MX2010014529A - Microorganismo que expresa aldosa-1-epimerasa. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un microorganismo transformado capaz de convertir una aldopentosa a una cetopentosa a una mayor velocidad que el microorganismo equivalente antes de la transformación.

Description

MICROORGANISMO QUE EXPRESA ALDOS A-1-EPI MERA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un microorganismo.

En particular, la presente invención se refier roorganismo transformado capaz de: (i) convertir una aldopento opentosa a una mayor velocidad que el microorganismo equivale la transformación; y/o ii) una mayor velocidad de crecimiento en aldopentosa que el microorganismo equivalente antes nsformación; y/o ¡ii) un mayor metabolismo de aldopentos roorganismo equivalente antes de la transformación.

La presente invención se refiere además a méto parar microorganismos transformados capaces de: (i) pro uesto derivado de entosa /o ii convertir una aldo ento roorganismo transformado es capaz de convertir una aldopento opentosa.

Además, la presente invención se refiere a inóculos y tivo que comprenden el microorganismo de conformidad con la ención, o un microorganismo preparado por un método de confor resente invención.

La presente invención se refiere adicionalmente a mét ducir biocombustible o un compuesto derivado de pentosa, que c tivar un microorganismo de conformidad con la presente inven roorganismo preparado por un método de conformidad con la ención.

Además, la presente invención se refiere a un biocomb compuesto derivado de pentosa obtenido por un método de la ención.

Además la resente invención se refiere al us inistro de energía. El aumento de los precios del petróleo ha he ducción de los biocombustibles sea económicamente factible, y f disponibilidad de los combustibles fósiles es limitada. Se eralmente que el bioetanol, un biocombustible, es mucho más en comparación con el combustible de transportación b róleo. Además, es posible usar bioetanol como un sustituto p o un sustituto de gasolina completo sin cambios drásticos a la t los motores.

Típicamente, se produce bioetanol por fermentación de rivados de materias primas agrícolas - tales como caña d olacha azucarera, maíz y cereales (tales como trigo y maíz) l n materias vegetales ricas en almidón y ricas en azúcar (el resto aterías vegetales es referido como desecho agrícola). Sin em Dblema asociado con los procedimientos que usan estos material an lo ue de otra manera se habría usado como materias ri oximadamente 12,000 millones de bushels (1 bushel = 36.36 íz se habrían cosechado en los Estados Unidos en 2008. Media técnicas disponibles actualmente en la materia, 10.60 litros de et ducción promedio de 36.36 litros de maíz. De esta manera, si l era de maíz de los Estados Unidos en 2008 fue producida en rían producido 33,000 millones de galones (1 galón = 3.785 nol. Sin embargo, de acuerdo con la estadística de la U ormation Administration, 142 mil millones de galones de gasolina o combustible para automóviles y camiones en 2007 en lo dos. Asumiendo que no existió disminución significativa en la de olina en los Estados Unidos en 2008, entonces el suministro de gasolina etanol a partir del maíz no podía haber satisfecho esta d De esta manera, la disponibilidad de fuentes de etales ricas en almidón y ricas en azúcar, es un factor lim ocidad ara la roducción de biocombustibles. úcares de pentosa (en particular xilosa y arabinosa), ncipalmente en la forma de polímeros de arabinoxilano. Desp rólisis de la celulosa, los azúcares de hexosa pueden ser ferme método tradicional basado en levaduras. Sin embargo, la celulo ructura fuerte que es muy resistente a la extracción y la zimática. Los arabinoxilanos son comparativamente más fáciles hidrolizar para liberar, principalmente, azúcares de pentosa; sin i azúcares liberados no pueden ser fermentados en etanol en con Ficientemente alta por los microorganismos conocidos.

Dos obstáculos para la producción eficiente de etanol iteria vegetal de desecho, son las dificultades asociada spolimerización de la celulosa y la falta de organismos adecú =dan metabolizar, para producción a gran escala, azúcares de p nol.

Teóricamente una forma de obt n h mplo, S. cerevisiae diseñada en la fermentación de etanol a tosas.

Enunciados de la invención En forma sorprendente, se ha encontrado que m roorganismos que expresan y/o sobreexpresan una aldosa-1-e facilita una conversión más rápida de las aldopentosas en cet ando se comparan con los microorganismos equivalentes an dificación). De esta manera, pueden obtenerse microorganismos aces de una conversión más rápida de azúcares de pe ferencia azúcares de aldopentosa) en un biocombustible (de pref ombustible que comprende etanol), cuando se comparan roorganismos equivalentes antes de la modificación, lo rticularmente ventajoso para la producción de biocombustible in in escala.

En un aspecto, la presente invención provee un micro sformado capaz de convertir una aldopentosa a una cetopento or velocidad que el microorganismo equivalente ante sformación.

En otro aspecto, la presente invención pr roorganismo transformado capaz de una mayor velocidad de er presencia de aldopentosa, que el microorganismo equivalente a sformación.

La presente invención provee adicionalmente un micro sformado capaz de un mayor metabolismo de aldopentosa roorganismo equivalente antes de la transformación.

La presente invención provee además un microorga de dicho microorganismo comprende una secuencia de nucleó ifica para una aldosa-1-epimerasa exógena.

En otro as ecto la resente invención r Además, la presente invención provee un microorgan prende un vector de expresión que codifica para una aldosa-1-e donde dicho microorganismo es capaz de convertir una aldopent opentosa.

En otro aspecto, la presente invención pr roorganismo transformado en donde dicho microorganismo es resar una aldosa-1-epimerasa, y en donde dicho microorganismo convertir una aldopentosa a una cetopentosa.

La presente invención provee, en otro aspecto, un mé parar un microorganismo transformado capaz de producir una cet ho método comprendiendo el paso de transformar un microorga secuencia de nucleótidos que codifica para una aldosa-1-epime de dicho microorganismo transformado es capaz de conv opentosa a una cetopentosa.

La resente invención rovee en otro as ecto un mé uivalente antes de la transformación, dicho método comprendien transformar un microorganismo con una secuencia de nucleó ifica para una aldosa-1-epimerasa, y en donde dicho micro sformado es capaz de convertir una aldopentosa a una cetopent En otro aspecto, la presente invención provee un mé parar un microorganismo transformado capaz de convertir una al na cetopentosa a una mayor velocidad que el microorganismo e es de la transformación, dicho método comprendiendo el nsformar un microorganismo con una secuencia de nucleótidos qu ra una aldosa-1-epimerasa, en donde dicho microorganismo tra capaz de convertir una aldopentosa a una cetopentosa.

En otro aspecto, la presente invención provee un mé parar un microorganismo transformado capaz de convertir una al na cetopentosa a una mayor velocidad que el microorganismo e tes de la transformación, dicho método com rendiendo el una aldosa-1-epimerasa, en donde dicho microorganismo trans paz de convertir una aldopentosa a una cetopentosa.

En otro aspecto, la presente invención provee un méto rar un microorganismo transformado capaz de una mayor veloc miento en presencia de aldopentosa que el microorganismo equ de la transformación, dicho método comprendiendo el ? formar un microorganismo de modo que la expresión de una al erasa sea sobrerregulada, en donde dicho microorganismo trans paz de convertir una aldopentosa a una cetopentosa.

La presente invención provee adicionalmente un méto rar un microorganismo transformado capaz de un mayor metabol entosa que el microorganismo equivalente antes de la transfor método comprendiendo el paso de transformar un microorganis secuencia de nucleótidos que codifica para una aldosa-1-epime e dicho microorganismo transformado es capaz de conve La presente invención provee, en otro aspecto, un mé ducir un compuesto derivado de pentosa, en donde dich prende cultivar en un medio de cultivo un microorganismo de co la presente invención o un microorganismo preparado por un resente invención.

En otro aspecto, la presente invención provee un mé ducir un compuesto derivado de pentosa, que comprende los pas (a) transformar un microorganismo con una secu cleótidos que codifica para una aldosa-1-epimerasa, en don roorganismo transformado es capaz de convertir una aldopent topentosa; y (b) cultivar el microorganismo transformado en un Itivo.

La presente invención provee, en otro aspecto, un mé )ducir una ceto entosa en donde dicho método com rend ul i (b) cultivar el microorganismo transformado en un tivo.

Las cetopentosas mencionadas en la presente pu tabolizadas adicionalmente dentro de la célula, facilitando la prod gama de productos que incluyen, pero no están limitados a, eta tico, ácido succinico, ácido acético, acetaldehído, ácido itacónic do 3-hidroxipropiónico, poli-3-hidroxialcanoatos, ácido proto catecol, guayacol, veratrol, vanilina, ácido vanílico, alcohol vanilíl cónico, ácido adípico, ácido 4-hidroxibenzoico, 4-hidroxiben do 4-metoxibenzoico, 4-aminobenzoato, 4-hidroxianilina, 4-met nol, anisol, fenol, ácido antranílico, 3-hidroxiantranilato, á idroxibenzoico, 2-aminofenol, 1 ,4-ciclohexanodiona y am máticos.

En otro aspecto, la presente invención provee un mé ducir un biocombustible, en donde dicho método com rende el nucleótidos que codifica para una aldosa-1-epimerasa, de prefe vector de expresión que codifica para la misma, en don roorganismo transformado es capaz de convertir una aldopent opentosa.

En otro aspecto, la presente invención provee un mé ducir un biocombustible, que comprende los pasos de: (a) transformar un microorganismo con una secu cleótidos que codifica para una aldosa-1-epimerasa, de preferen tor de expresión que codifica para la misma, en don roorganismo transformado es capaz de convertir una aldopent opentosa; y (b) cultivar el microorganismo transformado en un tivo que comprende aldopentosa.

En otro aspecto, la presente invención provee un mé ducir un biocombustible, en donde dicho método comprende e tivar un microor anismo en un medio de cultivo, en don roorganismo preparado por un método de la presente invenció ducción de una cetopentosa.

En otro aspecto, la presente invención provee el u roorganismo de conformidad con la presente invenció roorganismo preparado por un método de la presente invenció ducción de un compuesto derivado de pentosa.

Además, la presente invención provee el uso roorganismo de conformidad con la presente invenció roorganismo preparado por un método de la presente invenció ducción de un biocombustible.

En otro aspecto, la presente invención provee el u roorganismo para la producción de un biocombustible, en do roorganismo comprende una secuencia de nucleótidos que cod aldosa-1-epimerasa y en donde dicho microorganismo es resar dicha aldosa-1-e imerasa en donde dicho microor a roorganismo preparado por un método de conformidad con la ención.

Algunas ventajas En forma ventajosa, mediante el uso de los microorga formidad con la presente invención, pueden producirse bioco les como etanol).

Otra ventaja es que mediante el uso de los microorga formidad con la presente invención, pueden producirse eficie ombustibles (tales como etanol) usando azúcares de pentosa. S ee que sea limitado por la teoría, la modificación de microorgani resan o sobreexpresan una aldosa-1-epimerasa, muestra un in la velocidad de interconversión entre anómeros de aldopen versión intracelular de aldopentosas a cetopentosas - en otras ia una coacción limitativa de velocidad - lo cual a su vez e o forrajes de sorgo, soyas o maíz; y troceados de madera sente invención, no hay necesidad (o hay necesidad reducida teríales (tales como extracto de caña de azúcar, extracto de r carera, almidón de sorgo, almidón de maíz o almidón de trigo), l usarían de otra manera como una fuente de alimento para hu o un pienso.

En forma más ventajosa, la presente invenció roorganismos que son capaces de metabolizar, para producci ala (tal como producción industrial), azúcares de pentosa (ta cares de aldopentosa) en un biocombustible (tal como un bioco comprende etanol).

En forma ventajosa, los microorganismos de conformid sente invención permiten el uso óptimo de los azúcares liberad rólisis de material lignocelulósico por la fermentación de azú tosa.

En forma sorprendente, la presente invención muest nsformación de microorganismos que expresan aldosa-1-epimera una velocidad de conversión incrementada de azúcares de pen combustible.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Una representación esquemática de tabólicas que detallan el metabolismo de las dos aldopent undantes, D-xilosa y L-arabinosa. Ambas aldopentosas son conv a cetopentosa, y además en D-xilulosa 5-fosfato. Sin que se dese litado por la teoría, como se indica en la figura, un tipo de vía (tipo Juctasa) se encuentra en hongos, mientras que el otro tipo de imerasa) se encuentra en bacterias. En el tipo de vía en ho meras enzimas ueden den i s " - i " " - Figura 3. Una representación esquemática de la dativa de la vía de la pentosa fosfato (PPP).

Figura 4. Una representación esquemática de la ntosa fosfato (PPP). Aquí, la cetopentosa xilulosa-5-fosfato, la c rivarse de D-xilosa o L-arabinosa, es metabolizada adicional nol bajo condiciones anaeróbicas. XI es xilosa isomerasa locinasa. Se muestra el ingreso neto de xilosa en el procedimi dimiento neto de etanol a partir del procedimiento (procedimiento DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se usa en la presente, la frase "un micro sformado capaz de convertir una aídopentosa a una cetopent yor velocidad que el microorganismo equivalente ante sformación" abarca microor anismos transformados con una un microorganismo que permite que el microorganismo sobreex uencia de nucleótidos endógena que codifica para una imerasa.

En otra modalidad, el microorganismo ha sido transfor a secuencia de nucleótidos que codifica para una aldosa-1-epim mplo, el microorganismo es transformado con un vector de expr prende una secuencia de nucleótidos que codifica para una imerasa enlazada operablemente a una secuencia reguladora.

De preferencia, la secuencia de nucleótidos que cod a aldosa-1-epimerasa mencionada en la presente, está en un resión que codifica para la misma.

De preferencia, el vector de expresión menciona senté comprende un promotor capaz de sobreexpresar la sec cleótidos que codifica para una aldosa-1-epimerasa. Ejemplos motores inclu en el romotor de GPD el romotor de TEF el r capaz de disminuir la cantidad de aldopentosa en un medio de C do que la reducción en la cantidad de aldopentosa en el medio por lo menos 5%, 10%, 20% o 25% mayor por célula, q roorganismo equivalente antes de la transformación cuando se c mismas condiciones de cultivo por un período dado dentro de l cimiento exponencial.

El término "fase de crecimiento exponencial" se usa en mal de la técnica - por ejemplo, los microorganismos están dividi velocidad constante, de modo que el número total de microorga lica con cada división. El experto en la técnica puede d ilmente la fase de latencia (el período durante el cual las células s n nuevo ambiente antes del inicio del crecimiento exponencial), l cimiento exponencial, la fase estacionaria (en donde la velo isión de la célula iguala a la velocidad de muerte de la célula, y p úmero de células viables se mantiene constante la fase de n Como se usa en la presente, el término "la conversi pentosa a una cetopentosa" se refiere a, por ejemplo, la conver pentosa xilosa a la cetopentosa xilulosa; la conversión de la al binosa a la cetopentosa xilulosa; la conversión de la aldopentosa la cetopentosa ribulosa; la conversión de la aldopentosa lix opentosa xilulosa; y la conversión de la aldopentosa rib opentosa ribulosa.

En un aspecto preferido, la cetopentosa es xilulosa.

