CN1128873C

CN1128873C - 能有效发酵葡萄糖与木糖的重组酵母

Info

Publication number: CN1128873C
Application number: CN94194767A
Authority: CN
Inventors: N.W.Y.何; G.T.曹
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 1993-11-08
Filing date: 1994-11-08
Publication date: 2003-11-26
Anticipated expiration: 2014-11-08
Also published as: DE69434291T2; FI119433B; EP0728192B1; EP0728192A1; CA2176038A1; UA48125C2; CA2176038C; WO1995013362A1; DE69434291D1; AU1051795A; BR9408010A; JPH09505469A; AU695930B2; PL176399B1; EP0728192A4; PL314297A1; US5789210A; CN1141057A; ES2238072T3; ATE290589T1

Abstract

本发明描述的是含有编码木糖还原酶，木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因的重组酵母，DNA分子，载体及生产此类酵母的方法。此类重组酵母能有效地将木糖发酵为乙醇，优选的酵母能同时将葡萄糖和木糖发酵为二醇，使得存在于农作物中的这两种糖源能得以充分利用。

Description

能有效发酵葡萄糖与木糖的重组酵母

发明背景

本发明一般是涉及能同时将纤维质物质中的两种主要糖份，葡萄糖与木糖，发酵为乙醇的基因工程酵母。更具体地，本发明是涉及这类酵母可通过在能发酵葡萄糖为乙醇的酵母中克隆一个木糖还原酶基因，一个木糖醇脱氢酶基因，一个木酮糖激酶基因而构建成。

最新的研究表明，乙醇是汽车的理想的液体燃料。它可直接用做纯燃料(100％乙醇)或以不同浓度与汽油混合使用。

用乙醇来补充或替代汽油可减轻许多国家对进口石油的依赖，同时也为运输工业提供一种可再生的燃料。进一步，已证明乙醇是一种较常规汽油更清洁的燃料，因为它释放到环境中的污染物较后者要少得多。例如，已经证明，将氧化物掺人到汽油中，可减少有害物一氧化碳排放到空气中。在几种通常用于提高汽油氧含量的氧化物中，乙醇的氧含量最高。美国环保局(EPA)的资料表明，汽油里掺入10％的乙醇可减少一氧化碳排放量约25％～30％。

到目前为止，用于发醇生产工业用乙醇的原料仍是来源于甘蔗或甜菜的糖类及来源于玉米或其它农作物的淀粉。然而，用这些农作物作原料来大规模生产乙醇燃料是太浪费了。

植物，由于其可再生，价格便宜且数量巨大，因而成为发酵生产乙醇燃料的一种有吸收力的原料。早在二十年前人们就知道可以对农作物里的糖进行微生物发酵，并对产生的乙醇加以利用。来源于纤维素质的主要可发酵糖类是葡萄糖与木糖(葡萄糖与木糖的比例大约为2或3到1)。当然，对纤维素质最有价值的发酵过程是将葡萄糖和木糖完全转化为乙醇。不幸的是，至今还没有发现一种天然存在的微生物能够同时有效地既发酵葡萄糖又发酵木糖。

酵母，特别是酵母属( Saccharomyces)的，习惯上用于将富含葡萄糖的原料发酵为乙醇，如今仍然是将葡萄糖转化为乙醇的最佳微生物。然而，这些发酵葡萄糖的酵母却不能发酵木糖，也不能利用其进行生长；但他们能利用木酮糖进行生长，并将其发酵(图1)，虽然各种酵母的有效率不同。例如，酿造酵母( S.cerevisiae)仅能很微弱地发酵木酮糖，而裂殖酵母属( Schizosaccharomyces)的菌株，则能进行十分有效地发酵(Chiang等，1981；Lastick等，1989)。

虽然发酵葡萄糖的酵母不能利用木糖进行生长与发酵，但是，有许多天然酵母在有氧条件下能利用木糖进行生长，但却不能将木糖发酵为乙醇。这些能利用但不能发酵木糖的酵母依赖两种酶—木糖还原酶和木糖醇脱氢酶—来将木糖直接转化为木酮糖(图1)。酵母木糖还原酶和木糖醇脱氢酶作用时均需要辅助因子；木糖还原酶需NADPH做辅酶，木糖醇脱氢酶需NAD做辅酶。相反，细菌木糖异构酶不需要辅助因子，而直接将木糖转化为木酮糖(图1)。

二十年前，人们做了很多的努力企图发现能有效地将葡萄糖和木糖转化为乙醇的新酵母，虽然这种理想的酵母没有找到，但这些努力确实也没有白费。例如，发现少数酵母不仅能在有氧条件下利用木糖进行生长，也能将木糖发酵为乙醇(Toivola等，1984；Dupreez和Vander Walt，1983)，虽然这些发酵木糖的酵母中没有一种能够完全有效地将木糖转化为乙醇(Jeffries，1985)。另外，这些酵母均不能有效地发酵葡萄糖。

在这些发酵木糖酵母中，对三种菌，管囊酵母( Pachysolen tannophilus)(Toivola等，1984)，石氏假丝酵母( Candida shehatae)(Dupreez和VanderWalt，1983)，和树干毕赤酵母( Pichia stipitis)(Grootjen等，1990)的特性进行了深入的研究。树干毕赤酵母和石氏假丝酵母发酵木糖时比其它发酵木糖的酵母更有效(Grootjen等，1990)。然而，即使是最好的发酵木糖的酵母在发酵木糖时效率也不高，并且不能发酵葡萄糖(Jeffries，1985)。

在过去的十年里，人们致力利用重组DNA技术对传统地发酵葡萄糖的酵母，特别是酿造酵母，进行基因改造。最初的努力集中在将木糖异构酶基因克隆到酵母中去，使其能不依靠辅酶直接将木糖转化为木酮糖。然而，这些努力没有成功，因为编码各种细菌木糖异构酶的基因在酿造酵母中不能指导合成出有活性的酶(Rosenfeld等，1984；Ho等；1983；Sarthy等，1987；Wilhelm和Hollenberg，1984；Amore等，1989年)。

前几年，人们的研究目标是得到能发酵木糖的基因工程酵母，特别是酿造酵母，重点放在对编码木糖还原酶(Takama等，1991；Hallborn等，1991；Strasser等，1990)，木糖醇脱氢酶(Ketter等，1990；Hallborn等，1990)，和木酮糖激酶(stevis等，1987；Chang和Ho，1988；Ho和Chang，1989；Deng和Ho，1990)的基因进行克隆。酿造酵母和其它发酵葡萄糖的酵母均不含有任何可检测出的木糖还原酶或木糖醇脱氢酶活性，但似乎都含有木酮糖激酶活性。因此，发酵葡萄糖的酵母都能发酵木酮糖，只是各自的效率不同(Deng和Ho，为1990)。

