CN102144029B - 表达醛糖-1-差向异构酶的微生物 - Google Patents

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Abstract

能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖的经转化微生物。

Description

表达醛糖-1-差向异构酶的微生物
发明领域
本发明涉及微生物。
特别地，本发明涉及经转化微生物，其能够：(i)以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖；和/或(ii)在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高的生长速率；和/或(iii)比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢。
本发明进一步涉及用于制备经转化微生物的方法，所述经转化微生物能够：(i)生成戊糖衍生化合物；和/或(ii)以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖；和/或(iii)在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高的生长速率；和/或(iv)实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢；所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
另外，本发明涉及包含依照本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物的接种物和培养液(culture medium)。
本发明另外涉及用于生成生物燃料和/或戊糖衍生化合物的方法，包括培养依照本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物。
另外，本发明涉及通过本发明的方法获得的生物燃料和/或戊糖衍生化合物。
另外，本发明涉及依照本发明的或通过本发明的方法制备的微生物用于生成戊酮糖和/或生物燃料和/或戊糖衍生化合物的用途。
发明背景
作为用于运输，加热和能量供给的化石燃料的绿色的和可持续的替代品，正在开发生物燃料。上涨中的石油价格使得生物燃料生产在经济上更加可行，而且化石燃料的可得性最终是有限的。生物乙醇，一种生物燃料，一般被认为是与基于石油的运输燃料相比要更CO2中性得多。另外，有可能使用生物乙醇作为部分以及全部汽油替代品，而对发动机技术没有剧烈改变。
典型地，通过自农业饲料-诸如甘蔗、甜菜、玉蜀黍和谷类(诸如小麦和玉米)-它们是富含淀粉和富含糖的植物材料(这些植物材料的剩余物称作农业废物)衍生的糖的发酵来生成生物乙醇。然而，与使用这些材料的工艺有关的一个问题在于它们利用在其它情况中用于人的食物和动物饲料的材料。这样做的一个后果在于可得的食物和动物饲料的量减少，这继而提高食品的价格。
事实上，有预测说，即使将美国的全部玉蜀黍作物用于乙醇生产，它也不可能满足美国未来的需求。例如，在2008年春季，美国农业部估算，根据美国播种玉蜀黍的土地量，2008年美国会收获约120亿蒲式耳的玉蜀黍。使用本领域当前可得的技术，自1蒲式耳玉蜀黍平均生成2.8加仑乙醇。如此，如果全部2008年美国玉蜀黍收获制成乙醇，那么会获得330亿加仑的乙醇。然而，根据美国内源信息管理局的统计，美国2007年有1420亿加仑的汽油用作客车和货车的燃料。假设2008年美国的汽油需求没有显著下降，那么来自玉蜀黍的汽油替代品乙醇的供给不能满足需求。
如此，富含淀粉的和富含糖的植物材料的来源的可得性是生物燃料生产的限速因素。
例如，甘蔗、甜菜、高粱、大豆、玉蜀黍、和谷类(诸如小麦和玉米)的所谓的农业废物材料主要包含木质纤维素材料。木质纤维素材料主要包含长链糖。一般地，这些长链糖中约三分之二的糖是己糖(特别是葡萄糖)，它们主要是纤维素的形式，而且这些长链糖中约三分之一的糖是戊糖(特别是木糖和阿拉伯糖)，它们主要以阿拉伯糖基木聚糖聚合物的形式存在。纤维素水解后，能通过传统的基于酵母的方法来发酵己糖。然而，纤维素是一种结实的结构，其对提取和酶促水解的抗性很高。阿拉伯糖基木聚糖比较易于提取和水解以大体释放戊糖；但是所释放的糖不能被已知的微生物以足够高的浓度发酵成乙醇。
自废物植物材料高效生成乙醇的两项障碍是与纤维素解聚有关的困难和能为大规模生产将戊糖代谢成乙醇的合适微生物的缺乏。
理论上，获得此类合适生物体的一种方式是将代谢戊糖的能力自天然戊糖代谢生物体转移入已知的高效乙醇生成体。这已经成为最近15-20年期间多个研究小组的多项工作的主题。但是凭借戊糖，不可能获得与使用葡萄糖时获得的速率相当的代谢速率。提高这种低代谢速率已经成为且仍然是讨论和正在进行的研究的主题，而且仍然是在自戊糖发酵乙醇中使用例如工程化酿酒酵母的一项主要障碍。
发明概述
惊人地，我们发现，通过修饰微生物来表达和/或过表达醛糖-1-差向异构酶，戊醛糖更快地转变成戊酮糖得到推动(在与修饰前的等同微生物相比时)。那样，能获得如下的微生物，其能够在与修饰前的等同微生物相比时更快地将戊糖(优选戊醛糖)转变成生物燃料(优选包含乙醇的生物燃料)，这对于大规模工业生物燃料生产是特别有利的。
木酮糖-5-磷酸是一种中间体(其可以自D-木糖、L-阿拉伯糖或甚至D-来苏糖衍生)，其进入戊糖磷酸途径并在厌氧条件下被进一步代谢成乙醇。木糖变成乙醇的完整代谢途径显示于图4。
核酮糖-5-磷酸是一种中间体(其可以自D-核糖衍生)，其进入戊糖磷酸途径并在厌氧条件下被进一步代谢成乙醇。
一方面，本发明提供能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖的经转化微生物。
另一方面，本发明提供能够在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物的要更高的生长速率的经转化微生物。
本发明还提供能够实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的经转化微生物。
本发明进一步提供如下的微生物，其中所述微生物包含编码外源醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供如下的微生物，其中所述微生物能够表达外源醛糖-1-差向异构酶。
又一方面，本发明提供如下的微生物，其中所述微生物包含编码外源醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列，且其中所述微生物能够表达所述外源醛糖-1-差向异构酶；且其中所述微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
另外，本发明提供如下的微生物，其包含编码醛糖-1-差向异构酶的表达载体，其中所述微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
另一方面，本发明提供如下的经转化微生物，其中所述微生物能够表达醛糖-1-差向异构酶且其中所述微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
又一方面，本发明提供用于制备能够生成戊酮糖的经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，且其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
又一方面，本发明提供用于制备能够生成戊糖衍生化合物的经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，且其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
又一方面，本发明提供用于制备能够以比转化前的等同微生物要更高的速率产生戊糖衍生化合物的经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
另一方面，本发明提供用于制备能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖的经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
又一方面，本发明提供用于制备能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖的经转化微生物的方法，所述方法包括转化微生物使得醛糖-1-差向异构酶的表达上调的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
另外，本发明提供用于制备能够在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高的生长速率的经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
又一方面，本发明提供用于制备能够在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高的生长速率的经转化微生物的方法，所述方法包括转化微生物使得醛糖-1-差向异构酶的表达上调的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
本发明还提供用于制备能够实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
又一方面，本发明提供用于制备能够实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的经转化微生物的方法，所述方法包括转化微生物使得醛糖-1-差向异构酶的表达上调的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
又一方面，本发明提供用于生成戊糖衍生化合物的方法，其中所述方法包括在培养基中培养依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物。
又一方面，本发明提供用于生成戊糖衍生化合物的方法，其包括下述步骤：
(a)用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖；并
(b)在培养基中培养该经转化微生物。
又一方面，本发明提供用于生成戊酮糖的方法，其中所述方法包括在培养基中培养依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物。
又一方面，本发明提供用于生成戊酮糖的方法，其包括下述步骤：
(a)用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖；并
(b)在培养基中培养该经转化微生物。
本文所述戊酮糖可以在细胞内被进一步代谢，推动一系列产物的生成，包括但不限于：乙醇，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，衣康酸，甲酚，3-羟基丙酸，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，原儿茶酸，焦儿茶酚，愈创木酚，藜芦醚，香草醛，香草酸，香草醇，己二烯二酸，己二酸，4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸盐/酯，4-羟基苯胺，4-甲氧基苯胺，对苯二酚，苯甲醚，酚，邻氨基苯甲酸，3-羟基邻氨基苯甲酸盐/酯，2，3-二羟基苯甲酸，2-氨基苯酚，1，4-环己二酮和芳香族氨基酸。
另一方面，本发明提供用于生成生物燃料的方法，其中所述方法包括在培养基中培养依照本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物的步骤。
另一方面，本发明提供用于制备能够在培养基中以比转化前的等同微生物要更高的速率生成生物燃料的经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列(优选在编码它的表达载体中)转化微生物的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
另一方面，本发明提供用于生成生物燃料的方法，其包括下述步骤：
(a)用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列(优选在编码它的表达载体中)转化微生物，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖；并
(b)在包含戊醛糖的培养基中培养该经转化微生物。
又一方面，本发明提供用于生成生物燃料的方法，其中所述方法包括在培养基中培养微生物的步骤，其中所述微生物包含编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列且其中所述微生物能够表达所述醛糖-1-差向异构酶；且其中所述微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
又一方面，本发明提供通过依照本发明的方法获得的或可获得的生物燃料。
另一方面，本发明提供依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物用于生成戊酮糖的用途。
另一方面，本发明提供依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物用于生成戊糖衍生化合物的用途。
另外，本发明提供依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物用于生成生物燃料的用途。
另一方面，本发明提供微生物用于生成生物燃料的用途，其中所述微生物包含编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列，且其中所述微生物能够表达所述醛糖-1-差向异构酶，且其中所述微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
又一方面，本发明提供包含依照本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物的接种物。
另外，本发明提供包含依照本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物的培养液。
一些优点
有利地，通过使用依照本发明的微生物，能生成生物燃料(诸如乙醇)。
另一个优点在于通过使用依照本发明的微生物，能有效使用戊糖生成生物燃料(诸如乙醇)。不希望受理论束缚，修饰微生物以表达或过表达醛糖-1-差向异构酶容许提高各戊醛糖异头物之间的互相转变和细胞内戊醛糖变成戊酮糖的转变的速率-换言之，它减轻限速约束-这继而容许通过戊糖磷酸途径比修饰前的等同微生物要更快且更有效地生成乙醇。
更有利地，通过使用依照本发明的微生物，能自废物材料诸如农业废物(包括谷类秆-诸如小麦秆；甜菜浆；甘蔗渣；秣(stover)-诸如高粱、大豆、玉蜀黍或玉米秣；和木屑)生成生物燃料。凭借本发明，不需要(或需要降低)使用在其它情况中能用作人的食物来源和/或动物饲料的材料(诸如甘蔗提取物、甜菜提取物、高粱淀粉、玉蜀黍淀粉、小麦淀粉或玉米淀粉)。
最有利地，本发明提供能够为大规模生产(诸如工业生产)将戊糖(诸如戊醛糖)代谢成生物燃料(诸如包含乙醇的生物燃料)的微生物。
有利地，依照本发明的微生物能够通过戊糖发酵最佳地使用通过木质纤维素材料水解而释放的糖。
本发明能够生成与基于石油的运输燃料相比要更CO2中性的生物燃料。与生成典型的基于石油的运输燃料(化石燃料)相比，凭借本发明，在依照本发明生成生物燃料时CO2排放会较低(甚至更低)。
惊人地，本发明显示转化微生物以表达醛糖-1-差向异构酶导致戊糖变成生物燃料的转变速率升高。
附图简述
图1。代谢途径的示意图，详绘了两种最丰富的戊醛糖，D-木糖和L-阿拉伯糖的代谢。这两种戊醛糖被转变成戊酮糖，并被进一步转变成D-木酮糖5-磷酸。不希望受理论束缚，如图中所示，一种类型的途径(醛糖还原酶型)见于真菌，而另一种类型的途径(异构酶型)见于细菌。在真菌途径类型中，第一种酶可以称作“D-木糖还原酶”和“L-阿拉伯糖还原酶”，但是常常同一种酶能还原D-木糖和L-阿拉伯糖二者，而且可以然后服务于这两种途径且称作不太特异性的名称“醛糖还原酶”。
图2。不希望受理论束缚，图2显示一些不太丰富的戊糖(D-和L-来苏糖，D-核糖)的真菌和细菌类型的代谢途径的示意图，详绘了初始代谢直至进入戊糖磷酸途径。
图3。戊糖磷酸途径(PPP)的非氧化性部分的示意图。
图4。戊糖磷酸途径(PPP)的示意图。在这里，可以自D-木糖或L-阿拉伯糖衍生的戊酮糖木酮糖-5-磷酸在厌氧条件下被进一步代谢成乙醇。XI指木糖异构酶，而XK指木酮糖激酶。显示了进入该过程的木糖净输入和离开该过程的乙醇净输出(净过程)。
发明详述
如本文中使用的，短语“能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖的经转化微生物”涵盖经编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列诸如包含所述核苷酸序列的表达载体转化的微生物和经转化以上调醛糖-1-差向异构酶表达(换言之过表达醛糖-1-差向异构酶)的微生物。
在一个实施方案中，微生物已经用引起微生物过表达醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化。例如，将启动子插入微生物的基因组，这使得微生物能够过表达编码醛糖-1-差向异构酶的内源核苷酸序列。
在另一个实施方案中，微生物已经用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化。例如，微生物用包含可操作连接至调节序列的，编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列的表达载体转化。
优选地，本文所述编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列在编码它的表达载体中。
优选地，本文所述表达载体包含能够过表达编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列的启动子。此类启动子的例子包括GPD启动子、TEF启动子和ADP启动子。可用于过表达醛糖-1-差向异构酶的优选启动子可以是任何控制编码涉及糖酵解和葡萄糖发酵的蛋白质的核苷酸序列表达的调节元件。
如本文中使用的，短语“能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖的经转化微生物”中的术语“更高的速率”指经转化微生物能够降低培养液中戊醛糖的量，使得在相同培养条件下培养指数生长期内的给定时间段时，培养液中戊醛糖的量的降低比转化前的等同微生物要多至少5％、10％、20％或25％每细胞。
术语“指数生长期”以本领域普通含义使用-例如微生物以恒定速率分裂，使得微生物总数在每次分裂后加倍。技术人员能容易地为任何微生物为给定培养条件集确定延滞期(细胞在指数生长开始前适应新环境的时段)、指数生长期、稳定期(细胞分裂速率等于细胞死亡速率，因此存活细胞数保持恒定的时段)和死亡期(存活数下降的时段)。
如本文中使用的，术语“转化前的等同微生物”指用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化前的或用引起醛糖-1-差向异构酶上调(例如过表达)的核苷酸序列转化前的微生物。
如本文中使用的，术语“戊醛糖转变成戊酮糖”指例如戊醛糖木糖转变成戊酮糖木酮糖；戊醛糖阿拉伯糖转变成戊酮糖木酮糖；戊醛糖阿拉伯糖转变成戊酮糖核酮糖；戊醛糖来苏糖转变成戊酮糖木酮糖；和戊醛糖核糖转变成戊酮糖核酮糖。
在一个优选的方面，戊酮糖是木酮糖。
如本文中使用的，术语“能够将戊醛糖转变成戊酮糖的经转化微生物”指包含编码涉及戊醛糖转变成戊酮糖的一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸序列的微生物。能够将戊醛糖转变成戊酮糖的多肽的例子包括木糖异构酶、阿拉伯糖异构酶、D-来苏糖异构酶、和核糖异构酶；木糖还原酶和木酮糖还原酶的组合，阿拉伯糖还原酶、L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶、L-木酮糖还原酶和D-木酮糖还原酶的组合，及D-来苏糖还原酶和D-阿拉伯糖醇脱氢酶的组合。多肽对于所述微生物可以是内源的和/或外源的。多肽可以由一种或多种表达载体来编码。
优选地，戊醛糖选自下组：木糖，阿拉伯糖，核糖和来苏糖。优选地，戊醛糖是木糖或阿拉伯糖。更优选地，戊醛糖是木糖。
微生物中α-戊醛糖和β-戊醛糖之间的自发转变是缓慢的。例如，β-D-木糖变成α-D-木糖的自发转变在生理温度具有约0.094/min的一级K值(Bailey等，1969)。
如本文中使用的，短语“引起微生物过表达醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列”和“能够过表达编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列的启动子”中的术语“过表达”指在比较经转化微生物与转化前的等同微生物时，表达自零升高至某表达水平或自较低的表达水平升高至较高的表达水平(例如上调)。过表达醛糖-1-差向异构酶的微生物具有升高的催化α-戊醛糖和β-戊醛糖之间的转变的能力。
优选地，所述过表达醛糖-1-差向异构酶的经转化微生物能够以比未转化的微生物要高至少10％、15％、20％或25％的速率催化α-戊醛糖转变成β-戊醛糖，在如下的测定法中测量，将1g破碎的细胞量添加至50ml新鲜制备的含有100mMβ-戊醛糖的缓冲中性溶液，使用本文中稍后描述的互相转变测定法。
过表达醛糖-1-差向异构酶的微生物的例子包括：(i)经编码醛糖-1-差向异构酶的表达载体转化的微生物(在转化之前，所述微生物不能够表达醛糖-1-差向异构酶)；和(ii)经转化以上调内源醛糖-1-差向异构酶表达的微生物(在转化之前，所述微生物能够在指数生长期间对于给定的培养条件集表达所述醛糖-1-差向异构酶，但是在转化之后，所述微生物能够在指数生长期间在相同培养条件中以更高的水平表达所述醛糖-1-差向异构酶)。
如本文中使用的，短语“能够在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高的生长速率的经转化微生物”中的术语“更高的生长速率”指经转化微生物能够实现升高的生长速率，使得在相同培养条件下培养时指数生长期期间每ml微生物数加倍所花费的时间比转化前的等同微生物要少至少10％、15％、20％或25％。在一个优选的方面，微生物以它们的最适生长温度培养；且优选地，在最适量的盐、维生素和微生物所必需的其它养分之外，培养基包含介于1％和4％之间的戊醛糖。
如本文中使用的，短语“能够实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的经转化微生物”中的术语“更高的代谢”指经转化微生物能够代谢戊醛糖，使得在相同培养条件下培养指数生长期内的给定时间段时，培养液中戊醛糖的消耗量比转化前的等同微生物高至少10％、20％、25％、30％或35％每细胞。在一个优选的方面，微生物以它们的最适生长温度培养；且优选地，在最适量的盐、维生素和微生物所必需的其它养分之外，培养基包含介于1％和4％之间的戊醛糖。
优选地，依照本发明的经转化微生物所具有的将戊醛糖转变成戊酮糖的速率处于比转化前的等同微生物要更高的水平。此短语中使用的术语“更高的水平”指经转化微生物能够转变戊醛糖，使得在相同培养条件下培养指数生长期内的给定时间段时，培养液中戊醛糖的量的降低比转化前的等同微生物要多至少5％、10％、20％或25％每细胞。
如本文中使用的，术语“编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列”涵盖包含调节序列的核苷酸序列，调节序列使得编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列能够表达，诸如启动子和增强子，它们可以是与编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列天然或非天然关联的。
如本文中使用的，短语“能够在培养基中以比转化前的等同微生物要更高的速率生成生物燃料的经转化微生物”中的术语“更高的速率”指在相同培养条件下培养指数生长期内的给定时间段时，经转化微生物能够生成比转化前的等同微生物多至少10％、20％、25％、30％或35％的生物燃料每细胞。优选地，微生物以它们的最适生产环境(例如最适氧分压和搅动速度)培养，且优选地，在最适量的盐、维生素和微生物所必需的其它养分之外，培养基包含介于2％和6％之间的戊醛糖。
