (В) Дата подачи заявки: 8 ноября 1993 (С) Классификация (МІ) Данньіе о предшествующей заявке: нет (МІ) Сведения о поверенном (А) Ф.И.О.: Томас К. Генри 65 (В) Регистрационньй Мо: 28,309 (С) Мо дела: РОК17/18

(ІХ) Сведения о телекоммуникационном сообщении:

(А) Телефон: (317) 634-3456

(В) Телефакс: (317) 637-7561

(2) Информация для 5ЕО ІЮ Мо1

(Ї) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 2467п.н.

(В) Тип: нуклеотид, аминокислота

(С) Количество цепей: две

70 (Юр) Топология: линейная

(ІЇ) Тип молекуль!: Геномная ДНК

(хі) Описание последовательности: 5ЕО ІЮ Мо1:

Claims (20)

Формула винаходу

1. Рекомбинантнье дрожжи, содержащие введеннье сгень, кодирующие ксилозоредуктазу, ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу, и зффективнье для сбраживания ксилозь до зтанола.

2. Рекомбинантнье дрожжи по п. 1, отличающиеся тем, что зти дрожжи зффективнь! также для сбраживания До люкоЗзь до зтанола.

3. Рекомбинантньсе дрожжи по п. 2, отличающиеся тем, что они относятся к роду Засспаготусев.

4. Рекомбинантнье дрожжи по п. З, отличающиеся тем, что указаннье геньі слить! с не ингибируемьми глюкозой промоторами и что зти дрожжи зффективнь! для одновременного сбраживания глюкозь! и ксилозь! до зтанола. сч

5. Рекомбинантная молекула ДНК, содержащая геньії, коюдирующие ксилозоредуктазу, ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу. о б.

Рекомбинантная молекула ДНК по п. 5, отличающаяся тем, что указаннье гень слить! со не ингибируемьми глюкозой промоторами.

7. Вектор, зффективньій для трансформации дрожжей и содержащий геньі, кодирующие ксилозоредуктазу, ю Ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу.

8. Вектор по п. 7, отличающийся тем, что указанньєе гень! слить с не ингибируемьми глюкозой промоторами. ЄМ

9. Способ получения рекомбинантньх дрожжей, зффективньїх для сбраживания ксилозь! до зтанола, «- предусматривающий введение ДНК в дрожжи таким образом, чтобьі зти дрожжи имели введеннье гень, кодирующие ксилозоредуктазу, ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу. со

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что введенная ДНК содержит геньії, кодирующие ксилозоредуктазу, «т ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу.

11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указаннье дрожжи относятся к роду Засспаготусев.

12. Способ сбраживания ксилозь! до зтанола, предусматривающий сбраживание содержащей ксилозу средь! рекомбинантньми дрожжами, содержащими введеннье гень, кодирующие ксилозоредуктазу, « 70 Ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу, й зффективньми для сбраживания ксилозь до зтанола. ш-в с

13. Способ по п. 10, отличающийся тем, что среда содержит таюке глюкозу и что зти дрожжи также зффективнь! для сбраживания глюкозь! до зтанола. :з»

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что зти дрожжи относятся к роду Засспаготусев.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указаннье геньі слитьі с не ингибируемьми глюкозой промоторами и указаннье дрожжи зффективньї для одновременного сбраживания глюкозьі и ксилозь! до їз зтанола.

16. Способ сбраживания глюкозь! до зтанола, предусматривающий сбраживание содержащей глюкозу средь! бо рекомбинантньми дрожжами, содержащими введеннье гень, кодирующие ксилозоредуктазу, - ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу, и зффективнь!ми для сбраживания ксилозь и глюкозь! до зтанола.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что указанная среда содержит также ксилозу. їмо)

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что указаннье дрожжи относятся к роду Засспаготусев. с

19. Рекомбинантнье дрожжи, содержащие геньї, кодирующие ксилозоредуктазу, ксилитдегидрогеназу и ксилулокиназу, причем зти геньі слитьі с не ингибируемьми глюкозой промоторами и указаннье дрожжи зффективнь! для сбраживания ксилозь до зтанола.

20. Рекомбинантнье дрожжи по п. 19, отличающиеся тем, что указаннье дрожжи зффективнь! также для о сбраживания глюкозь! до зтанола. іме) 60 б5