最近，Ketter等(1990)，Strasser等(1990)，和Hallborn等(1990；1991)，已将木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因克隆到了酿造酵母中。但是，这些基因工程酵母仍然不能有效地发酵木糖。例如，这些酵母只能发酵不到2％的木糖。此外，它们从木糖产生大量的木糖醇，使得宝贵的木糖底物从希望的产生乙醇的发酵途径转向了产木糖醇的途径。

以上详细的背景介绍表明，虽然众多的研究者经过了一致不懈的努力，但能有效地发酵葡萄糖和木糖为乙醇的酵母仍没有得到。因此，仍然需要找到这类酵母以及其制备和使用方法。鉴于此，递交上本发明。

发明概述

本发明的特征在于如下发现：可通过重组DNA技术和基因克隆技术得到能有效地单独发酵木糖或同时也发酵葡萄糖的新酵母菌株。具体地说，这些技术被用于产生新的含有克隆的木糖还原酶(XR)基因，木糖醇脱氢酶(XD)基因，和木酮糖激酶(XK)基因的重组酵母。这些基因与不被存在葡萄糖抑制的启动子融合(fused)在一起。

据此，本发明的一个优选的实施方案是提供一种重组酵组菌株，该菌株含有导入的编码木糖还原酶，木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因，能将木糖发酵为乙醇。这株重组酵母菌优选地也能将葡萄糖发酵为乙醇和这种更为优选的能有效地同时发酵这两种糖为乙醇的酵母菌已经得到，在这些菌株中，XR、XD和XK基因与不被存在的葡萄糖抑制也不需木糖诱导的启动子融合在一起。

本发明的另一种优选的实施方案是提供一种含有编码木糖还原酶，木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因的重组酵母菌株。其中，所述基因与不被葡萄糖抑制的启动子融合在一起，和其中该重组酵母能将木糖发酵为乙醇。这个重组酵母菌株优选地也能将葡萄糖发酵为乙醇。

本发明的第三种优选的实施方案涉及用于产生本发明的重组酵母的各种试剂。因此，本发明也提供了一个包含编码木糖还原酶、木糖酶脱氢酶、木酮糖激酶的各种基因的重组DNA分子。本发明还提供了一个包含编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的各种基因的载体。在这些试剂中，各基因优选地与不被葡萄糖抑制也不需木糖诱导的启动子融合，使得能方便地产生能同时将葡萄糖和木糖发酵为乙醇的重组酵母。

本发明的第四种优选的实施方案是提供一种获得能将木糖发酵为乙醇的重组酵母的方法。这种方法包括将DNA引入到酵母中的步骤，使得酵母具有引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因。优选地是这些基因能被融合到不被葡萄糖抑制的启动子上，使得能同时将葡萄糖和木糖发酵为乙醇。更为有利的是，例如，利用上面讨论的本发明的各种试剂，可同时将这三种基因引入到酵母中。

本发明的第五种优选的实施方案是提供将木糖或葡萄糖发酵为乙醇的方法。该方法包括用一株含引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因的重组酵母菌发酵含木糖或含葡萄糖的培养基的步骤。理想的状况是将三种引入的基因与不被葡萄糖抑制的启动子相融合，并且培养基中既含葡萄糖也含木糖，以便能同时将木糖和葡萄糖发酵为乙醇。

本发明其它的优选实施方案、特征及优点，在随后的说明书中，会给以更加清楚的描述。

附图的简要说明

图1为细菌和酵母中与木糖代谢早期阶段相关的各种酶类的图解。

图2表示包括5′和3′-侧翼序列在内的酵母木酮糖激酶基因的核苷酸序列及衍生的氨基酸序列。起始密码和终止密码下面均已画线，位于5′-和3′-端非编码区域的可能的调控序列由箭头标出。

图3表示克隆在质粒pLSK15上的基因及该质粒的限制性酶切图谱。

图4表示克隆在质粒pUCKm10上的基因及该质粒的限制性酶切图谱。

图5表示克隆在质粒pLNH21上的基因及该质粒的限制性酶切图谱。

图6A表示用重组酵母SC(pLNH21)(含有引入的XR、XD和XK基因的酿造酵母)发酵木糖(I)2天；和(II)4天，所得发酵液的HPLC层析图谱。

图6B表示用重组酵母SC(pLNH13-32)(含引入的XR和XD基因，不含XK基因的酿造酵母)发酵木糖(I)2天，和(II)6天，所得发酵液的HPLC层析图谱。

图6C表示用非基因工程菌酿造酵母(不含引入的XR、XD或XK基因)发酵木糖(I)2天，和(II)7天，所得发酵液的HPLC层析图谱，详细描述见例6。

图7表示克隆在质粒pLNH33上的基因及该质粒的限制性酶切图谱。

图8A表示用非基因工程酵母菌1400(不含引入的XR、XD或XK基因)发酵含葡萄糖和木糖(相应为10％和5％)的培养基(I)0天；(II)2天，所得发酵液的HPLC层析图谱。详细描述见例8。

图8B表示用重组酵母1400(pLNH33)(含引入的XR、XD和XK基因的酵母1400)发酵含葡萄糖和木糖(分别为10％和5％)的培养基(I)0天；(II)2天，所得发酵液的HPLC层析图谱。详细描述见例8。

图9为含有克隆的XR、XD和XK基因的质粒pBluescript II KS(-)的构建图解：已建成4种这类质粒：pKS(-)-KK-A^*R-KD-1；pKS(-)-KK-A^*R-KD-2；pKS(-)-KK-AR-KD-3；和pKS(-)-KK-AR-KD-4，详细描述见例4。

图10表示用聚合酶链式反应(PCR)技术对从树干毕赤酵母染色体DNA得来的完整的木糖醇脱氢酶基因和不含启动子的XD进行直接扩增；从左至右，第一列：分子标准，BamHI-EcoKI降解人DNA；第二列：毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶基因(完整的)；第三列：毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶基因(不含启动子的)；第四列：分子标准，Hae III降解φx DNA。

图11为测定酵母木酮糖激酶基因序列的设计方案图。

图12为质粒pLNH21的构建图解。

图13表示用酿造酵母SC(pLNH13-32)(仅含XR和XD基因)发酵葡萄糖(10％)和木糖(5％)混合物(I)0天；(II)2天；(III)5天，所得发酵液的HPLC层析图谱。

图14表示用非基因工程树干毕赤酵母发酵葡萄糖(10％)和木糖(5％)混合物(I)0天；(II)3天；(III)5天，所得发酵液的HPLC层析图谱。

发明详述

为了增进对本发明原理的理解，对某些实施方案给出参考文献，并用专业语言加以叙述。然而，应当理解，本发明的范围是不受限制的，正如本文作为精选的例示所表明的对本发明原理的改变，进一步的修正及应用，通常是该发明所属领域的普通技术人员可以作出的。