优选地，用于生成生物燃料的方法进一步包括自培养液获得生物燃料的步骤。
经转化微生物
如本文所述，术语“经转化微生物”指通过重组DNA技术已经遗传改变的微生物。如本文中使用的，术语“经转化”与术语诸如“经转染”、“重组”、“经遗传工程改造”和“经遗传修饰”同义。
涉及本发明的术语“经转化微生物”包括任何包含如下的表达载体的微生物，所述表达载体包含本文所述核苷酸序列和/或能够容许本文所述核苷酸序列表达(特别是过表达即上调)的启动子。在一个实施方案中，将核苷酸序列掺入微生物的基因组。在另一个实施方案中，将启动子掺入微生物的基因组。这些特征使得经转化微生物(在与转化前的等同微生物比较时)能够(i)以更高的速率代谢戊醛糖；和/或(ii)具有更高的生长速率；和/或(iii)以更高的速率生成戊酮糖；和/或(iv)以更高的速率生成戊糖衍生化合物；和/或(v)以更高的速率生成生物燃料。
术语“经转化微生物”不涵盖在它们的天然启动子(在其天然环境中的)控制下的天然核苷酸编码序列(在其天然环境中的)。
因此，本发明的经转化微生物包括包含下述任一项或其组合的微生物：编码本文所述酶的核苷酸序列，包含所述核苷酸序列的构建物，包含所述核苷酸序列的载体，包含所述核苷酸序列的质粒和包含所述核苷酸序列的表达载体。
如此，本发明的又一个实施方案提供经表达本文所述酶的核苷酸序列转化或转染的微生物。微生物会选择成与载体相容，而且可以是例如细菌、真菌或酵母细胞。
合适的细菌宿主生物体的例子是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌物种。
根据编码本文所述酶的核苷酸序列的性质，真核宿主诸如酵母或其它真菌可能是优选的。一般地，优选酵母细胞胜过真菌细胞，因为它们易于操作。
合适的微生物-诸如酵母和真菌宿主细胞-的使用可提供翻译后修饰(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，因为它们可能是赋予本文所述重组表达产物以最佳生物学活性所需要的。
合适的微生物包括细菌、真菌和酵母。优选地，微生物是酵母或细菌。
优选地，所述经转化微生物是经转化酵母。优选地，所述经转化酵母衍生自糖酵母属/酵母属(genus Saccharomyces)。更优选地，所述经转化酵母是啤酒糖酵母/酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
在另一个实施方案中，优选地，所述经转化微生物是经转化细菌。优选地，所述经转化细菌衍生自发酵单胞菌属(genus Zymomonas)或发酵杆菌属(genus Zymobacter)。更优选地，所述经转化细菌是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)或棕榈发酵杆菌(Zymobacter palmae)。
在一个实施方案中，本文所述经转化微生物在包含戊醛糖的培养基中培养时以比转化前的等同微生物要更高的速率代谢戊醛糖。
另一方面，本文所述经转化微生物在包含戊醛糖的培养基中培养时的生长速率比转化前的等同微生物要更高。
又一方面，本文所述经转化微生物在包含戊醛糖的培养基中培养时能够以比转化前的等同微生物要更高的速率生成戊酮糖。
另一方面，本文所述经转化微生物在包含戊醛糖的培养基中培养时能够以比转化前的等同微生物要更高的速率生成生物燃料。
微生物可以使用本领域例行的技术诸如电穿孔(Sambrook等，1989)来转化。另外，经转化微生物中序列的存在可以通过合适培养基上的生长选择来确定，所述合适培养基选择经转化微生物的生长。或者/另外，插入的异源DNA序列的存在可以通过使用为插入的序列专门设计的引物进行的直接菌落PCR来确定。此类技术是本领域公知的且例行的(参见例如Sambrook等，1989和Ausubel等，1995)。
依照本发明的经转化微生物可以与一种或多种依照本发明的经转化微生物组合使用。
例如，一种或多种能够将D-木糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物可以与选自下组的一种或多种微生物组合使用：能够将L-阿拉伯糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖的依照本发明的经转化微生物；能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；和能够将D-核糖转变成D-核酮糖的依照本发明的经转化微生物。
又例如，一种或多种能够将L-阿拉伯糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物可以与选自下组的一种或多种微生物组合使用：能够将D-木糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖的依照本发明的经转化微生物；能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；和能够将D-核糖转变成D-核酮糖的依照本发明的经转化微生物。
又例如，一种或多种能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖的依照本发明的经转化微生物可以与选自下组的一种或多种微生物组合使用：能够将D-木糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；能够将L-阿拉伯糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；和能够将D-核糖转变成D-核酮糖的依照本发明的经转化微生物。
又例如，一种或多种能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物可以与选自下组的一种或多种微生物组合使用：能够将L-阿拉伯糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖的依照本发明的经转化微生物；能够将D-木糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；和能够将D-核糖转变成D-核酮糖的依照本发明的经转化微生物。
又例如，一种或多种能够将D-核糖转变成D-核酮糖的依照本发明的经转化微生物可以与选自下组的一种或多种微生物组合使用：能够将L-阿拉伯糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖的依照本发明的经转化微生物；能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；和能够将D-木糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物。
依照本发明的经转化微生物可以与一种或多种别的微生物组合使用。例如，一种或多种依照本发明的经转化微生物可以与能够在某些培养条件下生成选自下列的多种成分之一的至少一种微生物组合培养：乙醇，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，衣康酸，甲酚，3-羟基丙酸，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，原儿茶酸，焦儿茶酚，愈创木酚，藜芦醚，香草醛，香草酸，香草醇，己二烯二酸，己二酸，4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸盐/酯，4-羟基苯胺，4-甲氧基苯胺，对苯二酚，苯甲醚，酚，邻氨基苯甲酸，3-羟基邻氨基苯甲酸盐/酯，2，3-二羟基苯甲酸，2-氨基苯酚，1，4-环己二酮和芳香族氨基酸。
又一方面，提供下述各项的组合：(i)一种或多种依照本发明的经转化微生物和(ii)至少一种能够在某些培养条件下生成选自下列的多种成分之一的别的微生物：乙醇，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，衣康酸，甲酚，3-羟基丙酸，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，原儿茶酸，焦儿茶酚，愈创木酚，藜芦醚，香草醛，香草酸，香草醇，己二烯二酸，己二酸，4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸盐/酯，4-羟基苯胺，4-甲氧基苯胺，对苯二酚，苯甲醚，酚，邻氨基苯甲酸，3-羟基邻氨基苯甲酸盐/酯，2，3-二羟基苯甲酸，2-氨基苯酚，1，4-环己二酮和芳香族氨基酸。
另外，本发明提供包含上述组合之一的接种物。
另外，提供包含上述组合之一的培养液。
另外，本发明提供包含下述各项的试剂盒：(i)包含一种或多种依照本发明的微生物的接种物和(ii)包含一种或多种本文所述别的微生物的接种物。
表达载体
术语“表达载体”指能够在体内或在体外表达的构建物。
一方面，将表达载体掺入合适微生物的基因组。术语“掺入”优选涵盖稳定掺入基因组。
本文所述核苷酸序列可以存在于载体中，其中核苷酸序列可操作连接至调节序列，其能够提供合适宿主微生物对核苷酸序列的表达。
将载体转化入本文所述合适宿主微生物。
载体的选择(例如质粒、粘粒、或噬菌体载体)常常会取决于它要导入的微生物。
供本文中使用的载体可以含有一种或多种选择标志核苷酸序列-诸如赋予抗生素抗性的核苷酸序列，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。或者，可以通过共转化来实现选择(如WO91/17243中记载的)。
载体可以在体外使用，例如转染、转化、转导或感染宿主微生物。
载体可以进一步包含使得载体能够在所讨论的宿主微生物中复制的核苷酸序列。此类序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
在一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列。
优选地，如本文所述的表达载体包含编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列。
优选地，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含至少一种编码木糖还原酶和/或D-木酮糖还原酶的表达载体。
在另一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含编码木糖还原酶的表达载体和编码D-木酮糖还原酶的表达载体。
又一方面，优选地，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含至少一种编码木糖异构酶的表达载体。
另一方面，优选地，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含至少一种编码阿拉伯糖还原酶和/或L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和/或L-木酮糖还原酶和/或D-木酮糖还原酶的表达载体。
在又一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含编码阿拉伯糖还原酶的表达载体、编码L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶的表达载体、编码L-木酮糖还原酶的表达载体、和编码D-木酮糖还原酶的表达载体。
在又一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含编码L-阿拉伯糖异构酶的表达载体。
优选地，另一方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含至少一种编码L-阿拉伯糖异构酶和/或核酮糖激酶和/或核酮糖磷酸4-差向异构酶的表达载体。
在又一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含编码L-阿拉伯糖异构酶的表达载体、编码核酮糖激酶的表达载体、和编码核酮糖磷酸4-差向异构酶的表达载体。
在另一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含至少一种编码D-来苏糖异构酶的表达载体。
在又一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含编码D-核糖异构酶的表达载体。
优选地，另一方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物可进一步包含至少一种编码选自下组的一种或多种酶的表达载体：木酮糖激酶，D-核酮糖激酶，核糖-5-磷酸异构酶，核酮糖-5-磷酸差向异构酶，转醛醇酶，转酮醇酶和戊糖磷酸途径的任何其它酶。优选地，所述如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物进一步包含至少一种编码木酮糖激酶和/或D-核酮糖激酶的表达载体。更优选地，所述如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物进一步包含至少一种编码木酮糖激酶的表达载体。在另一个实施方案中，优选地，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物进一步包含至少一种编码核酮糖-5-磷酸差向异构酶和/或核糖-5-磷酸异构酶和/或转醛醇酶和/或转酮醇酶的表达载体。
一方面，如本文所述的表达载体可进一步编码选自下组的一种或多种酶：醛糖-1-差向异构酶，木糖还原酶，D-木酮糖还原酶，木糖异构酶，阿拉伯糖还原酶，L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶，L-木酮糖还原酶，L-阿拉伯糖异构酶，核酮糖激酶，核酮糖磷酸4-差向异构酶，D-来苏糖异构酶，D-核糖异构酶，木酮糖激酶，D-核酮糖激酶，核酮糖-5-磷酸差向异构酶，核糖-5-磷酸异构酶，转醛醇酶，和转酮醇酶。
一方面，如本文所述的表达载体可进一步编码选自下组的一种或多种酶：木酮糖激酶，D-核酮糖激酶，核糖-5-磷酸异构酶，D-核酮糖-5-磷酸差向异构酶，转醛醇酶，转酮醇酶和戊糖磷酸途径的任何其它酶。在一个优选的方面，如本文所述的表达载体进一步编码木酮糖激酶和/或D-核酮糖激酶。更优选地，所述如本文所述的表达载体进一步编码木酮糖激酶。在另一个实施方案中，优选地，如本文所述的表达载体进一步编码核酮糖-5-磷酸差向异构酶和/或核糖-5-磷酸异构酶和/或转醛醇酶和/或转酮醇酶。在另一个更优选的实施方案中，优选地，如本文所述的表达载体进一步编码核糖-5-磷酸异构酶和/或转醛醇酶和/或转酮醇酶。
在一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物进一步包含至少一种编码醛糖-1-差向异构酶的表达载体。
优选地，如本文所述的表达载体进一步包含编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列。
调节序列
在一些应用中，将本文所述核苷酸序列可操作连接至调节序列，其能够提供核苷酸序列的表达，诸如由所选择的微生物进行。举例而言，本发明涵盖使用如下的载体，其包含可操作连接至此类调节序列的本文所述核苷酸序列，即所述载体是表达载体。
术语“可操作连接”指如下的并置，其中所述成分的关系容许它们以它们的预定方式发挥功能。“可操作连接”至编码序列的调节序列以如下方式连接，即在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“调节序列”包括启动子和增强子和其它表达调节信号。
术语“启动子”以本领域普通含义使用，例如RNA聚合酶结合位点。
编码本文所述酶的核苷酸序列的增强的表达还可以通过选择异源调节区来实现，例如启动子、分泌前导序列和终止子区。
优选地，将本文所述核苷酸序列可操作连接至至少一种启动子。
其它启动子可同样用于指导本文所述多肽的表达。
用于在细菌、真菌或酵母细胞中指导核苷酸序列转录的合适启动子的例子是本领域公知的。
启动子可另外包括特征以确保或提高合适宿主中的表达。例如，所述特征可以是保守区，诸如Pribnow框或TATA框。
构建物
术语“构建物”-其与术语诸如“缀合物”、“盒”和“杂合物”同义-包括直接或间接附着至启动子的本文所述核苷酸序列。
间接附着的一个例子是在启动子和本文所述核苷酸序列中间提供合适的间隔物基团，诸如内含子序列，诸如Sh1内含子或ADH内含子。涉及本发明的术语“融合”也是如此，其包括直接或间接附着。在一些情况中，这些术语不覆盖天然组合的编码通常与野生型基因启动子有关的蛋白质且它们都处于天然环境中时的核苷酸序列。
构建物甚至可以含有或表达标志物，其容许选择遗传构建物。
对于一些应用，优选地，构建物至少包含可操作连接至启动子的本文所述核苷酸序列。
启动子
如本文所述，一方面，本发明涉及已经用引起微生物过表达醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列，诸如启动子转化的微生物。
例如，将启动子插入微生物的基因组，这使得微生物能够过表达(例如上调)编码醛糖-1-差向异构酶的内源核苷酸序列。
另一方面，将启动子可操作连接至例如表达载体中的核苷酸序列。
另一方面，启动子不受葡萄糖的存在遏制。
能在依照本发明的微生物，诸如酿酒酵母中使用的合适启动子的例子包括：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的启动子；醇脱氢酶(ADH)基因的启动子；促甲状腺胚胎因子(TEF)基因的启动子。能在运动发酵单胞菌中和在棕榈发酵杆菌中使用的合适启动子的例子包括发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Conway等，1987)和发酵单胞菌烯醇化酶启动子(Burnett等，1992)。
可用于过表达醛糖-1-差向异构酶的优选启动子可以是控制编码涉及糖酵解和葡萄糖发酵的蛋白质的核苷酸序列表达的任何调节元件。例子包括但不限于：
能够表达PGI1基因的P-pgi启动子，所述启动子包含此基因和可读框YBR197C之间的核苷酸序列；
能够表达TPI1基因的P-tpi启动子，所述启动子包含此基因和可读框YDR051C之间的核苷酸序列；
能够表达HXK2基因的P-hxk启动子，所述启动子包含此基因和基因FZF1之间的核苷酸序列；
能够表达PFK1基因的P-pfk启动子，所述启动子包含此基因和基因YAP1802之间的核苷酸序列；
能够表达ENO2基因的P-eno启动子，所述启动子包含此基因和基因SPC97之间的核苷酸序列；
能够表达TDH3基因的P-tdh启动子，所述启动子包含此基因和基因PDX1之间的核苷酸序列；
能够表达FBA1基因的P-fba启动子，所述启动子包含此基因和基因MPE1之间的核苷酸序列；
能够表达GPM1基因的P-gpm启动子，所述启动子包含此基因和可读框YKL151C之间的核苷酸序列；
能够表达PDC1基因的P-pdc启动子，所述启动子包含此基因和基因STU2之间的核苷酸序列；和，
能够表达PGM2基因的P-pgm启动子，所述启动子包含此基因和基因YKU80之间的核苷酸序列。
生物燃料
如本文中使用的，术语“生物燃料”指适合于在(例如)内燃机中使用的燃料(例如液体燃料)。所述生物燃料衍生自包含戊糖和/或通过酶手段和/或通过酸处理的水解能衍生戊糖的生物学物质。优选地，所述戊糖是戊醛糖。
植物材料-包括包含木质纤维素材料的植物废物(例如：谷类秆，诸如小麦秆；甜菜浆；甘蔗渣；高粱秣；大豆秣；玉蜀黍秣；玉米秣；木屑；和纸浆)和完整植株(诸如那些为能量目的而种植的，例如柳枝稷)-是用于本发明的戊糖，特别是戊醛糖的合适来源。植物材料的其它合适来源包括非废物产品(换言之，食物和饲料来源)诸如甘蔗提取物、甜菜提取物、高粱、大豆、小麦淀粉和玉米淀粉。
优选地，本文所述生物燃料包含至少一种醇。
在一个优选的方面，醇选自下组：甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。更优选地，生物燃料包含乙醇。
优选地，所述生物燃料是自依照本发明的经转化微生物已经在合适条件下培养的培养液获得的(或可获得的)一换言之，提取(或可提取的)。所述生物燃料可以是使用本领域常规技术自培养液获得的(或可获得的)，诸如通过离心除去微生物、分离上清液接着蒸馏、和进一步的脱水步骤以产生99.5％纯的乙醇。
生物燃料可包含一种或多种别的生物燃料成分，诸如丁醇。
可以在自培养物获得或提取(可获得的或可提取的)生物燃料之前和/或之后将一种或多种别的生物燃料成分与生物燃料混合。
或者/另外，可以在在培养基中培养依照本发明的经转化微生物以生成生物燃料之前和/或之后和/或同时通过在培养基中培养微生物来生成一种或多种别的生物燃料成分。
本发明还提供包含使用依照本发明的微生物生成的生物燃料的运输燃料。
用作运输燃料的乙醇可用于两种不同目的：
(i)它能起氧化添加剂(oxygenated additive)的作用以提高辛烷值和降低新配方汽油(RFG)(四乙铅或MTBE替代物)排放。
(ii)它能起常规汽油(RG)部分或完全替代品的作用以降低对汽油供给的依赖性。
无水乙醇具有130的辛烷值，而且能以5-10％的浓度(取决于季节)添加至直接自精炼厂获得的常规汽油。传统上，将四乙铅用于提高辛烷，然而，由于健康问题，几乎全世界都禁止使用铅。向常规汽油添加氧化剂(oxygenate)降低一氧化碳排放以及造成空气污染的其它颗粒。甲基叔丁基醚(MTBE)最初用作氧化添加剂，然而，饮用水含水层中MTBE污染的发生促使一些州禁止使用这种氧化剂。乙醇在全世界日益用作MTBE的替代物，作为RFG制造的氧化添加剂。
在充当新配方汽油生产中的氧化添加剂之外，乙醇可用作常规汽油的一般替代品。在发动机没有任何改变的情况中，汽车能使用E10混合物(添加10％乙醇)。
另外，已经制造了能以100％乙醇运行的交通工具-换言之，不需要基于化石的燃料。
依照本发明的经转化微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物能够以比转化前的等同微生物要更高的速率生成生物燃料。如本文中使用的，术语“更高的速率”指在相同培养条件下培养指数生长期内的给定时间段时，经转化微生物能够在培养液中生成比转化前的等同微生物多至少5％、10％、20％、25％、30％或35％的生物燃料(诸如生物乙醇)每细胞。
戊糖衍生化合物
如本文中使用的，术语“戊糖衍生化合物”指任何自戊糖衍生的化合物。戊糖衍生化合物可以是自戊醛糖衍生的。戊糖衍生化合物可以是自戊酮糖衍生的。
戊糖衍生化合物的例子包括但不限于：乙醇，芳香族氨基酸，甲酚，衣康酸，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，和3-羟基丙酸。图1显示其它戊糖衍生化合物，诸如自戊醛糖衍生的戊酮糖。可以将戊糖衍生产物转变成其它产物。例如，可以经戊糖磷酸途径将自戊醛糖D-木糖衍生的戊酮糖D-木酮糖转变成乙醇。
优选地，所述戊糖衍生化合物是乙醇、乳酸、琥珀酸、乙酸、乙醛、衣康酸、甲酚、3-羟基丙酸、聚-3-羟基链烷酸盐/酯、原儿茶酸、焦儿茶酚、愈创木酚、藜芦醚、香草醛、香草酸、香草醇、己二烯二酸、己二酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲醛、4-甲氧基苯甲酸、4-氨基苯甲酸盐/酯、4-羟基苯胺、4-甲氧基苯胺、对苯二酚、苯甲醚、酚、邻氨基苯甲酸、3-羟基邻氨基苯甲酸盐/酯、2，3-二羟基苯甲酸、2-氨基苯酚、1，4-环己二酮和芳香族氨基酸。
优选地，所述戊糖衍生化合物是乙醇、甲酚、衣康酸、乳酸、琥珀酸、和3-羟基丙酸。
更优选地，所述戊糖衍生化合物是乙醇。
培养基
培养基包含至少一种戊糖。在一个优选的方面，培养基包含至少一种戊醛糖。
优选地，经转化微生物在所述微生物的最适培养基中培养。使用常规技术，可以确定最适培养基；另外，可以确定最适生长条件。
一方面，所述培养基在接种微生物(即在时间零)之前包含约1％、约2％、约4％、约8％、约15％或约25％戊醛糖。
优选地，所述培养基包含最适量的盐、维生素和微生物所必需的其它养分。
微生物优选于它们的最适生长温度培养。技术人员会容易地能够确定培养本文所述微生物的最适温度。
在一个实施方案中，微生物于约20℃、25℃、30℃、35℃、或37℃培养。
在一个实施方案中，微生物于约35℃至39℃、优选约36℃至38℃、更优选约35.5℃至37.5℃培养。
优选地，微生物培养约3小时、约6小时、约15小时、约24小时、约48小时或约96小时。
一方面，微生物，特别是经转化微生物，是醇耐受的和/或酸耐受的。
涉及本发明的术语“醇耐受的”指微生物能够在包含至少2％、5％、10％或15％醇的培养基中生长。
如本文所述，术语“酸耐受的”指微生物能够在pH等于或小于6.5、6.0、5.0、4.0或3.0的培养基中生长。
