JPH09505469A

JPH09505469A - グルコースおよびキシロースの効果的発酵用の組み換え酵母

Info

Publication number: JPH09505469A
Application number: JP7513948A
Authority: JP
Inventors: ホー，ナンシー・ダブリュー・ワイ; ツァオ，ジョージ・ティー
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 1993-11-08
Filing date: 1994-11-08
Publication date: 1997-06-03
Also published as: US5789210A; DE69434291D1; AU1051795A; BR9408010A; FI119433B; PL176399B1; ATE290589T1; FI961926A; EP0728192A4; UA48125C2; EP0728192A1; ES2238072T3; AU695930B2; CN1128873C; DE69434291T2; CN1141057A; PL314297A1; EP0728192B1; WO1995013362A1; CA2176038A1

Abstract

(57)【要約】キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含有する組み換え酵母、並びに、そのような酵母を製造するのに有用なＤＮＡ分子、ベクターおよび方法が記載される。この組み換え酵母は、キシロースをエタノールへと効果的に発酵し、好ましい酵母はグルコースとキシロースをエタノールへと同時に発酵することができ、それにより、これらの２種の糖源が農業的バイオマスに存在する場合には、それらを十分に利用することができるようになる。

Description

【発明の詳細な説明】グルコースおよびキシロースの効果的発酵用の組み換え酵母発明の背景本発明は一般的には、セルロース性バイオマスの２つの主要な糖成分であるグルコースとキシロースとをエタノールへと同時に発酵することのできる遺伝的に操作した酵母に関する。さらに詳細には、本発明は、グルコースをエタノールへと発酵することのできる酵母中にキシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、およびキシルロキナーゼ遺伝子をクローニングすることによって構築することのできる上記のような酵母に関する。最近の研究により、エタノールが自動車用の理想的液体燃料であることが分かっている。それは、純正燃料（１００％エタノール）として、または多様な濃度でのガソリンとの配合物として、直接使用することができる。ガソリンを補うか代替するためのエタノールの使用により、多くの国は輸入外国油への依存を減少することができ、また輸送用の再生可能な燃料を提供することができる。さらに、エタノールは、通常のガソリンより、環境中への汚染の放出が非常に少ないより清潔な燃料であることが分かっている。例えば、ガソリン中の酸素含有（oxygenated）物質の使用により有害な汚染物質である一酸化炭素の空気中への放出を減少できることが証明されている。ガソリンの酸素含有量を増大させるために現在使用されているいくつかの酸素含有物質の中で、エタノールは最高の酸素含有量を有している。米国環境保護局（ＥＰＡ）は、１０％のエタノールを配合したガソリンが一酸化炭素の放出を約２５％〜３０％減少することを示している。今日までの所、発酵による工業用アルコールの製造のために使用されている原料は、サトウキビまたはビートからの糖類、トウモロコシまたは他の食用作物からのでんぷんであった。しかし、これらの農業作物は非常に高価であるため、燃料エタノールの大規模製造用の原料として使用することはできない。植物バイオマスは再生可能であり、低価格で大量に入手できるため、発酵によるエタノール燃料製造用の魅力的な原料である。農業的バイオマスからの糖類の微生物発酵により生産されたアルコールを使用するという概念は、少なくとも２０年前には出現していた。セルロース性物質からの主要な発酵可能な糖類は、グルコースとキシロースである（キシロースに対するグルコースの比率は１に対して約２から３である）。セルロース性物質の最も望ましい発酵は、勿論、グルコースとキシロースの両方をエタノールへと完全に転化するであろう。不幸なことに、今日でさえ、グルコースとキシロースの両方を効果的に発酵できる単一の天然微生物は知られていない。酵母、特にSaccharomycesは、グルコースに基づく原料をエタノールへと発酵するために伝統的に使用されており、それらは依然としてグルコースをエタノールへと転化するための最高の微生物である。しかし、これらのグルコース発酵酵母はキシロースを発酵できないばかりか、ペントース糖を生育のために使用できないことも分かっている。それにもかかわらず、これらのグルコース発酵酵母は、効率は多様であるけれども、生育および発酵のためにキシルロースを使用することができる（図１）。例えば、S．cerevisiaeはキシルロースをごく僅かに発酵する一方、Schizosaccharomycesの種は、非常に効果的にそれを行う（Chiang et al.，1981; Lastick et al.，1989）。グルコース発酵酵母は生育と発酵の両方のためにキシロースを使用することができないとしても、キシロースを好気的に生育のために使用することができる天然酵母は多数存在するが、それらはキシロースをエタノールへと発酵することはできない。これらのキシロースを使用し／発酵しない酵母は、２種の酵素（キシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼ）に依存して、キシロースをキシルロースへと転化する。これらの酵母は、単一の酵素（キシロースイソメラーゼ）に依存してキシロースを直接的にキシルロースへと転化する多くの細菌とは異なる（図１）。酵母キシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼはまた、その作用のために補因子を必要とする；キシロースレダクターゼはその補因子としてのＮＡＤＰＨに依存し、キシリトールデヒドロゲナーゼはその補因子としてのＮＡＤに依存する。対照的に、細菌キシロースイソメラーゼはキシロースのキシルロースへの直接転化のために補因子を必要とはしない（図１）。２０年前、グルコースとキシロースの両方をエタノールへと効果的に発酵することのできる新規な酵母を見つけようとする試みに多くの努力が捧げられた。そのような理想的酵母は見つからなかったけれども、これらの努力は限定された成功を収めた。例えば、数種の酵母は、好気的に生育のためにキシロースを利用できるのみならず、キシロースをエタノールへと発酵することができることが判明したが(Toivola et al.