本发明提供了重组酵母，DNA分子和包含XR、XD和XK基因的载体。众所周知，这些基因广泛存在于各种微生物中，事实上，正如前面所讨论的，大量的XR、XD和XK基因已被确定并分离出来。这些基因各自的来源对于本发明的各个方面并不是关键的。进一步说，任何编码具有木糖还原酶活性(即在NADPH或NADH作辅酶时，能将D-木糖转化为木糖醇)，木糖醇脱氢酶活性(NAD⁺作辅酶时，能将木糖醇转化为D-木酮糖)，或木酮糖激酶活性(能将D-木酮糖转化为5-磷酸-D-木酮糖)的蛋白质(酶)的DNA，都是适合的。这些基因可以天然存在的形式被得到，或以修饰的形式被得到，例如，通过碱基的增加，取代或缺失使得天然存在的基因被修饰，只要被编码的蛋白质仍具有XR、XD或XK活性。同样，这些基因或基因组分可由现成的技术合成出来，只要生成的基因编码的蛋白质具有所需的XR、XD或XK活性。

作为例子，合适的XR和XD基因来源包括能利用木糖的酵母如石氏假丝酵母、树干毕赤酵母；合适的XK基因来源包括上述的能利用木糖的酵母，以及不能利用木糖的酵母如那些来自酵母属的，如酿造酵母，裂殖酵母属的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，和细菌如大肠杆菌，芽胞杆菌属的菌种及链霉菌属的菌种等。利用一些常规方法可从这些来源获得感兴趣的基因。例如，杂交、互补或PCR技术都可用于此种目的。

申请人所用的特定的XR基因是通过聚合酶链式反应(PCR)从树干毕赤酵母中克隆出的(Chen和Ho，1993)。用PCR对从染色体DNA得到的XR基因进行扩增，所需的寡核苷酸链根据已报道的树干毕赤酵母XR基因的序列进行合成(Takama等，1991)。扩增出的XR基因首先被克隆并贮存在pUC19中，然后，将克隆的XR基因融合到不同的启动子上，这些启动子包括酵母TRP5基因的启动子(zalkin和Yanofsky，1982)和酵母乙醇脱氢酶I基因(ADC1)的启动子(Ammerer，1983；Bennetzen和Hall，1982)。

申请人研究所用的XD基因也通过PCR从树干毕赤酵母中克隆出。由毕赤酵母染色体DNA得来的XD基因的扩增所需的寡核苷酸链，根据已报道的毕赤酵母XD基因的序列加以合成(koetter等，1990)。同样，扩增的基因先克隆并贮存在PUC 19中。随后，这个基因被融合到酵母丙酮酸激酶基因(PYK)(Burke等，1983)和酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GPD)(Holland和Holland，1979)的糖酵解启动子上。

申请人已克隆三种不同的XK基因，它们来自酿造酵母(Ho和Chang，1989)、管囊酵母(stevis等，1987)和大肠杆菌并且发现在融合于高效酵母启动子之后这三种基因都能有效地在酿造酵母中表达。在此，用克隆的酿造酵母木酮糖激酶基因做说明性的工作。为了帮助正确地将酵母XK基因融合到合适的启动子上，对包括5′-、3′-端非编码在内的酿造酵母XK基因的全部核苷酸序列进行了分析，见图2。

各种不同的启动子都适合于本发明。广义的讲，与酵母相容的能控制XR、XD或XK基因转录的启动子都适用。这类启动子可从大量的来源得到，包括酵母、细菌及其它细胞来源。用于本发明的启动子优选是高效的，不被葡萄糖抑制，不需木糖诱导的。关于这一点，其中所述“高效”的启动子指的是能高水平地转录所融合的基因。具有这些特性的启动子也很容易得到。这类启动子在本发明中的应用，本文给出了指导，但启动子与XR、XD、XK基因的融合，启动子/基因融合物克隆到适合的载体中，载体对酵母菌的转化，本领域普通的技术人员都可以完成。所有的这些操作步骤用本领域和文献中常见的常规基因工程技术即可完成。

下面，对申请人的例示性工作给予更具体的叙述。将酵母木酮糖激酶基因XK融合到酵母乙醇脱氢酶基因(ADC1)，酵母丙酮酸激酶基因(PYK)，酵母TRP-5基因等的启动子上。融合到TRP-5启动子上的XK基因用于构建pLNH21(图5)，融合到PYK启动子上的XK基因用于构建pLNH33(图7) 。

XR、XD和XK基因与ADC1、PYK、GPD等的完整启动子的融合。通过克隆含有特定启动子的片段和XR、XD或XK的结构基因到一个Bluescript KS质粒上(stratagene，La Jolla，CA)而得以完成，然后通过专一位总诱变除去多余的不需要的核苷酸(Kunkel等，1987)。本发明还提供了几种pBluescript II KS(-)(以后简称pKS(-)衍生物，它们都含有克隆的XD(与丙酮酸脱氢酶启动子融合)，XR(与ADC1启动子融合)，XK(与丙酮酸激酶启动子融合)基因。这些重组质粒被叫做pKS(-)KD-AR(或A^*R)-KK。4种这样的质粒已经建成，详见图9。这些质粒具有相似但不相同的结构。克隆到这些质粒上的XR、XD和XK(或KD-AR(或A^*R)-KK)基因通过一个单位点xho I的限制性降解，可同亲代质粒pKS(-)分开。

然后，将融合到适当启动子上的XR、XD和XK基因克隆到pLSK15(图3)或pUCKm10(图4)上。pLSK15，由pLX10-14衍生而来(Stevis和Ho，1985)，为一低拷贝数质粒，在酵母(酿造酵母)中的拷贝数约为10。它含有酵母的2μ的复制子，使质粒在酿造酵母及相近的其它种中能自动复制。pLSK15还含有遗传霉素(卡那霉素)抗性基因(Km^R)和氨苄青霉素抗性基因(Ap^R也可amp^r)，它们在酿造酵母和其它酵母中充当选择性标记。pSK15还含有与酵母TRP-5启动子融合的XK基因。因而，与含有适合启动子的适当的5′-非端码序列相融合的XR、XD基因，被插入到pLSK15上以证明这个生成的质粒对酵母木糖发酵的影响。为此比较不同基因的存在对酵母木糖发酵的影响，用一种只含XR和XD基因的质粒去转化酿造酵母，转化后的酵母再用于比较发酵。用非基因工程酿造酵母，含有克隆的XR、XD和XK(SC(pLNH21))基因的酵母及含有克隆的XR、XD，但不含XK(SC(pLNH这13-32))基因的酵母分别对木糖进行发酵，结果见图6A、6B和6C。

pUCKm10(图4)是一种高拷贝数质粒(即质粒的拷贝数约为50或更多)，在酿造酵母中的拷贝数接近100。pUCKm10由PUC19衍生而来，含有与pLSK15相同的2μ的复制子，Km^R及Ap^R基因。这些特定的片段充当复制子，选择标记，使得质粒在酿造酵母(及相关酵母)中能自动复制。同样，使得含此质粒的酵母转化子能同未转化的寄主细胞区分开来。