在一个优选的方面，给培养基接种至少5x107至5x1011个细胞每kg培养基，优选5x108至5x1010个细胞每kg培养基，优选1x109至1x1010个细胞每kg培养基和更优选约5x109个细胞每kg培养基。
术语“接种物”和“起始培养物”可互换使用。
戊糖的来源
戊糖(特别是戊醛糖)衍生或可衍生自植物。
戊糖(特别是戊醛糖)可衍生自：通常用作食物或饲料来源的植物材料(诸如：甘蔗、甜菜、高粱、小麦和玉米-它们是富含淀粉和富含糖的植物材料)；完整植株(诸如那些为能量目的而种植的，例如柳枝稷)；和，特别地，废物农业(植物)材料(诸如：谷类秆，例如小麦秆；甜菜浆；渣，例如甘蔗渣；秣，例如高粱、大豆、玉蜀黍或玉米秣；和木屑)。
用于本文所述培养基的戊糖的来源包括通常视为农业废物材料的木质纤维素材料。茎/干、柄梗和叶含有木质纤维素材料。甘蔗渣、玉米秣和木屑(只有半纤维素)是三种最容易获得的木质纤维素材料来源，因为这些在各个季节易于大量收集或储存。
木质纤维素材料主要由长链糖组成。平均而言，三分之二的这些糖是己糖，它们主要以纤维素存在，而且三分之一的糖是戊糖，主要以阿拉伯糖基木聚糖聚合物存在。
显著量的半纤维素衍生戊糖是木糖。
可以水解木质纤维素材料以释放纤维素、半纤维素和木质素的长链糖中的己糖和/或戊糖。
木质纤维素材料的水解可以通过升高的温度的酸处理来进行。然而，这种处理可生成糖衍生副产物，它们对大多数微生物有毒，而且阻止糖转变成乙醇。可以除去此类有毒副产物(如果生成的话)，但是这一般是不经济的。
或者，可以使用纤维素和半纤维素水解酶来水解木质纤维素材料。有利地，这种工艺避免有毒副产物的生成。
在一个优选的方面，培养基包含自一种或多种经处理以释放己糖和/或戊糖的木质纤维素材料(此类处理技术的例子包括蒸气处理、蒸气爆发、湿氧化、酸水解、碱性湿氧化和氨纤维膨胀)衍生的材料。优选地，通过酶促水解工艺来处理木质纤维素材料。可以进一步处理所述经水解的木质纤维素材料以提取糖，之后在培养基中使用所述提取物。
木质纤维素材料的水解
初步机械处理：
根据需要及在认为需要时，将木质纤维素材料砍成小片。例如，将小麦秆切成长度为大约5cm的段。
后续湿热预处理：
木质纤维素材料的湿热预处理可以以蒸汽预处理接着清洗步骤来进行，由此生成纤维级分和液体级分。纤维级分含有超过90％的纤维素、最初存在于纤维素材料中的木质素、和一些半纤维素。液体级分含有来自半纤维素的糖(C5糖)、超过90％的包含在木质纤维素生物质中的碱金属氯化物、和大部分自木质纤维素原料预处理产生的发酵抑制剂。
典型地，通过蒸汽将小麦秆加热至介于180和200℃之间的温度，停留时间5-15分钟。自压力反应器卸下经预处理的生物质，并清洗和挤压。收集释放的蒸汽，并再次用于液体级分蒸发以进料糖蜜。
酶促水解：
糖聚合物的后续水解可以通过添加纤维素酶和半纤维素酶来进行，或是在发酵之前或是在发酵期间或是二者，就像同步糖化和发酵工艺等。
己糖
己糖具有6个碳原子。己醛糖在1位具有醛，而己酮糖在2位具有酮。葡萄糖是己醛糖的例子。果糖是己酮糖的例子。
戊糖
戊糖具有5个碳原子。戊糖或是具有1位醛官能团(戊醛糖)或是具有2位酮官能团(戊酮糖)。
戊醛糖
优选地，所述戊醛糖选自下组：木糖，阿拉伯糖，核糖和来苏糖。更优选地，戊醛糖是木糖或阿拉伯糖。
在一个优选的方面，所述戊醛糖是木糖。更优选地，所述戊醛糖是D-木糖。
戊酮糖
优选地，所述戊酮糖是木酮糖或核酮糖。
在一个优选的方面，所述戊酮糖是木酮糖。更优选地，所述戊酮糖是D-木酮糖。
在一个优选的方面，所述戊酮糖是核酮糖。更优选地，所述核酮糖是D-核酮糖。
戊醛糖转变成戊酮糖
戊醛糖转变成戊酮糖的例子包括但不限于：木糖转变成木酮糖；阿拉伯糖转变成木酮糖；阿拉伯糖转变成核酮糖；来苏糖转变成木酮糖；核糖转变成核酮糖；D-木糖转变成D-木酮糖；L-阿拉伯糖转变成L-木酮糖或D-木酮糖；L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖；D-来苏糖转变成D-木酮糖；和D-核糖转变成D-核酮糖。
不希望受理论束缚，典型地，真菌中涉及D-木糖转变成D-木酮糖的酶是木糖还原酶和D-木酮糖还原酶。
在细菌中，不希望受理论束缚，通常涉及D-木糖转变成D-木酮糖的酶是木糖异构酶。
不希望受理论束缚，真菌中一般涉及L-阿拉伯糖转变成L-木酮糖的酶是阿拉伯糖还原酶、L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶、L-木酮糖还原酶和D-木酮糖还原酶。
在细菌中，不希望受理论束缚，典型地，涉及L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖的酶是L-阿拉伯糖异构酶。
不希望受理论束缚，细菌中可涉及D-来苏糖转变成D-木酮糖的酶是来苏糖异构酶。
不希望受理论束缚，可涉及D-核糖转变成D-核酮糖的酶是D-核糖异构酶。
酶
本文所述酶命名法编号(EC编号)指1992年出版的国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会关于酶命名和分类的推荐。
本文所述酶可以由自极其多种来源衍生的核苷酸序列生成。一方面，编码本文所述酶的核苷酸序列可以衍生或可衍生自乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、Piromyces sp、热硫化氢高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)、树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)、或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
醛糖-1-差向异构酶(EC 5.1.3.3)
本文所述醛糖-1-差向异构酶能够作用于戊醛糖。
醛糖-1-差向异构酶具有EC命名法编号5.1.3.3。醛糖-1-差向异构酶可称作变旋酶或醛糖变旋酶。
术语醛糖-1-差向异构酶指能够将α-戊醛糖转变成β-戊醛糖和反之亦然的酶。
在一个优选的实施方案中，醛糖-1-差向异构酶由选自下组的核苷酸序列编码：AAD20257版本1，ABX75760版本1，AAK05605版本1，AAD20245版本1，AAD20251版本1，ABJ73095版本1，ABI49935版本1和AAO80762版本1(NCBI登录号)。更优选地，醛糖-1-差向异构酶选自下组：AAD20257版本1，ABX75760版本1，AAK05605版本1，AAD20245版本1和AAD20251版本1。
适合于如本文所述使用的醛糖-1-差向异构酶的例子包括由下述各项编码的醛糖-1-差向异构酶：乳酸乳球菌醛糖-1-差向异构酶基因的核苷酸序列(NCBI登录号AAD20245)；酿酒酵母GAL10基因的核苷酸序列(特别地，编码具有变旋酶活性的氨基酸序列的部分)；和酿酒酵母菌株D0002 GAL10基因的核苷酸序列(特别地，编码具有变旋酶活性的氨基酸序列的部分)。
醛糖还原酶(EC 1.1.1.21)
醛糖还原酶具有EC命名法编号1.1.1.21。醛糖还原酶可称作：多元醇脱氢酶，醛还原酶，ALR2，NADPH-戊醛糖还原酶，NADPH-醛糖还原酶，醛醇：NADP氧化还原酶或醛醇：NADP+1-氧化还原酶。
术语醛糖还原酶指能够将醛醇转变成醛糖和反之亦然的酶。
醛糖还原酶可还原超过一种类型的醛糖。例如，同一种酶可以能够还原D-木糖和L-阿拉伯糖二者，此类酶因此可称作醛糖还原酶，或者，它可以更特异性地以底物之一命名，例如木糖还原酶。
木糖还原酶(EC 1.1.1.21)
在一个实施方案中，醛糖还原酶是木糖还原酶。木糖还原酶具有EC命名法编号1.1.1.21。
术语木糖还原酶指能够将D-木糖转变成木糖醇和反之亦然的酶。
本文所述木糖还原酶能够作用于D-木糖。
适合于如本文所述使用的木糖还原酶的例子包括由下述各项编码的木糖还原酶：树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因(PsXR)的核苷酸序列；树干毕赤氏酵母菌株DSM3651木糖还原酶基因(PsXR)的核苷酸序列-NCBI登录号X59465版本1；纤细假丝酵母(Candida tenuis)的核苷酸序列(所述编码木糖还原酶的核苷酸序列可以如Kavanagh等，2003所述来获得)；和粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的核苷酸序列(所述编码木糖还原酶的核苷酸序列可以如Woodyer等，2005所述来获得)。
阿拉伯糖还原酶(EC 1.1.1.21)
在另一个实施方案中，醛糖还原酶是阿拉伯糖还原酶。阿拉伯糖还原酶具有EC命名法编号1.1.1.21。
术语阿拉伯糖还原酶指能够将L-阿拉伯糖转变成L-阿拉伯糖醇和反之亦然的酶。
本文所述阿拉伯糖还原酶能够作用于L-阿拉伯糖。
本领域当前已知的D-木糖还原酶也可以相似活性作用于作为底物的L-阿拉伯糖。因此，术语L-阿拉伯糖还原酶也可指归类为D-木糖还原酶的酶，而且适合于引入木糖代谢的本文所述木糖还原酶类似地适合用于将阿拉伯糖代谢引入微生物。
在又一个实施方案中，醛糖还原酶可以能够将L-来苏糖转变成L-阿拉伯糖醇和反之亦然。在另一个实施方案中，醛糖还原酶可以能够将D-来苏糖转变成D-阿拉伯糖醇和反之亦然。
在另一个实施方案中，醛糖还原酶可以能够将核糖转变成核糖醇(特别所将D-核糖转变成D-核糖醇)和反之亦然。
木酮糖还原酶(EC 1.1.1.9和EC 1.1.1.10)
术语木酮糖还原酶涵盖D-木酮糖还原酶和L-木酮糖还原酶。
D-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.9)
D-木酮糖还原酶具有EC命名法编号1.1.1.9。D-木酮糖还原酶可称作木糖醇脱氢酶、木糖醇-2-脱氢酶、2，3-顺式-多元醇(DPN)脱氢酶(C3-5)、NAD依赖性木糖醇脱氢酶、赤藓糖醇脱氢酶或戊糖醇-DPN脱氢酶。
术语D-木酮糖还原酶指能够将木糖醇转变成D-木酮糖和反之亦然的酶。
本文所述D-木酮糖还原酶能够作用于木糖醇。
适合于如本文所述使用的D-木酮糖还原酶的例子包括由下述各项编码的D-木酮糖还原酶：树干毕赤氏酵母D-木酮糖基因(PsXDH)的核苷酸序列；和树干毕赤氏酵母菌株DSM3651D-木酮糖还原酶基因(PsXDH)的核苷酸序列-NCBI登录号X55392版本1。
L-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.10)
L-木酮糖还原酶具有EC命名法编号1.1.1.10。L-木酮糖还原酶可称作L-木糖醇脱氢酶。
术语L-木酮糖还原酶指能够将L-木酮糖转变成木糖醇和反之亦然的酶。
本文所述L-木酮糖还原酶能够作用于L-木酮糖。
编码L-木酮糖还原酶的核苷酸序列可以自黑曲霉(Aspergillus niger)(如Witteveen等，1994所述)或自酵母单孢神食酵母(Ambrosiozymamonospora)(Verho等，2004)获得。
木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)
木酮糖激酶具有EC命名法编号2.7.1.17。木酮糖激酶可称作D-木酮糖激酶。
术语木酮糖激酶指能够将D-木酮糖转变成D-木酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。
本文所述木酮糖激酶能够作用于D-木酮糖。
适合于如本文所述使用的木酮糖激酶的例子包括由下述各项编码的木酮糖激酶：树干毕赤氏酵母木酮糖激酶基因(PsXKS)的核苷酸序列；树干毕赤氏酵母菌株DSM3651木酮糖激酶基因(PsXKS)的核苷酸序列-NCBI登录号AF127802版本1；酿酒酵母木酮糖激酶基因(ScXKS)的核苷酸序列；和酿酒酵母菌株D0002木酮糖激酶基因(ScXKS)的核苷酸序列-NCBI登录号X61377版本1。
木糖异构酶(EC 5.3.1.5)
木糖异构酶具有EC命名法编号EC 5.3.1.5。木糖异构酶可称作D-木糖异构酶、D-木糖酮异构酶、或D-木糖酮醇异构酶。
术语木糖异构酶指能够将D-木糖转变成D-木酮糖和反之亦然的酶。
本文所述木糖异构酶能够作用于D-木糖。
适合于如本文所述使用的木糖异构酶的例子包括由下述各项编码的木糖异构酶：Piromyces木糖异构酶基因(PmXI)的核苷酸序列；Piromyces sp E2木糖异构酶基因(PmXI)的核苷酸序列-NCBI登录号AJ249909版本1；和热硫化氢高温厌氧杆菌木糖异构酶基因(ThXI)的核苷酸序列-NCBI登录号D00756版本1；SEQ ID No 2和SEQ ID No 3。
D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(EC 1.1.1.11)
D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶具有EC命名法编号1.1.1.11。D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶可称作D-阿拉伯糖醇脱氢酶或阿拉伯糖醇脱氢酶。
术语D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶指能够将D-阿拉伯糖醇转变成D-木酮糖和反之亦然的酶。
本文所述D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶能够作用于D-阿拉伯糖醇。
一种合适的D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和相应的基因记载于Cheng等，2005。
L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(EC 1.1.1.12)
L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶具有EC命名法编号1.1.1.12。L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶可称作L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶或戊糖醇-DPN脱氢酶。
术语L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶指能够将L-阿拉伯糖醇转变成L-木酮糖和反之亦然的酶。
本文所述L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶能够作用于L-阿拉伯糖醇。
一种合适的L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和相应的基因记载于Richard等，2001。
L-阿拉伯糖异构酶(EC 5.3.1.4)
L-阿拉伯糖异构酶具有EC命名法编号5.3.1.4。L-阿拉伯糖异构酶可称作L-阿拉伯糖酮醇异构酶。
术语L-阿拉伯糖异构酶指能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖和反之亦然的酶。
本文所述L-阿拉伯糖异构酶能够作用于L-阿拉伯糖。
编码L-阿拉伯糖异构酶的核苷酸序列的一个例子是可以自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株NCIMB8826(ATCC 14917)获得的核苷酸序列(NCBI登录码NC_004567版本1中记载的基因)。
核酮糖激酶(EC 2.7.1.16)
核酮糖激酶具有EC命名法编号2.7.1.16。核酮糖激酶可称作L-核酮糖激酶。
术语核酮糖激酶指能够(i)将L-核酮糖转变成L-核酮糖5-磷酸和反之亦然；和/或(ii)将D-核酮糖转变成D-核酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。
本文所述核酮糖激酶能够作用于L-核酮糖和/或D-核酮糖。
一种合适的编码核酮糖激酶的核苷酸序列可以自植物乳杆菌菌株NCIMB8826(ATCC 14917)获得(NCBI登录码NC_004567版本1中记载的基因)。
L-核酮糖磷酸4-差向异构酶(EC 5.1.3.4)
L-核酮糖磷酸4-差向异构酶具有EC命名法编号5.1.3.4。L-核酮糖磷酸4-差向异构酶可称作核酮糖磷酸4-差向异构酶、磷酸核酮糖异构酶、L-核酮糖5-磷酸4-差向异构酶、AraD或L-Ru5P。
术语L-核酮糖磷酸4-差向异构酶指能够将L-核酮糖5-磷酸转变成D-木酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。
本文所述L-核酮糖磷酸4-差向异构酶能够作用于L-核酮糖5-磷酸。
一种合适的编码L-核酮糖磷酸4-差向异构酶的核苷酸序列可以自植物乳杆菌菌株NCIMB8826(ATCC 14917)获得(NCBI登录码NC_004567中记载的基因)。
D-核糖醇4-脱氢酶
D-核糖醇4-脱氢酶具有EC命名法编号1.1.1.56。这种酶也可称作核糖醇
2-脱氢酶、福寿糖醇脱氢酶或核糖醇脱氢酶。
术语D-核糖醇4-脱氢酶指能够将核糖醇转变成D-核酮糖和反之亦然的酶。
本文所述D-核糖醇4-脱氢酶能够作用于D-核糖醇。
一种合适的D-核糖醇4-脱氢酶和相应的基因记载于Dothie等，1985。
D-来苏糖异构酶(EC 5.3.1.15)
D-来苏糖异构酶具有EC命名法编号5.3.1.15。这种酶也可称作D-来苏糖酮醇异构酶。
术语D-来苏糖异构酶指能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖和反之亦然的酶。
本文所述D-来苏糖异构酶能够作用于D-来苏糖。
编码D-来苏糖/L-核糖异构酶的核苷酸序列可以自生物体不动杆菌(Acinetobacter sp.)菌株DL-28(Shimonishi和Izumori，1996)或产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)(Anderson和Allison，1965)克隆。
核糖异构酶(EC 5.3.1.20)
核糖异构酶具有EC命名法编号5.3.1.20。这种酶也可称作D-核糖异构酶或D-核糖酮醇异构酶。
术语核糖异构酶指能够将D-核糖转变成D-核酮糖和反之亦然的酶。
本文所述核糖异构酶能够作用于D-核糖。
已经在生物体耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)(Izumori等，1975)中找到D-核糖异构酶，可以自该生物体克隆D-核糖异构酶。
核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶(EC 5.1.3.1)
核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶具有EC命名法编号5.1.3.1。这种酶也可称作：戊糖-5-磷酸3-差向异构酶，磷酸戊酮糖3-差向异构酶，磷酸戊酮糖差向异构酶，磷酸核酮糖差向异构酶，核酮糖-磷酸3-差向异构酶；D-核酮糖5-磷酸差向异构酶；D-核酮糖磷酸-3-差向异构酶；D-核酮糖-5-P3-差向异构酶；D-木酮糖-5-磷酸3-差向异构酶；赤藓糖-4-磷酸异构酶；核酮糖5-磷酸3-差向异构酶；和木酮糖磷酸3-差向异构酶。
术语核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶指能够将D-核酮糖5-磷酸转变成D-木酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。
适合于如本文所述使用的核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶的例子包括由下述各项编码的核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶：酿酒酵母RPE1基因的核苷酸序列；酿酒酵母菌株D0002RPE1基因的核苷酸序列；NCBI登录码NP_012414版本1的核苷酸序列；和能在NCBI登录码NP_012414版本1中找到的来自树干毕赤氏酵母的核酮糖-5-磷酸异构酶。
核糖-5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)
核糖-5-磷酸异构酶具有EC命名法编号5.3.1.6。这种酶也可称作磷酸戊糖异构酶、磷酸戊糖异构酶、磷酸戊糖异构酶、磷酸核糖异构酶、核糖5-磷酸差向异构酶、核糖磷酸异构酶、5-磷酸核糖异构酶、或D-核糖-5-磷酸酮醇异构酶。
术语核糖-5-磷酸异构酶指能够将D-核糖5-磷酸转变成D-核酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。
适合于如本文所述使用的核糖-5-磷酸异构酶的例子包括由下述各项编码的核糖-5-磷酸酮醇异构酶：酿酒酵母RKI1基因的核苷酸序列；酿酒酵母菌株D0002 RKI1基因的核苷酸序列；NCBI登录码X94335版本1的核苷酸序列；NCBI登录码NP_014738版本1的核苷酸序列，和能在登录号NC_009043版本1中找到的来自树干毕赤氏酵母的核糖-5-磷酸异构酶。
转酮醇酶(EC 2.2.1.1)
转酮醇酶具有EC命名法编号2.2.1.1。这种酶也可称作羟乙醛转移酶。
术语转酮醇酶指能够将景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸转变成D-核糖5-磷酸+D-木酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。
适合于如本文所述使用的转酮醇酶的例子包括由下述各项编码的转酮醇酶：酿酒酵母TKL1基因的核苷酸序列；酿酒酵母菌株D0002 TKL1基因的核苷酸序列；NCBI登录码X73224版本1的核苷酸序列；NCBI登录码NP_015399版本1的核苷酸序列和能在登录码CP000496版本1中找到的来自树干毕赤氏酵母的转酮醇酶。
转醛醇酶(EC 2.2.1.2)
转醛醇酶具有EC命名法编号2.2.1.2。这种酶也可称作二羟基丙酮转移酶、二羟基丙酮合酶、甲醛转酮醇酶或甘油酮转移酶。
术语转醛醇酶指能够将景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸转变成D-赤藓糖4-磷酸+D-果糖6-磷酸和反之亦然的酶。
适合于如本文所述使用的转醛醇酶的例子包括由下述各项编码的转醛醇酶：酿酒酵母TAL1基因的核苷酸序列；酿酒酵母菌株D0002 TAL1基因的核苷酸序列；NCBI登录码X15953版本1的核苷酸序列；NCBI登录码NP_013458版本1的核苷酸序列，和能在登录码CP000502中找到的来自树干毕赤氏酵母的转醛醇酶。
戊醛糖测定法
溶液(诸如培养液)中戊醛糖的量可以通过如Ebert等(A Simplified，Colorimetric Micromethod for Xylose in Serum or Urine，with Phloroglucinol，1979，Clin.Chem.25，no.8，pp.1440-1443)记载的根皮酚法来比色测定。
显色试剂由0.5g根皮酚(1，3，5-三羟基苯)、100ml冰乙酸和10ml浓HCl组成。将50μl样品添加至950μl显色试剂。将混合物加热至100℃达4分钟，并于554nm读取混合物的吸光度。依据用同一种戊醛糖作为标准品绘制的标准曲线确定样品中戊醛糖的量。这种方法可用于测定培养液中木糖、阿拉伯糖、来苏糖和核糖的量。
互相转变测定法
微生物催化α-戊醛糖和β-戊醛糖之间转变的能力可以通过多种方法来测定。例如，醛糖的α和β-异头物之间的互相转变可以通过NMR来跟踪(例如如Ryu等，2004解释的)，或通过偶联测定法来跟踪(其中跟踪对异头物之一特异性的酶的活性，如Brahma和Bhattacharyya，2004记载的)。
戊酮糖测定法
溶液(诸如培养液)中戊酮糖的量可以通过如Zacharias Dische和EllenBorenffeund(1951；J.Biol.Chem.192(2)：583)记载的半胱氨酸-咔唑法来比色测定。
乙醇测定法
溶液(诸如培养液)中生物燃料像乙醇的量可以通过使用由MegazymeInternational，Bray Business Park，Bray，Co.Wicklow，Ireland制造和销售的商品化乙醇测定法K-ETOH试剂盒来测定；或者它可以通过例如使用气相层析来测定。
戊糖磷酸途径
戊酮糖经戊糖磷酸途径被转变成乙醇。这样的一个例子显示于图4。
涉及戊糖磷酸途径的酶的例子包括：转酮醇酶，转醛醇酶，核糖-5-磷酸酮醇异构酶和核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。
在一个实施方案中，依照本发明的微生物还已经转化以表达或过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶。