El término "un microorganismo transformado capaz de a aldopentosa a una cetopentosa", como se usa en la presente, s microorganismo que comprende una o más secuencias de polin e codifican para uno o más polipéptidos implicados en la conversi lopentosa a un cetopentosa. Ejemplos de polipéptidos capaces d a aldopentosa a una cetopentosa, incluyen xilosa isomerasa, merasa D-lixosa isomerasa ribosa isomerasa la combinación La conversión espontánea entre a-aldopentosa y p-al microorganismos, es lenta. Por ejemplo, la conversión espontáne sa a a-D-xilosa tiene un valor K de primer orden de aproxim 94/min a temperatura fisiológica (Bailey et al., 1969).

Como se usa en la presente, el término "sobreexpre se "una secuencia de nucleótidos que hace que el micro reexprese una aldosa-1-epimerasa" y "un promotor c reexpresar la secuencia de nucleótidos que codifica para una imerasa", se refiere a un incremento en la expresión de cero a u resión, o que va de un menor nivel de expresión a un mayo resión (por ejemplo, sobrerregulación), cuando el micro sformado se compara con el microorganismo equivalente an nsformación. Los microorganismos que sobreexpresan una imerasa, tienen una capacidad incrementada de catalizar la c re a-aldo entosa -aldo entosa.

Ejemplos de microorganismos que sobreexpresan una merasa, incluyen: (i) microorganismos transformados con un resión que codifica para una aldosa-1-epimerasa (ante sformación, dicho microorganismo no era capaz de expresar la imerasa); y (ii) microorganismos transformados que sobrerr resión de una aldosa-1-epimerasa endógena (antes de la transf ho microorganismo era capaz de expresar dicha aldosa-1-epime serie dada de condiciones de cultivo durante el crecimiento ex ro después de la transformación, dicho microorganismo es presar dicha aldosa-1-epimerasa a un mayor nivel, en las ndiciones de cultivo, durante el crecimiento exponencial).

Como se usa en la presente, el término "mayor vel icimiento" en la frase "un microorganismo transformado capa lyor velocidad de crecimiento en presencia de aldopentos roor anismo e uivalente antes de la transformación" se refi más de cantidades óptimas de sales, vitaminas y otros esarios para el microorganismo.

El término "mayor metabolismo", como se usa en la pr rase "un microorganismo transformado capaz de un mayor metab opentosa que el microorganismo equivalente antes de la transfo refiere se un microorganismo transformado que es capaz de met opentosa, de modo que la cantidad consumida de la aldopent J ÍO de cultivo es por lo menos 10%, 20%, 25%, 30% o 35% ula, que la del microorganismo equivalente antes de la trans ndo se cultiva bajo las mismas condiciones de cultivo por un perí tro de la fase de crecimiento exponencial. En un aspecto pref roorganismos se cultivan a su temperatura de crecimiento ópti erencia, el medio de cultivo comprende entre 1 % y 4% de al emás de cantidades óptimas de sales, vitaminas y otros cesarios ara el microor anismo. sformación cuando se cultiva bajo las mismas condiciones de período dado dentro de la fase de crecimiento exponencial.

El término "una secuencia de nucleótidos que codifica osa-1-epimerasa", como se usa en la presente, abarca secu leótidos que comprenden secuencias reguladoras que pe resión de la secuencia de nucleótidos que codifica para una merasa, tales como promotores e intensificadores que pue ciados nativamente o no nativamente con la secuencia de nucle ifica para una aldosa-1-epimerasa.

Como se usa en la presente, el término "mayor veloci se "un microorganismo transformado capaz de producir un biocom mayor velocidad en un medio de cultivo que el micro ivalente antes de la transformación", se refiere a un micro nsformado capaz de producir por lo menos 10%, 20%, 25%, 30 s biocombustible or célula ue la del microor anismo e uivale De preferencia, el método para producir un biocor prende además el paso de obtener el biocombustible a partir del tivo.

Microorganismo transformado Como se menciona en la presente, el término "micro sformado" se refiere a un microorganismo que ha sido gené rado por tecnología de ADN recombinante. El término "trans o se usa en la presente, es sinónimo de términos tal nsfectado", "recombinante", "genéticamente diseñado" y "gené dificado".

El término "microorganismo transformado" con rela sente invención, incluye cualquier microorganismo que compre ios vectores de expresión que comprenden las secuencias de n ndonadas en la resente, /o uno o varios romotores ue son c ocidad de crecimiento; y/o (iii) produzca cetopentosa a u ocidad; y/o (iv) produzca un compuesto derivado de pentosa a u ocidad; y/o (v) produzca un biocombustible a una mayor velocidad El término "microorganismo transformado" no abarca s ificantes de nucleótidos nativas en su ambiente natural cuando ontrol de su promotor nativo, el cual está también en su ambiente Por lo tanto, el microorganismo transformado de la ención incluye un microorganismo que comprende cualquie binaciones de, las secuencias de nucleótidos que codifican zimas mencionadas en la presente, construcciones que comprend uencias de nucleótidos, vectores que comprenden dichas secu cleótidos, plásmidos que comprenden dichas secuencias de nuc ctores de expresión que comprenden dichas secuencias de nucleó De esta manera, otra modalidad de la presente invenci croor anismos transformados o transfectados con una o varias s eral, se prefieren las células de levadura sobre las células de otr bido a que son más fáciles de manipular.

El uso de microorganismos adecuados - tales com pederas de hongos y levaduras - puede proveer modificació ducción (por ejemplo, miristoilación, glucosilación, truncamiento, ? osforilación de tirosina, serina o treonina), ya que pueden ser n ra conferir actividad biológica óptima en los productos de ombinantes mencionados en la presente.

Microorganismos adecuados incluyen bacterias, aduras. De preferencia, el microorganismo es una levadura o una De preferencia, dicho microorganismo transformad adura transformada. De preferencia, dicha levadura transformada I género Saccharomyces. Más preferiblemente, dicha nsformada es Saccharomyces cerevisiae.

En o l En otro aspecto, la velocidad de crecimiento del micro nsformado descrito en la presente es mayor cuando se cultiva en cultivo que comprende aldopentosa, que el microorganismo e tes de la transformación.

En otro aspecto, el microorganismo transformado menc presente es capaz de producir la cetopentosa a una mayor ando se cultiva en un medio de cultivo que comprende aldopento croorganismo equivalente antes de la transformación.

En otro aspecto, el microorganismo transformado menc presente es capaz de producir un biocombustible a una mayor ando se cultiva en medio de cultivo que comprende aldopento croorganismo equivalente antes de la transformación.

El microorganismo puede ser transformado usando té n de rutina en la materia, tales como electroporación (Sambr 89 . Además la resencia de una se Un microorganismo transformado de conformidad sente invención puede usarse en combinación con uno roorganismos transformados de conformidad con la presente inve Por ejemplo, uno o más microorganismos transfor formidad con la presente invención capaces de convertir la D-xi losa, pueden usarse en combinación con uno o más microor eccionados del grupo que consiste de: un microorganismo transfo formidad con la presente invención capaz de convertir la L-arabi losa; un microorganismo transformado de conformidad con la ención capaz de convertir la L-arabinasa a L-ribulosa; un micro sformado de conformidad con la presente invención capaz de c ixosa a D-xilulosa; y un microorganismo transformado de confor resente invención capaz de convertir la D-ribosa a D-ribulosa.

En otro ejemplo, uno o más microorganismos transferi nformidad con la resente invención ca aces de convertir la L-ar En otro ejemplo, uno o más microorganismos transfor formidad con la presente invención capaces de convertir la L-ar ibulosa, pueden usarse en combinación con uno o más microor eccionados del grupo que consiste de: un microorganismo transfo formidad con la presente invención capaz de convertir la D-xi losa; un microorganismo transformado de conformidad con la ención capaz de convertir la L-arabinasa a D-xilulosa; un micro sformado de conformidad con la presente invención capaz de c ixosa a D-xilulosa; y un microorganismo transformado de confor resente invención capaz de convertir la D-ribosa a D-ribulosa.

En otro ejemplo, uno o más microorganismos transfor formidad con la presente invención capaces de convertir la D-li losa, pueden usarse en combinación con uno o más microor eccionados del grupo que consiste de: un microorganismo transfo nformidad con la resente invención ca az de convertir la L-arabi eccionados del grupo que consiste de: un microorganismo transfo formidad con la presente invención capaz de convertir la L-arabi losa; un microorganismo transformado de conformidad con la ención capaz de convertir la L-arabinasa a L-ribulosa; un micro sformado de conformidad con la presente invención capaz de c ilosa a D-xilulosa; y un microorganismo transformado de confor resente invención capaz de convertir la D-xilosa a D-xilulosa.

Los microorganismos transformados de conformida sente invención pueden usarse en combinación con uno o más roorganismos. Por ejemplo, uno o más microorganismos transfor formidad con la presente invención pueden cultivarse en combin lo menos un microorganismo capaz de producir, bajo ciertas co cultivo, uno o más componentes seleccionados de la lista que co ol, ácido láctico, ácido succínico, ácido acético, acetaldehí ónico cresol ácido 3-hidroxi ro iónico oli-3-hidroxialcanoat por lo menos otro microorganismo capaz de producir, baj diciones de cultivo, uno o más componentes seleccionados de l siste de: etanol, ácido láctico, ácido succinico, ácido acético, ace do itacónico, cresol, ácido 3-hidroxipropiónico, poli-3-hidroxial do protocatecuico, pirocatecol, guayacol, veratrol, vanilina, ácid >hol vanilílico, ácido mucónico, ácido adípico, ácido 4-hidroxibe roxibenzaldehído, ácido 4-metoxibenzoico, 4-aminobenz roxianilina, 4-metoxianilina, quinol, anisol, fenol, ácido antra roxiantranilato, ácido 2,3-dihidroxibenzoico, 2-aminofen lohexanodiona y aminoácidos aromáticos.

Además, la presente invención provee un inó prende una de las combinaciones mencionadas anteriormente.

Además, se provee un medio de cultivo que compren combinaciones mencionadas anteriormente.

Además la resente invención rovee un kit ue com En un aspecto, el vector de expresión es incorpora oma de un microorganismo adecuado. El término "incorporado" ferencia incorporación estable en el genoma.

Las secuencias de nucleótidos mencionadas en la dén estar presentes en un vector en el cual la secuencia de nucl azada operablemente a secuencias reguladoras capaces de p resión de la secuencia de nucleótidos por un microorganismo h cuado.

Los vectores son transformados en un micro pedero adecuado como se describe en la presente.

La elección del vector, por ejemplo, un plásmido, c tor de fago, dependerá con frecuencia del microorganismo en el oducido.

Los vectores para su uso en la presente pueden conte s secuencias de nucleótidos de marcadores seleccionares - tal spedero en cuestión. Ejemplos de dichas secuencias son los orí licación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, 702.

En un aspecto preferido, el microorganismo capaz de a aldopentosa a una cetopentosa como se menciona en la aprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una imerasa.

De preferencia, un vector de expresión como se menci sente, comprende la secuencia de nucleótidos que codifica osa-1-epimerasa.

De preferencia, el microorganismo capaz de con opentosa a una cetopentosa como se menciona en la presente, c r lo menos un vector de expresión que codifica para xilosa reduct losa reductasa.

En otro as ecto referido el microor anismo ca az d En otro aspecto, de preferencia, el microorganismo vertir una aldopentosa a una cetopentosa como se mencio sente, comprende por lo menos un vector de expresión que co binosa reductasa y/o L-arabitol 4-deshidrogenasa y/o L-xilulosa D-xilulosa reductasa.

En otro aspecto preferido, el microorganismo capaz d a aldopentosa a una cetopentosa como se menciona en la mprende un vector de expresión que codifica para arabinosa red tor de expresión que codifica para L-arabitol 4-deshidrogenasa, expresión que codifica para L-xilulosa reductasa y un vector de e codifica para D-xilulosa reductasa.

En otro aspecto preferido, el microorganismo capaz d a aldopentosa a una cetopentosa como se menciona en la mprende un vector de expresión que codifica para L-arabinosa iso De referencia en otro as ecto el microor anismo En otro aspecto preferido, el microorganismo capaz de aldopentosa a una cetopentosa como se menciona en la prende por lo menos un vector de expresión que codifica par merasa.

En otro aspecto preferido, el microorganismo capaz de aldopentosa a una cetopentosa como se menciona en la prende un vector de expresión que codifica para D-ribosa isomer De preferencia, en otro aspecto, el microorganismo vertir una aldopentosa a una cetopentosa como se mencio sente, puede comprender además por lo menos un vector de codifica para una o más enzimas seleccionadas del grupo que c locinasa, D-ribulocinasa, ribosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa imerasa, transaldolasa, transcetolasa, y cualquier otra enzima de pentosa fosfato. De preferencia, dicho microorganismo capaz de a aldo entosa a una ceto entosa como se menciona en la resión que codifica para ribulosa-5-fosfato epimerasa y/o ribosa merasa y/o transaldolasa y/o transcetolasa.

En un aspecto, un vector de expresión como se menci sente, puede codificar además para una o más enzimas selecció po que consiste de una aldosa-1 -epimerasa, xilosa reductasa, uctasa, xilosa isomerasa, arabinosa reductasa, L-ara hidrogenasa, L-xilulosa reductasa, L-arabinosa isomerasa, rib losa fosfato 4-epimerasa, D-lixosa isomerasa, D-ribosa is locinasa, D-ribulocinasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, ribosa merasa, transaldolasa y transcetolasa.

En un aspecto, un vector de expresión como se menci sente, puede codificar además para una o más enzimas selecció po que consiste de xilulocinasa, D-ribulocinasa, ribosa-5-fosfato is ibulosa-5-fosfato epimerasa, transaldolasa, transcetolasa, y cual ima de la vía de la entosa fosfato. En un as ecto referido un sente codifica además para ribosa-5-fosfato isomerasa y/o tran transcetolasa.

En un aspecto preferido, el microorganismo capaz de aldopentosa a una cetopentosa como se menciona en la prende además por lo menos un vector de expresión que cod aldosa-1-epimerasa.

De preferencia, un vector de expresión como se menci sente comprende además una secuencia de nucleótidos que cod aldosa-1-epimerasa.

Secuencias reguladoras En algunas aplicaciones, las secuencias de n ncionadas en la presente son enlazadas operablemente a una uladora que es capaz de proveer la expresión de la secu leótidos, tal como or el microor anismo ele ido. A manera de e ñera que la expresión de la secuencia codificante se logra bajo c mpatibles con las secuencias control.

El término "secuencias reguladoras", incluye pro ensificadores y otras señales de regulación de la expresión.

El término "promotor" se usa en el sentido normal de ? r ejemplo, un sitio de unión de la ARN polimerasa.

La expresión incrementada de las secuencias de núcle difican para las enzimas mencionadas en la presente, pued bién por la selección de regiones reguladoras heterólogas, po iones de promotor, regiones de secuencia guía de secreción y re minador.

De preferencia, las secuencias de nucleótidos menci presente son enlazadas operablemente a por lo menos un promot Otros promotores pueden usarse incluso para dirigir la los oli é tidos mencionados en la resente.

Construcciones El término "construcción" - el cual es sinónimo de térm o "conjugado", "cassette" e "híbrido" - incluye una secu cleótidos mencionada en ia presente unida directamente o indirec promotor.