申请人在重组质粒的基础上构建了pUCKm10，这些重组质粒含有相同的XR、XD和XK基因，这些基因与包含适合启动子的5′-端适当的非编码序列融合。设计的这些载体对转化所有的酿造酵母菌株及相关酵母的菌株都适用。不需要特定的突变体充当受体菌株。象pLNH33(图7)及pLNH21(图5)这样的质粒可用于转化工业酿造酵母及其它酵母菌。

用pLSK15或pUCKm10的衍生质粒对酵母的转化作用，通常采用Becker和Guarente(1991)的方法得以完成。含有pLSK15或pUCKm10衍生质粒的真正的酵母转化子，由下述方法可被分离。质粒中的Km^R充当初始选择标记，它使任何含有一个这类质粒的寄主细胞对培养基中存在的更高浓度的遗传霉素产生抗性。然而，一些酵母细胞可被诱导变为抗与含质粒的转化子具有相同水平的遗传霉素。因此，并非每一个抗遗传霉素的克隆都是真正的转化子。已有报道表明，Ap^R能在酿造酵母中表达，但后者在无Ap^R存在时，对氨苄青霉素具有抗性，这样，对于质粒介导的酵母的转化，Ap^R不能充当选择性标记。然而，含有高表达Ap^R的酵母将产生足够的青霉素酶，使得通过青霉素酶实验(chevallier和Aigle，1979)能够分辨出长在特定固体平板上的含有这种酵母的克隆。后一种实验提供了一种可以遗传霉素抗性克隆中分辨出酿造酵母和其它酵母的真正转化子的技术。

在厌氧条件下，用本发明的重组酵母，可以完成酵母的木糖(或葡萄糖和木糖)发酵，详述见例6到例9。发酵过程中，糖(木糖和葡萄糖)的消耗量，乙醇及其它产物如木糖醇的生成量，可通过取样，并用HPLC进行分析而测得，进一步的说明见例6。

例如，用pLNH21(图5)转化酿造酵母，生成的含pLNH21的转化子叫做SC(pLNH21)。该转化子在2-4天时间里可将5％的木糖几乎全部转化为乙醇，如图6A所证明。

作为另外的例子，用pLNH33(图7)转化酵母菌株1400，该菌株与酿造酵母密切相关，对乙醇和温度有很高的耐受力(D′Amore等，1989；D′Amore，1990)。这个生成的基因工程酵母，被叫做1400(pLNH33)。该酵母在2-4天内，能将10％的葡萄糖和5％的木糖全部发酵为乙醇，而不需要很高的细胞密度，如图8A和8B所示。

在对木糖发酵时，pLNH33质粒比pLNH21质粒更为有效，因为前者的拷贝数更高些。再者，pLNH33中XK融合的启动子比pLNH21中XK融合的启动子更为有效。也可用pLNH33转化酿造酵母，生成的转化子叫做SC(pLNH33)。虽然在发酵木糖或木糖与葡萄糖混合物时，SC(pLNH33)比SC(pLNH21)更有效，但也发现，在发酵木糖与葡萄糖混合物时，1400(pLNH33)比SC(pLNH33)更有效。因此，菌株本身也会对发酵的效率产生影响。与酿造酵母类似，非基因工程菌1400也不能利用或发酵木糖(单独存在或与葡萄糖混合存在)，如图8B所示。

一般而言这些发酵实验的结果表明，酵母具有三种引入的基因XR、XD和XK是必需的，它们恰当地与合适的启动子融合在一起(最好是有效的糖酵解或别的启动子，不被葡萄糖抑制，也不需木糖诱导)，协调地表达这些基因，使得酵母只将木糖发酵为乙醇，而不生成别的副产物如木糖醇等。

这些结果进一步表明，除去克隆XR和XD基因外，还克隆一个木酮糖激酶基因(XK)，其重要性在于使酶母能有效地发酵木糖，特别是当葡萄糖和木糖同存于一个培养基中时，如纤维素类物质的水解液中，能同时发酵这两种糖。与XR和XD基因类似，这个克隆的XK基因最好与一个适合的有效的糖酵解或别的启动子融合，这个启动子不被葡萄糖抑制，也不被木糖诱导。

申请人还发现，仅含克隆的XR和XD基因的酵母，当葡萄糖和木糖同时存在于培养基中时，只能将葡萄糖发酵为乙醇，而不能将木糖发酵为乙醇(见图13)。申请人的结果还表明，对于任何酵母来说，包括发酵木糖的酵母如酿造酵母、石氏假丝酵母，要想在葡萄糖和木糖同时存在于发酵培养基时，能同时将这两种糖发酵为乙醇，必需具有XR、XD和XK基因，并且这些基因均与不被葡萄糖抑制，也不需木糖诱导的启动子融合。图13表明，酿造酵母及相关酵母，若仅含有与适当的启动子融合的克隆的XR和XK基因，则当葡萄糖与木糖同时存在于发酵培养基中时，仅能将葡萄糖，而不能将木糖发酵为乙醇。同样，图14表明，含有原始XR、XD和XK基因的非基因工程树干毕赤酵母，在葡萄糖与木糖作为碳源存在于同一培养基中时，不能发酵木糖；而仅木糖为培养基中唯一碳源时，则能发酵木糖(结果未写出)。

应当知道，对于那些木酮糖激酶活力很低的酵母，引入XK基因有两个目的。一是提高该酶的活力水平，高XK活力更有利于酵母将木糖发酵为乙醇而不是木糖醇；二是为了使基因处于不被葡萄糖抑制的有效的启动子控制之下。众所周知，包括酵母在内的天然野生型微生物，当葡萄糖存在于发酵培养基中时，便不能利用其它糖进行生长与发酵，葡萄糖将抑制代谢其它糖分子所需的酶类的合成(称为葡萄糖效应)。因此，不能选择由指导糖分子，包括葡萄糖、代谢酶类合成的基因得来的启动子，因为这类启动子对两种来源丰富的糖不能提供同步发酵。此外，申请人的工作表明，细胞生长是诱导的先决条件。因此，在XR、XD或XK基因表达时，不选择需要木糖诱导的启动子。