在一个实施方案中，依照本发明的微生物还已经用引起微生物过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列转化。例如，将启动子插入微生物的基因组，使得微生物能够过表达编码涉及戊糖磷酸途径的酶的内源核苷酸序列。
在另一个实施方案中，微生物已经用编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列转化。例如，微生物用表达载体转化，该表达载体包含编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的核苷酸序列。
优选地，本文所述表达载体包含一种或多种启动子，其能够过表达编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列。此类启动子的例子包括GPD启动子、TEF启动子和ADP启动子。可用于过表达编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列的优选启动子可以是任何控制编码涉及糖酵解和葡萄糖发酵的蛋白质的核苷酸序列表达的调节元件。
如本文中使用的，短语“引起微生物过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列”和“能够过表达编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列的一种或多种启动子”中的术语“过表达”指在比较经转化微生物与转化前的等同微生物时，表达自零升高至某表达水平或自较低的表达水平升高至较高的表达水平(例如上调)。过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的微生物具有升高的催化戊酮糖(诸如木酮糖5-磷酸)转变成生物燃料(诸如乙醇)的能力。
优选地，所述过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的经转化微生物能够以比未转化的微生物要高至少10％、15％、20％或25％的速率催化戊酮糖(诸如木酮糖5-磷酸)转变成生物燃料(诸如乙醇)。
表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的微生物的例子包括：(i)经编码一种或多种转酮醇酶、转醛醇酶、核糖-5-磷酸酮醇异构酶和核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶的一种或多种表达载体转化的微生物；和(ii)经转化以上调编码一种或多种转酮醇酶、转醛醇酶、核糖-5-磷酸酮醇异构酶和核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶的一种或多种内源核苷酸序列表达的微生物(在转化之前，所述微生物能够在指数生长期间对于给定的培养条件集表达一种或多种这些酶，但是在转化之后，所述微生物能够在指数生长期间在相同培养条件中以更高的水平表达一种或多种这些酶)。
现在会借助实施例进一步描述本发明，实施例意图用来帮助本领域技术人员实施本发明而非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
一般重组DNA方法学技术
除非另外指明，本发明采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力之内。文献中解释了此类技术。参见例如Sambrook等，1989；Ausubel，F.M.等，1995；Roe等，1996；Gait，1984；及Lilley和Dahlberg，1992。通过述及将每一篇这些通用教科书收入本文。
除非另外指明，本发明采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力之内。文献中解释了此类技术。参见例如J.B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996，DNA Isolationand Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；M.J.Gait(编)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesisand Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press。通过述及将每一篇这些通用教科书收入本文。
实施例1a-基于NCBI登录码AAD20245版本1的乳酸乳球菌的合成变旋酶基因(醛糖-1-差向异构酶)的构建。
由GeneartAG(Regensburg，Germany)合成和装配完整乳酸乳球菌醛糖-1-差向异构酶基因(LlMR)。序列中的密码子选择是基于来自Kazusa密码子选择数据库(Nakamura等，2000)的酵母密码子选择表而优化的。在合成的构建物中在可读框的侧翼包括靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。通过对两条链的测序来确定LlMR合成基因的完整性。包括侧翼限制性位点的LlMR的核苷酸序列鉴定为SEQ ID NO 1(即AAD20245)，而由此核苷酸序列编码的氨基酸序列鉴定为SEQ ID No 47。包含的质粒命名为0717050pGA14。
实施例1b-基于NCBI登录码AJ249909版本1的Piromyces sp.E2的合成木糖异构酶基因的构建。
由Geneart AG(Regensburg，Germany)合成和装配完整Piromyces木糖异构酶基因(PmXI)。序列中的密码子选择是基于来自Kazusa密码子选择数据库(Nakamura等，2000)的酵母密码子选择表而优化的。在合成的构建物中在可读框的侧翼包括靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。通过对两条链的测序来确定PmXI合成基因的完整性。包括侧翼限制性位点的PmXI的核苷酸序列鉴定为SEQ ID NO 2，而由此核苷酸序列编码的氨基酸序列鉴定为SEQ ID No 48。包含的质粒命名为0717049pGA15。
实施例1c-基于NCBI登录码D00756版本1的热硫化氢高温厌氧杆菌的合成木糖异构酶(XylA)基因的构建。
由Geneart AG(Regensburg，Germany)合成和装配完整热硫化氢高温厌氧杆菌木糖异构酶基因(ThXI)。序列中的密码子选择是基于来自Kazusa密码子选择数据库(Nakamura等，2000)的酵母密码子选择表而优化的。在合成的构建物中在可读框的侧翼包括靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。通过对两条链的测序来确定ThXI合成基因的完整性。包括侧翼限制性位点的ThXI的核苷酸序列鉴定为SEQ ID NO 3，而由此核苷酸序列编码的氨基酸序列鉴定为SEQ ID No 49。包含的质粒命名为0717046pGA14。
实施例2a-基于NCBI登录码AF127802版本1的来自树干毕赤氏酵母菌株DSM3651的D-木酮糖激酶基因的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5鉴定的引物自得自菌株DSM3651的DNAPCR扩增完整树干毕赤氏酵母D-木酮糖激酶基因(PsXKS)。在PsXKS基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自树干毕赤氏酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，30个循环的30秒96℃、30秒50℃、和150秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离1891bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-BluntII-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为pCR-Blunt 2 P.stip XKS。
实施例2b-基于NCBI登录码X59465版本1的来自树干毕赤氏酵母菌株DSM3651的D-木糖还原酶基因的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7鉴定的引物自得自菌株DSM3651的DNA PCR扩增完整树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因(PsXR)。在PsXR基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自树干毕赤氏酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，30个循环的30秒96℃、30秒50℃、和150秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离976bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为pCR-Blunt 2 P.stip XR。
实施例2c-基于NCBI登录码X55392版本1的来自树干毕赤氏酵母菌株DSM3651的木糖醇脱氢酶(D-木酮糖还原酶)基因的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9鉴定的引物自得自菌株DSM3651的DNA PCR扩增完整树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶基因(PsXDH)。在PsXDH基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自树干毕赤氏酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，30个循环的30秒96℃、30秒50℃、和150秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离1108bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-BluntII-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为pCR-Blunt 2P.stip XDH。
实施例2d-基于NCBI登录码NC_004567版本1的来自植物乳杆菌菌株NCIMB8826(ATCC 14917)的L-阿拉伯糖异构酶基因(EC 5.3.1.4)的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11鉴定的引物自得自菌株ATCC14917的DNA PCR扩增完整植物乳杆菌L-阿拉伯糖异构酶基因(LpAraA)。在LpAraA基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自植物乳杆菌菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(FinnzymesOy，Finland)实施PCR，30个循环的30秒96℃、30秒55℃、和60秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离1444bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例2e-基于NCBI登录码NC_004567版本1的来自植物乳杆菌菌株NCIMB8826(ATCC 14917)的L-核酮糖激酶基因(EC 2.7.1.16)的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13鉴定的引物自得自菌株ATCC14917的DNAPCR扩增完整植物乳杆菌L-核酮糖激酶基因(LpAraB)。在LpAraB基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自植物乳杆菌菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，30个循环的30秒96℃、30秒55℃、和60秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离1618bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例2f-基于NCBI登录码NC_004567版本1的来自植物乳杆菌菌株NCIMB8826(ATCC 14917)的L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶基因(EC 5.1.3.4)的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 15鉴定的引物自得自菌株ATCC14917的DNA PCR扩增完整植物乳杆菌L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶基因(LpAraD)。在LpAraD基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自植物乳杆菌菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，30个循环的30秒96℃、30秒55℃、和60秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离745bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例2g-基于NCBI登录号码Z35888版本1的来自酿酒酵母菌株D0002的GAL10基因的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增完整酿酒酵母GAL10基因(ScGAL10)。在ScGAL10基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和120秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离2116bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-BluntII-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为ScGAL-a23a。
实施例2h-基于NCBI登录码Z35888版本1的来自酿酒酵母菌株D0002的截短型GAL10基因[核苷酸1084-2100]的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 17鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNAPCR扩增完整N端截短型酿酒酵母GAL10基因(ScGAL10Δ)。在ScGAL10Δ基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和120秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离1036bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为ScGALΔ-a24a。
实施例3a-在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYC1终止子控制下含有Piromyces木糖异构酶(PmXI)基因的质粒PmXI-8a的构建。
用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P426-GPD(Mumberg等，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自载体0717049pGA15(实施例1b中描述的)释放编码Piromyces木糖异构酶基因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P426-GPD和编码PmXI的DNA片段在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为PmXI-8a的质粒。
实施例3b-在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYC1终止子控制下含有热硫化氢高温厌氧杆菌木糖异构酶(ThXI)基因的质粒ThXI-5a的构建。
用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P426-GPD(Mumberg等，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自载体0717046pGA14(实施例1c中描述的)释放编码热硫化氢高温厌氧杆菌木糖异构酶基因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P426-GPD和编码ThXI的DNA片段在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为ThXI-5a的质粒。
实施例3c-在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYC1终止子控制下含有树干毕赤氏酵母D-木酮糖激酶(PsXKS)基因的质粒PsXKS-14a的构建。
用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P426-GPD(Mumberg等，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自载体pCR-Blunt 2 P.stip XKS(实施例2a中描述的)释放编码树干毕赤氏酵母木酮糖激酶基因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P426-GPD和编码PsXKS的DNA片段在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为PsXKS-14a的质粒。
实施例3d-在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYC1终止子控制下含有树干毕赤氏酵母木糖还原酶(PsXR)基因的质粒PsXR-24a和PsXR-25的构建。
用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P426-GPD(Mumberg等，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自载体pCR-Blunt 2 P.stip XR(实施例2b中描述的)释放编码树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P424-GPD和P414-GPD和编码PsXR的DNA片段在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将线性化质粒P424-GPD与PsXR片段连接到一起，产生命名为PsXR-24a的质粒。同样地，将线性化质粒P414-GPD与PsXR片段连接到一起，产生命名为PsXR-25a的质粒。
实施例3e-在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYC1终止子控制下含有树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶(PsXDH)基因(木酮糖还原酶)的质粒PsXDH-11a的构建。
用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P426-GPD(Mumberg等，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自载体pCR-Blunt 2 P.stip XDH(实施例2c中描述的)释放编码树干毕赤氏酵母木酮糖脱氢酶基因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P426-GPD和编码PsXDH的DNA片段在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为PsXDH-11a的质粒。
实施例3f-在来自酿酒酵母的各种启动子和CYC1终止子控制下含有乳酸乳球菌变旋酶基因(LlMR)基因(醛糖-1-差向异构酶)的质粒LlMR-36a、LlMR-38a和LlMR-40a的构建。
用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母低拷贝穿梭载体P413-GPD、P413-ADH和P413-TEF(Mumberg等，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自载体0717050pGA14(实施例1a中描述的)释放编码乳酸乳球菌醛糖-1-差向异构酶基因(LlMR)基因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P413-GPD、P413-ADH和P413-TEF和编码LlMR的DNA片段在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将线性化质粒P413-GPD与LlMR片段连接到一起，产生命名为LlMR-36a的质粒。同样地，将线性化质粒P413-ADH与LlMR片段连接到一起，产生命名为LlMR-38a的质粒。最后，将线性化质粒P413-TEF与LlMR片段连接到一起，产生命名为LlMR-40a的质粒。
P413-GPD包含来自编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(也称作GAPDH)同工酶3的基因TDH3的启动子；P413-ADH包含来自编码醇脱氢酶I的基因ADH1的启动子；而P413-TEF包含来自编码翻译延伸因子EF-1α的基因TEF2的启动子。
实施例3g-在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYC1终止子控制下含有植物乳杆菌L-阿拉伯糖异构酶基因(LpAraA)基因的酵母表达质粒的构建。
用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P426-GPD(Mumberg等，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自实施例2d中描述的载体释放编码植物乳杆菌L-阿拉伯糖异构酶基因(LpAraA)的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P426-GPD和编码LpAraA的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例3h-在来自酿酒酵母的ADH启动子和CYC1终止子控制下含有植物乳杆菌L-核酮糖激酶基因(LpAraB)基因的酵母表达质粒的构建。
用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P425-ADH(Mumberg等，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自实施例2e中描述的载体释放编码植物乳杆菌L-核酮糖激酶基因(LpAraB)的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P425-ADH和编码LpAraB的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例3i-在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYC1终止子控制下含有植物乳杆菌L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶基因(LpAraD)基因的酵母表达质粒的构建。