Un ejemplo de una unión indirecta, es la provisión de aciador adecuado, tal como una secuencia de intrón, tal com 1 o el intrón ADH, intermedio entre el promotor y las secu cleótidos mencionadas en la presente. Lo mismo se aplica para sionado" con relación a la presente invención, el cual incluye unió irecta. En algunos casos, los términos no abarcan la combinaci la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína inariamente con el promotor del gen de tipo silvestre y cuando e biente natural- La construcción uede ex resar o contener incluso un r uencia de nucleótidos, tal como un promotor, que hace roorganismo sobreexprese una aldosa-1-epimerasa.

Por ejemplo, el promotor es insertado en el geno roorganismo que permite que el microorganismo sobreexp mplo, sobrerregule) una secuencia de nucleótidos endógena qu a una aldosa-1-epimerasa.

En otro aspecto, el promotor es enlazado operableme uencia de nucleótidos en, por ejemplo, un vector de expresión.

En otro aspecto, el promotor no es reprimido por la pre cosa.

Ejemplos de promotores adecuados que podrían u roorganismos de conformidad con la presente invención, ta charomyces cerevisiae, incluyen: el promotor del gen de gliceral fato deshidrogenasa (GPD); el promotor del gen de alcohol deshid H ; el romotor del en del factor embrionario tirotrófico TEF . a proteínas implicadas en la glucólisis y la fermentación de la mplos incluyen, pero no están limitados a: el promotor P-pgi capaz de expresar el gen PGI1 , motor comprende la secuencia de nucleótidos entre este gen y el tura abierto YBR197C; el promotor P-tpi capaz de expresar el gen TPI1 , motor comprende la secuencia de nucleótidos entre este gen y el tura abierto YDR051C; el promotor P-hxk capaz de expresar el gen HXK2 motor comprende la secuencia de nucleótidos entre este gen F1 ; el promotor P-pfk capaz de expresar el gen PFK1 , motor comprende la secuencia de nucleótidos entre este gen 1802; el romotor P-eno ca az de ex resar el en EN 2 ! el promotor P-gpm capaz de expresar el gen GPM1 motor comprende la secuencia de nucleótidos entre este gen y el tura abierto YKL151 C; el promotor P-pdc capaz de expresar el gen PDC1 motor comprende la secuencia de nucleótidos entre este gen U2; y el promotor P-pgm capaz de expresar el gen PGM2 motor comprende la secuencia de nucleótidos entre este gen J80.

Biocombustible Como se usa en la presente, el término "biocombu ere a un combustible (por ejemplo, un combustible líquido) adec uso en (por ejemplo) motores de combustión. Dicho biocomb iva de materia bioló ica ue com rende azúcares de entosa positos de energía, por ejemplo, Panicum virgatum) - so cuadas de azúcares de pentosa, en particular azúcares de ald a la presente invención. Otras fuentes adecuadas de materi luyen productos no de desecho (en otras palabras, fuentes de a raje), tales como extracto de caña de azúcar, extracto de r carera, sorgo, soya, almidón de trigo y almidón de maíz.

De preferencia, el biocombustible mencionado en la prende por lo menos un alcohol.

En un aspecto preferido, el alcohol se selecciona del siste de metanol, etanol, propanol y butanol. Más preferible ombustible comprende etanol.

De preferencia, dicho biocombustible se obtiene (o es otras palabras, se extrae (o es extraíble) - del medio de cultivo microorganismo transformado de conformidad con la presente inv cultivado ba o condiciones adecuadas. Dicho biocombustib Los uno o más componentes de biocombustible a eden mezclarse con el biocombustible antes y/o después d combustible se obtiene o se extrae (es obtenible o extraíble) de u En forma alternativa o además, uno o más de otros co biocombustible pueden producirse cultivando un microorganis dio de cultivo antes y/o después y/o al mismo tiempo, roorganismo transformado de conformidad con la presente inve tivado o haya sido cultivado en un medio de cultivo para p combustible.

La presente invención provee además un combu nsportación que comprende un biocombustible producido U roorganismos de conformidad con la presente invención.

El etanol usado como un combustible de transportaci mplir dos propósitos diferentes: i roblemas de salud, el uso de plomo ha sido prohibido casi mun adición de compuestos oxigenados a la gasolina regular dis isiones de monóxido de carbono, así como otras partículas que c la contaminación atmosférica. Se usó inicialmente éter de metil TBE) como un aditivo de compuestos oxigenados; sin em urrencia de contaminación por el MTBE en acuíferos de agua p impulsado a algunos estados a que prohiban el uso de este c genado. El etanol se usa cada vez más mundialmente como un r l MTBE como aditivo de compuestos oxigenados para la fabri Aparte de servir como un aditivo de compuestos oxig producción de gasolina reformulada, puede usarse etanol como u eral de la gasolina regular. Los automóviles pueden usar me % de etanol añadido) sin modificación alguna del motor.

Además se han fabricado vehículos ue ueden usa dio de cultivo por lo menos 5%, 10%, 20%, 25%, 30% o combustible (tal como bioetanol) por célula, que el porcentaje qu microorganismo equivalente antes de la transformación cuando o las mismas condiciones de cultivo por un período dado dentro crecimiento exponencial.

Compuesto derivado de pentosa Como se usa en la presente, el término "compuesto d ntosa" se refiere a cualquier compuesto derivado de un azúcar d compuesto derivado de pentosa puede derivarse de una aldop mpuesto derivado de pentosa puede derivarse de una cetopentos Ejemplos de compuestos derivados de pentosa incluye án limitados a, etanol, aminoácidos aromáticos, cresol, ácido ido láctico, ácido succtnico, ácido acético, acetaldehíd roxialcanoatos ácido 3-hidroxi ro iónico. La fi ura 1 mue tocatecuico, pirocatecol, guayacol, veratrol, vanilina, ácido vanílic ilílico, ácido mucónico, ácido adípico, ácido 4-hidroxiben roxibenzaldehído, ácido 4-metoxibenzoico, 4-aminobenz roxianilina, 4-metoxianilina, quinol, anisol, fenol, ácido antra roxiantranilato, ácido 2,3-dihidroxibenzoico, 2-aminofen lohexanodiona y aminoácidos aromáticos.

De preferencia, dicho compuesto derivado de pentosa Sol, ácido itacónico, ácido láctico, ácido succínico y roxipropiónico.

Más preferiblemente, dicho compuesto derivado de p nol.

Medio de cultivo El medio de cultivo comprende por lo menos una pento ecto referido, el medio de cultivo com rende or lo m opentosa antes de la inoculación con el microorganismo (es d po cero).

De preferencia, dicho medio de cultivo comprende las c imas de sales, vitaminas y otros nutrientes necesarios roorganismo.

Los microorganismos se cultivan de preferencia a su te crecimiento óptima. El experto en la técnica habría sido erminar fácilmente la temperatura óptima a la cual se cu roorganismos mencionados en la presente.

En una modalidad, los microorganismos se c roximadamente 20°C, 25°C, 30°C, 35°C ó 37°C.

En una modalidad, los microorganismos se c roximadamente 35°C a 39°C, de preferencia aproximadament C, más preferiblemente a aproximadamente 35.5°C a 37.5°C.

De referencia los microor anismos se culti dio de cultivo que comprende por lo menos 2%, 5%, 10% o ohol.

Como se menciona en la presente, el término "tolerante refiere a microorganismos que son capaces de crecer en un tivo que tiene un pH igual a o menor que 6.5, 6.0, 5.0, 4.0 ó 3.0.

En un aspecto preferido, el medio de cultivo es inoculad enos 5 x 107 a 5 x 0 1 células por kg de medio de cultivo, de p 108 a 5 x 1010 células por kg de medio de cultivo, de preferencia x 1010 células por kg de medio de cultivo, y más prefer oximadamente 5 x 109 células por kg de medio de cultivo.

Los términos "inoculo" y "cultivo iniciador", son intercam Fuentes de azúcares de pentosa Los azúcares de pentosa (en particular azúc o entosa se derivan o son derivables de lantas. r ejemplo, bagazo de caña de azúcar; forrajes, por ejemplo, f rgo, soya, maíz o trigo; y troceados de madera).

Las fuentes de azúcares de pentosa para el medio scrito en la presente, incluyen materiales lignocelulósicos nor nsiderados como material de desecho agrícola. Tallos, pedúncul ntienen material lignocelulósico. Bagazos de caña de azúcar, f íz y troceados de madera (sólo hemicelulosa), son tres fuentes cesibles de material lignocelulósico, ya que éstos se colectan o a ilmente en grandes cantidades por varias razones.

El material lignocelulósico consiste principalmente denas de azúcar. En promedio, dos terceras partes de estos azú úcares de hexosa, los cuales están presentes principalmente en l una tercera parte de los azúcares son azúcares de pentosa ncipalmente en polímeros de arabinoxilano.

Una cantidad si nificativa del azú ar n cares en etanol. Dichos subproductos tóxicos (si se generan) p ovidos, pero esto es generalmente no económico.

En forma alternativa, los materiales lignocelulósicos p rolizados usando enzimas que hidrolizan la celulosa y hemicel ma ventajosa, este procedimiento evita la generación de úndanos tóxicos.

En un aspecto preferido, el medio de cultivo comprend ivado de uno o más materiales lignocelulósicos que han sid mplos de dichas técnicas de tratamiento incluyen: tratamiento c losión con vapor, oxidación en húmedo, hidrólisis ácida, oxi medo alcalina y expansión de fibras con amoníaco) para liberar hexosa y/o pentosa. De preferencia, el material lignocelulósico se procedimiento de hidrólisis enzimática. Dicho material ligno rolizado puede tratarse adicionalmente para extraer los azúcares de dicho extracto en un medio de cultivo.

Pre-tratamiento hidrotérmico subsiguiente: El pre-tratamiento hidrotérmico del material lignocelulós arse a cabo como un pre-tratamiento con vapor seguido de u ado, produciendo de esta manera una fracción de fibras y una fr uido. La fracción de fibras contiene más de 90% de la celulosa, sente originalmente en el material celulósico, y parte de las hemi fracción de líquido contiene azúcares de las hemicelulosas (azú s de 90% de cloruros de álcali comprendidos en la biomasa ligno mayoría de los inhibidores de fermentación que surgen del pre-tr la materia prima lignocelulósica.

Típicamente, paja de trigo es calentada por vap peratura entre 180 y 200°C, con un tiempo de residencia d ñutos. La biomasa pre-tratada es descargada del reactor de ada y prensada. El vapor liberado es colectado y reutilizad a oración de la fracción de lí uido hasta melazas de ienso.

Hexosa Los azúcares de hexosa tienen 6 átomos de carb ohexosas tienen un aldehido en la posición 1 , y las cetohexosas ti ona en la posición 2. La glucosa es un ejemplo de una aldoh ctosa es un ejemplo de una cetohexosa.

Pentosa Los azúcares de pentosa tienen 5 átomos de carb tosas tienen un grupo funcional aldehido en la posición 1 (aldope grupo funcional cetona en la posición 2 (cetopentosas).

Aldopentosa De preferencia, dicha aldopentosa se selecciona del siste de xilosa, arabinosa, ribosa y lixosa. Más preferible o entosa es xilosa o arabinosa.

En un aspecto preferido, dicha cetopentosa es ribul feriblemente, dicha ribulosa es D-ribulosa.

Conversión de una aldopentosa a una cetopentosa Ejemplos de una aldopentosa que es convertida opentosa incluyen, pero no están limitados a: la conversión de losa; la conversión de arabinosa a xilulosa; la conversión de ar losa; la conversión de lixosa a xilulosa; la conversión de ribosa a conversión de D-xilosa a D-xilulosa; la conversión de L-arabin losa o D-xilulosa; la conversión de L-arabinosa a L-ribulosa; la c D-lixosa a D-xilulosa; y la conversión de D-ribosa a D-ribulosa.

Sin que se desee que sea limitado por la teoría, típica imas implicadas en la conversión de D-xilosa a D-xilulosa en ho ilosa reductasa y D-xilulosa reductasa.

En bacterias, sin que se desee que sea limitado por camente la enzima implicada en la conversión de L-arabinosa a la L-arabinosa isomerasa.

Sin que se desee que sea limitado por la teoría, la en de estar implicada en la conversión de D-lixosa a D-xilulosa en la lixosa isomerasa.

Sin que se desee que sea limitado por la teoría, la en de estar implicada en la conversión de D-ribosa a D-ribulosa, sa isomerasa.

Enzimas Los números de la nomenclatura para las enzimas (nú ) mencionados en la presente, se refieren a las recomendac menclature Committee of the International Union of Biochem ecular Biolo sobre la nomenclatura clasificación de las Aldosa-1-epimerasa (EC 5.1.3.3) Una aldosa-1-epimerasa mencionada en la presente, actuar sobre la aldopentosa.

La aldosa-1 -epimerasa tiene el número de nomenclat .3.3. La aldosa-1-epimerasa puede ser referida como una mut a aldosa mutarrotasa.

El término aldosa-1-epimerasa se refiere a una enzi paz de convertir una a-aldopentosa a una ß-aldopentosa, y viceve En una modalidad preferida, la aldosa-1 -epimerasa es r una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que co D20257 versión 1 , ABX75760 versión 1 , AAK05605 versión 1 , rsión 1 , AAD20251 versión 1 , ABJ73095 versión 1 , ABI49935 v O80762 versión 1 (números de acceso del NCBI). Más preferibl osa-1 -epimerasa se selecciona del grupo que consiste de: A Saccharomyces cerevisiae (en particular, la parte que codifica cuencia de aminoácidos que tiene actividad de mutarrotasa).

Aldosa reductasa (EC 1.1.1.21 ) La aldosa reductasa tiene el número de nomenclatu .1.21. La aldosa reductasa puede ser referida como: polio! deshid ehído reductasa, ALR2, NADPH-aldopentosa reductasa, NAD uctasa, alditol:NADP oxidorreductasa, o alditol:NADP+ 1-oxidorre El término aldosa reductasa se refiere a una enzim paz de convertir un alditol a una aldosa, y viceversa.

Una aldosa reductasa puede reducir más de un tipo r ejemplo, la misma enzima puede ser capaz de reducir D-xi binosa, y dicha enzima puede denominarse de esta manera co ductasa, o puede denominarse más específicamente después de bstratos, or e em lo, xilosa reductasa.

Ejemplos de xilosa reductasas adecuadas para su uso cribe en la presente, incluyen la xilosa reductasa codificad uencia de nucleótidos del gen de xilosa reductasa de Pichia stipiti ecuencia de nucleótidos del gen de xilosa reductasa de la cepa Pichia stipitis (PsXR) - número de acceso del NCBI X59465 ver uencia de nucleótidos de Candida tenuis (dicha secuencia de n codifica para xilosa reductasa, puede obtenerse como es de anagh et a/. , 2003); y la secuencia de nucleótidos de Neurospo ha secuencia de nucleótidos que codifica para xilosa reductas enerse como es descrito por Woodyer et al. , 2005).

Arabinosa reductasa (EC 1.1.1.21 ) En otra modalidad, la aldosa reductasa es una uctasa. La arabinosa reductasa tiene el número de nomenclatu ncionadas en la presente como adecuadas para introducir el me la xilosa, son asimismo adecuadas para su uso para intr tabolismo de la arabinosa a un microorganismo.