为了进一步增进对本发明及其优点的理解，下面给出了许多实例。应当明白，实际上这些例子仅是说明性的，而非限定性的。

实例1

用PCR技术合成XR和XD基因

用PCR技术合成完整的或不含启动子的XR基因已有报道(chen和Ho，1993)。在用PCR技术合成XD之前，需根据XD的核苷酸序列(ketter等，1990)合成出三条寡核苷酸链，如下所示：

寡核苷酸链I： pTCTAGACCACCCTAAGTCG

寡核苷酸链II： pCACACAATTAAAATGA

寡核苷酸链III：pGGATCCACTATAGTCGAAG

寡核苷酸链I和II用于合成完整的XD基因，寡核苷酸链II和III用于合成不含启动子的XD基因，如图10所示，完整的XD和不含启动子的XD基因首先被克隆到pKS(-)质粒中。然后，将完整的XR基因亚克隆到质粒pUCKm10(图4)中，生成的质粒pUCKm10-XD采用例5中描述的电穿孔法去转化酿造酵母。检测酵母转化子的木糖醇脱氢酶活性以证明克隆的基因是完整的，并能在酿造酵母中表达。

实例2

不含启动子的XD基因融合到酵母

丙酮酸激酶基因的启动子上

选择XD基因与P_PK的融合(fusion)来阐明用定点诱变技术将代谢木糖的基因准确地融合到完整的启动子上。这些启动子可以是糖酵解启动子，也可以是那些被培养基中存在的葡萄糖抑制，也不需木糖来诱导的启动子。

如同例1中合成XD基因一样，用PCK技术合成了从-910到+23的酵母丙酮酸激酶的启动子片段(Burke等，1983)。P_PK片段和不含启动子的XD都被亚克隆到质粒PKS(-)中，介于P_PK和完整的XD结构基因间的不必要的核苷酸采用位点专一诱变将其去掉，详见Kunkel的方法(Kunkel，1987)。得到的融合基因含有丙酮酸激酶基因的-910到-1的启动子片段，毕赤氏酵母XD基因的+1到+1963核苷酸片段。生成的含P_PK-XD(或XD)的质粒PKS(-)被叫做PKS(-)KD或pKD2。

实例3

酵母丙酮酸激酶基因核苷酸序列的分析

关于含有酵母丙酮酸激酶基因的一个7.0Kb酵母(酿造酵母)DNA片段的克隆已有报道(Ho和Chang，1989)。通过亚克隆使得XK基因位于一个2.4kb的片段上。这个2.4kb片段的核苷酸序列已经分析出来。5′-端非编码区域含有345个核苷酸。翻译区域含有2118个核苷酸。由XK编码的丙酮酸激酶基因含有591个氨基酸，如图2所示。测定XK基因序列的方案见图11。

实例4

完整的ADC1启动子的构建

PMA56质粒(Ammerer，1983)含有酵母乙醇脱氢酶I启动子(P_ADC1)。申请人在其工作中利用这个启动子来修饰某些基因。例如，P_ADC1与XR融合在一起，生成的基因叫做P_ADC1-XR或AR。但是，这个P_ADC1是不完整的，缺少完整启动子ADC1的-1到-14核苷酸片段(Bennetzen和Hall，1982)。一个基因的-1到-14区域通常在控制蛋白质合成方面有重要意义。任何与这种启动子融合的基因在控制基蛋白质产物合成时必须依赖其原有的基因信号。

为了更好地控制与启动子ADC1融合的基因的表达，申请人采用位点专一诱变将缺失的核苷酸序列(-1到-14)增加到克隆在PMA56上的启动子ADC1上。这个新的完整的启动子ADC1叫做P^* _ADC1。这个启动子与XR连接，生成的基因叫做P^* _ADC1-XR或A^*R.

实例5

PLNH21质粒的构建(也叫pLSK15-KD-AR)

以及用pLNH21转化酿造酵母与1400

pLNH21的构建如图12所示。在下述条件下采用电穿孔法用pLNH21转化酿造酵母和菌株1400。取50ml生长到早对数期(克莱特单位(kleH Unit)(KU)130)的酵母细胞，离心除去培养基，用冷水洗两遍，其中一次含有1M冷山梨醇，再重新悬浮于200μl 1M山梨醇中。将60μl上述细胞转移到一个预先灭菌的4μl塑料管(带盖)中，加入0.1～1μg质粒DNA。用吸管吸取50μl生成的细胞和质粒混合物，加入到一预先冷却的电极宽度为0.2cm的基因电击杯中，杯中的混合物受到由基因电击仪的电击控制器(BioRad)控制的2.0KV，25μF，200ohms的电击。

立即将0.5ml YEPD(1％酵母提取液，2％蛋白胨，及2％葡萄糖)加入到电击杯中，然后将杯中的细胞溶液转移到一个新的已灭菌的4ml塑料管中，30℃保温1小时。取100μl细胞涂到含YEPD和50μg/ml G418(遗传菌素)的琼脂平板上。将迅速生长的菌落选出，重新涂在另一含相同培养基的平板上。这些选出的菌落用氨苄青霉素试验(Chevallier和Aigle，1979)检测，直到一个阳性菌落被检测出来。以上叙述的电穿孔步骤是基于Beeker和Guarente(1971)的报道。我们所用的抗G418转化子的选择方法是十分有效的，大多数选出的菌落在含YEPD和50μg/ml G418的平板上复制，用青霉素酶试验检测都是阳性的。

pLNH21或其它质粒对菌株1400的转化，其步骤与上述步骤类似。除了细胞生长到140-190KD而不是130KU，用于电穿孔后转化子最初选择的YEPD平板含有40μg/ml遗传菌素G418而不是50μg/ml。通过上述步骤对菌株1400的转化不象酿造酵母的转化那样有效。

实例6

用基因工程SC(pLNH21)，SC(pLNH 13-32)

及非基因工程亲代酿造酵母

对木糖的发酵

这三种酵母在同等条件下于丰富培养基YEPD中需氧培养(SC(pLNH13-32)通过一个叫做pLNH13-32的质粒对酿造酵母转化而建成，该质粒仅含与启动子融合的XR和XD基因)。然后，同样在同等条件下，在YEP(1％酵母提取液，2％蛋白胨)培养基中，这些酵母细胞被用于厌氧发酵5％的木糖。在发酵过程中，于适当的时间间隔取样，在下述条件下用HPLC分析样品，以确定木糖的消耗量及乙醇和木糖醇的生成量。

从培养基中取出含培养液(0.6ml～1.0ml)的样品放入1.5ml的Eppendorf管中，离心除去细胞及其它残渣，然后，上清液用无菌的aerodisc(GelmanSciences)，0.2～0.45mm的针筒式滤器进一步过滤。用高压液相色谱(HPLC)分析每一种样品滤液的乙醇、葡萄糖、木糖及木糖醇含量。测定时根据下列条件采用Hitachi系统。