，1984; Dupreez および vander Walt，1983)、これらのキシロース発酵酵母はいずれもキシロースをエタノールへと発酵するのに完全には効果的ではなかった（Jeffries，1985）。さらに、これらの酵母はグルコースを効果的に発酵することができない。キシロース発酵酵母の中では、３つの種、Pachysolen tannophilus(Toivola e t al.，1984)、Candida shehatae(Dupreez および van der Walt，1983)、およびPichia stipitis（Grootjen et al.，1990）が広く同定されている。P．stipi tis および C．shihatae は他のキシロース発酵酵母よりも良好にキシロースを発酵する(Grootjen et al.，1990)。それにもかかわらず、この最高のキシロース発酵酵母でさえキシロースの発酵に関して高い効率性を欠いており、またグルコースの発酵に関しても非常に効果的でない（Jeffries，1985）。過去１０年に、組み換えＤＮＡ技術によって、伝統的なグルコース発酵酵母、特にはS．cerevisiae を遺伝的に改良するための努力もなされてきた。最初の努力は、キシロースイソメラーゼ遺伝子を酵母中にクローニングして、酵母が補因子に依存することなしにキシロースをキシルロースへと直接転化することができるようにすることに集中した。しかし、各種の細菌キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子はS．cerevisiae中で活性酵素の合成を行うことができないために、これらの努力は不成功であった(Rosenfeld et al.，1984; Ho et al.，1983 ; Sarthy et al.，1987; Wilhelm および Hollenberg，1984; Amore et al.，19 89)。最近の数年は、キシロースを発酵するために、酵母、特にはS．cerevisiae を遺伝的に操作することに向けての努力が、キシロースレダクターゼ（Takama et al.，1991; Hallborn et al.，1991; Strasser et al.，1990）、キシリトールデヒドロゲナーゼ(Koetter et al.，1990; Hallborn et al.，1990)、およびキシルロキナーゼ（Stevis et al.，1987; Chang および Ho，1988; Ho および Ch ang，1989; Deng および Ho，1990）をコードする遺伝子をクローニングすることに集中している。S．cerevisiae および他のグルコース発酵酵母は、検出可能なキシロースレダクターゼまたはキシリトールデヒドロゲナーゼ活性を全く含有していないが、全てがキシルロキナーゼ活性を含有しているらしい。即ち、グルコース発酵酵母は全てキシルロースを発酵することができるが、その効率は相違している（Deng および Ho，1990）。最近、Koetter et al．(1990)，Strasser et al．(1990)，および Hallborn e t al.（1990; 1991）が、キシロースレダクターゼとキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の両方を S．cerevisiae 中にクローニングした。しかし、これらの遺伝的に操作した酵母は依然としてキシロースを効果的に発酵することができない。例えば、これらの酵母は２％以上のキシロースを発酵することができなかった。さらに、それらはキシロースから大量のキシリトールを生産し(Hallborn et al.，1990; Koetter および Ciriacy，1993)、貴重なキシロース基質をエタノールへの望ましい発酵経路からそらしてしまう。上記概説した本分野の広い背景は、多数の研究者の協調した長年の努力にもかかわらず、グルコースとキシロースの両方をエタノールへと効果的に発酵できる酵母は得られていないことを示している。従って、そのような酵母、並びにその製造および使用の方法に対する要求が依然として存在する。本発明はこれらの要求に対して向けられるものである。発明の要旨本発明の特徴は、キシロースを単独にまたはグルコースと同時に効果的に発酵することができる新規な酵母株を、組み換えＤＮＡおよび遺伝子クローニング技術を用いて創造することができるという発見に関するものである。特に、これらの技術は、グルコースの存在によって抑制されないプロモーターに融合されているクローニングされたキシロースレダクターゼ（ＸＲ）、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤ）、およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）遺伝子を含有する新規な組み換え酵母を創造するために使用されている。従って、本発明の一つの好ましい態様は、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする導入された遺伝子を含有し、キシロースをエタノールへと発酵することのできる、組み換え酵母株を提供する。この組み換え酵母株は、好ましくは、グルコースをエタノールへと発酵することもでき、そして、これらの２種の糖類をエタノールへと同時に効果的に発酵できるさらに好ましい上記の酵母株は、ＸＲ、ＸＤおよびＸＫ遺伝子を、グルコースの存在によって抑制されず、誘導のためにキシロースを必要としないプロモーターに融合する場合に得られる。本発明のもう一つの好ましい態様は、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含有する組み換え酵母株であって、上記遺伝子が非グルコース抑制プロモーターに融合しており、上記酵母がキシロースをエタノールへと発酵できる、上記の酵母株を提供する。組み換え酵母株は好ましくは、グルコースをエタノールへと発酵することもできる。本発明の他の好ましい態様は、本発明の組み換え酵母の製造に有用な試薬に関する。即ち、本発明はまた、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、およびキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含む組み換えＤＮＡ分子をも提供する。同様に、本発明は、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含むベクターを提供する。これらの試薬において、当該遺伝子は好ましくは、グルコースによって抑制されず、また誘導のためにキシロースを必要としないプロモーターに融合しており、その結果、グルコースとキシロースをエタノールへと同時に発酵できる組み換え酵母を適切に製造することが可能になる。本発明のもう一つの好ましい態様は、キシロースをエタノールへと発酵できる組み換え酵母を得るための方法を提供する。