En otra modalidad, ta aldosa reductasa puede ser vertir la L-lixosa a L-arabitol, y viceversa. En otra modalidad, uctasa puede ser capaz de convertir la D-lixosa a D-arabitol, y vic En otra modalidad, la aldosa reductasa puede ser vertir la ribosa a ribitol (en particular la D-ribosa a D-ribitol), y vice Xilulosa reductasa (EC 1.1.1.9 y EC 1.1.1.10) El término xilulosa reductasa abarca la D-xilulosa redu losa reductasa.

D-xilu!osa reductasa (EC 1.1.1.9) La D-xil l sa redu a ne l n mer Ejemplos de D-xilulosa reductasas adecuadas para su describe en la presente, incluyen la D-xilulosa reductasa codifica uencia de nucleótidos del gen de D-xilulosa de Pichia stipitis (Ps uencia de nucleótidos del gen de D-xilulosa reductasa de M3651 de Pichia stipitis (PsXDH) - número de acceso del NCB sión 1.

L-xilulosa reductasa (EC 1.1.1.10) La L-xilulosa reductasa tiene el número de nomenclat .1.10. La L-xilulosa reductasa puede ser referida como hidrogenasa.

El término L-xilulosa reductasa se refiere a una enzi az de convertir la L-xilulosa a xilitol, y viceversa.

Una L-xilulosa reductasa mencionada en la presente, actuar sobre la L-xilulosa.

El término xilulocinasa se refiere a una enzima que es nvertir la D-xilulosa a D-xilulosa 5-fosfato, y viceversa.

Una xilulocinasa mencionada en la presente, es capaz bre la D-xilulosa.

Ejemplos de xilulocinasas adecuadas para su uso scribe en la presente, incluyen la xilulocinasa codificada por: la nucleótidos del gen de xilulocinasa de Pichia stipitis (PsXKS); la nucleótidos del gen de xilulocinasa de la cepa DSM3651 de Pic XKS) - número de acceso del NCBI AF 127802 versión 1 ; la sec cleótidos del gen de xilulocinasa de S. cerevisiae (ScXKS); y la nucleótidos del gen de xilulocinasa de la cepa D0002 de S. XKS) - número de acceso del NCBI X61377 versión 1.

Xilosa isomerasa (EC 5.3.1.5) La xilosa isomerasa tiene el número de nomenclatura uencia de nucleótidos del gen de isomerasa de Piromyces xylos secuencia de nucleótidos del gen de xilosa isomerasa de la ce omyces sp. (PmXI) - número de acceso del NCBI AJ249909 versi uencia de nucleótidos del gen de xilosa isomerasa de Thermoana rmohydrosulfuricus (ThXI) - número de acceso del NCBI D00756 Q ID No 2 y SEQ ID No 3.

D-arabinitol 4-deshidroqenasa (EC 1.1.1.1 1 ) La D-arabinitol 4-deshidrogenasa tiene el nú enclatura de EC 1.1.1.11. La D-arabinitol 4-deshidrogenasa p rida como D-arabitol deshidrogenasa o arabitol deshidrogenasa.

El término D-arabinitol 4-deshidrogenasa se refiere a u es capaz de convertir el D-arabinitol a D-xilulosa, y viceversa.

Una D-arabinitol 4-deshidrogenasa mencionada en la ca az de actuar sobre el D-arabinitol.

El término L-arabinitol 4-deshidrogenasa se refiere a u es capaz de convertir el L-arabinttol a L-xilulosa, y viceversa.

Una L-arabinitol 4-deshidrogenasa mencionada en la capaz de actuar sobre el L-arabinitol.

Una L-arabinitol 4-deshidrogenasa adecuada y respondiente, se describen en Richard et al. (2001 ).

L-arabinosa isomerasa (EC 5.3.1.4) La L-arabinosa isomerasa tiene el número de nomen 5.3.1.4. La L-arabinosa isomerasa puede ser referida como L- ol-isomerasa.

El término L-arabinosa isomerasa se refiere a una enzi paz de convertir la L-arabinosa a L-ribulosa, y viceversa.

Una L-arabinosa isomerasa mencionada en la pre oaz de actuar sobre la L-arabinosa.

El término ribulocinasa se refiere a una enzima que es vertir, (i) la L-ribulosa a L-ribulosa 5-fosfato, y viceversa; y/o losa a D-ribulosa 5-fosfato, y viceversa.

Una ribulocinasa mencionada en la presente, es capaz re la L-ribulosa y/o D-ribulosa.

Una secuencia de nucleótidos adecuada que codi locinasa puede obtenerse de la cepa NCMB8826 de La tarum (ATCC 14917) (gen descrito en el código de acceso _004567 versión 1 ).

L-ribulosa fosfato 4-epimerasa (EC 5.1.3.4) La L-ribulosa fosfato 4-epimerasa tiene el nú menclatura de EC 5.1.3.4. La L-ribulosa fosfato 4-epimerasa erida como ribulosa fosfato 4-epimerasa, fosforribulosa isom ulosa 5-fosfato 4-e imerasa, AraD o L-Ru5P. tobacillus plantarum (ATCC 14917) (gen descrito en el código i NCBI NC _004567 versión 1).

D-ribitol 4-deshidroqenasa La D-ribitol 4-deshidrogenasa tiene el número de no EC 1.1.1.56. Esta enzima puede ser referida también como shidrogenasa, adonitol deshidrogenasa o ribitol deshidrogenasa.

El término D-ribitol 4-deshidrogenasa se refiere a un e es capaz de convertir el ribitol a D-ribulosa, y viceversa.

Una D-ribitol 4-deshidrogenasa mencionada en la pr az de actuar sobre el D-ribitol.

Una D-ribitol 4-deshidrogenasa adecuada y rrespondiente, son descritos por Dothie et al., 1985. - i Una secuencia de nucleótidos que codifica para una sa isomerasa, puede ser clonada de la cepa DL-28 del netobacter sp. (Shimonishi e Izumori, 1996) o de Aerobacter derson y Allison, 1965).

Ribosa isomerasa (EC 5.3.1.20) La ribosa isomerasa tiene el número de nomenclatu .1.20. Esta enzima puede ser referida también como D-ribosa iso ibosa cetol-isomerasa.

El término ribosa isomerasa se refiere a una enzim az de convertir la D-ribosa a D-ribulosa, y viceversa.

Una ribosa isomerasa mencionada en la presente, es uar sobre la D-ribosa.

La D-ribosa isomerasa se ha encontrado en el cobacterium sme matis Izumori et a/. 1975 de donde uede se losa-5-? 3-epimerasa; D-xilulosa-5-fosfato 3-epimerasa; eritrosa merasa; ribulosa 5-fosfato 3-epimerasa; y xilulosa fosfato 3-epime El término ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa se refier ima que es capaz de convertir la D-ribulosa 5-fosfato a D-x fato, y viceversa.

Ejemplos de ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa adecuado como se describe en la presente, incluyen la ribulosa-5-f imerasa codificada por: la secuencia de nucleótidos del gen R evisiae; la secuencia de nucleótidos del gen RPE1 de la cepa DO evisiae] la secuencia de nucleótidos del código de acceso _012414 versión 1 ; y la ribulosa-5-fosfato isomerasa de P. s de encontrarse en el número de acceso del NCBI NP_012414 ve Ribosa-5-fosfato isomerasa (EC 5.3.1.6) La ribosa-5-fosfa isom rasa i el n Ejemplos de ribosa-5-fosfato isomerasa adecuados pa o se describe en la presente, incluyen la ribosa-5-fosfato cetol-i ificada por: la secuencia de nucleótidos del gen RKI1 de S. cer uencia de nucleótidos del gen RKI1 de la cepa D0002 de S. cer uencia de nucleótidos del código de acceso del NCBI X94335 ve uencia de nucleótidos del código de acceso del NCBI NP 0147 y la ribosa-5-fosfato isomerasa de P. stipitis que puede encontr eso NC J509043 versión 1.

Transcetolasa (EC 2.2.1.1 ) La transcetolasa tiene el número de nomenclatura de E ta enzima puede ser referida también como glicolaldehídotransfer El término transcetolasa se refiere a una enzima que convertir la sedoheptulosa 7-fosfato + D-gliceraldehído 3-fosfato sfato + D-xilulosa 5-fosfato viceversa.

Transaldolasa (EC 2.2.1.2) La transaldolasa tiene el número de nomenclatura de E a enzima puede ser referida también como dihidroxiacetonatr idroxiacetona sintasa, formaldehído transcetolasa o glicerona tran El término transaldolasa se refiere a una enzima que convertir la sedoheptulosa 7-fosfato + D-gliceraldehído 3-fos rosa 4-fosfato + D-fructosa 6-fosfato, y viceversa.

Ejemplos de transaldolasas adecuadas para su uso cribe en la presente, incluyen la transaldolasa codificada por: la nucleótidos del gen TAL1 de Saccharomyces cerevisiae la sec leótidos del gen TAL 1 de la cepa D0002 de Saccharomyces cer uencia de nucleótidos del código de acceso del NCBI X15953 ve uencia de nucleótidos del código de acceso del NCBI NP 0134 y la transaldolasa de P. stipitis que puede encontrarse en 000502 versión 1.

El reactivo al color consiste de 0.5 g de florogluci idroxibenceno), 100 mi de ácido acético glacial y 10 mi centrado. 50 µ? de la muestra se añaden a 950 µ? del reactivo al zcla se calienta a 100°C por 4 minutos, y la absorbancia de la a 554 nm. La cantidad de una aldopentosa en la muestra se det erdo con una curva estándar obtenida con la misma aldopent ándar. Este método puede usarse para determinar la cantidad binosa, lixosa y ribosa en un medio de cultivo.

Prueba de interconversión La capacidad de los microorganismos para cat versión entre a-aldopentosa y ß-aldopentosa, puede ponerse a p ios métodos. Por ejemplo, la interconversión entre el anómero mero beta de las aldolasas puede ir seguida de RMN, por ejem ex licado or R u et al. 2004 o or una rueba aco lada en Prueba de etanol La cantidad del biocombustible como etanol en una so o un medio de cultivo) puede determinarse por el uso de una nol disponible comercialmente, el kit de K-ETOH, fabricado y ve gazyme International, Bray Business Park, Bray, Co. Wicklow, de determinarse, por ejemplo, por el uso de cromatografía de gas Vía de la pentosa fosfato Las cetopentosas son convertidas en etanol por la ntosa fosfato. Un ejemplo de esto se muestra en la figura 4.

Ejemplos de enzimas implicadas en la vía de la pento luyen: transcetolasa, transaldolasa, ribosa-5-fosfato cetol-iso ulosa-5-fosfato 3-epimerasa.

En una modalidad, el microorganismo de conformid sente invención ha sido transformado también ara ex En otra modalidad, el microorganismo ha sido transferi o más secuencias de nucleótidos que codifican para una o má licadas en la vía de la pentosa fosfato. Por ejemplo, el microorg sformado con un vector de expresión que comprende una sec leótidos que codifica para una o más enzimas implicadas en la tosa fosfato.

De preferencia, el vector de expresión menciona sente comprende uno o más promotores capaces de sobreexpre S secuencias de nucleótidos que codifican para una o más licadas en la vía de la pentosa fosfato. Ejemplos de dichos p luyen el promotor de GPD, el promotor de TEF y el promotor motores preferidos que pueden usarse para sobreexpresar u uencias de nucleótidos que codifican para una o más enzimas i la vía de la pentosa fosfato, pueden ser cualquiera de los uiadores ue controlan la ex resión de secuencias de nucleó expresión, o qüe va de un menor nivel de expresión a un mayo resión (por ejemplo, sobrerregulación) cuando el micro sformado se compara con el microorganismo equivalente an nsformación. Los microorganismos que sobreexpresan una o má ilcadas en la vía de la pentosa fosfato tienen una capacidad incr a catalizar la conversión de una cetopentosa (tal como xilulosa 5- biocombustible (tal como etanol).

De preferencia, dicho microorganismo transform reexpresa una o más enzimas implicadas en la vía de la pentos capaz de catalizar la conversión de una cetopentosa (tal como fato) a un biocombustible (tal como etanol) por una velocidad que nos 10%, 15%, 20% ó 25% mayor que en un microorga nsformado.

Ejemplos de microorganismos que sobreexpresan u imas im licadas en la vía de la entosa fosfato incl tivo durante la fase de crecimiento exponencial, pero despu sformación, dicho microorganismo es capaz de expresar una as enzimas a un mayor nivel, en las mismas condiciones d rante la fase de crecimiento exponencial).

La invención se describirá ahora adicionalmente por mplos, los cuales tienen el propósito de ayudar al experto en la ar a cabo la invención, y de ninguna manera se pretende que ance de la invención.

EJEMPLOS La presente invención usa, a menos que se indiqu añera, técnicas convencionales de química, biología crobiolo ía ADN recombinante e inmunolo ía las cuales stán ratura. Véase, por ejemplo, J. B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, 1 lation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & S it (editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymol ucture Parí A: Synthesis and Physical Analysis of DNA M zymology, Academic Press. Cada uno de estos textos gen orpora en la presente como referencia.

EJEMPLO 1A onstrucción de un gen de mutarrotasa sintético (aldosa-1-epi de Lactococcus lactis basada en el código de acceso del AAD20245 versión 1 El gen de aldosa-1-epimerasa de L. lactis (LIMR) itetizado ensamblado or Geneart AG Re ensbur Alemania . s decir, AAD20245), y la secuencia de aminoácidos codificada uencia de nucleótidos se identifica como SEQ ID No 47. El pedero fue nombrado como 0717050pGA14.