°柱子：Aminex HPX-87C，300X7.8mm

°流动相：水

°流速：0.8ml/min

°检测：Hitachi L-3350RI检测仪

°温度：80℃

°加样体积：20μl

图6A、6B及6C的结果表明(由于仪器灵敏度，在这些图及其它图中的乙醇峰实际上比他们应该有的小2 1/2倍)，只有含克隆的XR、XD和XK的基因工程SC(pLNH21)能将高浓度的木糖(5％)发酵为乙醇，而非基因工程亲代酿造酵母，以及仅含有克隆的XD、XR而不含XK的基因工程SC(pLNH13-32)则不能。SC(pLNH13-32)将大多数木糖发酵为木糖醇。

实例8

1400(pLNH 33)有效地将高浓度

的葡萄糖和木糖发酵为乙醇

在相同的条件下，用菌株1400与1400(pLNH33)发酵葡萄糖和木糖的混合物(大约10％的葡萄糖和5％的木糖)。这些酵母保留在含有适当培养基的琼脂平板上，分别将其直接从平板上接种到装有50ml YEPD培养液(1％酵母提取液，2％蛋白胨及2％葡萄糖)的250ml的Erlenmeyer烧瓶中，此烧瓶装有侧臂，使得用klett比色计能直接监测酵母培养液的生长情况。培养液在30℃、200rpm的摇床上需氧培养。

当细胞密度达到对数生长中期(400klett单位)，在每一个烧瓶中加入12.5ml(40％)葡萄糖，6.25ml(40％)木糖，混匀后，取出1ml培养液混合物作为对照。然后，用saran包装膜将烧瓶封住，使得发酵在厌氧条件下进行。每隔一定的时间(每24hr)，取出1ml发酵液(含细胞)作样品，用于检测发酵过程中培养液的糖含量与乙醇含量。样品中乙醇、葡萄糖、木糖及木糖醇的含量用HPLC来测定，详细方法见例6。图8A与8B的结果表明，基因工程酵母1400(pLNH33)在2-4天时间内，并且不需要高密度的细胞，就可同时将10％葡萄糖与5％木糖发酵为乙醇。另一方面，亲代酵母菌1400仅能将葡萄糖发酵为乙醇，不能将木糖发酵为乙醇。该发酵过程在常规条件下进行，不需要特殊的培养基及pH，也不需要酵母细胞生长到高细胞密度。因此，含有XR、XD及XK基因的基因工程酵母1400(pLNH33)，其中各基因与糖酵解启动子相融合，并克隆到高拷贝质粒pUCKm10上，在2-4天时间内，可同时将高浓度的葡萄糖与木糖发酵为乙醇，并且只有极少的副产物木糖醇生成。

实例9

尝试用基因工程SC(pLNH13-32)

对木糖/葡萄糖进行发酵

重复例8的发酵过程，只是用酿造酵母SC(pLNH13-32)(只含XR和XD基因)做为发酵微生物。图13的结果表明，这种只含XR和XD基因的非基因工程酵母，当葡萄糖与木糖同时存在于发酵培养基中时，只能发酵葡萄糖而不能发酵木糖。

实例10

尝试用非基因工程树干毕赤

酵母发酵木糖/葡萄糖

重复例8的发酵过程，除了用非基因工程树干毕赤酵母做发酵微生物。用HPLC检测发酵了(I)0天；(II)3天；及(III)5天的发酵液样品，结果见图14。结果表明，当葡萄糖与木糖同时存在于培养基中时，树干毕赤酵母只能发酵葡萄糖而不能发酵木糖。

虽然已用附图及前述的说明对本发明进行了详细的叙述，但均为说明性的而非限定性的。应当明白，前面列出并加以说明的仅是优选的实施方案，所有的在本发明构思范围内的变化与修饰都要求受到保护。

参考文献

下列文献，均为提供示范性步骤或对此发明中提出的步骤给予细节补充，在此专门引入作为参考。Ammerer，G.，″Expression of genes in yeast using the ADC1promoter，″Methods in Enzymol.101，192-201(1983).Amore，R.，M.Wilhelm，and C.P.Hollenberg，″Thefernentation of xylose：An analysis of the expression ofBacillus and Actinoplanes xylose isomerase genes inyeast，″Appl.Microbiol.Biotechnol.，30(4)，351-357(1989).Becker，D.，and L.Guarente，″High efficiencytransformation of yeast by electroporation，″Methods inEnzymol.194，182-186(1991).Bennetzen，J.L.and B.D.Hall，″The primary structure ofthe Saccharomyces cerevisiae gene for alcoholdehydrogenase I，″J.Biol.Chem.，257(6)，3018-3025(1982).Burke，R.L.，P.Tekamp-Olson，and R.Najarian，″Theisolation，characterization，and sequence of the pyruvatekinase gene of Saccharomyces cerevisiae，″J.Biol.Chem.258(4)2193-2201(1983).Chang，S.F.and N.W.Y.Ho，″Cloning the yeast xylulokinasegene for the improvement of xylose fermentation.″Appl.Biochem Biotechnol.17，313-318(1988).Chen，Zhengdao，and N.W.Y.Ho，″Cloning and improving theexPression 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(i)申请人：Nancy Ho和George T.Tsao

(ii)发明题目：能有效发酵葡萄糖与木糖的重组酵母

(iii)序列号：1

(iv)相应地址：

(A)户主：Thomas Q.Henry

(B)街道：Bank One Tower，Suite 3700，111Monument Circle

(C)城市：Indianapolis

(D)州：Indiana

(E)国家：USA

(F)邮编：46204

(v)计算机可读形式：

(A)中介类型：软盘，3.50inch，

1.4Mb内存

(B)计算机：COMPAQ

(C)操作系统：MSDOS

(D)软件：ASCII

(vi)现在的申请日期：

(A)申请号：08/148,581

(B)申请日期：1993，11，8

(C)分类：

(vii)在先的申请日期：无

(viii)代理人资料：

(A)姓名：Thomas Q.Henry

(B)注册号：28，309

(C)参考/摘要号：PUR 17/18

(ix)电信资料：

(A)电话：(317)634-3456

(B)电传：(317)637-7561(2)1号序列ID资料

(i)序列特征

(A)长度：2467碱基对

(B)类型：核苷酸氨基酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线型分子(ii)分子类型：基因组DNA(xi)序列图：序列ID 1号：GGATCCAAGA CCATTATTCC ATCAGAATGG AAAAAAGTTT AAAAGATCAC 50GGAGATTTTG TTCTTCTGAG CTTCTGCTGT CCTTGAAAAC AAATTATTCC 100GCTGGCCGCC CCAAACAAAA ACAACCCCGA TTTAATAACA TTGTCACAGT 150ATTAGAAATT TTCTTTTTAC AAATTACCAT TTCCAGCTTA CTACTTCCTA 200TAATCCTCAA TCTTCAGCAA GCGACGCAGG GAATAGCCGC TGAGGTGCAT 250AACTGTCACT TTTCAATTCG GCCAATGCAA TCTCAGGCGG ACGAATAAGG 300GGGCCCTCTC GAGAAAAACA AAAGGAGGAT GAGATTAGTA CTTTA ATG TTG 351