この方法は、酵母中にＤＮＡを導入して、酵母がキシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする導入遺伝子を有するようにする工程を含む。好ましくは、これらの遺伝子は、グルコースとキシロースのエタノールへの同時発酵が可能になるように非グルコース抑制プロモーターに融合されている。有利なことに、これらの３つの遺伝子は全て、例えば上記のような本発明の試薬を用いて、同時に導入することができる。本発明のさらに他の好ましい態様は、キシロースまたはグルコースをエタノールへと発酵するための方法を提供する。本発明の方法は、キシロース含有またはグルコース含有培地を、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする導入遺伝子を含有する組み換え酵母株とともに発酵する工程を含む。望ましくは、３つの導入遺伝子は非グルコース抑制プロモーターに融合しており、培地はグルコースとキシロースの両方を含み、その結果キシロースとグルコースのエタノールへの同時発酵がもたらされる。本発明のさらに別の好ましい態様、特徴および利点は、以下の説明から明らかであろう。図面の簡単な説明図１は、細菌および酵母中でのキシロース代謝の初期段階に関連した酵素の概要図式である。図２は、５’−および３’−フランキング配列を含む酵母キシルロキナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。開始コドンおよび停止コドンには下線が付されている。５’−および３’−非コード領域中の可能な調節配列は矢印によって示される。図３は、プラスミドｐＬＳＫ１５上にクローニングされた遺伝子および当該プラスミドの制限地図を示す。図４は、プラスミドｐＵＣＫｍ１０上にクローニングされた遺伝子および当該プラスミドの制限地図を示す。図５は、プラスミドｐＬＮＨ２１上にクローニングされた遺伝子および当該プラスミドの制限地図を示す。図６Ａは、組み換え酵母ＳＣ（ｐＬＮＨ２１）（導入されたＸＲ、ＸＤおよびＸＫ遺伝子を含有するS．cerevisiae）とともにキシロースを（１）２日間；および（ＩＩ）４日間、発酵することによって得られた発酵ブロスのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図６Ｂは、組み換え酵母ＳＣ（ｐＬＮＨ１３−３２）（導入されたＸＲおよびＸＤ遺伝子を含有するがＸＫ遺伝子を含有しないS．cerevisiae）とともにキシロースを（１）２日間；および（ＩＩ）６日間、発酵することによって得られた発酵ブロスのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図６Ｃは、実施例６でさらに説明するように、未操作のS．cerevisiae酵母（導入されたＸＲ、ＸＤまたはＸＫ遺伝子を含有しない）とともにキシロースを（１）２日間；および（ＩＩ）７日間、発酵することによって得られた発酵ブロスのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図７は、プラスミドｐＬＮＨ３３上にクローニングされた遺伝子および当該プラスミドの制限地図を示す。図８Ａは、実施例８でさらに説明するように、未操作の酵母株１４００（導入されたＸＲ、ＸＤまたはＸＫ遺伝子を含有しない）とともにグルコース−およびキシロース−含有培地（各々１０％と５％）を（１）０日間；および（ＩＩ）２日間発酵することによって得られた発酵ブロスのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図８Ｂは、実施例８でさらに説明するように、組み換え酵母１４００（ｐＬＮＨ３３）（導入されたＸＲ、ＸＤおよびＸＫ遺伝子を含有する酵母１４００）とともにグルコース−およびキシロース−含有培地（各々１０％と５％）を（１）０日間；および（ＩＩ）２日間、発酵することによって得られた発酵ブロスのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図９は、クローニングされたＸＲ、ＸＤ、およびＸＫ遺伝子を含有するpBlues cript II KS（-）の構築の概略を示す概要図式である；実施例４でさらに説明するように、４つのそのようなプラスミドを構築した：ｐＫＳ（−）−ＫＫ−Ａ★ Ｒ−ＫＤ−１；ｐＫＳ（−）−ＫＫ−Ａ★Ｒ−ＫＤ−２；ｐＫＳ（−）−ＫＫ− ＡＲ−ＫＤ−３；およびpＫＳ（−）−ＫＫ−ＡＲ−ＫＤ−４。図１０は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって P．stipitis染色体ＤＮＡからの完全なキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびプロモーター不在のＸＤの直接増幅を示す；左から、レーン１：分子マーカー、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで切断したλＤＮＡ；レーン２：Pichia のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子（完全）；レーン３：Pichia のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子（プロモーター不在）；およびレーン４：分子マーカー、ＨａｅIIIで切断したφＸＤＮＡ図１１は、酵母キシルロキナーゼ遺伝子の配列決定に使用した戦略を図式で示す。図１２は、プラスミドｐＬＮＨ２１の構築の概略を示す概要図式である。図１３は、S．cerevisiae ＳＣ（ｐＬＮＨ１３−３２）（ＸＲおよびＸＤ遺伝子のみを含有する）とともにグルコース（１０％）とキシロース（５％）の混合物を（１）０日間；（ＩＩ）２日間；および（ＩＩＩ）５日間、発酵することによって得られた発酵ブロスのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１４は、未操作のPichia stipitis とともにグルコース（１０％）とキシロース（５％）の混合物を（１）０日間；（ＩＩ）３日間；および（ＩＩＩ）５日間、発酵することによって得られた発酵ブロスのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。詳細な説明さて、本発明の原理の理解を促進する目的のために、その一定の態様に言及することとし、特定の言葉がそれを説明するために使用されるであろう。しかしながら、それによって本発明の範囲の限定が意図されるわけではないことが理解され、本明細書中に例示されるような本発明の原理の代替、さらなる改良および応用は本発明と直接の関係がある当業者により通常行われるであろうことが理解される。本発明は、ＸＲ、ＸＤおよびＸＫ遺伝子を含む、組み換え酵母、ＤＮＡ分子およびベクターを提供する。当該遺伝子は、広く多様な微生物で生じることが周知であり、事実、本明細書中の上記議論の通りに、多数のＸＲ、ＸＤおよびＸＫ遺伝子が同定かつ単離されている。