用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P424-GPD(Mumberg等.，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自实施例2f中描述的载体释放编码植物乳杆菌L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶基因(LpAraD)的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P424-GPD和编码LpAraD的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例3j-用于醛糖-1-差向异构酶过表达的在来自酿酒酵母的ADH启动子和CYC1终止子控制下含有酿酒酵母双功能醛糖-1-差向异构酶/UDP半乳糖4-差向异构酶基因(ScGAL10)基因的酵母表达质粒的构建。
用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母低拷贝穿梭载体P413-ADH(Mumberg等(1995)Gene 156，p.119-122)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化自载体ScGAL-a23a(实施例2g中描述的)释放编码酿酒酵母双功能醛糖-1-差向异构酶/UDP半乳糖4-差向异构酶基因(ScGAL10)的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P413-ADH和编码ScGAL10的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒P413-ADH与ScGAL10片段连接到一起，产生酵母表达质粒。
实施例3k-用于醛糖-1-差向异构酶过表达的在来自酿酒酵母的ADH启动子和CYC1终止子控制下含有酿酒酵母醛糖-1-差向异构酶/UDP-半乳糖4-差向异构酶基因之变旋酶部分(ScGAL10Δ)基因的酵母表达质粒的构建。
已知基因GAL10是一种双功能酶，含有催化UDP-半乳糖转变成UDP-葡萄糖的差向异构酶部分以及催化α-半乳糖转变成β-半乳糖和反之亦然的变旋酶部分Majumdar等，2004。
用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母低拷贝穿梭载体P413-ADH(Mumberg等(1995)Gene 156，p.119-122)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化自载体ScGALΔ-a24a(实施例2h中描述的)释放编码酿酒酵母双功能醛糖-1-差向异构酶/UDP-半乳糖4-差向异构酶基因之变旋酶部分(ScGAL10Δ)的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P413-ADH和编码ScGAL10Δ的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒P413-ADH与ScGAL10Δ片段连接到一起，产生酵母表达质粒。
实施例4a-连同LlMR-36a、LlMR-38a、LlMR-40a或空P413-CYC质粒(Mumberg等，1995)任一含有PmXI-8a和PsXKS-14a质粒的酿酒酵母菌株的构建。
将200ng每一种质粒组合并使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔用于转化酿酒酵母酵母菌株BY4741(Euroscarf，Germany)。依照标准方案(Becker，D.M.和Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。在遗漏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸且补充有2％D-葡萄糖的固体合成完全失落培养基(solid synthetic complete dropout media)(SC-Ura，His，Leu)(Rose等，1990)上进行对经所有三种质粒转化的克隆的选择。将中等大小的原代克隆在SC-Ura，His，Leu上再划线，并分离下述每一项的一个菌落：经质粒LlMR-36a、PmXI-8a和PsXKS-14a转化的菌株T0062；经质粒LlMR-38a、PmXI-8a和PsXKS-14a转化的菌株T0063；经质粒LlMR-40a、PmXI-8a和PsXKS-14a转化的菌株T0065；和最终经质粒P413-CYC、PmXI-8a和PsXKS-14a转化的菌株T0067(这些质粒在实施例3中有描述；P413-CYC是Mumberg等，1995中描述的空质粒)。
实施例4b-通过酵母菌株T0062、T0063、T0065和T0067的生长曲线对D-木糖代谢的测量。
作为木糖代谢性酵母菌株的生长速率的变化来测量D-木糖代谢速率的变化。首先使四种菌株适应D-木糖代谢。在遗漏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸且补充有2％D-木糖和0.2％D-葡萄糖的液体合成完全失落培养基(SCX(+0.2％D-glc)-Ura，His，Leu)中分别接种每一种菌株。将培养物在以225RPM运行的摇床中于30℃温育1周。1周后，用遗漏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸且补充有2％D-木糖和0.02％D-葡萄糖的液体合成完全失落培养基(SCX(+0.02％D-glc)-Ura，His，Leu)将每一种培养物用于再接种新的培养物。将这些培养物如上所述再温育1周。通过以初始细胞滴度OD600＝0.006/ml接种补充有2％D-木糖的SCX-Ura，His，Leu来启动生长实验。将这些培养物如上所述温育。对于四种菌株每一种，间隔24小时四次采样等分试样，测量光密度OD600并确定生长曲线。使用初始延滞期后24-96小时时间间隔确定倍增时间(即指数生长期期间每ml的微生物数目倍增所花去的时间)。可以为四种菌株确定下面的生长数据：
  酵母菌株  比生长速率(μ)h-1   最终OD600ml-1
  T0067   0.058   0.110
  T0065   0.070   0.215
  T0063   0.079   0.441
  T0062   0.088   0.524
这些结果显示与不表达变旋酶的同基因菌株相比，当醛糖-1-差向异构酶与木糖异构酶和D-木酮糖激酶一起共表达时，菌株中约20％或更多的生长速率升高。将菌株T0056、T0063和T0062与不表达变旋酶的T0067比较。
特别地，菌株T0062显示生长速率升高超过50％。就同化的碳而言，在该重组酵母菌株中实现超过4倍的生物质增加。另外，在其它方面同基因的菌株中使用不同启动子来控制醛糖-1-差向异构酶证明碳流量的增加是启动子强度升高的结果。这显示了在D-木糖分解代谢的代谢途径中D-木糖异构化之前存在有瓶颈。
实施例5a-连同LlMR-36a或空P413-CYC质粒(Mumberg等，1995)任一含有ThXI-5a和PsXKS-14a质粒的酿酒酵母菌株的构建。
将200ng每一种质粒组合并使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔用于转化酿酒酵母酵母菌株BY4741(Euroscarf，Germany)。依照标准方案(Becker，D.M.和Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。在遗漏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸且补充有2％D-葡萄糖的固体合成完全失落培养基(SC-Ura，His，Leu)(Rose等，1990)上进行对经所有三种质粒转化的克隆的选择。将中等大小的原代克隆在SC-Ura，His，Leu上再划线，并分离下述每一项的一个菌落：经质粒LlMR-36a、ThXI-5a和PsXKS-14a转化的菌株T0085；和经质粒P413-CYC、ThXI-5a和PsXKS-14a转化的菌株T0086。
实施例5b-通过酵母菌株T0085和T0086的生长曲线对D-木糖代谢的测量。
作为木糖代谢性酵母菌株的生长速率的变化来测量D-木糖代谢速率的变化。首先使两种菌株适应D-木糖代谢。在遗漏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸且补充有2％D-木糖和0.2％D-葡萄糖的液体合成完全失落培养基(SCX(+0.2％D-glc)-Ura，His，Leu)中分别接种每一种菌株。将培养物在以225RPM运行的摇床中于30℃温育1周。1周后，用遗漏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸且补充有2％D-木糖和0.02％D-葡萄糖的液体合成完全失落培养基(SCX(+0.02％D-glc)-Ura，His，Leu)将每一种培养物用于再接种新的培养物。将这些培养物如上所述再温育1周。通过以初始细胞滴度OD600＝0.006/ml接种补充有2％D-木糖的SCX-Ura，His，Leu来启动生长实验。将这些培养物如上所述温育。对于四种菌株每一种，间隔24小时四次采样等分试样，测量光密度OD600并确定生长曲线。使用初始延滞期后24-96小时时间间隔确定倍增时间。可以为两种菌株确定下面的生长数据：
  酵母菌株  比生长速率(μ)h-1   最终OD600ml-1
  T0086   0.056   0.101
  T0085   0.067   0.172
这证明与不表达变旋酶的同基因菌株相比，当醛糖-1-差向异构酶与木糖异构酶和D-木酮糖激酶一起共表达时，能实现约20％的生长速率升高。将菌株T0085与不表达变旋酶的菌株T0086比较。
实施例6a-连同LlMR-38a或空P423-CYC质粒(Mumberg等，1995)任一含有PsXR-24a(或PsXR-25)、PsXDH-11a、和PsXKS-14a质粒的酿酒酵母菌株的构建。
将200ng每一种质粒组合并使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔用于转化酿酒酵母酵母菌株Y07202(Euroscarf，Germany)。依照标准方案(Becker和Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。在遗漏尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸和色氨酸且补充有2％D-葡萄糖的固体合成完全失落培养基(SC-Ura，His，Leu，Trp)(Rose等，1990)上进行对经所有四种质粒同时转化的克隆的选择。将中等大小的原代克隆在SC-Ura，His，Leu，Trp上再划线，并分离下述每一项的一个菌落：经质粒LlMR-38a、PsXR-24a、PsXDH-11a和PsXKS-14a转化的菌株T0114；经质粒P423-CYC、PsXR-24a、PsXDH-11a和PsXKS-14a转化的菌株T0117；经质粒LlMR-38a、PsXR-25a、PsXDH-11a和PsXKS-14a转化的菌株T0123；和经质粒P423-CYC、PsXR-25a、PsXDH-11a和PsXKS-14a转化的菌株T0126。
实施例6b-通过酵母菌株T0114、T0117、T0123和T0126的生长曲线对D-木糖代谢的测量。
作为木糖代谢性酵母菌株的生长速率的变化来测量D-木糖代谢速率的变化。首先使四种菌株适应D-木糖代谢。在遗漏尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸和色氨酸且补充有2％D-木糖和0.2％D-葡萄糖的液体合成完全失落培养基(SCX(+0.2％D-glc)-Ura，His，Leu，Trp)中分别接种每一种菌株。将培养物在以225RPM运行的摇床中于30℃温育1周。1周后，用遗漏尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸和色氨酸且补充有2％D-木糖和0.02％D-葡萄糖的液体合成完全失落培养基(SCX(+0.02％D-glc)-Ura，His，Leu，Trp)将每一种培养物用于再接种新的培养物。将这些培养物如上所述再温育1周。通过以初始细胞滴度OD600＝0.006/ml接种补充有2％D-木糖的SCX-Ura，His，Leu，Trp来启动生长实验。将这些培养物如上所述温育。对于四种菌株每一种，间隔24小时五次采样等分试样，测量光密度OD600并确定生长曲线。使用初始延滞期后24-120小时时间间隔确定倍增时间。可以为四种菌株确定下面的生长数据：
  酵母菌株  比生长速率(μ)h-1   最终OD600ml-1
  T0114   0.040   0.089
  T0117   0.033   0.055
  T0123   0.039   0.084
  T0126   0.034   0.059
这证明与不表达变旋酶的同基因菌株相比，当醛糖-1-差向异构酶与木糖还原酶、木酮糖脱氢酶和D-木酮糖激酶一起共表达时，能实现超过10％的生长速率升高。将菌株T0114与不表达变旋酶的菌株T0117比较，并将菌株T0123与不表达变旋酶的菌株T126比较。
在高拷贝(菌株T0114)或低拷贝(菌株T0123)质粒任一上表达树干毕赤氏酵母木糖还原酶的菌株之间测量不到显著差异。
实施例7a-连同LlMR-36a或空P413-CYC质粒(Mumberg等，1995)任一含有LpAraA、LpAraB和LpAraD质粒的酿酒酵母菌株的构建。
将200ng每一种质粒LpAraA、LpAraB和LpAraD(实施例3g、3h和3i中描述的)与LlMR-36a(实施例3f中描述的)或空质粒P413-CYC(Mumberg等，1995)任一组合并使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔用于转化酿酒酵母酵母菌株Y07202(Euroscarf，Germany)。依照标准方案(Becker，D.M.和Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。在遗漏尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸和色氨酸且补充有2％D-葡萄糖的固体合成完全失落培养基(SC-Ura，His，Leu，Trp)(Rose等，1990)上进行对经所有四种质粒转化的克隆的选择。将中等大小的原代克隆在SC-Ura，His，Leu，Trp上再划线，并分离携带醛糖-1-差向异构酶(LlMR)基因或空载体P413-CYC任一的每一种酵母菌株的一个菌落。
实施例7b-通过实施例7a中描述的酵母菌株的生长曲线对L-阿拉伯糖代谢的测量。
作为阿拉伯糖代谢性酵母菌株的生长速率的变化来测量L-阿拉伯糖代谢速率的变化。首先使两种菌株(实施例7a中描述的)适应L-阿拉伯糖代谢。在遗漏尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸和色氨酸且补充有2％L-阿拉伯糖和0.2％D-葡萄糖的液体合成完全失落培养基(SCA(+0.2％D-glc)-Ura，His，Leu，Trp)中分别接种每一种菌株。将培养物在以225RPM运行的摇床中于30℃温育1周。1周后，用遗漏尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸和色氨酸且补充有2％L-阿拉伯糖和0.02％D-葡萄糖的液体合成完全失落培养基(SCA(+0.02％D-glc)-Ura，His，Leu，Trp)将每一种培养物用于再接种新的培养物。将这些培养物如上所述再温育1周。通过以初始细胞滴度OD600＝0.006/ml接种补充有2％L-阿拉伯糖的SCA-Ura，His，Leu，Trp来启动生长实验。将这些培养物如上所述温育。对于两种菌株，间隔24小时五次采样等分试样，测量光密度OD600并确定生长曲线。使用初始延滞期后24-120小时时间间隔确定倍增时间。
与不表达变旋酶的同基因菌株相比，当醛糖-1-差向异构酶与L-阿拉伯糖异构酶(LpAraA)、L-核酮糖激酶(LpAraB)和L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶(LpAraD)一起共表达时，实现生长速率和累积酵母生物质的升高。
实施例8a-用于醛糖-1-差向异构酶过表达的连同在ADH启动子控制下编码ScGAL10的质粒含有PmXI-8a和PsXKS-14a质粒的酿酒酵母菌株的构建。
将200ng三种质粒每一种组合并使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔用于转化酿酒酵母酵母菌株BY4741(Euroscarf，Germany)。依照标准方案(Becker和Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。在遗漏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸且补充有2％D-葡萄糖的固体合成完全失落培养基(SC-Ura，His，Leu)(Rose等，1990)上进行对经所有三种质粒转化的克隆的选择。包含所有三种质粒的克隆会在SC-Ura，His，Leu上生长。
实施例8b-用于醛糖-1-差向异构酶过表达的连同在ADH启动子控制下编码ScGAL10Δ的质粒含有PmXI-8a和PsXKS-14a质粒的酿酒酵母菌株的构建。
将200ng三种质粒每一种组合并使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔用于转化酿酒酵母酵母菌株BY4741(Euroscarf，Germany)。依照标准方案(Becker和Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。在遗漏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸且补充有2％D-葡萄糖的固体合成完全失落培养基(SC-Ura，His，Leu)(Rose等，1990)上进行对经所有三种质粒转化的克隆的选择。包含所有三种质粒的克隆会在SC-Ura，His，Leu上生长。
实施例8c-通过实施例8a和8b中描述的酵母菌株的生长曲线对D-木糖代谢的测量。
作为木糖代谢性酵母菌株的生长速率的变化来测量D-木糖代谢速率的变化。首先使两种菌株适应D-木糖代谢。首先，在遗漏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸且补充有2％D-木糖和0.2％D-葡萄糖的液体合成完全失落培养基(SCX(+0.2％D-glc)-Ura，His，Leu)中分别接种，并在以225RPM运行的摇床中于30℃温育1周。此后，在遗漏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸且补充有2％D-木糖和0.02％D-葡萄糖的液体合成完全失落培养基(SCX(+0.02％D-glc)-Ura，His，Leu)中将每一种培养物用于再接种新的培养物。再次，将每一种培养物在以225RPM运行的摇床中于30℃温育1周。通过以初始细胞滴度OD600＝0.006/ml接种补充有2％D-木糖的SCX-Ura，His，Leu来启动生长实验。可以在实验中包括实施例4a中描述的菌株T0067(经质粒P413-CYC、PmXI-8a和PsXKS-14a转化的)，充当同基因对照，用于测量没有ScGAL10或ScGAL10Δ基因存在的情况中的生长。将三种培养物每一种如上所述温育，并间隔24小时四次采样等分试样。对于每一种菌株，测量光密度OD600并基于此来确定生长曲线。使用初始延滞期后24-96小时时间间隔确定倍增时间。与未经异源酵母GAL10表达衍生物(例如ScGAL10或ScGAL10Δ)转化的同基因T0067菌株相比，在表达ScGAL10或ScGAL10Δ任一的这两种酵母菌株中展现了比生长速率和累积酵母生物质的升高。
实施例9a-基于NCBI登录码DQ130086版本1的用于表达构建物稳定整合入酵母Rdn1基因座的左侧翼区(LFRRdn1)的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增容许稳定整合入RDN1之RDN37-2部分(LFRRdn1)的酿酒酵母DNA片段。在LFRRdn1碎片侧翼导入靠近DNA片段的PmeI限制性位点和远离DNA片段的SalI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和20秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在1.0％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离433bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为Rdn1-L-a15c(+)。
实施例9b-基于NCBI登录码DQ130089版本1的用于表达构建物稳定整合入酵母Rdn1基因座的右侧翼区(RFRRdn1)的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 21和SEQ ID NO 22鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增容许稳定整合入RDN1之RDN37-2部分(RFRRdn1)的酿酒酵母DNA片段。在RFRRdn1碎片侧翼导入靠近DNA片段的XhoI限制性位点和远离DNA片段的PmeI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(FinnzymesOy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和20秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在1.0％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离503bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为Rdn1-R-a16b(+)。
实施例9c-基于NCBI登录码Z72557版本1的用于表达构建物稳定整合入酵母MIG1基因座的左侧翼区(LFRMig1-2)的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增容许稳定整合入MIG1基因座(LFRMig1-2)的酿酒酵母DNA片段。在LFRMig1-2碎片侧翼导入靠近DNA片段的PmeI限制性位点和远离DNA片段的SalI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和20秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在1.0％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离507bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为Mig1-L2-a19h(+)。
实施例9d-基于NCBI登录码Z72556版本1的用于表达构建物稳定整合入酵母MIG1基因座的右侧翼区(RFRMig1-2)的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增容许稳定整合入MIG1基因座(RFRMig1-2)的酿酒酵母DNA片段。在RFRMig1-2碎片侧翼导入靠近DNA片段的XhoI限制性位点和远离DNA片段的PmeI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和20秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在1.0％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离500bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为Mig1-R2-a20a(-)。
实施例10a-容许同源重组入酵母基因组的含有Rdn1基因座之酿酒酵母左和右侧翼区(LFRRdn1+RFRRdn1)的酵母整合质粒的构建。