Met Leu

1TGT TCA GTA ATT CAG AGA CAG ACA AGA GAG GTT TCC AAC ACA 393Cys Ser Val Ile Gln Arg Gln Thr Arg Glu Val Ser Asn Thr

5 10 15ATG TCT TTA GAC TCA TAC TAT CTT GGG TTT GAT CTT TCG ACC 435Met Ser Leu Asp Ser Tyr Tyr Leu Gly Phe Asp Leu Ser Thr

20 25 30CAA CAA CTG AAA TGT CTC GCC ATT AAC CAG GAC CTA AAA ATT 477Gln Gln Leu Lys Cys Leu Ala Ile Ash Gln Asp Leu Lys Ile

35 40GTC CAT TCA GAA ACA GTG GAA TTT GAA AAG GAT CTT CCG CAT 519Val His Ser Glu Thr Val Glu Phe Glu Lys Asp Leu Pro His45 50 55TAT CAC ACA AAG AAG GGT GTC TAT ATA CAC GGC GAC ACT ATC 561Tyr His Thr Lys Lys Gly Val Tyr Ile His Gly Asp Thr Ile

60 65 70GAA TGT CCC GTA GCC ATG TGG TTA GGG GCT CTA GAT CTG GTT 603Glu Cys Pro Val Ala Met Trp Leu Gly Ala Leu Asp Leu Val

75 80 85CTC TCG AAA TAT CGC GAG GCT AAA TTT CCA TTG AAC AAA GTT 645Leu Ser Lys Tyr Arg Glu Ala Lys Phe Pro Leu Asn Lys Val

90 95 100ATG GCC GTC TCA GGG TCC TGC CAG CAG CAC GGG TCT GTC TAC 687Met Ala Val Ser Gly Ser Cys Gln Gln His Gly Ser Val Tyr

105 110TGG TCC TCC CAA GCC GAA TCT CTG TTA GAG CAA TTG AAT AAG 729Trp Ser Ser Gln Ala Glu Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Lys115 120 125AAA CCG GAA AAA GAT TTA TTG CAC TAC GTG AGC TCT GTA GCA 771Lys Pro Glu Lys Asp Leu Leu His Tyr Val Ser Ser Val Ala

130 135 140TTT GCA AGG CAA ACC GCC CCC AAT TGG CAA GAC CAC AGT ACT 813Phe Ala Arg Gln Thr Ala Pro Asn Trp Gln Asp His Ser Thr

145 150 155GCA AAG CAA TGT CAA GAG TTT GAA GAG TGC ATA GGT GGG CCT 855Ala Lys Gln Cys Gln Glu Phe Glu Glu Cys Ile Gly Gly Pro

160 165 170GAA AAA ATG GCT CAA TTA ACA GGG TCC AGA GCC CAT TTT AGA 897Glu Lys Met Ala Gln Leu Thr Gly Ser Arg Ala His Phe Arg

175 180TTT ACT GGT CCT CAA ATT CTG AAA ATT GCA CAA TTA GAA CCA 939Phe Thr Gly Pro Gln Ile Leu Lys Ile Ala Gln Leu Glu Pro185 190 200GAA GCT TAC GAA AAA ACA AAG ACC ATT TCT TTA GTG TCT AAT 981Glu Ala Tyr Glu Lys Thr Lys Thr Ile Ser Leu Val Ser Asn

205 210 215TTT TTG ACT TCT ATC TTA GTG GGC CAT CTT GTT GAA TTA GAG 1023Phe Leu Thr Ser Ile Leu Val Gly His Leu Val Glu Leu Glu

220 225 230GAG GCA GAT GCC TGT GGT ATG AAC CTT TAT GAT ATA CGT GAA 1065Glu Ala Asp Ala Cys Gly Met Ash Leu Tyr Asp Ile Arg Glu

235 240 245AGA AAA TTC ATG TAT GAG CTA CTA CAT CTA ATT GAT AGT TCT 1107Arg Lys Phe Met Tyr Glu Leu Leu His Leu Ile Asp Ser Ser

250 255TCT AAG GAT AAA ACT ATC AGA CAA AAA TTA ATG AGA GCA CCC 1149Ser Lys Asp Lys Thr Ile Arg Gln Lys Leu Met Arg Ala Pro260 265 270ATG AAA AAT TTG ATA GCG GGT ACCA TCT GTA AA TAT TTT ATT 1191Met Lys Asn Leu Ile Ala Gly Thr Ile Cys Lys Tyr Phe Ile

275 280 285GAG AAG TAC GGT TTC AAT ACA AAC TGC AAG GTC TCT CCC ATG 1233Glu Lys Tyr Gly Phe Asn Thr Ash Cys Lys Val Ser Pro Met

290 300 305ACT GGG GAT ATT TTA GCC ACT ATA TGT TCT TTA CCC CTG CGG 1275Thr Gly Asp Asn Leu Ala Thr Ile Cys Ser Leu Pro Leu Arg

310 320 325AAG AAT GAC GTT CTC GTT TCC CTA GGA ACA AGT ACT ACA GTT 1317Lys Asn Asp Val Leu Val Ser Leu Gly Thr Ser Thr Thr Val

330 335CTT CTG GTC ACC GAT AAG TAT CAC CCC TCT CCG AAC TAT CAT 1359Leu Leu Val Thr Asp Lys Tyr His Pro Ser Pro Asn Tyr His340 345 350CTT TTC ATT CAT CCA ACT CTG CCA AAC CAT TAT ATG GGT ATG 1401Leu Phe Ile His Pro Thr Leu Pro Asn His Tyr Met Gly Met

355 360 365ATT TGT TAT TGT AAT GGT TCT TTG GCA AGG GAG AGG ATA AGA 1443Ile Cys Tyr Cys Asn Gly Ser Leu Ala Arg Glu Arg Ile Arg

370 375 380GAC GAG TTA AAC AAA GAA CGG GAA AAT AAT TAT GAG AAG ACT 1485Asp Glu Leu Asn Lys Glu Arg Glu Asn Asn Tyr Glu Lys Thr