これらの遺伝子の特定の源は本発明の広い側面にとって重要ではない；むしろ、キシロースレダクターゼ活性（補因子としてのＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨとともにＤ−キシロースをキシリトールへと転化する能力）、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性（補因子としてのＮＡＤ⁺とともにキシリトールをＤ−キシルロースへと転化する能力）、またはキシルロキナーゼ活性（Ｄ−キシルロースをＤ−キシルロース−５−ホスフェートへと転化する能力）を有するタンパク質（酵素）をコードする任意のＤＮＡが適当であろう。これらの遺伝子は天然由来の遺伝子として得てもよいし、または、例えば、コードされるタンパク質が依然としてＸＲ、ＸＤまたはＸＫ活性を有する限りは、天然由来の遺伝子に対するまたはそれの、塩基の付加、置換または欠失によって、改良してもよい。同様に、得られるＤＮＡが所望のＸＲ、ＸＤまたはＸＫ活性を示すタンパク質をコードする限りは、その部分の遺伝子を既知の技術によって合成的に製造してもよい。例えば、ＸＲおよびＸＤ遺伝子の好適な源には、Candida shehatae，Pichia s tipitis ，Pachysolen tannophilus 等のキシロース利用酵母が含まれ、ＸＫ遺伝子の好適な源には、上記のキシロース利用酵母、並びに、Saccharomyces属、例えばS．cerevisiae、Schizosaccharomyces属、例えばSchizosaccharomyces pomb e からのもの等のキシロース非利用酵母、およびEscherichia coli、Bacillus種、Streptomyces種等の細菌等が挙げられる。対象の遺伝子は慣用技法を用いてこれらの源から取り出すことができる。例えば、ハイブリダイゼーション、相補性またはＰＣＲ技術をこの目的のために用いることができる。本明細書中の本出願人の研究において使用した特定のＸＲ遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってP．stipitisからクローニングした（Chen および Ho，1993）。ＰＣＲによる染色体ＤＮＡからのＸＲの増幅のために必要なオリゴヌクレオチドは、P、stipitis ＸＲ遺伝子の発表された配列に従って合成した(Takama et al.，1991)。増幅したＸＲを最初にプラスミドｐＵＣ１９中にクローニングして保存した。クローニングしたＸＲを次いで、酵母ＴＲＰ５遺伝子（Zalkin および Yanofsky，1982）および酵母アルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子（ＡＤＣＩ）(Ammerer，1983; Bennetzen および Hall，1982)のプロモーターを含む異なるプロモーターに融合した。本出願人の研究で使用したＸＤ遺伝子もまた、ＰＣＲによってP．stipitisからクローニングした。Pichia染色体ＤＮＡからのＸＤの増幅のために必要なオリゴヌクレオチドは、PichiaＸＤ遺伝子の発表された配列に従って合成した（Koet ter et al.，1990）。増幅したＸＤも最初にｐＵＣ１９中にクローニングして保存した。次いで遺伝子を、続いて、酵母ピルベートキナーゼ遺伝子（ＰＹＫ）（ Burke et al.，1983）および酵母グリセルアルデヒド３ホスホデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＰＤ）（Holland および Holland，1979）の解糖プロモーターに融合させた。本出願人は、３種の異なるＸＫ遺伝子、即ち、S．cerevisiae（Ho および Cha ng，1982）、P．tannophilus（Stevis et al.，1987）およびE．coliからの遺伝子をクローニングし、これら３種の遺伝子の全てを非常に効率的な酵母プロモーターへの融合後にS．cerevisiae中で効果的に発現できることを見いだした。クローニングされたS．cerevisiaeキシルロキナーゼ遺伝子を本明細書中に記載する例示的実験において使用した。酵母ＸＫ遺伝子を好適なプロモーターに適切に融合するのを助けるために、５’および３’非コード配列を含む S．cerevisiae ＸＫ遺伝子の完全なヌクレオチド配列を分析したので、それを図２中に示す。広範囲の多様なプロモーターが本発明での使用に好適であろう。広く言えば、ＸＲ、ＸＤまたはＸＫ遺伝子の転写を調節できる酵母適合性プロモーターが使用されるであろう。そのようなプロモーターは、酵母、細菌、および他の細胞源を含む多数の既知の源から入手できる。好ましくは、本発明で使用されるプロモーターは、誘導のためにキシロースを必要としない、効率的な非グルコース抑制プロモーターである。この点、本明細書中で使用される「効率的な」プロモーターとは、融合遺伝子の高水準の転写をもたらすプロモーターのことを言う。これらの特徴を有するプロモーターもまた広く入手でき、本発明でのその使用は、本明細書中の教示が付与されれば、通常の技術を有する当業者の理解の範囲内のもであり、プロモーターのＸＲ、ＸＤおよびＸＫ遺伝子への融合、適切なベクター中へのプロモーター／遺伝子融合産物のクローニング、および酵母を形質転換するためのベクターの使用も同様である。これらの操作は全て、当業者および文献に周知の慣用の遺伝子操作技術を用いて実施できる。本明細書中の本出願人の例示的実験をさらに詳細に説明すると、酵母キシルロキナーゼ遺伝子、ＸＫを、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＣ１）、酵母ピルベートキナーゼ遺伝子（ＰＹＫ）、酵母ＴＲＰ５−遺伝子、等からのプロモーターに融合させた。ＴＲＰ−５プロモーターに融合したＸＫを使用してｐＬＮＨ２１を構築し（図５）、ＰＹＫプロモーターに融合したＸＫを使用してｐＬＮＨ３３を構築した（図７）。ＡＤＣ１、ＰＹＫ、ＧＰＤ、等からの完全なプロモーターへのＸＲ、ＸＤ、およびＸＫの融合は、特定のプロモーターを含む断片とＸＲ、ＸＤ、またはＸＫの構造遺伝子との両方を、Bluescript KS プラスミド（Stratagene，La Jolls，CA ）の一つにクローニングし、その後に部位特異的突然変異誘発（Kunkel etal.， 1987）によって余計な不必要なヌクレオチドを除去することによって実施した。即ち、本発明はまた、クローニングされたＸＤ（ピルベートデヒドロゲナーゼプロモーターに融合した）、ＸＲ（ＡＤＣＩプロモーターに融合した）、およびＸＫ（ピルベートキナーゼプロモーターに融合した）を含む数種のpBluescript II KS（-）（本明細書中以後ｐＫＳ（−）とする）誘導体を提供する。これらの組み換えプラスミドはｐＫＳ（−）ＫＤ−ＡＲ（またはＡ★Ｒ）−ＫＫと称される。４種のこのようなプラスミドは図９に概要を示すように構築した。