用XhoI和PsmOMI消化质粒Rdn1-L-a15c(+)(实施例9a中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用XhoI和NotI消化质粒Rdn1-R-a16b(+)(实施例9b中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒Rdn1-L-a15c(+)和源自质粒Rdn1-R-a16b(+)的含有RFRRdn1的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒Rdn1-L-a15c(+)与RFRRdn1DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为Rdn1-LR-b5a。
实施例10b-容许同源重组入酵母基因组的含有Mig1基因座之酿酒酵母左和右侧翼区(LFRMig1-2+RFRMig1-2)的酵母整合质粒的构建。
用NotI和XbaI消化质粒Mig1-L2-a19h(+)(实施例9c中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用SpeI和NotI消化质粒Mig1-R2-a20a(-)(实施例9d中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒Mig1-L2-a19h(+)和源自质粒Mig1-R2-a20a(-)的含有RFRMig1-2的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒Mig1-L2-a19h(+)与RFRMig1-2DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为Mig1-LR2-b7a。
实施例11-以loxP为侧翼的具有kanMX或nat1基因任一的抗生素标志基因盒的构建。
用Xba和XhoI消化质粒pUG6(Güldener等，1996)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用SpeI和SalI消化质粒pAG25(Goldstein和McCusker，1999)和pUG6。通过电泳将所得线性化质粒pUG6和含有nat1基因(源自质粒pAG25的)和kanMX基因(源自质粒pUG6的)的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒pUG6与nat1编码DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。此质粒命名为pUG6R25-b2a。类似地，将线性化质粒pUG6与kanMX编码DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。此质粒命名为pUG6R6-b1a。
实施例12a-容许同源重组入酵母基因组及随后使用抗生素诺尔丝菌素选择的含有Rdn1基因座之酿酒酵母左侧翼区(LFRRdn1)、以loxP为侧翼的抗生素标志基因nat1和Rdn1基因座之右侧翼区(RFRRdn1)的酵母整合质粒的构建。
用NotI消化质粒Rdn1-LR-b5a(实施例10a中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用NotI消化质粒pUG6R25-b2a(实施例11中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒Rdn1-LR-b5a和含有以loxP为侧翼的nat1基因的DNA片段(源自质粒pUG6R25-b2a的)在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒Rdn1-LR-b5a与以loxP为侧翼的nat1基因DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例12b-容许同源重组入酵母基因组及随后使用抗生素G418选择的含有Mig1基因座之酿酒酵母左侧翼区(LFRMig1-2)、以loxP为侧翼的抗生素标志基因kanMX和Mig1基因座之右侧翼区(RFRMig1-2)的酵母整合质粒的构建。
用NotI消化质粒Mig1-LR2-b7a(实施例10b中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用NotI消化质粒pUG6R6-b1a(实施例11中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒Mig1-LR2-b7a和含有以loxP为侧翼的kanMX基因的DNA片段(源自质粒pUG6R6-b1a的)在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒Mig1-LR2-b7a与以loxP为侧翼的kanMX基因DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例13a-基于NCBI登录码Z21487版本1的含有可读框YBR197C之转录终止子和基因PGI1之启动子的DNA片段的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 27和SEQ ID NO 28鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增覆盖可读框YBR197C之终止密码子和基因PGI1之ATG密码子之间的区域的酿酒酵母DNA片段(P-pgi)。在基因间区侧翼导入靠近DNA片段的SalI限制性位点和远离DNA片段的AvrII限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和30秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离1318bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为P-pgi-a1a(+)。
实施例13b-基于NCBI登录码Z49209版本1的含有可读框YDR051C之转录终止子和基因TPI1之启动子的DNA片段的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 29和SEQ ID NO 30鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增覆盖可读框YDR051C之终止密码子和基因TPI1之ATG密码子之间的区域的酿酒酵母DNA片段(P-tpi)。在基因间区侧翼导入靠近DNA片段的SalI限制性位点和远离DNA片段的AvrII限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和30秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离599bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为P-tpi-a2d(+)。
实施例13c-基于NCBI登录码Z49702版本1的含有基因YKU80之转录终止子和基因PGM2之启动子的DNA片段的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 31和SEQ ID NO 32鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增覆盖基因YKU80之终止密码子和基因PGM2之ATG密码子之间的区域的酿酒酵母DNA片段(P-pgm)。在基因间区侧翼导入靠近DNA片段的SalI限制性位点和远离DNA片段的AvrII限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和30秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离710bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为P-pgm-a10a(+)。
实施例13d-基于NCBI登录码Z73217版本1的含有基因STU2之转录终止子和基因PDC1之启动子的DNA片段的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 33和SEQ ID NO 34鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增覆盖基因STU2之终止密码子和基因PDC1之ATG密码子之间的区域的酿酒酵母DNA片段(P-pdc)。在基因间区侧翼导入靠近DNA片段的SalI限制性位点和远离DNA片段的AvrII限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和30秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离971bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为P-pdc-a9f(+)。
实施例13e-基于NCBI登录码Z28060版本1的含有基因MPE1之转录终止子和基因FBA1之启动子的DNA片段的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 35和SEQ ID NO 36鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增覆盖基因MPE1之终止密码子和基因FBA1之ATG密码子之间的区域的酿酒酵母DNA片段(P-fba)。在基因间区侧翼导入靠近DNA片段的SalI限制性位点和远离DNA片段的AvrII限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和30秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离646bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为P-fba-a7b(+)。
实施例13f-基于NCBI登录码Z26877版本1的含有可读框YKL151C之转录终止子和基因GPM1之启动子的DNA片段的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增覆盖可读框YKL151C之终止密码子和基因GPM1之ATG密码子之间的区域的酿酒酵母DNA片段(P-gpm)。在基因间区侧翼导入靠近DNA片段的SalI限制性位点和远离DNA片段的AvrII限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和30秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离547bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为P-gpm-a8a(+)。
实施例14a-基于NCBI登录码X73224版本1的来自酿酒酵母菌株D0002的TKL1基因的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 39和SEQ ID NO 40鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增完整酿酒酵母TKL1基因(ScTKL1)。在ScTKL1基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的XbaI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和90秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离2059bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为ScTKL 1-a25a(+)。
实施例14b-基于NCBI登录码X61377版本1的来自酿酒酵母菌株D0002的XKS1基因的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 42鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增完整酿酒酵母XKS1基因(ScXKS1)。在ScXKS1基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和90秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离2059bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为ScXKS1-G2。
实施例14c-基于NCBI登录码X15953版本1的来自酿酒酵母菌株D0002的包括187bp转录终止子的TAL1基因的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 43和SEQ ID NO 44鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增完整酿酒酵母TAL1基因连同187bp转录终止子序列(ScTAL1+T)。在ScXKS1+T基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离转录终止子序列的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和60秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离1210bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为ScTAL1+T-a22a(+)。
实施例14d-基于NCBI登录码X94335版本1的来自酿酒酵母菌株D0002的包括206bp转录终止子的RKI1基因的TOPO克隆。
使用由SEQ ID NO 45和SEQ ID NO 46鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的DNA PCR扩增完整酿酒酵母RKI1基因连同206bp转录终止子序列(ScRKI1+T)。在ScRKI1+T基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离转录终止子序列的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，35个循环的30秒96℃、30秒57℃、和60秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离998bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为ScRKI1+T-a21c(+)。
实施例15a-含有由P-pgi启动子在ScXKS1基因前面构成的酵母表达盒的质粒的构建。
用AvrII和XhoI消化质粒P-pgi-a1a(+)(实施例13a中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用NheI和XhoI消化质粒ScXKS1-G2(实施例14b中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒P-pgi-a1a(+)和源自质粒ScXKS1-G2的含有ScXKS1的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒P-pgi-a1a(+)与ScXKS1编码DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为P-pgi+ScXKS1-b38a。
实施例15b-含有由P-fba启动子在PmXI基因前面构成的酵母表达盒的质粒的构建。
用AvrII和XhoI消化质粒P-fba-a7b(+)(实施例13e中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用NheI和XhoI消化携带PmXI基因的质粒0717049pGA15(实施例1b中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒P-fba-a7b(+)和源自质粒0717049pGA15的含有PmXI的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒P-fba-a7b(+)与PmXI编码DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为P-fba+PmXI-b34c。
实施例15c-含有由P-gpm启动子在ScRKI1+T基因前面构成的酵母表达盒的质粒的构建。
用AvrII和XhoI消化质粒P-gpm-a8a(+)(实施例13f中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用NheI和XhoI消化质粒ScRKI1+T-a21c(+)(实施例13d中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒P-gpm-a8a(+)和源自质粒ScRKI1+T-a21c(+)的含有ScRKI1+T的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒P-gpm-a8a(+)与ScRKI1+T编码DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为P-gpm+ScRKI1+T-b15a。
实施例15d-含有由P-tpi启动子在LIMR基因前面构成的酵母表达盒的质粒的构建。
用AvrII和XhoI消化质粒P-tpi-a2d(+)(实施例13b中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用NheI和XhoI消化质粒0717050pGA14(实施例1a中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒P-tpi-a2d(+)和源自质粒0717050pGA14的含有LlMR的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒P-tpi-a2d(+)与LlMR编码DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为P-tpi+LlMR-b39a。
实施例15e-含有由P-pgm启动子在ScTKL1基因前面构成的酵母表达盒的质粒的构建。
用AvrII和XhoI消化质粒P-pgm-a10a(+)(实施例13c中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用XbaI和XhoI消化质粒ScTKL1-a25a(+)(实施例14a中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒P-pgm-a10a(+)和源自质粒ScTKL1-a25a(+)的含有ScTKL1的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒P-pgm-a10a(+)与ScTKL1编码DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为P-pgm+ScTKL 1-b67a。
实施例15f-含有由P-pdc启动子在TAL1+T基因前面构成的酵母表达盒的质粒的构建。
用AvrII和XhoI消化质粒P-pdc-a9f(+)(实施例13d中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用NheI和XhoI消化质粒ScTAL1+T-a22a(+)(实施例14c中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒P-pdc-a9f(+)和源自质粒ScTAL1+T-a22a(+)的含有ScTAL1+T的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒P-pdc-a9f(+)与ScTAL1+T编码DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为P-pdc+ScTAL1+T-b26a。
实施例16a-具有P-pgi+ScXKS和P-fba+PmXI串联酵母表达盒的质粒的构建。
用XhoI和ApaI消化质粒pgi+ScXKS1-b38a(实施例15a中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用SalI和ApaI消化质粒P-fba+PmXI-b34c(实施例15b中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒pgi+ScXKS1-b38a和源自质粒P-fba+PmXI-b34c的含有P-fba+PmXI表达盒的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒pgi+ScXKS1-b38a与含有P-fba+PmXI表达盒的DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例16b-具有P-tpi+LlMR和P-pgm+ScTKL1串联酵母表达盒的质粒的构建。
用XhoI和ApaI消化质粒P-tpi+LlMR-b39a(实施例15d中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用SalI和ApaI消化质粒P-pgm+ScTKL1-b67a(实施例15e中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒P-tpi+LlMR-b39a和源自质粒P-pgm+ScTKL1-b67a的含有P-pgm+ScTKL1表达盒的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒P-tpi+LlMR-b39a与含有P-pgm+ScTKL1表达盒的DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例17a-具有P-pgi+ScXKS、P-fba+PmXI和P-gpm+ScRKI1+T串联酵母表达盒的质粒的构建。
用XhoI和ApaI消化含有串联P-pgi+ScXKS和P-fba+PmXI酵母表达盒的质粒(实施例16a中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用SalI和ApaI消化质粒P-gpm+ScRKI1+T-b15a(实施例15c中描述的)。通过电泳将所得含有串联P-pgi+ScXKS和P-fba+PmXI酵母表达盒的线性化质粒和源自质粒P-gpm+ScRKI1+T-b15a的含有P-gpm+ScRKI1+T表达盒的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将含有串联P-pgi+ScXKS和P-fba+PmXI酵母表达盒的线性化质粒与含有P-gpm+ScRKI1+T表达盒的DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例17b-具有P-tpi+LlMR、P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T串联酵母表达盒的质粒的构建。
用XhoI和ApaI消化含有串联P-tpi+LlMR和P-pgm+ScTKL1酵母表达盒的质粒(实施例16b中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用SalI和ApaI消化质粒P-pdc+ScTAL1+T-b26a(实施例15f中描述的)。通过电泳将所得含有串联P-tpi+LlMR和P-pgm+ScTKL1酵母表达盒的线性化质粒和源自质粒P-pdc+ScTAL1+T-b26a的含有P-pdc+ScTAL1+T表达盒的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将含有串联P-tpi+LlMR和P-pgm+ScTKL1酵母表达盒的线性化质粒与含有P-pdc+ScTAL1+T表达盒的DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例17c-具有P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T串联酵母表达盒的质粒的构建。