385 390 400AAC GAT TGG ACT CTT TTT AAT CAA GCT GTG CTA GAT GAC TCA 1527Asn Asp Trp Thr Leu Phe Asn Gln Ala Val Leu Asp Asp Ser

405 410GAA AGT AGT GAA AAT GAA TTA GGT GTA TAT TTT CCT CTG GGG 1569Glu Ser Ser Glu Asn Glu Leu Gly Val Tyr Phe Pro Leu Gly415 420 425GAG ATC GTT CCT AGC GTA AAA GCC ATA AAC AAA AGG GTT ATC 1611Glu Ile Val Pro Ser Val Lys Ala Ile Asn Lys Arg Val Ile

430 435 440TTC AAT CCA AAA ACG GGT ATG ATT GAA AGA GAG GTG GCC AAG 1653Phe Asn Pro Lys Thr Gly Met Ile Glu Arg Glu Val Ala Lys

445 450 455TTC AAA GAC AAG AGG CAC GAT GCC AAA AAT ATT GTA GAA TCA 1695Phe Lys Asp Lys Arg His Asp Ala Lys Asn Ile Val Glu Ser

460 465 470CAG GCT TTA AGT TGC AGG GTA AGA ATA TCT CCC CTG CTT TCG 1737Gln Ala Leu Ser Cys Arg Val Arg Ile Ser Pro Leu Leu Ser

475 480GAT TCA AAC GCA AGC TCA CAA CAG AGA CTG AAC GAA GAT ACA 1779Asp Ser Asn Ala Ser Ser Gln Gln Arg Leu Asn Glu Asp Thr485 490 495ATC GTG AAG TTT GAT TAC GAT GAA TCT CCG CTG CGG GAC TAC 1821Ile Val Lys Phe Asp Tyr Asp Glu Ser Pro Leu Arg Asp Tyr

500 505 510CTA AAT AAA AGG CCA GAA AGG ACT TTT TTT GTA GGT GGG GCT 1863Leu Asn Lys Arg Pro Glu Arg Thr Phe Phe Val Gly Gly Ala

515 520 525TCT AAA AAC GAT GCT ATT GTG AAG AAG TTT GCT CAA GTC ATT 1905Ser Lys Asn Asp Ala Ile Val Lys Lys Phe Ala Gln Val Ile

530 535 540GGT GCT ACA AAG GGT AAT TTT AGG CTA GAA ACA CCA AAC TCA 1947Gly Ala Thr Lys Gly Asn Phe Arg Leu Glu Thr Pro Asn Ser

545 550TGT GCC CTT GGT GGT TGT TAT AAG GCC ATG TGG TCA TTG TTA 1989Cys Ala Leu Gly Gly Cys Tyr Lys Ala Met Trp Ser Leu Leu555 560 565TAT GAC TCT AAT AAA ATT GCA GTT CCT TTT GAT AAA TTT CTG 2031Tyr Asp Ser Asn Lys Ile Ala Val Pro Phe Asp Lys Phe Leu

570 575 580AAT GAC AAT TTT CCA TGG CAT GTA ATG GAA AGC ATA TCC GAT 2073Asn Asp Asn Phe Pro Trp His Val Met Glu Ser Ile Ser Asp

585 590 595GTG GAT AAT GAA AAT TGG ATC GCT ATA ATT CCA AGA TTG TCC 2115Val Asp Asn Glu Asn Trp Ile Ala Ile Ile Pro Arg Leu Ser

600 605 610CCT TAAGCGAACT GGAAAAGACT CTCATCTAAA ATATGTTTGA ATAATTTATC 2168ProATGCCCTGAC AAGTACACAC AAACACAGAC ACATAATATA CATACATATA 2218TATATATCAC CGTTATTATG CGTGCACATG ACAATGCCCT TGTATGTTTC 2268GTATACTGTA GCAAGTAGTC ATCATTTTGT TCCCCGTTCG GAAAATGACA 2318AAAAGTAAAA TCAATAAATG AAGAGTAAAA AACAATTTAT GAAAGGGTGA 2368GCGACCAGCA ACGAGAGAGA CAAATCAAAT TAGCGCTTTC CAGTGAGAAT 2418ATAAGAGAGC ATTGAAAGAG CTAGGTTATT GTTAAATCAT CTCGAGCTC 2467

Claims

1.一种重组酵母，它含有引入的能编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶及木酮糖激酶的基因，和该酵母能有效地将木糖发酵为乙醇。

2.权利要求1的重组酵母，其中该酵母也能有效地将葡萄糖发酵为乙醇。

3.权利要求2的重组酵母，其中该酵母是酵母属(Saccharomyces)的。

4.权利要求3的重组酵母，其中所述各基因与不被葡萄糖抑制的启动子融合，和该酵母能同时有效地将葡萄糖和木糖发酵为乙醇。

5.重组DNA分子，它含有编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因。

6.权利要求5的重组DNA分子，其中所述各基因与不被葡萄糖抑制的启动子融合。

7.一种载体，它能有效转化酵母并含有能编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因。

8.权利要求7的载体，其中所述各基因与不被葡萄糖抑制的启动子融合。

9.得到能有效地将木糖发酵为乙醇的重组酵母的方法，包括将DNA引入到酵母中，使得该酵母具有引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶及木酮糖激酶的基因。

10.权利要求9的方法，其中该引入的DNA包含编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶及木酮糖激酶的基因。

11.权利要求9的方法，其中所述的酵母是酵母属(Saccharomyces)的。

12.一种将木糖发酵为乙醇的方法，包括用一含引入的能编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因的重组酵母发酵含木糖的培养基，并有效地将木糖发酵为乙醇。

13.权利要求12的方法，其中所述培养基也含有葡萄糖，酵母也能有效地将该葡萄糖发酵为乙醇。

14.权利要求13的方法，其中所述酵母是酵母属(Saccharomyces)的。

15.权利要求14的方法，其中所述基因与不被葡萄糖抑制的启动子融合，该酵母能同时有效地将葡萄糖和木糖发酵为乙醇。

16.一种将葡萄糖发酵为乙醇的方法，包括用一含引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶及木酮糖激酶基因的重组酵母发酵一含有葡萄糖的培养基，并有效地将木糖和葡萄糖发酵为乙醇。

17.权利要求16的方法，其中所述培养基也含有木糖。

18.权利要求17的方法，其中所述酵母是酵母属(Saccharomyces)的。

19.一种重组酵母，它含有编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶及木酮糖激酶的基因，其中，所述各基因与不被葡萄糖抑制的启动子融合，所述酵母能有效地将木糖发酵为乙醇。

20.权利要求19的重组酵母，其中该酵母也能有效地将葡萄糖发酵为乙醇。