これらのプラスミドは類似しているが同一ではない構造を有している。これらのプラスミド上にクローニングされたＸＲ、ＸＤ、およびＸＫ（またはＫＤ−ＡＲ（またはＡ★ Ｒ）−ＫＫ）は、１回のＸｈｏＩ制限消化によって親ｐＫＳ（−）プラスミドから分離することができる。次いで、適切なプロモーターに融合したＸＲ、ＸＤ、およびＸＫ遺伝子をｐＬＳＫ１５（図３）またはｐＵＣＫｍ１０（図４）上にクローニングした。ｐＬＳＫ１５、即ちｐＬＸ１０−１４の誘導体（Stevis および Ho.，1985）は、酵母（S．cerevisiae）中で約１０のコピー数を有する低コピー数プラスミドである。それは、プラスミドが S．cerevisiaeおよび密接な関連種の中で自動的に複製されることを可能にする酵母の２μレプリコンを含有する。ｐＬＳＫ１５はまたS．cerevisiae および他の酵母中で選択マーカーとしての役割を果たすジェネチシン（geneticin）（カナマイシン）耐性遺伝子（Ｋｍ^R）およびアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ^Rそしてまたａｍｐ^r）を含有している。ｐＬＳＫ１５はまた、酵母ＴＲＰ−５プロモーターに融合したＸＫ遺伝子を含有している。かくして、好適なプロモーターを含む適切な５’非コード配列に融合したＸＲと５ＸＤ遺伝子をｐＬＳＫ１５中に挿入して、酵母キシロース発酵に対する得られたプラスミドの影響を示した。酵母キシロース発酵に対する異なる遺伝子の存在の影響を比較するために、ＸＲおよびＸＤのみを含有するプラスミドも使用して、S．cerevis iae を形質転換し、得られた酵母を比較発酵で使用した。未操作のS．cerevisia e 、クローニングされたＸＲ、ＸＤ、およびＸＫを含む酵母（ＳＣ（ｐＬＮＨ２１））、およびクローニングされたＸＲとＸＤを含むがＸＫ遺伝子を含まない酵母（ＳＣ（ｐＬＮＨ１３−３２））によるキシロースの発酵の結果を図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃ中に示す。ｐＵＣＫｍ１０（図４）は、S．cerevisiae中で１００近いコピー数を有する高コピー数プラスミド（即ち、約５０以上のコピー数を有するプラスミド）である。ｐＵＣＫｍ１０は同一の２μレプリコンを含有するｐＵＣ９誘導体であり、Ｋｍ^R、およびＡｐ^R遺伝子がｐＬＳＫ１５中に存在している。これらの特定のＤＮＡ断片はレプリコンおよび選択マーカーとしての役割を果たし、これによりプラスミドが S．cerevisiae中で（および関連酵母において）自動的に複製されることが可能になり、またプラスミドを含有する酵母形質転換体を形質転換されていない宿主細胞から区別することが可能になる。本出願人は、好適なプロモーターを含む５’の適切な非コード配列に融合した同一のＸＲ、ＸＤ、およびＸＫを含むｐＵＣＫｍ１０に基づく組み換えプラスミドを構築した。これらのベクターは、S．cerevisiae株および関連種の株の全てを形質転換するのに有用となるように設計されている。受容株として作用するために特別の変異体は必要ではない。従って、ｐＬＮＨ３３（図７）、並びにｐＬＮＨ２１（図５）等のプラスミドを使用して、工業用S．cerevisiaeおよび他の株を形質転換することができる。ｐＬＳＫ１５またはｐＵＣＫｍ１０のいずれかの誘導体による酵母の形質転換は、一般的にBeckerおよびGuarente(1991)により記載された操作を使用してエレクトロポレーションにより実施した。ｐＬＳＫ１５またはｐＵＣＫｍ１０のいずれかの誘導体を含む真正の酵母形質転換体を以下にさらに記載するように単離した。プラスミド中に存在するＫｍ^Rは一次選択マーカーとしての役割を果たし、これにより、これらのプラスミドの一つを取得した宿主細胞が、培地中に存在するはるかに高い濃度のジェネチシンに対して耐性となるようになる。しかし、いくつかの酵母細胞はプラスミドを含有する形質転換体のジェネチシンの同一レベルに対して耐性を有するように誘導される可能性がある。従って、ジェネチシン耐性コロニーの全てが真の形質転換体であるわけではない。Ａｐ^RはS．cerevisi ae 中で発現させることができるが、後者はＡｐ^Rの存在なしでアンピシリンに対して耐性であることが報告されている。従って、Ａｐ^Rは酵母プラスミド−仲介形質転換のための選択マーカーとしての役割を果たすことはできない。それにもかかわらず、高度に発現したＡｐ^Rを含む酵母は十分なペニシリナーゼを生産し、ペニシリナーゼ試験による特別の固体プレート上でそのような酵母を含むコロニーを同定することが可能である（Chevallier および Aigle，1979）。後者の試験は、ジェネチシン耐性コロニーからS．cerevisiaeおよび他の酵母の真の形質転換体を同定するための技術を提供している。酵母キシロース（またはキシロースおよびグルコース）発酵は、実施例６から９に記載したような嫌気的条件下で本発明の組み換え酵母を使用して実施した。糖類（キシロースおよびグルコース）の消費、並びに、エタノールおよび他の生成物、例えばキシリトールの形成を、実施例６にさらに記載するように、試料を採取してそれらをＨＰＬＣにより分析することによって発酵の間追跡した。例えば、ｐＬＮＨ２１（図５）を使用してS．cerevisiaeを形質転換した。ｐＬＮＨ２１を含有する得られた形質転換体はＳＣ（ｐＬＮＨ２１）と称され、図６Ａに示されるように２〜４日間で５％キシロースをほぼ完全にエタノールへと発酵することができる。さらなる例として、ｐＬＮＨ３３（図７）を使用して、S．cerevisiaeと密接に関連し、アルコールと温度に対して高い耐性を有する酵母株１４００を形質転換した（D'Amore et al.，1989; D'Amore，1990）。１４００（ｐＬＮＨ３３）と称される得られた遺伝的に操作した酵母は、図８Ａおよび８Ｂに示すように、高い細胞密度を必要とすることなく、１０％グルコースと５％キシロースをエタノールへと２〜４日間で完全に発酵することができる。ｐＬＮＨ３３はより高コピー数プラスミドであるため、キシロース発酵のためにはｐＬＮＨ２１より効果的なプラスミドである。さらに、ｐＬＮＨ３３中のＸＫはｐＬＮＨ２１中のＸＫよりも効率的なプロモーターに融合される。S．cerev isiae もまたｐＬＮＨ３３により形質転換し、これはＳＣ（ｐＬＮＨ３３）と称される。ＳＣ（ｐＬＮＨ３３）は、キシロースまたはキシロースとグルコースの混合物の発酵に関して、ＳＣ（ｐＬＮＨ２１）よりも効果的であるが、１４００（ｐＬＮＨ３３）は、グルコースとキシロースの混合物の発酵に関して、ＳＣ（ｐＬＮＨ３３）よりも効果的であることが分かった。即ち、個々の株もまた発酵の効率に影響する。S．cerevisiaeと同様に、未操作の株１４００は図８Ｂに示すようにキシロース（単独にまたはグルコースとキシロースの混合物中で）を使用または発酵することができない。