EJEMPLO 1B Construcción de un gen de xilosa isomerasa sintético de E romvces basada en el código de acceso del NCBI AJ249909 v El gen de xilosa isomerasa de Piromyces (PmXI) e etizado y ensamblado por Geneart AG (Regensburg, Alemania). ones en la secuencia fue optimizado con base en la tabla d ones de levadura de la base de datos del uso de codones d kamura et al., 2000). Flanqueando el marco de lectura abierto, u tricción para Nhel proximal al codón de inicio de ATG, y u tricción ara Xhol distal al codón de detención se inclu er EJEMPLO 1C Construcción del gen de xilosa isomerasa sintético (XvIA) Thermoanaerobacter thermohvdrosulfuricus basada en el cód acceso del NCBI D00756 versión 1 El gen de xilosa isomerasa de T. thermohydrosulfuric ero fue sintetizado y ensamblado por Geneart AG (Regensburg, so de codones en la secuencia fue optimizado con base en la ta codones de levadura de la base de datos del uso de codones d kamura et a/., 2000). Flanqueando el marco de lectura abierto, tricción para Nhel proximal al codón de inicio de ATG, y u tricción para Xhol distal al codón de detención, se incluyer strucción sintética. La integridad del gen sintético de ThXI se uenciando ambas cadenas. La secuencia de nucleótidos lu endo los sitios de restricción de flan ueo se identifica como S EJEMPLO 2A lonación por TOPO del gen de D-xilulocinasa de la cepa DSM hia stipitis basada en el código de acceso del NCBI AF12780 1 Se amplificó por PCR el gen de D-xilulocinasa de XKS) entero a partir de ADN obtenido de la cepa DSM3651 , u iadores identificados por SEQ.ID.NO. 4 y SEQ.ID.NO. 5. Se int o de restricción para Nhel proximal al codón de inicio de ATG, y ricción para Xhol distal al codón de detención, flanqueando el ge mo molde, se usó ADN de la cepa de P. stipitis a una concentraci µ? de la reacción de PCR. Se llevó a cabo PCR a 30 ciclos de 30 6°C, 30 segundos a 50°C y 150 segundos a 72°C, seguid ubación final de 10 minutos a 72°C usando la ADN polimeras lidad Phusion Finnz mes O Finlandia . El roducto de PCR EJEMPLO 2B lonación por TOPO del gen de D-xilosa red uc tas a de la cepa Pichia stipitis basada en el código de acceso del NCBI X5946 1 Se amplificó por PCR el gen de D-xilosa reductasa de XR) entero a partir de ADN obtenido de la cepa DSM3651 , u adores identificados por SEQ.ID.NO. 6 y SEQ.ID.NO. 7. Se int o de restricción para Nhel proximal al codón de inicio de ATG, y tricción para Xhol distal al codón de detención, flanqueando el g mo molde, se usó ADN de la cepa de P. stipitis a una concentraci µ? de la reacción de PCR. Se llevó a cabo PCR a 30 ciclos de 30 96°C, 30 segundos a 50°C y 150 segundos a 72°C, seguid ubación final de 10 minutos a 72°C usando la ADN polimeras lidad Phusion Finnz mes O , Finlandia . El roducto de PCR EJEMPLO 2C Clonación por TOPO del gen de xilitol deshidroqenasa (D-xil ductasa) de la cepa DSM3651 de Pichia stipitis basada en el c acceso del NCBI X5S392 versión 1 Se amplificó por PCR el gen de xilitol deshidrogena itis (PsXDH) entero a partir de ADN obtenido de la cepa DSM365 iniciadores identificados por SEQ.ID.IMO. 8 y SEQ.ID.NO. 9. Se sitio de restricción para Nhel proximal al codón de inicio de ATG, restricción para Xhol distal ai codón de detención, flanquean XDH. Como molde, se usó ADN de la cepa de P. stipit centración de 0.2 ng/µ? de la reacción de PCR. Se llevó a cabo los de 30 segundos a 96°C, 30 segundos a 50°C y 150 segundo uida de una incubación final de 10 minutos a 72°C usand limerasa de alta fidelidad Phusion Finnz mes O Finlandia . El EJEMPLO 2D onación por TOPO del gen de L-arabinosa isomerasa (EC 5.3. pa NCIMB8826 de Lactobacillus plantarum (ATCC 14917) bas código de acceso del NCBI NC 004567 versión 1 Se amplifica por PCR el gen de L-arabinosa ¡somer ntarum (LpAraA) entero a partir de ADN obtenido de la cepa AT ndo los iniciadores identificados por SEQ.ID.NO. 10 y SEQ.ID.N roduce un sitio de restricción para Nhel proximal al codón de inici n sitio de restricción para Xhol distal al codón de detención, flanq n LpAraA. Como molde, se usa ADN de la cepa de L. plantar ncentración de 0.2 ng/µ? de la reacción de PCR. Se lleva a cabo los de 30 segundos a 96°C, 30 segundos a 55°C y 60 segundo uida de una incubación final de 10 minutos a 72°C usand limerasa de alta fidelidad Phusion Finnz mes O Finlandia . El EJEMPLO 2E lonación por TOPO del gen de L-ribulocinasa (EC 2,7.1.16) de NCIMB8826 de Lactobacillus plantarum (ATCC 14917) basad código de acceso del NCBI NC 004567 versión 1 Se amplifica por PCR el gen de L-ribulocinasa de L. AraB) entero a partir dé ADN obtenido de la cepa ATCC14917, u adores identificados por SEQ.ID.NO. 12 y SEQ.ID.NO. 13. Se int o de restricción para Nhel proximal al codón de inicio de ATG, y tricción para Xhol distal al codón de detención, flanqueando el ge mo molde, se usa ADN de la cepa de L plantarum a una concen ng/µ? de la reacción de PCR. Se lleva a cabo PCR a 30 cicl undos a 96°C, 30 segundos a 55°C y 60 segundos a 72°C, segui ubación final de 10 minutos a 72°C usando la ADN polimeras lidad Phusion Finnz mes O Finlandia . El roducto de PCR EJEMPLO 2F lonación por TOPO del gen de L-ribulosa-5-fosfato 4-epimer 1.3.4) de la cepa NCIMB8826 de Lactobacillus plantarum (ATC basada en el código de acceso del NCBI NC 004567 versi Se amplifica por PCR el gen de L-ribulosa-5-fosfato 4- L plantarum (LpAraD) entero a partir de ADN obtenido d cC14917, usando los iniciadores identificados por SEQ.ID. Q.ID.NO. 15. Se introduce un sitio de restricción para Nhel p ón de inicio de ATG, y un sitio de restricción para Xhol distal al tención, flanqueando el gen LpAraD. Como molde, se usa ADN L plantarum a una concentración de 0.2 ng/µ? de la reacción de a a cabo PCR a 30 ciclos de 30 segundos a 96°C, 30 segundos segundos a 72°C, seguida de una incubación final de 10 minut ando la ADN olimerasa de alta fidelidad Phusion Finnz EJEMPLO 2G nacíón por TOPO del gen GAL10 de la cepa D0002 de Sacch erevisiae basada en el código del número de acceso del NCBI versión 1 Se amplificó por PCR el gen GAL10 de Sacch evisiae (ScGALIO) entero a partir de ADN obtenido de la cepa ccharomyces cerevisiae, usando los iniciadores identific Q.ID.NO. 16 y SEQ.ID.NO. 17. Se introdujo un sitio de restricción ximal al codón de inicio de ATG, y un sitio de restricción para Xh ón de detención, flanqueando el gen ScGALIO. Como molde, se la cepa de S. cerevisiae a una concentración de 0.2 ng/µ? de la re R. Se llevó a cabo PCR por 35 ciclos de 30 segundos a 96°C, 30 7°C y 120 segundos a 72°Ct seguida de una incubación final de 1 2°C usando la ADN olimerasa de alta fidelidad Phusion Finnz EJEMPLO 2H onacion por TOPO de un gen GAL10 truncado fnucleótidos 1 e la cepa D0002 de Saccharomyces cerevisiae basada en el c acceso del NCBI Z3S888 versión 1 Se amplificó por PCR el gen GAL10 truncado N-term evisiae (ScGALlOA) a partir de ADN obtenido de la cepa D0 evisiae, usando los iniciadores identificados por SEQ.ID.N Q.ID.NO. 17. Se introdujo un sitio de restricción para Nhel p ón de inicio de ATG, y un sitio de restricción para Xhol distal al tención, flanqueando el gen ScGALIOA. Como molde, se usó pa de S. cerevisiae a una concentración de 0.2 ng/µ? de la reacció llevó a cabo PCR por 35 ciclos de 30 segundos a 96°C, 30 s °C y 120 segundos a 72°C, seguida de una incubación final de 10 °C usando la ADN olimerasa de alta fidelidad Phusion Finnz EJEMPLO 3A Construcción del plásmido PmXI-8a que contiene al gen de merasa de Piromvces (PmXI) bajo el control del promotor de terminador CYC1 de S. cerevisiae El vector promiscuo de alto número de copias P426-//S. cerevisiae (Mumberg et al., 1995) fue digerido con Spel y remos terminales resultantes fueron desfosforilados con fosfatas ¡mismo, el fragmento de ADN que codifica para el gen de xilosa i Piromyces fue liberado del vector 07T7049pGA15 (descrito en ) por digestión con Nhel y Xhol. El plásmido linealizado resulta D y el fragmento de ADN que codifica para el PmXI se ctroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusió aislaron. Los dos fragmentos de ADN fueron ligados juntos, res lásmido nombrado como PmXI-8a. remos terminales resultantes fueron desfosforilados con fosfatas imismo, el fragmento de ADN que codifica para el gen de xilosa i T. thermohydrosulfuricus fue liberado del vector 0717046pGA14 el ejemplo 1c) por digestión con Nhel y Xhol. El plásmido li ultante P426-GPD y el fragmento de ADN que codifica para e araron electroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo ión a 1 %, y se aislaron. Los dos fragmentos de ADN fueron ligad ultando en el plásmido nombrado como ThXI-5a.

EJEMPLO 3C Construcción del plásmido PsXKS-14a que contiene al gen lulocinasa de P. stipitis (PsXKS) bajo el control del promotor el terminador CYC1 de 5. cerevisiae El vector romiscuo de alto número de co ias P42 - aislaron. Los dos fragmentos de ADN fueron ligados juntos, res lásmido nombrado como PsXKS-14a.

EJEMPLO 3D onstrucción de los plásmidos PsXR-24a y PsXR-25 que conti n de xilosa reductasa de P. stipitis (PsXR) bajo el control del de GPD y el terminador CYC1 de S. cerevisiae El vector promiscuo de alto número de copias P424-/ZS. cerevisiae y el vector promiscuo de bajo número de copi 14-GPD (Mumberg et al., 1995) fue digerido con Spel y X remos terminales resultantes fueron desfosforilados con fosfatas imismo, el fragmento de ADN que codifica para el gen de xilosa P. stipitis fue liberado del vector pCR-Blunt 2 P.stip XR (des m lo 2b or di estión con Nhel Xhol. Los lásmidos li EJEMPLO 3E Construcción del plásmido PsXDH-11a que contiene al gen d shidrogenasa de P. stipitis (PsXDH) (xilulosa red uc tasa) bato del promotor de GPD y el terminador CYC1 de S. cerevisi El vector promiscuo de alto número de copias P426-G /ZS. cerevisiae (Mumberg et al. , 1995) fue digerido con Spel y remos terminales resultantes fueron desfosforilados con fosfatas imismo, el fragmento de ADN que codifica para el gen d shidrogenasa de P. stipitis fue liberado del vector pCR-Blunt 2 P scrito en el ejemplo 2c) por digestión con Nhel y Xhol. El alizado resultante P426-GPD y el fragmento de ADN que codifi XDH se separaron electroforéticamente sobre un gel de agaros to de fusión a 1 %, y se aislaron. Los dos fragmentos de A dos untos resultando en el lásmido nombrado como PsXDH-11 EJEMPLO 3F Construcción de los plásmidos LIMR-36a, LIMR-38a y LIMR-4 ntienen al gen de mutarrotasa de L lactis (LIMR) (aldosa-1-epi bajo el control de varios promotores y el terminador CYC1 d cerevisiae Los vectores promiscuos de bajo número de copias P 13-ADH y P413-TEF de E. coli/S. cerevisiae (Mumberg et al., 199 eridos con Spel y Xhol, y los extremos terminales resultant fosforilados con fosfatasa alcalina. Asimismo, el fragmento de ifica para el gen de aldosa-1-epimerasa de L lactis (LIMR) fue lib tor 0717050pGA14 (descrito en el ejemplo 1a) por digestión c l. Los plásmidos linealizados resultantes P413-GPD, P4 3-ADH F y el fragmento de ADN que codifica para LIMR se ctroforéticamente sobre un el de a arosa d un i PDH), isozima 3; P413-ADH comprende el promotor del gen ifica para alcohol deshidrogenasa I; y P413-TEF comprende el l gen de TEF2 que codifica para el factor de alargamiento EF-1 ducción.

EJEMPLO 3G onstrucción de un plásmido de expresión de levadura que co en de L-arabinosa isomerasa de L plantarum (LpAraA) bajo el del promotor de 6PD y el terminador CYC1 de S. cerevisi El vector promiscuo de alto número de copias P426-G i/S. cerevisiae (Mumberg et al., 1995) es digerido con Spel y X remos terminales resultantes son desfosforilados con fosfatas imismo, el fragmento de ADN que codifica para el gen de L- merasa de L lantarum L AraA es liberado del vector desc EJEMPLO 3H onstrucción de un plásmido de expresión de levadura que co gen de L-ribulocinasa de L plantarum (LpAraB) bajo el contr promotor ADH y el terminador CYC1 de S. cerevisiae El vector promiscuo de alto número de copias P425-A //S. cerevisiae (Mumberg et ai, 1995) es digerido con Spel y X remos terminales resultantes son desfosforilados con fosfatas imismo, el fragmento de ADN que codifica para el gen de L-ribulo lantarum (LpAraB) es liberado del vector descrito en el ejempl estión con Nhel y Xhol. El plásmido linealizado resultante P425 gmento de ADN que codifica para LpAraB se separan electroforé bre un gel de agarosa de bajo punto de fusión a 0.7%, y se aisla gmentos de ADN son ligados juntos, y el plásmido resultante se u nsformación de TOP10 de E. coli. remos terminales resultantes son desfosforilados con fosfatas imismo, el fragmento de ADN que codifica para el gen de L-r fato 4-epimerasa de L plantarum (LpAraD) es liberado del vect el ejemplo 2ft por digestión con Nhel y Xhol. El plásmido li ultante P424-GPD y el fragmento de ADN que codifica para L paran electroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo punto .7%, y se aislan. Los dos fragmentos de ADN son ligados ju smido resultante se usa para la transformación de TOP10 de E. c EJEMPLO 3J onstrucción de un plásmido de expresión de levadura que co n de aldosa-1-epimerasa/UDP galactosa 4-epimerasa bifuncio erevisiae (ScGALIO) bajo el control del promotor ADH y el ter YC1 de S, cerevisiae, para la sobreexpresión de aldosa-1 -epi GAL10 se separan electroforéticamente sobre un gel de agaros nto de fusión a 0.7%, y se aislan después. El plásmido linealiz H es ligado junto con el fragmento ScGALI O, resultando en el pl presión de levadura.

EJEMPLO 3K nstrucción de un plásmido de expresión de levadura que con arte de mutarrotasa del gen de aldosa-1-epimerasa/UDP qala imerasa de S. cerevisiae (ScGALIQA) bajo el control del prom l terminador CYC1 de S. cerevisiae, para la sobreexpresión d 1-epimerasa El gen GAL10 es conocido por ser una enzima bifun tiene una parte de epimerasa que cataliza la conversión de UDP DP- lucosa así como una arte de mutarrotasa ue cataliza la c ??. El plásmido linealizado resultante P413-ADH y el fragmento de ifica para ScGALlOA se separan electroforéticamente sobre rosa de bajo punto de fusión a 0.7%, y se aislan después. El alizado P413-ADH es ligado junto con el fragmento ScGAUOA, r el plásmido de expresión de levadura.

EJEMPLO 4A onstrucción de cepas de S. cerevisiae que contienen a los pl PmXI-8a y PsXKS-14a ¡unto con los plásmidos LIMR-36a, LIM LIMR-40a o el plásmido P413-CYC vacio (Mumberq ef a/., 1 200 ng de cada uno de los plásmidos se combinaron y ra la transformación de la cepa de levadura BY4741 de S. roscarf, Alemania) por medio de electroporación, usando el sist lser II de Biorad Biorad, USA , de acuerdo con las instrucc a T0063 con los plásmidos LIMR-38a, PmXI-8a y PsXKS-14a; ce los plásmidos LIMR-40a, PmXI-8a y PsXKS-14a; y finalment 67 con los plásmidos P413-CYC, PmXI-8a y PsXKS-14a (estos describen en el ejemplo 3; P413-CYC es el plásmido vacío d mberg et al., 1995).