用XhoI和ApaI消化质粒P-pgm+ScTKL1-b67a(实施例15e中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，用SalI和ApaI消化质粒P-pdc+ScTAL1+T-b26a(实施例15f中描述的)。通过电泳将所得线性化质粒P-pgm+ScTKL1-b67a和源自质粒P-pdc+ScTAL1+T-b26a的含有P-pdc+ScTAL1+T表达盒的DNA片段在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒P-pgm+ScTKL1-b67a与含有P-pdc+ScTAL1+T表达盒的DNA片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例18a-容许同源重组入Rdn1基因座及随后使用抗生素诺尔丝菌素选择的包含P-pgi+ScXKS、P-fba+PmXI和P-gpm+ScRKI1+T串联酵母表达盒的酵母整合质粒的构建。
用XhoI消化容许同源重组入Rdn1基因座及随后在补充有诺尔丝菌素的生长培养基上选择的酵母整合质粒(实施例12a中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上通过电泳将所得线性化质粒与未切割的质粒分开，并在此后分离。同样地，用XhoI和SalI消化携带串联P-pgi+ScXKS、P-fba+PmXI和P-gpm+ScRKI1+T酵母表达盒的质粒(实施例17a中描述的)。使用0.7％低熔点琼脂糖凝胶通过电泳将串联P-pgi+ScXKS、P-fba+PmXI和P-gpm+ScRKI1+T酵母表达盒片段与载体主干分开，并在此后分离。将线性化整合质粒与串联P-pgi+ScXKS、P-fba+PmXI和P-gpm+ScRKI1+T酵母表达盒片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例18b-容许同源重组入Mig1基因座及随后使用抗生素G418选择的包含P-tpi+LlMR、P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T串联酵母表达盒的酵母整合质粒的构建。
用XhoI消化容许同源重组入Mig1基因座及随后在补充有G418的生长培养基上选择的酵母整合质粒(实施例12b中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上通过电泳将所得线性化质粒与未切割的质粒分开，并在此后分离。同样地，用XhoI和SalI消化P-tpi+LlMR、P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T串联酵母表达盒(实施例17b中描述的)。使用0.7％低熔点琼脂糖凝胶通过电泳将串联P-tpi+LlMR、P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T酵母表达盒片段与载体主干分开，并在此后分离。将线性化整合质粒与串联P-tpi+LlMR、P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T酵母表达盒片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例18c-容许同源重组入Mig1基因座及随后使用抗生素G418选择的包含P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T串联酵母表达盒的酵母整合质粒的构建。
用XhoI消化容许同源重组入Mig1基因座及随后在补充有G418的生长培养基上选择的酵母整合质粒(实施例12b中描述的)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上通过电泳将所得线性化质粒与未切割的质粒分开，并在此后分离。同样地，用XhoI和SalI消化P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T串联酵母表达盒(实施例17c中描述的)。使用0.7％低熔点琼脂糖凝胶通过电泳将串联P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T酵母表达盒片段与载体主干分开，并在此后分离。将线性化整合质粒与串联P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T酵母表达盒片段连接到一起，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。
实施例19-通过重组入Rdn1基因座及随后使用抗生素诺尔丝菌素的选择的含有P-pgi+ScXKS、P-fba+PmXI和P-gpm+ScRKI1+T串联酵母表达盒的酿酒酵母菌株的构建。
用PmeI消化5μg包含P-pgi+ScXKS、P-fba+PmXI和P-gpm+ScRKI1+T串联酵母表达盒的整合质粒(实施例18a中描述的)，并随后使用2.5个体积的96％乙醇来沉淀。丢弃液体后，将DNA团粒用70％乙醇清洗，干燥并用5μl水再溶解。使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔将再溶解的经消化质粒用于转化酿酒酵母酵母菌株BY4741(Euroscarf，Germany)。依照标准方案(Becker和Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。通过在补充有100mg/L ClonNAT(Werner BioAgents，Jena，Germany)的YPD固体生长培养基上涂板来进行对经P-pgi+ScXKS、P-fba+PmXI和P-gpm+ScRKI1+T串联酵母表达盒稳定转化的克隆的选择。涂板前，容许经转化细胞在液体YPD中于30℃生长4小时。在选择性培养基上涂板后，将板于30℃温育3天，分离中等大小的菌落并在补充有100mg/LClonNAT的固体YPD上再划线并随后分离克隆。
实施例20a-通过重组入Mig1基因座及随后使用抗生素G418的选择的包括P-tpi+LlMR、P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T串联酵母表达盒的含有P-pgi+ScXKS、P-fba+PmXI和P-gpm+ScRKI1+T串联表达盒的酿酒酵母菌株的构建。
用PmeI消化5μg包含P-tpi+LlMR、P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T串联酵母表达盒的整合质粒(实施例18b中描述的)，并随后使用2.5个体积的96％乙醇来沉淀。丢弃液体后，将DNA团粒用70％乙醇清洗，干燥并用5μl水再溶解。使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔将再溶解的经消化质粒用于转化实施例19中描述的酿酒酵母酵母菌株。依照标准方案(Becker和Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。通过在补充有200mg/L遗传霉素(Life Technologies)的YPD固体生长培养基上涂板来进行对经P-tpi+LlMR、P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T串联酵母表达盒稳定转化的克隆的选择。涂板前，容许经转化细胞在液体YPD中于30℃生长4小时。在选择性培养基上涂板后，将板于30℃温育3天，分离中等大小的菌落并在补充有200mg/L遗传霉素的固体YPD上再划线并随后分离克隆。
实施例20b-通过重组入Mig1基因座及随后使用抗生素G418的选择的包括P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T串联酵母表达盒的含有P-pgi+ScXKS、P-fba+PmXI和P-gpm+ScRKI1+T串联表达盒的酿酒酵母菌株的构建。
用PmeI消化5μg包含P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T串联酵母表达盒的整合质粒(实施例18c中描述的)，并随后使用2.5个体积的96％乙醇来沉淀。丢弃液体后，将DNA团粒用70％乙醇清洗，干燥并用5μl水再溶解。使用BioradGene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔将再溶解的经消化质粒用于转化实施例19中描述的酿酒酵母酵母菌株。依照标准方案(Becker和Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。通过在补充有200mg/L遗传霉素(Life Technologies)的YPD固体生长培养基上涂板来进行对经P-pgm+ScTKL1和P-pdc+ScTAL1+T串联酵母表达盒稳定转化的克隆的选择。涂板前，容许经转化细胞在液体YPD中于30℃生长4小时。在选择性培养基上涂板后，将板于30℃温育3天，分离中等大小的菌落并在补充有200mg/L遗传霉素的固体YPD上再划线并随后分离克隆。
实施例21a-通过实施例20a和20b中描述的酵母菌株的生长曲线对D-木糖代谢的测量。
作为木糖代谢性酵母菌株的生长速率的变化来测量D-木糖代谢速率的变化。首先使两种菌株(实施例20a和20b中描述的)适应D-木糖代谢。在补充有0.2％葡萄糖的液体酵母胨木糖(YPX)中分别接种每一种菌株。将培养物在以225RPM运行的摇床中于30℃温育1周。1周后，用补充有0.02％葡萄糖的YPX将每一种培养物用于再接种新的培养物。将两种培养物如上所述再温育1周。通过以初始细胞滴度OD600＝0.006/ml接种YPX来启动生长实验。将培养物如上所述温育。对于两种菌株，间隔24小时五次采样等分试样，测量光密度OD600并确定生长曲线。使用初始延滞期后24-120小时时间间隔确定倍增时间。与不表达变旋酶的类似菌株相比，连同木糖异构酶(PmXI)、D-木酮糖激酶(ScXKS)、核糖-5-磷酸酮醇异构酶(ScRKI1+T)、转酮醇酶(ScTKL1)和转醛醇酶(ScTAL1+T)一起表达醛糖-1-差向异构酶(LlMR)的菌株展现升高的生长速率。
实施例21b-实施例20a和20b中描述的酵母菌株的D-木糖代谢的测量。
使用带挡板的摇瓶在液体酵母胨木糖(YPX)中分别接种两种适应D-木糖代谢的酵母菌株(实施例21a中描述的)。将培养物在以225RPM运行的摇床中于30℃温育直至OD600约为1.0。此后，通过离心来收获培养物并使用具有两个侧颈的摇瓶在20ml补充有50g/L D-木糖的液体酵母胨中重悬浮，最终细胞浓度为OD600＝5。用含有插入的发酵锁的塞子密封摇瓶。给侧颈配上不透气的可重新密封的橡胶塞。在以100RPM运行的摇床中于30℃进行发酵。使用皮下针和注射器穿过可重新密封的橡胶塞取出样品，并使用2M NaOH调节至pH＝9.0。乙醇浓度使用Megazyme乙醇测定试剂盒K-ETOH(MegazymeInternational，Ireland)依照制造商的用法说明和用适宜的样品稀释液来测量。两种菌株每一种的发酵进展通过将乙醇浓度作为时间的函数绘图来确定。速率以好氧生长和厌氧发酵之间的初始两期转变之后曲线之线性部分的斜率给出。表达醛糖-1-差向异构酶的菌株展现出与没有这种基因的同源菌株相比更快的发酵速率。
参考文献
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通过述及将上文说明书中提到的所有出版物收入本文。对本发明的所述方法和系统的各种更改和变异对于本领域技术人员会是显然的，不偏离本发明的范围和精神。虽然已经连同具体的优选实施方案一起描述了本发明，但是应当理解要求保护的发明不应当过度限于此类具体实施方案。确实，对于生物化学和分子生物学或相关领域的技术人员显而易见的对本发明所述实施方式的各种更改意图在所附权利要求的范围内。
序列表
>SEQ ID NO 1(AAD20245)：
由此核苷酸序列编码的氨基酸序列显示为sEQ ID No 47。
1  GAATTCCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGGAGCTAGCC
    M   A   T   F   T   I   S   K   E   S   L   P   F   R   A   D
49 ATG GCT ACT TTT ACA ATC AGC AAG GAG AGC CTG CCA TTC AGA GCA GAT
    K   S   I   S   Q   I   T   L   S   N   E   R   L   T   I   V
97 AAA TCA ATT TCC CAA ATT ACT TTG TCA AAT GAA AGA TTA ACA ATC GTC
    V   H   D   Y   G   A   R   A   H   Q   L   L   T   P   D   K
145GTA CAC GAC TAT GGA GCT AGA GCC CAC CAG CTG TTG ACA CCT GAC AAA
    N   G   T   F   E   N   I   L   L   S   K   N   D   S   E   T
193AAC GGT ACA TTT GAA AAC ATC TTG TTG TCC AAG AAT GAT TCT GAA ACT
    Y   A   N   D   G   G   Y   Y   G   V   I   C   G   P   V   A
241TAT GCA AAT GAT GGC GGC TAT TAT GGT GTT ATT TGT GGT CCT GTT GCT
    G   R   I   S   G   A   T   Y   D   S   V   S   L   E   A   N
289GGC AGA ATA TCT GGA GCT ACT TAT GAC TCA GTG AGC TTA GAA GCC AAC
    E   G   K   N   N   L   H   S   G   S   H   G   W   E   R   Q
337GAG GGC AAA AAT AAC TTA CAT TCA GGC TCA CAC GGT TGG GAA AGA CAA
    F   W   S   Y   E   T   F   E   T   A   S   S   L   G   I   K
385TTT TGG AGC TAT GAG ACA TTT GAG ACT GCT TCT TCA TTG GGA ATA AAA
    L   S   L   R   D   E   E   S   G   F   P   G   Q   I   Q   A
433CTG TCA TTG AGA GAC GAA GAA TCT GGT TTT CCA GGC CAG ATT CAA GCA
    E   V   T   Y   K   L   T   D   N   K   L   E   V   T   I   S
481GAA GTA ACC TAC AAA TTA ACC GAT AAT AAA CTG GAA GTA ACA ATA AGC
    G   L   S   V   T   D   T   V   F   N   P   A   W   H   P   Y
529GGA TTA TCA GTT ACT GAT ACT GTT TTT AAT CCT GCC TGG CAC CCT TAT
    F   N   L   S   A   E   L   S   T   T   H   E   H   F   I   Q
577TTC AAT CTT AGC GCA GAA CTT AGC ACC ACT CAC GAA CAC TTC ATA CAA
      A   N   V   D   F   L   V   E   T   N   Q   E   N   I   P   T
625  GCC AAC GTG GAC TTT TTA GTA GAA ACC AAT CAG GAG AAC ATC CCT ACC
      G   R   L   L   T   V   D   D   S   S   Y   S   I   K   E   S
673  GGA AGA CTG CTT ACT GTT GAT GAT TCA AGC TAT TCT ATT AAA GAA AGC
      V   S   I   K   K   L   L   K   D   N   P   E   G   L   D   D
721  GTC TCC ATT AAG AAG TTG TTG AAG GAT AAC CCA GAA GGT TTG GAC GAT
      C   F   V   F   N   P   K   G   D   K   S   L   M   L   Y   D
769  TGC TTT GTT TTC AAT CCA AAA GGA GAC AAA TCC CTT ATG TTA TAC GAT
      P   L   S   G   R   K   L   V   A   Q   T   D   R   Q   A   V
817  CCA CTG AGC GGT AGA AAA TTG GTT GCA CAA ACT GAT CGT CAA GCC GTC
      V   I   Y   T   A   T   N   P   E   I   E   S   M   I   N   G
865  GTT ATT TAC ACC GCA ACG AAC CCA GAG ATT GAA TCA ATG ATA AAT GGT
      R   P   M   S   K   N   R   G   I   A   I   E   F   Q   E   I
913  AGA CCT ATG TCC AAA AAT AGA GGC ATA GCC ATT GAG TTT CAA GAA ATC
      P   D   L   V   H   H   P   E   W   G   T   I   E   L   K   A
961  CCG GAT CTT GTT CAC CAC CCA GAA TGG GGA ACC ATT GAA TTG AAA GCT
      G   Q   K   K   T   F   I   T   E   Y   L   F   T   T   N   *
1009 GGC CAA AAG AAA ACT TTT ATC ACT GAG TAT TTG TTC ACC ACT AAC TAG
1057 CCTAGGCTCGAGGAATTC
>SEQ ID NO 2：
由此核苷酸序列编码的氨基酸序列显示为SEQ ID No 48。
1   GAATTCCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGGAGCTAGCC
     M   A   K   E   Y   F   P   Q   I   Q   K   I   K   F   E   G
49  ATG GCC AAA GAA TAC TTT CCA CAA ATA CAG AAG ATT AAG TTT GAA GGC
     K   D   S   K   N   P   L   A   F   H   Y   Y   D   A   E   K
97  AAA GAT TCA AAG AAT CCA CTG GCC TTC CAT TAT TAT GAT GCA GAA AAG
     E   V   M   G   K   K   M   K   D   W   L   R   F   A   M   A
145 GAA GTG ATG GGT AAG AAA ATG AAA GAC TGG CTG AGA TTC GCT ATG GCT
     W   W   H   T   L   C   A   E   G   A   D   Q   F   G   G   G
193 TGG TGG CAT ACC TTA TGT GCT GAA GGT GCA GAT CAA TTC GGT GGC GGT
     T   K   S   F   P   W   N   E   G   T   D   A   I   E   I   A
241 ACG AAG AGC TTT CCT TGG AAT GAG GGT ACT GAT GCA ATA GAA ATA GCA
      K   Q   K   V   D   A   G   F   E   I   M   Q   K   L   G   I
289  AAA CAA AAG GTT GAC GCA GGC TTT GAG ATT ATG CAA AAG CTG GGT ATT
      P   Y   Y   C   F   H   D   V   D   L   V   S   E   G   N   S
337  CCT TAT TAT TGT TTT CAT GAC GTG GAC TTG GTA TCC GAA GGA AAT AGC
      I   E   E   Y   E   S   N   L   K   A   V   V   A   Y   L   K
385  ATC GAA GAG TAC GAA AGC AAT CTG AAG GCT GTC GTT GCA TAT CTG AAG
      E   K   Q   K   E   T   G   I   K   L   L   W   S   T   A   N
433  GAG AAG CAA AAG GAA ACG GGT ATA AAG TTG TTA TGG TCA ACA GCA AAT
      V   F   G   H   K   R   Y   M   N   G   A   S   T   N   P   D
481  GTC TTC GGT CAT AAA AGA TAC ATG AAC GGT GCC TCA ACA AAC CCA GAC
      F   D   V   V   A   R   A   I   V   Q   I   K   N   A   I   D
529  TTT GAC GTT GTG GCA CGT GCA ATA GTT CAA ATT AAG AAC GCT ATC GAT
      A   G   I   E   L   G   A   E   N   Y   V   F   W   G   G   R
577  GCT GGC ATA GAG TTG GGC GCC GAG AAT TAC GTT TTC TGG GGT GGC CGT
      E   G   Y   M   S   L   L   N   T   D   Q   K   R   E   K   E
625  GAG GGT TAT ATG AGC CTT TTA AAT ACG GAT CAA AAA CGT GAG AAG GAA
      H   M   A   T   M   L   T   M   A   R   D   Y   A   R   S   K
673  CAC ATG GCT ACA ATG CTT ACG ATG GCC CGT GAC TAT GCT AGA TCA AAA
      G   F   K   G   T   F   L   I   E   P   K   P   M   E   P   T
721  GGT TTT AAG GGT ACA TTC TTG ATA GAA CCT AAA CCG ATG GAA CCA ACA
      K   H   Q   Y   D   V   D   T   E   T   A   I   G   F   L   K
769  AAG CAC CAA TAT GAT GTA GAT ACC GAA ACC GCA ATT GGA TTT TTG AAG
      A   H   N   L   D   K   D   F   K   V   N   I   E   V   N   H
817  GCA CAT AAC TTG GAC AAG GAT TTC AAG GTA AAC ATA GAA GTA AAT CAT
      A   T   L   A   G   H   T   F   E   H   E   L   A   C   A   V
865  GCA ACG TTG GCA GGT CAT ACT TTC GAA CAC GAA TTA GCT TGC GCA GTA
      D   A   G   M   L   G   S   I   D   A   N   R   G   D   Y   Q