一般的に、これらの発酵試験の結果により、酵母が、好適なプロモーター（好ましくはグルコース抑制を受けず、誘導のためにキシロースを必要としない効率的な解糖または他のプロモーター）に適切に融合している３種の導入遺伝子、ＸＲ、ＸＤ、およびＸＫを含んでいること、並びに、これらの遺伝子を対等に発現して酵母がキシロースをエタノールのみへと発酵することができ、キシリトール等の他の副生物へと発酵しないようにすることが必要であることが示される。この結果からさらに、酵母が効果的にキシロースを発酵するようにするためには、特には、セルロース性バイオマスの加水分解生成物中の場合のように、グルコースとキシロースが同一培地中に存在する場合に、これらの両方を同時に発酵するためには、ＸＲとＸＤに加えてキシルロキナーゼ遺伝子（ＸＫ）のクローニングが重要であることが示される。ＸＲおよびＸＤと同様に、クローニングされたＸＫは好ましくは、グルコース抑制を受けず、そして誘導のためにキシロースを必要としない好適な効率的な解糖または他のプロモーターに融合される。また、本出願人は、クローニングされたＸＲとＸＤのみを含む酵母が、グルコースとキシロースの両方の糖類が一緒に培養培地中に存在する場合に、グルコースのみをエタノールへと発酵できキシロースはエタノールへと発酵できないことを見いだした（図１３を参照）。さらに、P．stipitis および C．shihatae 等のキシロース発酵酵母を含む任意の酵母は、グルコースとキシロースの両方の糖類が一緒に培養培地中に存在する場合にそれらの両方をエタノールへと発酵することができるようになるためには、グルコースの存在によって抑制されず、誘導のためにキシロースの使用を必要としないプロモーターに融合したＸＲ、ＸＤおよびＸＫを含むことが必要であることが、本出願人の結果により示される。図１３は、グルコースとキシロースの両方の糖類が培養培地中に存在する場合に、適切なプロモーターに融合したクローニングされたＸＲとＸＤ遺伝子のみを含むS ．cerevisiae および関連種がグルコースのみをエタノールへと発酵でき、キシロースをエタノールへと発酵できないことを示している。同様に、図１４は、キシロース糖が培地の唯一の炭素源である場合には、その本来のＸＲ、ＸＤ、およびＸＫを含む未操作のP．stipitisはキシロースを発酵できるが（結果は示されていない）、グルコースとキシロースの両方の糖が同一培地中に存在する炭素源である場合には、それはキシロースを発酵できないことを示している。低レベルのキシルロキナーゼ活性を含むこれらの酵母に関して、ＸＫ遺伝子を導入することは２つの目的の役割を果たすことが理解されるであろう。一つは酵素活性のレベルを改善することである。高レベルのＸＫ活性はキシロースをキシリトールとは反対のエタノールへのより有利な酵母発酵のために重要である。もう一つの目的は、その遺伝子をグルコースの存在によって抑制されないであろう効率的なプロモーターの調節下に置くことである。酵母を含む天然の野生型微生物は、グルコースが培養培地中に存在する場合、生育および発酵のために他の糖類を使用できないことは周知である。グルコースは、他の糖分子を代謝するのに必要な酵素の合成を阻害するのであろう（いわゆる「グルコース」効果）。即ち、グルコースを除く糖分子代謝酵素の合成のための遺伝子からのプロモーターは、２種の豊富な糖類の同時発酵をもたらさないので好ましくないであろう。さらに、細胞生育も誘導のために必要条件であることが本出願人の実験中に分かった。即ち、誘導のためにキシロースを必要とするプロモーターは、ＸＲ、ＸＤまたはＸＫの発現のために好ましくない。本発明とその利点のさらなる理解を促進する目的のために、以下の実施例を提供する。これらの実施例は例示的なものであり、決して限定的なものではないことが理解されよう。実施例１ＰＣＲによるＸＲおよびＸＤ遺伝子の合成ＰＣＲによる完全またはプロモーター不在のＸＲの合成は以前に記載されている（Chen および Ho，1993）。ＰＣＲによるＸＤの合成のために、ＸＤのヌクレオチド配列に従う（Koetter et al.，1990）３種のオリゴヌクレオチドを合成したが、これを以下に掲げる。オリゴヌクレオチドＩ：ｐＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＣＧオリゴヌクレオチドＩＩ：ｐＣＡＣＡＣＡＡＴＴＡＡＡＡＴＧＡオリゴヌクレオチドＩＩＩ：ｐＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＧＡＡＧオリゴヌクレオチドＩとＩＩを使用して完全なＸＤ遺伝子を合成し、オリゴヌクレオチドＩＩとＩＩＩを使用して図１０に示すようにプロモーター不在のＸＤを合成した。完全なＸＤとプロモーター不在のＸＤを最初にｐＫＳ（−）プラスミド中にクローニングした。次いで、完全なＸＲをｐＵＣＫｍ１０上にサブクローニングし（図４）、得られたプラスミドｐＵＣＫｍ１０−ＸＤを使用して、実施例５に記載するようなエレクトロポレーションによってS．cerevisiaeを形質転換した。酵母形質転換体を使用してキシリトールデヒドロゲナーゼ活性を分析し、クローニングされた遺伝子が完全であり、S．cerevisiae中で発現できることを示した。実施例２酵母ピルベートキナーゼ遺伝子プロモーターへのプロモーター不在のＸＤ遺伝子の融合Ｐ_PKへのＸＤ遺伝子の融合を選択して、部位特異的突然変異誘発による完全なプロモーターへのキシロース代謝遺伝子の正確な融合を示す。これらのプロモーターは解糖プロモーターであるか、または培養培地中におけるグルコースの存在によって抑制されず、誘導のためにキシロースの存在を必要としないであろうプロモーターのいずれかである。 −９１０から＋２３までの酵母ピルベートキナーゼのプロモーター断片（Burk e et al.，1983）を、ＸＤ遺伝子の合成のために実施例１に記載したようにＰＣＲにより合成した。Ｐ_PK断片およびプロモーター不在のＸＤの両方をｐＫＳ（− ）プラスミド上にサブクローニングし、Ｐ_PKと完全なＸＤ構造遺伝子間の不要なヌクレオチドを、Kunkel（Kunkel，1987）の方法に従って部位特異的突然変異誘発によって除去した。得られた融合遺伝子はピルベートキナーゼ遺伝子からの− ９１０から−１プロモーター断片と、PichiaＸＤ遺伝子からの＋１から＋１９６３のヌクレオチドを含有している。Ｐ_PK−ＸＤ（またはＫＤ）を含む得られたｐＫＳ（−）プラスミドは、ｐＫＳ（−）−ＫＤまたはｐＫＤ２と称される。実施例３酵母キシルロキナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の分析酵母キシルロキナーゼ遺伝子を含む７．０ｋｂ酵母（S．cerevisiae）ＤＮＡ断片のクローニングは以前に報告されている（Ho および Chang，1989）。サブクローニングによって、ＸＫ遺伝子を２．４ｋｂ断片上に位置させた。２．４ｋｂ断片のヌクレオチド配列を分析した。５’−非コード領域は３４５ヌクレオチドを含み、翻訳された領域は２１１８ヌクレオチドを含み、ＸＫによってコードされたキシルロキナーゼは図２に示すような５９１アミノ酸を有している。