EJEMPLO 4B ediciones del metabolismo de D-xilosa por curvas de crecimi las cepas de levadura T0062, T0063, T0065 y T0067 Cambios en la velocidad de metabolismo de D-xilosa s o alteraciones en la velocidad de crecimiento de las cepas de metabolizan xilosa. Las cuatro cepas fueron adaptadas inicia tabolismo de D-xilosa. Cada cepa fue inoculada individualmente se aración com leto sintético lí uido omitiendo uracilo histidina complementado con D-xilosa a 2% a un título de células inicial .006/ml. Estos cultivos se incubaron como se describió anterior aron muestras de alícuotas cuatro veces con intervalos de 24 ió la densidad óptica DO600, y se determinó una curva de er a cada una de las cuatro cepas. Se determinó el tiempo de dupli ir, el tiempo transcurrido para una duplicación en el nú roorganismos por mi durante la fase de crecimiento exponencial) rvalo de tiempo de 24 a 96 horas después de la fase de laten dieron determinarse los siguientes datos de crecimiento para l as: Velocidad de crecimiento Cepa de levadura DO600 fin específica (µ)?"1 T0067 0.058 0.1 10 T0065 0.070 0.215 T0063 0.079 0.441 T0062 0.088 0.524 ! logró un incremento en biomasa de más de 4 veces en esa adura recombinante. Además, el uso de diferentes promot trolan la aldosa-1-epimerasa, en cepas de otra manera is muestra un incremento en el flujo de carbono como resultad centración incrementada del promotor. Esto muestra que existe botella antes de la isomerización de la D-xilosa en la vía meta abolismo de la D-xilosa.

EJEMPLO SA onstrucción de cepas de S. cerevisiae que contienen a los pl Xl-5a y PsXKS-14a junto con el plásmido LIMR-36a o el plásm CYC vacío (Mumberq et a 1995) 200 ng de cada uno de los plásmidos se combinaron y ra la transformación de la ce a de levadura BY4 41 .

-Ura, His, Leu, y se aisló una colonia de cada una de las siguie 085 transformada con los plásmidos LIMR-36a, ThXI-5a y PsX pa T0086 con los plásmidos P413-CYC, ThXI-5a y PsXKS-14a.

EJEMPLO SB Iedíciones del metabolismo de D-xilosa por curvas de crecimí las cepas de levadura T0085 y T0086 Cambios en la velocidad de metabolismo de D-xilosa s no alteraciones en la velocidad de crecimiento de las cepas d e metabolizan xilosa. Las dos cepas fueron adaptadas inicia tabolismo de D-xilosa. Cada cepa fue inoculada individualmente separación completo sintético líquido omitiendo uracilo, histidina mplementado con D-xilosa a 2% y D-glucosa a 0.2% (SCX (+ D- % - Ura His Leu . Los cultivos se incubaron or una semana arón muestras de alícuotas cuatro veces con intervalos de 24 ió la densidad óptica DO600, y se determinó una curva de er ra cada una de las cuatro cepas. Se determinó el tiempo de d ndo el intervalo de tiempo de 24 a 96 horas después de la fase d ial. Pudieron determinarse los siguientes datos de crecimiento pa pas: Velocidad de crecimiento Cepa de levadura DO600 fin específica (p)h 1 T0086 0.056 0.101 T0085 0.067 0.172 Esto demuestra que puede lograrse un incremen locidad de crecimiento de aproximadamente 20% cuando la imerasa es co-expresada junto con la xilosa isomerasa y D-xilulo mparación con la cepa isogénica que no expresa la m m árese la ce a T0085 con la ce a T0086 ue no ex resa la mut EJEMPLO 6A nstrucción de cepas de S. cerevisiae que contienen al plásmi a (o PsXR-251, el plásmido PsXDH-11a y el plásmido PsXKS- on el plásmido LIMR-38a, o el plásmido P423-CYC vacío (Mu a 1995) 200 ng de cada uno de los plásmidos se combinaron y ra la transformación de la cepa de levadura Y07202 de S. roscarf, Alemania) por medio de electroporación, usando el siste lser II de Biorad (Biorad, USA), de acuerdo con las instrucc ricante. Células de levadura se hicieron competentes de acuer tocolo estándar (Becker y Guarente, 1991). La selección pa nsformados con los cuatro plásmidos se hizo simultáneamente en aración completo sintético sólido omitiendo uracilo, histidina, )tófano com lementado con D- lucosa a 2% SC-Ur Hi EJEMPLO 6B ediciones del metabolismo de D-xilosa por curvas de crecími las cepas de levadura TO0114, T0117. T0123 y T0126 Cambios en la velocidad de metabolismo de D-xilosa s o alteraciones en la velocidad de crecimiento de las cepas de metabolizan xilosa. Las cuatro cepas fueron adaptadas inicia tabolismo de D-xilosa. Cada cepa fue inoculada individualmente separación completo sintético líquido omitiendo uracilo, histidina, tófano complementado con D-xilosa a 2% y D-glucosa a 0.2% ( cosa a 0.2%) - Ura, His, Leu, Trp). Los cultivos se incubaron ana a 30°C en un agitador que corría a 225 RPM. Despué ana, cada cultivo se usó para re-inocular nuevos cultivos con aración completo sintético líquido omitiendo uracilo, histidina, tófano com lementado con D-xilosa a 2% D- lucosa a 0.02% 120 horas después de la fase de latencia inicial. Pudieron dét iguientes datos de crecimiento para las cuatro cepas: Velocidad de crecimiento Cepa de levadura DO600 fin específica (µ)??"1 T0114 0.040 0.089 T0117 0.033 0.055 T0123 0.039 0.084 T0126 0.034 0.059 Esto demuestra que puede lograrse un incremen ocidad de crecimiento de más de 10% cuando la aldosa-1-epinr expresada junto con la xilosa reductasa, xilulosa deshidrogen locinasa, en comparación con la cepa isogénica que no e tarrotasa. Compárese la cepa T01 14 con la cepa T0117 que no tarrotasa y la cepa T0123 con la cepa T0126 que no e tarrotasa.

No udieron medirse diferencias si nificativas entre l EJEMPLO 7A onstrucción de cepas de S. cerevisiae que contienen a los plá AraA, LpAraB y LpAraD ¡unto con el plásmido LIMR-36a o el P413-CYC vacío (Mumberq et aL 1995) 200 ng de cada uno de los plásmidos LpAraA, LpAraB scritos en los ejemplos 3g, 3h y 3i) se combinan con el plásmido scrito en el ejemplo 3f) o con el plásmido vacío P413-CYC (Mumb 95), y se usan para la transformación de la cepa de levadura Y07 evisiae (Euroscarf, Alemania) por medio de electroporación tema Gene Pulser II de Biorad (Biorad, USA), de acuerdo trucciones del fabricante. Células de levadura se hacen compe erdo con un protocolo estándar (Becker, D. M. y Guarente, ección para clones transformados con los cuatro plásmidos se lle medio de se aración m in i l n EJEMPLO 7B ediciones del metabolismo de L-arabinosa por curvas de cre de las cepas de levadura descritas en el ejemplo 7a Cambios en la velocidad de metabolismo de L-ara ieron como alteraciones en la velocidad de crecimiento de las adura que metabolizan arabinosa. Las dos cepas (descritas en ) son adaptadas inicialmente al metabolismo de L-arabinosa. Cad culada individualmente en medio de separación completo sintéti itiendo uracilo, histidina, leucina y triptófano complementad binosa a 2% y D-glucosa a 0.2% (SCA (+ D-glucosa a 0.2%) -u, Trp). Los cultivos se incuban por una semana a 30°C en un agi re a 225 RPM. Después de una semana, cada cultivo se usa cular nuevos cultivos con medio de separación completo sintéti itiendo uracilo histidina leucina tri tófano com l ment pos de duplicación usando el intervalo de tiempo de 24 a 1 spués de la fase de latencia inicial.

Un incremento en la velocidad de crecimiento y en l umulada de levaduras se logra cuando la aldosa-1-epimeras resada junto con L-arabinosa isomerasa (LpAraA), L-ribulocinasa L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa (LpAraD), en comparación co génica que no expresa una mutarrotasa.

EJEMPLO 8A nstruccion de una cepa de S. cerevisiae que contiene a los pl mXI-8a y PsXKS-14a junto con el plásmido que codifica para ajo el control del promotor ADH. para la sobreexpresión de al epimerasa 200 n de cada uno de los tres lásmidos se combinan plementado con D-glucosa a 2% (SC-Ura, His, Leu) (Rose et. clones que comprendan los tres plásmidos crecerán en SC-Ura, EJEMPLO 8B nstrucción de una cepa de S. cerevisíae que contiene a los pl XI-8a y PsXKS-14a junto con el plásmido que codifica para S ajo el control del promotor ADH. para la sobreexpresión de al epimerasa 200 ng de cada uno de los tres plásmidos se combinan a la transformación de la cepa de levadura BY4741 de S. roscarf, Alemania) por medio de electroporación usando el siste lser II de Biorad (Biorad, USA), de acuerdo con las instrucc ricante. Células de levadura se hacen competentes de acuerd tocolo estándar Becker Guarente 1991 . La selección a EJEMPLO 8C ediciones del metabolismo de D-xilosa por curvas de crecimí las cepas de levadura descritas en los ejemplos 8a y 8b Cambios en la velocidad de metabolismo de D-xilosa o alteraciones en la velocidad de crecimiento de las cepas de metabolizan xilosa. Las dos cepas son adaptadas inicia abolismo de D-xilosa. Primero, por inoculación individual en aración completo sintético líquido omitiendo uracilo, histidina plementado con D-xilosa a 2% y D-glucosa a 0.2% (SCX (+ D-%) - Ura, His, Leu), e incubación por una semana a 30°C en u corre a 225 RPM. Después, cada cultivo se usa para la re-inoc vos cultivos en medio de separación completo sintético líquido cilo, histidina y leucina complementado con D-xilosa a 2% y D-% SCX + D- lucosa a 0.02% - Ura His Leu . De nuevo c alícuotas cuatro veces con intervalos de 24 horas. Se mide la tica DO600 y, con base en eso, se determina la curva de crecim da cepa. Se determina el tiempo de duplicación, usando el int mpo de 24 a 96 horas después de la fase de latencia inicial. El i la velocidad de crecimiento específica y en la biomasa acu aduras se demuestra en estas dos cepas de levadura que GAL10 o ScGAU OA, en comparación con la cepa T0067 iso sformada con un derivado de expresión heterólogo de GAL10 d r ejemplo, ScGALIO o ScGAUOA).

EJEMPLO 9A Clonación por TOPO de una región de flanqueo izquierda p tegración estable de la construcción de expresión en el locus evadura (LFRRfini) basada en el código de acceso del NCBI D versión 1 /µ? de la reacción de PCR. Se llevó a cabo PCR a 35 ciclos de 30 96°C, 30 segundos a 57°C y 20 segundos a 72°C, seguid ubación final de 10 minutos a 72°C usando la ADN polímera elidad Phusion (Finnzymes Oy, Finlandia). El producto de PCR ctroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusi e aisló un fragmento de 433 pb. El fragmento de ADN fue cl PO en el vector pCR-Blunt ll-TOPO (Invitrogen, USA) de acuer trucciones del fabricante, y el plásmido resultante se usó nsformación de TOP10 de E. coli. El plásmido fue nombrado com 5c(+).

EJEMPLO 9B Clonación por TOPO de una región de flanqueo derecha pa tegración estable de la construcción de expresión en el locus v R e CB RRdni - Como molde, se usó ADN de la cepa de S. cerevisi centración de 0.2 ng/µ? de la reacción de PCR. Se llevó a cabo los de 30 segundos a 96°C, 30 segundos a 57°C y 20 segundo uida de una incubación final de 10 minutos a 72°C usand limerasa de alta fidelidad Phusion (Finnzymes Oy, Finlandia). El PCR se separó electroforéticamente sobre un gel de agarosa de fusión a 1.0%, y se aisló un fragmento de 503 pb. El fragmento d nado por TOPO en el vector pCR-Blunt ll-TOPO (Invitrogen, erdo con las instrucciones del fabricante, y el plásmido resultan ra la transformación de TOP10 de E. coli. El plásmido fue nombr n1-R-a16b(+).

EJEMPLO 9C Clonación por TOPO de una región de flanqueo izquierda p egración estable de la construcción de expresión en el locus a Salí distal al fragmento de ADN, flanqueando la pieza LFR ¡g lde, se usó ADN de la cepa de S. cerevisiae a una concentraci µ? de la reacción de PCR. Se llevó a cabo PCR a 35 ciclos de 30 6°C, 30 segundos a 57°C y 20 segundos a 72°C, seguid ubación final de 10 minutos a 72°C usando la ADN polimeras lidad Phusion (Finnzymes Oy, Finlandia). El producto de PCR ctroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusió e aisló un fragmento de 507 pb. El fragmento de ADN fue cl PO en el vector pCR-Blunt ll-TOPO (Invitrogen, USA) de acuerd trucciones del fabricante, y el plásmido resultante se usó sformación de TOP10 de E. coli. El plásmido fue nombrado co a19h(+).

EJEMPLO 9D tricción para Xhol proximal al fragmento de ADN, y un sitio de ra Pmel distal al fragmento de ADN, flanqueando la pieza RFRM¡g lde, se usó ADN de la cepa de S. cerevisiae a una concentraci /µ? de la reacción de PCR. Se llevó a cabo PCR a 35 ciclos de 30 96°C, 30 segundos a 57°C y 20 segundos a 72°C, seguid ubación final de 10 minutos a 72°C usando la ADN polimeras lidad Phusion (Finnzymes Oy, Finlandia). El producto de PCR Ctroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusió e aisló un fragmento de 500 pb. El fragmento de ADN fue cl PO en el vector pCR-Blunt ll-TOPO (Invitrogen, USA) de acuer trucciones del fabricante, y el plásmido resultante se usó sformación de TOP10 de E. coli. El plásmido fue nombrado co -a20a(-). smido Rdn1-R-a16b(+) (descrito en el ejemplo 9b) fue digerido c tl. El plásmido linealizado resultante Rdn1-L-a15c(+) y el fragment contiene a RFRRdni que se origina del plásmido Rdn1 -R-a1 araron electroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo ión a 0.7%, y se aislaron después. El plásmido linealizado Rdn1- ligado junto con el fragmento de ADN RFRRcini , y el plásmido res para la transformación de TOP10 de E. coli. El plásmido fue o Rdn1-LR-b5a.

EJEMPLO 10B nstruccion de un plásmido integrativo de levadura que conti regiones de flanqueo izquierda y derecha del locus Mig1 (LFR FRMÍQI-?) de S. cerevisiae que permiten recombinación homólo genoma de levadura ligado junto con el fragmento de ADN RFRM¡gi-2, y el plásmido usó para la transformación de TOP10 de E. coli. El plásmido fue o Mig1-LR2-b7a.

EJEMPLO 11 Construcción de cassettes de genes marcadores de antibió flanqueados por loxP con el gen kanMXo natl El plásmido pUG6 (Güldener et al., 1996) fue digerido c ??, y los extremos terminales resultantes fueron desfo siguientemente con fosfatasa alcalina. Asimismo, los plásmid ldstein y McCusker, 1999) y pUG6 fueron digeridos con Spel smido linealizado resultante pUG6 y los fragmentos de ADN que gen natl (que se origina del plásmido pAG25) y al gen kanM ina del lásmido UG6 se se araron electroforéticamente sob EJEMPLO 12A onstrucción de un plásmido integrativo de levadura que cont ión de flanqueo izquierda del locus Rdn1 (LFRRfini¾ de S. cer en marcador de antibióticos natl flanqueado por loxP y la re nqueo derecha del locus Rdn1 (RFRRf<ni) que permiten recom méloga en el genoma de levadura v selección subsiguiente, antibiótico nourseotricina El plásmido Rdn1 -LR-b5a (descrito en el ejemplo jerido con Notl, y los extremos terminales resultantes desfo bsiguientemente con fosfatasa alcalina. Asimismo, el plásmido a (descrito en el ejemplo 1) es digerido con Notl. El plásmido li ultante Rdn1-LR-b5a y el fragmento de ADN que contiene al nqueado por loxP (que se origina de plásmido pUG6R25-b2a), s íctroforéticamente sobre un el de a arosa de ba o unto de fusió EJEMPLO 12B onstrucción de un plásmido inteqrativo de levadura que conti qión de flanqueo izquierda del locus Miq1 (LFRMini,g) de S. ce gen marcador de antibióticos kanMX flanqueado por loxP y l de flanqueo derecha del locus Miq1 (RFRMmi ?) que permit recombinación homologa en el qenoma de levadura y selec subsiguiente, usando el antibiótico G418 El plásmido Mig1-LR2-b7a (descrito en el ejemplo erido con Notl, y los extremos terminales resultantes desfo siguientemente con fosfatasa alcalina. Asimismo, el plásmido (descrito en el ejemplo 1 1 ) es digerido con Notl. El plásmido li ultante Mig1-LR2-b7a y el fragmento de ADN que contiene al g queado por loxP (que se origina de plásmido pUG6R6-b1 a), s ctroforéticamente sobre un el de a arosa de ba o unto de fusió EJEMPLO 13A nación por TOPO de un fragmento de ADN que contiene al te transcripción del marco de lectura abierto YBR197C y al pro gen PGI1, basada en el código de acceso del NCBI Z21487 ve El fragmento de ADN (P-pgi) de S. cerevisiae que ión entre el codón de detención del marco de lectura abierto YBR ón de ATG del gen PGI1, se amplificó por PCR a partir de AD la cepa D0002 de S. cerevisiae, usando los iniciadores identifi Q.ID.NO. 27 y SEQ.ID.NO. 28. Se introdujo un sitio de restricción ximal al fragmento de ADN, y un sitio de restricción para Avrl gmento de ADN, flanqueando la región intergénica. Como mold N de la cepa de S. cerevisiae a una concentración de 0.2 n cción de PCR. Se llevó a cabo PCR a 35 ciclos de 30 segundos undos a 57°C 30 se undos a 72°C, se uida de una incubaci EJEMPLO 13B ación por TOPO de un fragmento de ADN que contiene al te transcripción del marco de lectura abierto YDR051C y al prom en TPI1, basada en el código de acceso del NCBI Z49209 ver El fragmento de ADN (P-tpi) de S. cerevisiae que a ón entre el codón de detención del marco de lectura abierto YDR ón de ATG del gen TPI1, se amplificó por PCR a partir de ADN a cepa D0002 de S. cerevisiae, usando los iniciadores identific .ID.NO. 29 y SEQ.ID.NO. 30. Se introdujo un sitio de restricción imal al fragmento de ADN, y un sitio de restricción para Avrll mento de ADN, flanqueando la región intergénica. Como mold de la cepa de S. cerevisiae a una concentración de 0.2 ng ción de PCR. Se llevó a cabo PCR a 35 ciclos de 30 segundos a undos a 57°C y 30 segundos a 72°C, seguida de una incubació EJEMPLO 13C nación por TOPO de un fragmento de ADN que contiene al te transcripción del gen YKU80 y al promotor del gen PGM2, b el código de acceso del NCBI Z49702 versión 1 El fragmento de ADN (P-pgm) de S. cerevisiae que ión entre el codón de detención del gen YKU80 y el codón de AT M2, se amplificó por PCR a partir de ADN obtenido de la cepa DO evisiae, usando los iniciadores identificados por SEQ.ID.N Q.ID.NO. 32. Se introdujo un sitio de restricción para Salí p gmento de ADN, y un sitio de restricción para Avrll distal al frag N, flanqueando la región intergénica. Como molde, se usó ADN S. cerevisiae a una concentración de 0.2 ng/µ? de la reacción de ó a cabo PCR a 35 ciclos de 30 segundos a 96°C, 30 segundos se undos a 72°C, se uida de una incubación final de 10 minut EJEMPLO 13D nación por TOPO de un fragmento de ADN que contiene al te transcripción del gen STU2 y al promotor del gen PDC1. bas código de acceso del NCBI Z73217 versión 1 El fragmento de ADN (P-pdc) de S. cerevisiae que ión entre el codón de detención del gen STU2 y el codón de AT Cí, se amplificó por PCR a partir de ADN obtenido de la cepa DO ews/'ae, usando los iniciadores identificados por SEQ.ID.N Q.ID.NO. 34. Se introdujo un sitio de restricción para Salí p gmento de ADN, y un sitio de restricción para Avrll distal al frag N, flanqueando la región intergénica. Como molde, se usó ADN S. cerevisiae a una concentración de 0.2 ng/µ? de la reacción de ó a cabo PCR a 35 ciclos de 30 segundos a 96°C, 30 segundos undos a 72°C uida in ci n fi EJEMPLO 13E nación por TOPO de un fragmento de ADN que contiene al te transcripción del gen MPE1 y al promotor del gen FBA1, bas código de acceso del NCBI Z28060 versión 1 El fragmento de ADN (P-fba) de S. cerevisiae que ión entre el codón de detención del gen MPE1 y el codón de AT A1, se amplificó por PCR a partir de ADN obtenido de la cepa DO evisiae, usando los iniciadores identificados por SEQ.ID.N ?.??.??. 36. Se introdujo un sitio de restricción para Salí p gmento de ADN, y un sitio de restricción para Avrll distal al frag N, flanqueando la región intergénica. Como molde, se usó ADN S. cerevisiae a una concentración de 0.2 ng/µ? de la reacción de ó a cabo PCR a 35 ciclos de 30 segundos a 96°C, 30 segundos se undos a 72°C se uida de una incubación final de 10 minut EJEMPLO 13F nación por TOPO de un fragmento de ADN que contiene al te transcripción del marco de lectura abierto YKL151C y al pro en GPM19 basada en el código de acceso del NCBI Z26877 ve El fragmento de ADN (P-gpm) de S. cerevisiae que ión entre el codón de detención del marco de lectura abierto YKL ón de ATG del gen GPM1, se amplificó por PCR a partir de AD la cepa D0002 de S. cerevisiae, usando los iniciadores identifi Q.ID.NO. 37 y SEQ.ID.NO. 38. Se introdujo un sitio de restricción ximal al fragmento de ADN, y un sitio de restricción para Avrl gmento de ADN, flanqueando la región intergénica. Como mold N de la cepa de S. cerevisiae a una concentración de 0.2 n cción de PCR. Se llevó a cabo PCR a 35 ciclos de 30 segundos a undos a 57°C 30 se undos a 72°C se uida de una incubad EJEMPLO 14A onación por TOPO del gen TKL1 de la cepa D0002 de Saccha erevisiae basada en el código de acceso del NCBI X73224 ve Se amplificó por PCR el gen TKL1 de S. cerevisiae ero a partir de ADN obtenido de la cepa D0002 de S. cerevisia iniciadores identificados por SEQ.ID.NO. 39 y SEQ.ID.NO. 40. Se sitio de restricción para Xbal proximal al codón de inicio de ATG, restricción para Xhol distal al codón de detención, flanquean KL1. Como molde, se usó ADN de la cepa de S. cerevis¡ centración de 0.2 ng/µ? de la reacción de PCR. Se llevó a cabo os de 30 segundos a 96°C, 30 segundos a 57°C y 90 segundo uida de una incubación final de 10 minutos a 72°C usand imerasa de alta fidelidad Phusion (Finnzymes Oy, Finlandia). El PCR se se aró electroforéticamente sobre un el de a arosa de EJEMPLO 14B onación por TOPO del gen XKS1 de la cepa D0002 de Saccha cerevisiae basada en el código de acceso del NCBI X61377 ve Se amplificó por PCR el gen XKS1 de S. cerevisiae ero a partir de ADN obtenido de la cepa D0002 de S. cerevisia iniciadores identificados por SEQ.ID.NO. 41 y SEQ.ID.NO. 42. S sitio de restricción para Nhel proximal al codón de inicio de ATG, restricción para Xhol distal al codón de detención, flanquean KS1. Como molde, se usó ADN de la cepa de S. cerevisi centracion de 0.2 ng/µ? de la reacción de PCR. Se llevó a cabo los de 30 segundos a 96°C, 30 segundos a 57°C y 90 segundo uida de una incubación final de 10 minutos a 72°C usand limerasa de alta fidelidad Phusion (Finnzymes Oy, Finlandia). El PCR se se aró electroforéticamente sobre un el de a arosa de EJEMPLO 14C onación por TOPO del gen TAL1 incluyendo 187 pb del termi nscripcion de la cepa D0002 de Saccharomvces cerevisiae. b el código de acceso del NCBI X15953 versión 1 Se amplificó por PCR el gen TAL1 de S. cerevisiae e n 187 pb de la secuencia del terminador de transcripción (ScT rtir de ADN obtenido de la cepa D0002 de S. cerevisiae, u adores identificados por SEQ.ID.NO. 43 y SEQ.ID.NO. 44. Se in io de restricción para Nhel proximal al codón de inicio de ATG, y tricción para Xhol distal a la secuencia del terminador de tra nqueando el gen ScXKS1 +T. Como molde, se usó ADN de la c revisiae a una concentración de 0.2 ng/µ? de la reacción de PCR. bo PCR a 35 ciclos de 30 segundos a 96°C, 30 segundos a undos a 72°C, se uida de una incubación final de 10 minuto EJEMPLO 14D lonación por TOPO del gen RKI1 incluyendo 206 pb del termin nscripción de la cepa D0002 de Saccharomyces cerevisiae, b el código de acceso del NCBI X94335 versión 1 Se amplificó por PCR el gen RKI1 de S. cerevisiae en 206 pb de la secuencia del terminador de transcripción (Sc rtir de ADN obtenido de la cepa D0002 de S. cerevisiae, u adores identificados por SEQ.ID.NO. 45 y SEQ.ID.NO. 46. Se in o de restricción para Nhel proximal al codón de inicio de ATG, y tricción para Xhol distal a la secuencia del terminador de tran queando el gen ScRKI1+T. Como molde, se usó ADN de la c evisiae a una concentración de 0.2 ng/µ? de la reacción de PCR. o PCR a 35 ciclos de 30 segundos a 96°C, 30 segundos a 5 undos a 72°C se ida in baci n al EJEMPLO 15A onstrucción de un plásmido que contiene al cassette de expr levadura compuesto del promotor P-pqi frente al gen ScX El plásmido P-pgi-a1 a(+) (descrito en el ejemplo erido con Avrll y Xhol, y los extremos terminales resultant sfosforilados subsiguientemente con fosfatasa alcalina. Asi smido ScXKS 1-G2 (descrito en el ejemplo 14b) fue digerido c 0I. El plásmido linealizado resultante P-pgi-a1a(+) y el fragment e contiene a ScXKSI que se origina del plásmido ScXKS araron electroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo ión a 0.7%, y se aislaron después. El plásmido linealizado P-pgi- do junto con el fragmento de ADN que codifica para ScXKSI , y el ultante se usó para la transformación de TOP10 de E. coli. El plá mbrado como P- i+ScXKS1-b38a. smido 0717049pGA15 que posee al gen PmXI (descrito en el ej digerido con Nhel y Xhol. El plásmido linealizado resultante P-fb fragmento de ADN que contiene a PmXI que se origina del 17049pGA15, se separaron electroforéticamente sobre un gel d bajo punto de fusión a 0.7%, y se aislaron después. El plásmido li ba-a7b(+) fue ligado junto con el fragmento de ADN que cod XI, y el plásmido resultante se usó para la transformación de TO /'. El plásmido fue nombrado como P-fba+PmXI-b34c.

EJEMPLO 15C onstrucción de un plásmido que contiene al cassette de expr levadura compuesto del promotor P-gpm frente al gen ScR El plásmido P-gpm-a8a(+) (descrito en el ejemplo erido con Avrll Xhol los extremos terminales resultant l plásmido resultante se usó para la transformación de TOP10 de smido fue nombrado como P-gpm+ScRKI1 +T-b15a.

EJEMPLO 15D onstrucción de un plásmido que contiene al cassette de expr levadura compuesto del promotor P-tpi frente al gen LIM El plásmido P-tpi-a2d(+) (descrito en el ejemplo 13b) fu Avrll y Xhol, y los extremos terminales resultantes fueron desfo siguientemente con fosfatasa alcalina. Asimismo, el 7050pGA14 (descrito en el ejemplo 1 a) fue digerido con Nhel smido linealizado resultante P-tpi-a2d(+) y el fragmento de tiene a LI R que se origina del plásmido 0717050pGA14, se ctroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusió e aislaron des ués. El lásmido linealizado P-t i-a2d + fue li ado EJEMPLO 1 SE onstrucción de un plásmido que contiene al cassette de expr levadura compuesto del promotor P-pgm frente al gen SCT El plásmido P-pgm-a10a(+) (descrito en el ejemplo erido con Avrll y Xhol, y los extremos terminales resultant fosforilados subsiguientemente con fosfatasa alcalina. Asi smido ScTKL1-a25a(+) (descrito en elejemplo 14a) fue digerido c ??. El plásmido linealizado resultante P-pgm-a10a(+) y el fragment contiene a ScTKL que se origina del plásmido ScTKL1-a2 araron electroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo ión a 0.7%, y se aislaron después. El plásmido linealizado P-pg ligado junto con el fragmento de ADN que codifica para ScT smido resultante se usó para la transformación de TOP10 de smido fue nombrado como P- m+ScTKL1-b67a. smido ScTAL1 +T-a22a(+) (descrito en el ejemplo 14c) fue dig el y Xhol. El plásmido linealizado resultante P-pdc-a9f(+) y el frag N que contiene a ScTAL1+T que se origina del plásmido S a(+), se separaron electroforéticamente sobre un gel de agaros to de fusión a 0.7%, y se aislaron después. El plásmido linealiza (+) fue ligado junto con el fragmento de ADN que codifica para S l plásmido resultante se usó para la transformación de TOP10 de smido fue nombrado como P-pdc+ScTAL1 +T-b26a.

EJEMPLO 16A Construcción de un plásmido con los cassettes de expresió levadura concatenados P-pgi+ScXKS y P-fba+PtnXI El plásmido pgi+ScXKS1-b38a (descrito en el ejempl erido con Xhol Apal, los extremos terminales resultantes desfo sette de expresión P-fba+PmXI, y el plásmido resultante se us sformación de TOP10 de E. coli.