ＸＫ遺伝子の配列決定のために使用した戦略は図１１に示す。実施例４完全なＡＤＣＩプロモーターの構築プラスミドｐＭＡ５６（Ammerer，1983）は、酵母アルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーター（Ｐ_ADCI）を含む。本出願人はこのプロモーターを使用して、本実験において遺伝子の幾つかを改良した。例えば、Ｐ_ADCIをＸＲに融合させて、得られた遺伝子をＰ_ADCI−ＸＲまたはＡＲと称した。それにもかかわらず、このＰ_ADCIは完全ではなく、完全なＡＤＣＩプロモーターの−１から−１４のヌクレオチドを含有していない（Bennetzen および Hall，1982）。遺伝子の領域−１から−１４はタンパク質合成を調節するために通常は非常に重要である。そのようなプロモーターに融合した遺伝子はいずれも、そのタンパク質生成物の合成を調節するためにその本来の遺伝的シグナルに依存しなければならない。ＡＤＣＩプロモーターに融合した遺伝子の発現をより良く調節するために、本出願人は部位特異的突然変異誘発を使用し、欠けているヌクレオチド（−１から −１４）をｐＭＡ５６上にクローニングされたＡＤＣＩプロモーターに加えた。この新規な完全なＡＤＣＩプロモーターをＰ_★ADCIと称する。このプロモーターを使用してＸＲを改良し、得られた遺伝子をＰ_★ADCI−ＸＲまたはＡ★Ｒと称する。実施例５プラスミドｐＬＮＨ２１（ｐＬＳＫ１５−ＫＤ−ＡＲとも称される）の構築およびｐＬＮＨ２１によるS．cerevisiaeと１４００の形質転換ｐＬＮＨ２１の構築は図１２に概要を示す。ｐＬＮＨ２１を使用して以下の条件下でエレクトロポレーションによってS．cerevisiaeおよび株１４００を形質転換した。初期対数期（Klett Unit（KU）130）まで生育した、５０ｍｌの酵母細胞を遠心して培地を除去し、冷水で２回、冷１Ｍソルビトールで１回洗浄し、２００μｌの１Ｍソルビトール中に再懸濁した。６０μｌの細胞を４ｍｌの予め滅菌したプラスチックチューブ（キャップ付き）中に移し、それに０．１μｇから１μｇのプラスミドＤＮＡを添加した。得られた細胞およびプラスミド混合物の５０μｌを０．２ｃｍの電極ギャップ付きの予め冷却した遺伝子パルサーキュベット中にピペットで入れ、キュベットの内容物を、２．０ＫＶ、２５μＦ、２００オームでパルス調節器付きの遺伝子パルサー（BioRad）によりパルスに付した。直後に、．５０ｍｌのＹＥＰＤ（１％酵母エキス、２％ペプトン、および２％グルコース）をキュベットに添加した。キュベットの内容物を新しい４ｍｌの滅菌プラスチックチューブに移し、３０℃で１時間インキュベートした。１００μ ｌの細胞をＹＥＰＤと５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（ジェネチシン）を含有する寒天プレート上にまいた。速やかに生育するコロニーを選択し、同じ培地を含む別のプレート上にレプリカを取った。選択したコロニーをアンピシリン試験（Chev allierおよびAigle，1979）に付し、陽性コロニーを同定した。上記のエレクトロポレーション操作は、BeckerおよびGuarente（1971）により報告されたものに基づくものである。Ｇ４１８耐性形質転換体の選択ための本出願人の方法は非常に効果的であり、ＹＥＰＤと５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するプレート上にレプリカを取った選択コロニーの大部分がペニシリナーゼ試験に関して陽性であった。ｐＬＮＨ２１または他のプラスミドによる株１４００の形質転換は、上記と同様の方法を用いて実施したが、細胞は１３０ＫＵではなく１４０〜１９０ＫＵまで生育させ、エレクトロポレーション後の形質転換体の最初の選択のためのＹＥＰＤプレートは５０ではなく４０μｇ／ｍｌのジェネチシンＧ４１８を含有させた。上記の方法による株１４００の形質転換はS．cerevisiaeの形質転換ほど効果的ではなかった。実施例６操作したＳＣ（ｐＬＮＨ２１）、ＳＣ（ｐＬＮＨ１３−３２）、および未操作の親S．cerevisiaeによるキシロースの発酵これらの３種の酵母を同一の条件下で好気的に富裕培地ＹＥＰＤ中で培養した（ＳＣ（ｐＬＮＨ１３−３２）は、ＸＲとＸＤ遺伝子／プロモーターの組み合わせのみを含有する、ｐＬＮＨ１３−３２と称されるプラスミドによりS．cerevis iae を形質転換することによって構築した。）。次いで、これらの酵母細胞を使用して同一の条件下で嫌気的にＹＥＰ（１％酵母エキス、２％ペプトン）培地中で５％キシロースを発酵した。キシロースの消費およびエタノールとキシリトールの形成を、適切な間隔で試料を採取し、それらを以下の条件下でＨＰＬＣにより分析することによって、発酵の間追跡した。培養物から取り出した発酵ブロス（０．６ｍｌから１．０ｍｌ）を含む試料を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中に保持した。細胞および他の残存物を最初に遠心によって除去した。上清を滅菌エアロディスク（Gelman Sciences）、０．２または０．４５ｍｍ、シリンジフィルターを用いることによってさらに濾過した。各試料から得られた濾液を、以下の条件に従って日立システムを用いて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、そのエタノール、グルコース、キシロースおよびキシリトール含有量に関して分析した。カラム： Aminex HPX-87C，３００×７．８ｍｍ移動相：水流速：０．８ｍｌ／分検出：日立Ｌ−３３５０ＲＩ検出器温度：８０℃ 注入量：２０μｌ図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃ（これらおよび他の図中のエタノールピークは、機器の感度のせいで要求されるよりも実際には２と１／２倍だけ小さい。）に示す結果は、クローニングされたＸＲ、ＸＤ、およびＸＫを含有する操作された酵母ＳＣ（ｐＬＮＨ２１）のみが、高濃度のキシロース（５％）をエタノールへと発酵することができ、未操作の親S．cerevisiae、およびクローニングされたＸＤとＸＲのみを含みＸＫを含まない操作されたＳＣ（ｐＬＮＨ１３−３２）はできなかったことを示している。ＳＣ（ｐＬＮＨ１３−３２）はキシロースを大部分はキシリトールへと発酵する。実施例８１４００（ｐＬＮＨ３３）による高濃度のグルコースとキシロースの両方のエタノールへの効果的発酵グルコースとキシロースの混合物（約１０％のグルコースと５％のキシロース）を同一条件下で株１４００および１４００（ｐＬＮＨ３３）によって発酵した。これらの酵母を適切な培地を含む寒天プレート上に保持し、Klett 比色計によって酵母培養物の生育を直接モニターすることを可能にするサイドアームを備えた２５０ｍｌのErlenmeyerフラスコ中の５０ｍｌのＹＥＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、および２％グルコース）中へ寒天プレートから直接接種した。培養物を３０℃で２００ｒｐｍで好気的に振盪器でインキュベートした。細胞密度が中間対数期（mid-log phase）（４００ Klettユニット）に達したら、１２．５ｍｌ（４０％）のグルコースおよび６．２５ｍｌ（４０％）のキシロースを各フラスコに添加した。十分に混合した後、１ｍｌの培養混合物をフラスコから取り出し、ゼロ試料として使用した。次いで、フラスコをサランラップで密閉し、発酵を嫌気的に実施した。発酵ブロスの１ｍｌの試料（多少の細胞を含む）を適切な間隔（２４時間毎）で取り出し、発酵の間にブロスの糖およびエタノール含有量を測定するための試料として使用した。試料のエタノール、グルコース、キシロース、およびキシリトール含有量を実施例６に記載したようにＨＰＬＣによって分析した。図８Ａと８Ｂに示される結果から、遺伝的に操作された酵母１４００（ｐＬＮＨ３３）は高い細胞密度を必要とすることなく２〜４日間で１０％グルコースと５％キシロースとを同時にエタノールへと同時に発酵できることが示される。一方、親株１４００は、グルコースをエタノールへと転化できるのみでキシロースを転化することはできない。発酵は、特別の培地、特別のｐＨを必要とすることなく、そして、高い細胞密度への酵母の生育を必要とすることなく、通常の条件下で実施した。かくして、解糖プロモーターに融合され、そして高コピー数プラスミドｐＵＣＫｍ１０上にクローニングされたＸＲ、ＸＤ、およびＸＫを含有する遺伝的に操作された１４００（ｐＬＮＨ３３）は、副生物としてほとんどキシリトールを生成することなく、２〜４日間で高濃度のグルコースとキシロースの両方を同時にエタノールへと発酵することができるわけである。実施例９操作されたＳＣ（ｐＬＮＨ１３−３２）によるキシロース／グルコースの発酵の試み発酵生物としてS．cerevisiae ＳＣ（ｐＬＮＨ１３−３２）（ＸＲとＸＤ遺伝子のみを含有する）を使用する以外は、実施例８の発酵操作を繰り返した。図１３に示される結果により、ＸＲとＸＤ遺伝子のみを含有するそのような遺伝的に未操作の酵母は、グルコースとキシロースの両方の糖類が発酵培地中に存在する場合、グルコースを発酵できるがキシロースを発酵できないことが示される。実施例１０未操作のPichia stipitis によるキシロース／グルコースの発酵の試み発酵生物として未操作のPichia stipitis を使用する以外は、実施例８の発酵操作を繰り返した。発酵ブロスの試料を、（Ｉ）０日間；（１１）３日間；および（１１１）５日間の発酵後にＨＰＬＣによって分析した。図１４に示される結果により、P．stipitisは、グルコースとキシロースの両方の糖類が同一培地中に存在する場合、グルコースを発酵できるのみでキシロースを発酵できないことが示される。本発明を図面および上記説明において詳細に例示および説明してきたが、これらは例示的なものであり、特徴を制限するものではないとみなすされなければならず、好ましい態様のみが示されかつ説明されていること、並びに、本発明の精神の範囲内にある改良および修正の全てを保護することが望まれることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ツァオ，ジョージ・ティーアメリカ合衆国インディアナ州47906，ウエスト・ラファイエット，ノース 300 ウエスト 4200

Claims

【特許請求の範囲】１．キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする導入遺伝子を含有し、キシロースをエタノールへと発酵するのに効果的な組み換え酵母。２．酵母がグルコースをエタノールへと発酵するのにも効果的である、請求の範囲第１項の組み換え酵母。３．酵母が Saccharomyces 属のものである、請求の範囲第２項の組み換え酵母。４．当該遺伝子が非グルコース抑制プロモーターに融合しており、酵母がグルコースとキシロースをエタノールへと同時に発酵するのに効果的である、請求の範囲第３項の組み換え酵母。５．キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含む組み換えＤＮＡ分子。６．当該遺伝子が非グルコース抑制プロモーターに融合している、請求の範囲第５項の組み換えＤＮＡ分子。７．酵母を形質転換するのに効果的であり、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含むベクター。８．当該遺伝子が非グルコース抑制プロモーターに融合している、請求の範囲第７項のベクター。９．ＤＮＡを酵母中に導入して酵母がキシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする導入遺伝子を有するようにすることを含む、キシロースをエタノールへと発酵するのに効果的な組み換え酵母を得るための方法。１０．当該導入ＤＮＡが、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含む、請求の範囲第９項の方法。１１．当該酵母が Saccharomyces 属のものである、請求の範囲第９項の方法。１２．キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする導入遺伝子を含有し、キシロースをエタノールへと発酵するのに効果的な組み換え酵母とともにキシロース含有培地を発酵することを含む、キシロースをエタノールへと発酵するための方法。１３．培地がグルコースも含み、酵母が当該グルコースをエタノールへと発酵するのにも効果的である、請求の範囲第１０項の方法。１４．酵母が Saccharomyces 属のものである、請求の範囲第１３項の方法。１５．当該遺伝子が非グルコース抑制プロモーターに融合しており、酵母がグルコースとキシロースをエタノールへと同時に発酵するのに効果的である、請求の範囲第１４項の方法。１６．キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする導入遺伝子を含有し、キシロースとグルコースをエタノールへと発酵するのに効果的な組み換え酵母とともにグルコース含有培地を発酵することを含む、グルコースをエタノールへと発酵するための方法。１７．当該培地がキシロースをも含む、請求の範囲第１６項の方法。１８．当該酵母が Saccharomyces 属のものである、請求の範囲第１７項の方法。１９．キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含有する組み換え酵母であって、当該遺伝子が非グルコース抑制プロモーターに融合しており、当該酵母がキシロースをエタノールへと発酵するのに効果的である、上記の組み換え酵母。２０．当該酵母がグルコースをエタノールへと発酵するのにも効果的である、請求の範囲第１９項の組み換え酵母。