EJEMPLO 16B Construcción de un plásmido con los cassettes de expresió levadura concatenados P-tpi+LI R y P-pgm+ScTKL1 El plásmido P-tpi+LIMR-b39a (descrito en el ejempl erido con Xhol y Apal, y los extremos terminales resultantes desfo bsiguientemente con fosfatasa alcalina. Asimismo, el plá m+ScTKL1-b67a (descrito en el ejemplo 15e) es digerido con Salí smido linealizado resultante P-tpi+LIMR-b39a y el fragmento de ntiene al cassette de expresión P-pgm+ScTKL1 que se origina del gm+ScTKL1-b67a, se separan electroforéticamente sobre u arosa de ba o unto de fusión a 0.7% se aislan des ués. El EJEMPLO 17A Construcción de un plásmido con los cassettes de expresi evadura concatenados P-pqi+ScXKS. P-fba-PmXI y P-qpm+Sc El plásmido que contiene a los cassettes de exp adura P-pgi+ScXKS y P-fba+PmXI concatenados (descritos en a) es digerido con Xhol y Apal, y los extremos terminales result sfosforilados subsiguientemente con fosfatasa alcalina. Asi smido P-gpm+ScRKI1 +T-b15a (descrito en el ejemplo 15c) es di il y Apal. El plásmido linealizado resultante que contiene a los ca presión de levadura P-pgi+ScXKS y P-fba+PmXI concatena gmento de ADN que contiene al cassette de expresión P-gpm+ e se origina del plásmido P-gpm+ScRKI1 +T-b15a, se ctroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusió e aislan des ués. El lásmido linealizado ue contiene a los ca EJEMPLO 17B Construcción de un plásmido con los cassettes de expresi vadura concatenados P-tpi+LIMR, P-pgm+ScTKL1 y P-pdc+S El plásmido que contiene a los cassettes de exp adura P-tpi+LIMR y P-pgm+ScTKL1 concatenados (descritos en b) es digerido con Xhol y Apal, y los extremos terminales result sfosforilados subsiguientemente con fosfatasa alcalina. Asi smido P-pdc+ScTAL1 +T-b26a (descrito en el ejemplo 15f) es di ll y Apal. El plásmido linealizado resultante que contiene a los ca presión de levadura P-tpi+LIMR y P-pgm+ScTKL1 concatena gmento de ADN que contiene al cassette de expresión P-pdc+ e se origina del plásmido P-pdc+ScTAL1 +T-b26a, se ctroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusió e aislan des ués. El lásmido linealizado ue contiene a los ca EJEMPLO 17C Construcción de un plásmido con los cassettes de expresió levadura concatenados P-pqm+ScTKL1 y P-pdc+ScTAL1 El plásmido P-pgm+ScTKL1 -b67a (descrito en el eje digerido con Xhol y Apal, y los extremos terminales resulta fosforilados subsiguientemente con fosfatasa alcalina. Asi smido P-pdc+ScTAL1 +T-b26a (descrito en el ejemplo 15f) es dig I y Apal. El plásmido linealizado resultante, P-pgm+ScTKL1-b mento de ADN que contiene al cassette de expresión P-pdc+ se origina del plásmido P-pdc+ScTAL1 +T-b26a, se ctroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusió e aislan después. El plásmido linealizado, P-pgm+ScTKL1-b67a, to con el fragmento de ADN que contiene al cassette de exp +ScTAL1+T el lásmido resultante se usa ara la transfor EJEMPLO 18A onstrucción de un plásmido inteqrativo de levadura que alber cassettes de expresión de levadura concatenados P-pqi+ScX +PmXI y P-gpm+ScRKM+T, que permite recombinación hom el locus Rdn1 y selección subsiguiente usando el antibióti nourseotricina El plásmido integrativo de levadura que permite reco óloga en el locus Rdn1 y selección subsiguiente en medio de er plementado con nourseotricina (descrito en el ejemplo 12a) es Xhol, y los extremos terminales resultantes son desfo siguientemente con fosfatasa alcalina. El plásmido linealizado s ctroforéticamente sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusió aquel del plásmido no cortado, y se aisla después. Asimismo, el osee a los cassettes de ex resión de levadura P- i+S ncatenados, y el plásmido resultante se usa para la transfor P10 de E. coli.

EJEMPLO 18B onstrucción de un plásmido inteqrativo de levadura que alber cassettes de expresión de levadura concatenados P-tpi+LIM m+ScTKL1 y P-pdc+ScTALI+T, que permite recombinación h n el locus Mig1 y selección subsiguiente usando el antibiótic El plásmido integrativo de levadura que permite reco móloga en el locus Mig1 y selección subsiguiente en medio de e mplementado con G418 (descrito en el ejemplo 12b) es digerido c extremos terminales resultantes son desfosforilados subsigui n fosfatasa alcalina. El plásmido linealizado se separa electroforé bre un el de a arosa de ba o unto de fusión a 0.7% de presión de levadura P-tpi+LIMR, P-pgm+ScTKL1 y P-pdc+ catenados, y el plásmido resultante se usa para la transfor PI O de E. coli.

EJEMPLO 18C onstrucción de un plásmido inteqrativo de levadura que albe assettes de expresión de levadura concatenados P-pqm+ScT c+ScTALH-T, que permite recombinación homologa en el loc selección subsiguiente usando el antibiótico G418 El plásmido integrativo de levadura que permite reco móloga en el locus Mig1 y selección subsiguiente en medio de e mplementado con G418 (descrito en el ejemplo 12b) es digerido c extremos terminales resultantes son desfosforilados subsigui n fosfatasa alcalina. El l smido linealiz do r el mento de los cassettes de expresión de levadura P-pgm+ScT +ScTAL1+T concatenados, y el plásmido resultante se usa sformación de TOP10 de E. coli.

EJEMPLO 19 nstruccion de una cepa de S. cerevisiae que contiene a los c e expresión de levadura concatenados P-pgi+ScXKS, P-fba+P gpm+ScRKI1+T por recombinación en el locus Rdn1, y sele subsiguiente usando el antibiótico nourseotricina Cinco pg del plásmido integrativo que alberga a los ca resión de levadura concatenados P-pgi+ScXKS, P-fba+Pm m+ScRKI1+T (descritos en el ejemplo 18a) son digeridos con cipitados subsiguientemente usando 2.5 volúmenes de etano s ués de ue se desecha el li uido, la ella de ADN se lava co a a cabo por siembra en medio de crecimiento sólido YPD compl 100 mg/L de ClonNAT (Werner BioAgents, Jena, Alemania). A mbra, se deja que las células transformadas crezcan en YPD C por 4 horas. Después de la siembra en medio selectivo, las uban a 30°C por 3 días, se aisla una colonia de tamaño medio y sembrar por estría en YPD sólido complementado con 100 nNAT, y se aisla subsiguientemente un clon.

EJEMPLO 20A nstrucción de una cepa de S. cerevisiae que contiene a los c expresión de levadura concatenados P-pgi+ScXKS, P-fba+P qpm+ScRKM+T, incluyendo los cassettes de expresión de le concatenados P-tpi+LIMR. P-pgm+ScTKL1 y P-pdc+ScTAL1+ recombinación en el locus Mig1, y selección subsiguiente usa antibiótico G418 crita en el ejemplo 19 por medio de electroporación usando e ne Pulser II de Biorad (Biorad, USA), de acuerdo con las instruc ricante. Células de levadura se hacen competentes de acuerd tocolo estándar (Becker y Guarente, 1991 ). La selección pa sformados establemente con los cassettes de expresión de catenados P-tpi+LIMR, P-pgm+ScTKL1 y P-pdc+ScTAL1 +T, s o por siembra en medio de crecimiento sólido YPD compleme mg/L de geneticina (Life Technologies). Antes de la siembra, se células transformadas crezcan en YPD líquido a 30°C por spués de la siembra en medio selectivo, las placas se incuban a 3 s, se aisla una colonia de tamaño medio y se vuelve a sembrar YPD sólido complementado con 200 mg/L de geneticina, y siguientemente un clon.

EJEMPLO 20B scritos en el ejemplo 18c) son digeridos con Pmel, y pr siguientemente usando 2.5 volúmenes de etanol a 96%. Despu desecha el líquido, la pella de ADN se lava con etanol a 70%, se isuelve con 5 µ? de agua. El plásmido digerido re-disuelto se u sformación de la cepa de la levadura S. cerevisiae descrita en por medio de electroporación usando el sistema Gene Pulser II orad, USA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. C adura se hacen competentes de acuerdo con un protocolo cker y Guarente, 1991). La selección para clones trans ablemente con los cassettes de expresión de levadura concate +ScTKL1 y P-pdc+ScTAL1+T, se lleva a cabo por siembra en cimiento sólido YPD complementado con 200 mg/L de geneti hnologies). Antes de la siembra, se deja que las células trans zcan en YPD líquido a 30°C por 4 horas. Después de la siembra ectivo las lacas se incub n a 30° or EJEMPLO 21 A ediciones del metabolismo de D-xilosa por curvas de crecimi las cepas de levadura descritas en los ejemplos 20a v 20 Los cambios en la velocidad de metabolismo de en como alteraciones en la velocidad de crecimiento de las adura que metabolizan xilosa. Las dos cepas de levadura (descri mpios 20a y 20b) son adaptadas inicialmente a metabolismo de da cepa es inoculada individualmente en medio líquido de pept levadura (YPX) complementado con glucosa a 0.2%. Los c uban por una semana a 30°C en un agitador que corre a spués de una semana, cada cultivo se usa para re-inocular nuev n YPX complementado con glucosa a 0.02%. Los dos cultivos s r otra semana como se describió anteriormente. Se inician experi cimiento or inoculación de YPX a un titulo de células inicial de TKL1) y la transaldolasa (ScTAL1 +T), en comparación con la cep no expresa la mutarrotasa.

EJEMPLO 21 B Mediciones de la fermentación de D-xilosa de las cepas de le descritas en los ejemplos 20a y 20b Las dos cepas de levadura adaptadas para metabolis sa (descritas en el ejemplo 21a) son inoculadas individualmente ido de peptona xilosa de levadura (YPX), usando matraces de linados. Los cultivos se incuban a 30°C en un agitador que co M hasta DO600 = 1.0. Después, los cultivos se cose ntrifugación, y se resuspenden en 20 mi de medio líquido de p adura complementado con 50 g/L de D-xilosa, usando un itación con dos cuellos laterales a una concentración de célula ? fabricante, y con diluciones adecuadas de las muestras. Se dét greso de la fermentación para cada una de las dos cepas gra centración de etanol como una función del tiempo. Las velocid as por la pendiente de la parte lineal de la curva, subsiguiente uxico inicial entre el crecimiento aeróbico y la fermentación anaer muestra una velocidad de fermentación más rápida de la cepa qu ldosa-1-epimerasa, en comparación con la cepa congenética sin REFERENCIAS Anderson R. L y Allison D. P. (1965) Purific acterization of D-Lyxose Isomerase. J. Biol. Chem. 240, 2367-2 Ausubel F. M. , Brent R., Kingston R. E., Moore D., S , Smith J. A. y Struhl K., eds. (1995 (y suplementos periódicos tocols in Molecular Biology, capítulos 9, 13 y 16. John Wiley & rk, N. Y.

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Todas las publicaciones mencionadas en la esp terior, se incorporan en la presente como referencia. Varias modi ariaciones de los métodos y sistemas de la invención descrit dentes para los expertos en la técnica sin que se aparten del píritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito con dalidades preferidas específicas, debe entenderse que la inven reclama no debe limitarse indebidamente a dichas mo pecíficas. Por supuesto, se pretende que varias modificacion dos descritos para llevar a cabo la invención, las cuales son o expertos en bioquímica y biología molecular o campos relaciona ntro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1 .- Un microorganismo transformado, capaz de: (i) con opentosa a una cetopentosa a una mayor velocidad que el micro uivalente antes de la transformación; y/o (ii) una mayor vel cimiento en presencia de la aldopentosa que el micro uivalente antes de la transformación; y/o (iii) un mayor metaboli opentosa que el microorganismo equivalente antes de la transf donde dicho microorganismo ha sido transformado con una sec cleótidos que hace que el microorganismo sobreexprese una imerasa, y/o en donde dicho microorganismo ha sido transformad uencia de nucleótidos que codifica para una aldosa-1 -epimeras roorganismo ha sido transformado con por lo menos un roorganismo sobreexprese una o más enzimas seleccionadas consiste de xilosa reductasa, D-xilulosa reductasa, xilosa is binosa reductasa, L-arabitol 4-deshidrogenasa, L-xilulosa redu binosa isomerasa, ribulocinasa, ribulosa fosfato 4-epimerasa, I merasa, D-ribosa isomerasa, xilulocinasa, D-ribulocinasa, ribosa merasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transaldolasa, transce lquier otra enzima de la vía de la pentosa fosfato. 2. - El microorganismo de conformidad con la reivindi acterizado además porque dicho microorganismo es una nsformada. 3. - El microorganismo de conformidad con la reivindica acterizado además porque dicha aldopentosa se selecciona del siste de xilosa, arabinosa, ribosa y lixosa. 4. - El microorganismo de conformidad con cualquie indicaciones anteriores, caracterizado además porque dicha ce ivalente antes de la transformación; y/o (iii) una mayor velo cimiento en presencia de aldopentosa que el microorganismo e es de la transformación; y/o (iv) un mayor metabolismo de aldope microorganismo equivalente antes de la transformación; dich prendiendo el paso de transformar un microorganismo con una nucleótidos que codifica para una aldosa-1-epimerasa, en do roorganismo transformado es capaz de convertir una aldopent puesto derivado de pentosa; en donde dicho microorganism sformado con una secuencia de nucleótidos que hace roorganismo sobreexprese una aldosa-1-epimerasa, y/o en do roorganismo ha sido transformado con una secuencia de nucleó ifica para una aldosa-1-epimerasa; y dicho microorganismo nsformado con por lo menos un vector de expresión que codifica p s enzimas seleccionadas del grupo que consiste de xilosa redu losa reductasa, xilosa isomerasa, arabinosa reductasa, L-a hidrogenasa, L-xilulosa reductasa, L-arabinosa isomerasa, rib losa fosfato 4-epimerasa, D-lixosa isomerasa, D-ribosa is locinasa, D-ribulocinasa, ribosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa merasa, transaldolasa, transcetolasa, y cualquier otra enzima de entosa fosfato. 8. - El método de conformidad con la reivindic acterizado porque dicha secuencia de nucleótidos que codifica osa-1-epimerasa es un vector de expresión que codifica para la mi 9. - Un método para producir un compuesto derivado de donde dicho método comprende cultivar en un medio de c roorganismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a roorganismo preparado por el método de la reivindicación indicación 8. 10. - Un método para producir un biocombustible, en do todo comprende el paso de cultivar en un medio de c 13. - El uso de un microorganismo en la producci ducto derivado de pentosa; en donde dicho microorganismo roorganismo transformado capaz de: (i) convertir una aldopent opentosa a una mayor velocidad que el microorganismo equival la transformación; y/o (ii) una mayor velocidad de crecimiento en aldopentosa que el microorganismo equivalente ante sformación; y/o (iii) un mayor metabolismo de aldopentos roorganismo equivalente antes de la transformación, en do roorganismo ha sido transformado con una secuencia de nucle ce que el microorganismo sobreexprese una aldosa-1-epimer nde dicho microorganismo ha sido transformado con una sec cleótidos que codifica para una aldosa-1-epimerasa; o roorganismo preparado por el método de la reivindicación 7 u 8. 14. - El uso de un microorganismo en la producci ombustible; en donde dicho microorganismo es: (a) un micro roorganismo ha sido transformado con una secuencia de nucle ifica para una aldosa-1-epimerasa; o (b) un microorganismo prep étodo de la reivindicación 7 u 8.