913  GAT GCT GGA ATG TTA GGT AGC ATC GAT GCA AAT AGA GGT GAT TAC CAG
      N   G   W   D   T   D   Q   F   P   I   D   Q   Y   E   L   V
961  AAT GGC TGG GAT ACT GAT CAA TTC CCA ATA GAC CAG TAT GAA CTG GTA
      Q   A   W   M   E   I   I   R   G   G   G   F   V   T   G   G
1009 CAG GCC TGG ATG GAA ATA ATC CGT GGC GGT GGT TTC GTG ACA GGT GGA
      T   N   F   D   A   K   T   R   R   N   S   T   D   L   E   D
1057 ACA AAT TTT GAT GCA AAA ACT CGT AGA AAC TCA ACT GAT CTT GAG GAT
      I   I   I   A   H   V   S   G   M   D   A   M   A   R   A   L
1105 ATC ATT ATC GCT CAC GTA TCT GGC ATG GAC GCT ATG GCC CGT GCA TTG
      E   N   A   A   K   L   L   Q   E   S   P   Y   T   K   M   K
1153 GAG AAC GCT GCT AAG CTT TTA CAA GAG TCC CCA TAT ACG AAG ATG AAG
      K   E   R   Y   A   S   F   D   S   G   I   G   K   D   F   E
1201 AAA GAG AGA TAT GCT TCT TTT GAT AGC GGT ATA GGA AAA GAC TTC GAG
      D   G   K   L   T   L   E   Q   V   Y   E   Y   G   K   K   N
1249 GAT GGA AAG CTG ACA CTG GAG CAA GTG TAC GAA TAT GGT AAA AAG AAT
      G   E   P   K   Q   T   S   G   K   Q   E   L   Y   E   A   I
1297 GGT GAA CCA AAA CAG ACC TCA GGA AAG CAG GAA TTA TAT GAA GCC ATT
      V   A   M   Y   Q   *
1345 GTG GCT ATG TAC CAA TAG CCTAGGCTCGAGGAATTC
>SEQ ID NO 3：
由此核苷酸序列编码的氨基酸序列显示为SEQ ID No 49。
1   GAATTCCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGGAGCTAGCC
     M   E   Y   F   K   N   V   P   Q   I   K   Y   E   G   P   K
49  ATG GAA TAT TTC AAA AAC GTG CCA CAG ATC AAG TAT GAA GGT CCT AAA
     S   N   N   P   Y   A   F   K   F   Y   N   P   D   E   I   I
97  AGC AAT AAC CCT TAT GCA TTT AAG TTC TAT AAC CCA GAT GAA ATT ATA
     D   G   K   P   L   K   E   H   L   R   F   S   V   A   Y   W
145 GAT GGA AAA CCA TTA AAA GAA CAC TTA AGA TTT AGC GTA GCC TAC TGG
     H   T   F   T   A   N   G   T   D   P   F   G   A   P   T   M
193 CAT ACA TTT ACC GCT AAC GGA ACG GAT CCA TTT GGT GCA CCG ACT ATG
     Q   R   P   W   D   H   F   T   D   P   M   D   I   A   K   A
241 CAG CGT CCT TGG GAT CAT TTT ACC GAC CCT ATG GAC ATA GCA AAA GCA
     R   V   E   A   A   F   E   L   F   E   K   L   D   V   P   F
289 CGT GTG GAA GCC GCA TTC GAG CTT TTT GAA AAA TTG GAT GTT CCA TTC
     F   C   F   H   D   R   D   I   A   P   E   G   E   T   L   R
337 TTC TGT TTT CAT GAC AGA GAT ATA GCT CCG GAA GGT GAA ACA TTG AGA
     E   T   N   K   N   L   D   T   I   V   A   M   I   K   D   Y
385 GAA ACC AAC AAA AAC TTA GAT ACT ATC GTT GCT ATG ATT AAA GAC TAC
     L   K   T   S   K   T   K   V   L   W   G   T   A   N   L   F
433 TTA AAA ACG TCA AAG ACT AAA GTT CTT TGG GGC ACT GCT AAT TTG TTT
      S   N   P   R   F   V   H   G   A   A   T   S   C   N   A   D
481  TCT AAT CCA CGT TTC GTG CAT GGC GCT GCC ACA TCA TGT AAT GCA GAC
      V   F   A   Y   A   A   A   Q   V   K   K   A   L   E   I   T
529  GTA TTT GCT TAT GCA GCC GCT CAA GTT AAA AAG GCC TTA GAG ATT ACC
      K   E   L   G   G   Q   N   Y   V   F   W   G   G   R   E   G
577  AAA GAG TTA GGA GGC CAG AAT TAT GTT TTC TGG GGT GGT CGT GAG GGA
      Y   E   T   L   L   N   T   D   M   E   L   E   L   D   N   L
625  TAT GAG ACA CTT TTA AAT ACT GAT ATG GAG TTG GAA TTA GAT AAT TTA
      A   R   F   L   H   M   A   V   E   Y   A   Q   E   I   G   F
673  GCA AGA TTC TTA CAC ATG GCA GTA GAA TAT GCT CAG GAA ATT GGT TTT
      E   G   Q   F   L   I   E   P   K   P   K   E   P   T   K   H
721  GAA GGA CAG TTC TTG ATC GAG CCT AAA CCA AAG GAA CCA ACA AAG CAT
      Q   Y   D   F   D   A   A   S   V   H   A   F   L   K   K   Y
769  CAG TAT GAT TTC GAC GCT GCT TCT GTA CAC GCC TTT TTG AAG AAG TAT
      D   L   D   K   Y   F   K   L   N   I   E   A   N   H   A   T
817  GAT TTG GAT AAA TAC TTT AAG TTG AAC ATA GAG GCT AAT CAC GCA ACG
      L   A   G   H   D   F   Q   H   E   L   R   Y   A   R   I   N
865  TTG GCA GGT CAC GAT TTT CAA CAC GAA TTG AGA TAC GCC CGT ATT AAT
      N   M   L   G   S   I   D   A   N   M   G   D   M   L   L   G
913  AAC ATG TTA GGT TCC ATA GAT GCC AAC ATG GGT GAC ATG TTG CTG GGT
      W   D   T   D   Q   Y   P   T   D   I   R   M   T   T   L   A
961  TGG GAT ACT GAT CAA TAC CCA ACG GAT ATT AGA ATG ACA ACT TTA GCA
      M  Y   E   V   I   K   M   G   G   F   N   K   G   G   L   N
1009 ATG TAC GAG GTC ATT AAA ATG GGA GGT TTT AAC AAA GGA GGT TTG AAT
      F   D   A   K   V   R   R   A   S   F   E   P   E   D   L   F
1057 TTC GAT GCT AAA GTG CGT CGT GCC TCT TTT GAA CCT GAA GAC CTT TTT
      L   G   H   I   A   G   M   D   A   F   A   K   G   F   K   V
1105 CTT GGA CAT ATT GCC GGA ATG GAT GCA TTT GCA AAA GGT TTC AAG GTC
      A   Y   K   L   V   K   D   G   V   F   D   R   F   I   E   E
1153 GCT TAT AAG CTT GTT AAG GAT GGT GTA TTT GAT AGA TTC ATT GAA GAG
      R   Y   K   S   Y   R   E   G   I   G   A   E   I   V   S   G
1201 AGA TAC AAA TCC TAT CGT GAA GGT ATA GGT GCT GAA ATC GTT TCA GGT
      K   A   N   F   K   T   L   E   E   Y   A   L   N   N   P   K
1249 AAG GCC AAT TTT AAG ACT TTA GAG GAA TAT GCA TTG AAT AAC CCA AAA
      I   E   N   K   S   G   K   Q   E   L   L   E   S   I  L    N1297  ATC GAA AAC AAA AGC GGT AAA CAG GAA CTG CTG GAA TCT ATT TTG AAT
      Q   Y   L   F   S   E   *
1345 CAA TAT TTG TTC TCT GAA TAG CCTAGGCTCGAGGAATTC
>SEQ ID NO 4：
1  GCTAGCCATG GCCACTACCC CATTTGATGC TCCAGATAAG
>SEQ ID NO 5：
1  CTCGAGCCTA GGCTAGTGTT TCAATTCACT TTCCATCTTG GCC
>SEQ ID NO 6：
1  GCTAGCCATG GCTTCTATTA AGTTGAACTC TGGTTACG
>SEQ ID NO 7：
1  CTCGAGCCTA GGCTAGACGA AGATAGGAAT CTTGTCCCAG TCCC
>SEQ ID NO 8：
1  GCTAGCCATG GCTGCTAACC CTTCCTTGGT GTTG
>SEQ ID NO 9：
1  CTCGAGCCTA GGCTACTCAG GGCCGTCAAT GAGACACTTG ACAGCACCC
>SEQ ID NO 10：
1  TAGCTAGCAT GTTATCAGTA CCTGATTATG AG
>SEQ ID NO 11：
1  ATCTCGAGTT ACTTTAAGAA TGCCTTAGTC ATGCC
>SEQ ID NO 12：
1  TAGCTAGCAT GAATTTAGTT GAAACAGCCC AAGC
>SEQ ID NO 13：
1  ATCTCGAGCT AATATTTGAT TGCTTGCCCA GCC
>SEQ ID NO 14：
1  TAGCTAGCAT GCTAGAAGCA TTAAAACAAG AAG
>SEQ ID NO 15：
1  ATCTCGAGTT ACTTGCGAAC TGCATGATCC TTAG
>SEQ ID NO 16：
1  TAGCTAGCAT GACAGCTCAG TTACAAAGTG AAAG
>SEQ ID NO 17：
1  ATCTCGAGTC AGGAAAATCT GTAGACAATC TTGG
>SEQ ID NO 18：
1  TAGCTAGCAT GGCCAGATTT TCCGCTGAAG ATATGCG
>SEQ ID NO 19：
1  TAGTTTAAAC TTGCCATCAT CATTCCCTAG AAACTGC
>SEQ ID NO 20：
1  TAGTCGACAG TGTGTAAGAG TGTACCATTT ACT
>SEQ ID NO 21：
1  TACTCGAGTT TCCCTTTTTC TGCCTTTTTC GGTG
>SEQ ID NO 22：
1  TAGTTTAAAC TGATGGTGTG GAAGACATAG ATGG
>SEQ ID NO 23：
1  TAGTTTAAAC AGTTATGTTT AAAAAATCAA CTTTCTTTCC
>SEQ ID NO 24：
1  TAGTCGACAA CCAGGTCCTT GTGTGCCGCT GTT
>SEQ ID NO 25：
1  TACTCGAGTC CTATCGAGTT ACACTGCTAG TG
>SEQ ID NO 26：
1  TAGTTTAAAC ATTGCTTAGC ATAGCTGCCA CTAACC
>SEQ ID NO 27：
1  TAGTCGACTG ACATGTATGG GTTGAAAATA TTTAG
>SEQ ID NO 28：
1  TACCTAGGTT TTAGGCTGGT ATCTTGATTC
>SEQ ID NO 29：
1  TAGTCGACTG TTTAAAGATT ACGGATATTT AAC
>SEQ ID NO 30：
1  TACCTAGGTT TTAGTTTATG TATGTGTTTT TTGTAG
>SEQ ID NO 31：
1  TAGTCGACAA AAGGTCTAAC ATCCTTTGAG TTATG
>SEQ ID NO 32：
1  TACCTAGGGT TATGTTAACT TTTGTTACTT
>SEQ ID NO 33：
1  TAGTCGACAG GGTAGCCTCC CCATAACATA AAC
>SEQ ID NO 34：
1  TACCTAGGTT TGATTGATTT GACTGTGTTA TTTTGCG
>SEQ ID NO 35：
1  TAGTCGACAT AACAATACTG ACAGTACTAA A
>SEQ ID NO 36：
1  TACCTAGGTT TGAATATGTA TTACTTGGTT ATGG
>SEQ ID NO 37：
1  TAGTCGACCA CATGCAGTGA TGCACGCGCG
>SEQ ID NO 38：
1  TACCTAGGTA TTGTAATATG TGTGTTTGTT TGG
>SEQ ID NO 39：
1  TATCTAGAAT GACTCAATTC ACTGACATTG ATAAGC
>SEQ ID NO 40：
1  TACTCGAGTT AGAAAGCTTT TTTCAAAGGA GAAATTAGC
>SEQ ID NO 41：
1  TAGCTAGCAT GTTGTGTTCA GTAATTCAGA GAC
>SEQ ID NO 42：
1  ATCTCGAGGA TGAGAGTCTT TTCCAGTTCG C
>SEQ ID NO 43：
1  GCTAGCCATG TCTGAACCAG CTCAAAAGAA ACAAAAGG
>SEQ ID NO 44：
1  TACTCGAGAG AAACTGTATC ATTCATCAAA TAGG
>SEQ ID NO 45：
1  GCTAGCCATG GCTGCCGGTG TCCCAAAAAT TGATGCG
>SEQ ID NO 46：
1  TACTCGAGAA CATTGCATTT ATTGGTGTTG AATC
>SEQ ID NO 47：
由核苷酸序列SEQ ID No 1编码的氨基酸序列。
M  A  T  F  T  I  S  K  E  S  L  P  F  R  A  D
K  S  I  S  Q  I  T  L  S  N  E  R  L  T  I  V
V  H  D  Y  G  A  R  A  H  Q  L  L  T  P  D  K
N  G  T  F  E  N  I  L  L  S  K  N  D  S  E  T
Y  A  N  D  G  G  Y  Y  G  V  I  C  G  P  V  A
G  R  I  S  G  A  T  Y  D  S  V  S  L  E  A  N
E  G  K  N  N  L  H  S  G  S  H  G  W  E  R  Q
F  W  S  Y  E  T  F  E  T  A  S  S  L  G  I  K
L  S  L  R  D  E  E  S  G  F  P  G  Q  I  Q  A
E  V  T  Y  K  L  T  D  N  K  L  E  V  T  I  S
G  L  S  V  T  D  T  V  F  N  P  A  W  H  P  Y
F  N  L  S  A  E  L  S  T  T  H  E  H  F  I  Q
A  N  V  D  F  L  V  E  T  N  Q  E  N  I  P  T
G  R  L  L  T  V  D  D  S  S  Y  S  I  K  E  S
V  S  I  K  K  L  L  K  D  N  P  E  G  L  D  D
C  F  V  F  N  P  K  G  D  K  S  L  M  L  Y  D
P  L  S  G  R  K  L  V  A  Q  T  D  R  Q  A  V
V  I  Y  T  A  T  N  P  E  I  E  S  M  I  N  G
R  P  M  S  K  N  R  G  I  A  I  E  F  Q  E  I
P  D  L  V  H  H  P  E  W  G  T  I  E  L  K  A
G  Q  K  K  T  F  I  T  E  Y  L  F  T  T  N  *
>SEQ ID NO 48(编号CAB76571)：
由核苷酸序列SEQ ID No 2编码的氨基酸序列。
M  A  K  E  Y  F  P  Q  I  Q  K  I  K  F  E  G
K  D  S  K  N  P  L  A  F  H  Y  Y  D  A  E  K
E  V  M  G  K  K  M  K  D  W  L  R  F  A  M  A
W  W  H  T  L  C  A  E  G  A  D  Q  F  G  G  G
T  K  S  F  P  W  N  E  G  T  D  A  I  E  I  A
K  Q  K  V  D  A  G  F  E  I  M  Q  K  L  G  I
P  Y  Y  C  F  H  D  V  D  L  V  S  E  G  N  S
I  E  E  Y  E  S  N  L  K  A  V  V  A  Y  L  K
E  K  Q  K  E  T  G  I  K  L  L  W  S  T  A  N
V  F  G  H  K  R  Y  M  N  G  A  S  T  N  P  D
F  D  V  V  A  R  A  I  V  Q  I  K  N  A  I  D
A  G  I  E  L  G  A  E  N  Y  V  F  W  G  G  R
E  G  Y  M  S  L  L  N  T  D  Q  K  R  E  K  E
H  M  A  T  M  L  T  M  A  R  D  Y  A  R  S  K
G  F  K  G  T  F  L  I  E  P  K  P  M  E  P  T
K  H  Q  Y  D  V  D  T  E  T  A  I  G  F  L  K
A  H  N  L  D  K  D  F  K  V  N  I  E  V  N  H
A  T  L  A  G  H  T  F  E  H  E  L  A  C  A  V
D  A  G  M  L  G  S  I  D  A  N  R  G  D  Y  Q
N  G  W  D  T  D  Q  F  P  I  D  Q  Y  E  L  V
Q  A  W  M  E  I  I  R  G  G  G  F  V  T  G  G
T  N  F  D  A  K  T  R  R  N  S  T  D  L  E  D
I  I  I  A  H  V  S  G  M  D  A  M  A  R  A  L
E  N  A  A  K  L  L  Q  E  S  P  Y  T  K  M  K
K  E  R  Y  A  S  F  D  S  G  I  G  K  D  F  E
D  G  K  L  T  L  E  Q  V  Y  E  Y  G  K  K  N
G  E  P  K  Q  T  S  G  K  Q  E  L  Y  E  A  I
V  A  M  Y  Q  *
>SEQ ID NO 49(编号P22842)：
由核苷酸序列SEQ ID No 3编码的氨基酸序列。
M  E  Y  F  K  N  V  P  Q  I  K  Y  E  G  P  K
S  N  N  P  Y  A  F  K  F  Y  N  P  D  E  I  I
D  G  K  P  L  K  E  H  L  R  F  S  V  A  Y  W
H  T  F  T  A  N  G  T  D  P  F  G  A  P  T  M
Q  R  P  W  D  H  F  T  D  P  M  D  I  A  K  A
R  V  E  A  A  F  E  L  F  E  K  L  D  V  P  F
F  C  F  H  D  R  D  I  A  P  E  G  E  T  L  R
E  T  N  K  N  L  D  T  I  V  A  M  I  K  D  Y
L  K  T  S  K  T  K  V  L  W  G  T  A  N  L  F
S  N  P  R  F  V  H  G  A  A  T  S  C  N  A  D
V  F  A  Y  A  A  A  Q  V  K  K  A  L  E  I  T
K  E  L  G  G  Q  N  Y  V  F  W  G  G  R  E  G
Y  E  T  L  L  N  T  D  M  E  L  E  L  D  N  L
A  R  F  L  H  M  A  V  E  Y  A  Q  E  I  G  F
E  G  Q  F  L  I  E  P  K  P  K  E  P  T  K  H
Q  Y  D  F  D  A  A  S  V  H  A  F  L  K  K  Y
D  L  D  K  Y  F  K  L  N  I  E  A  N  H  A  T
L  A  G  H  D  F  Q  H  E  L  R  Y  A  R  I  N
N  M  L  G  S  I  D  A  N  M  G  D  M  L  L  G
W  D  T  D  Q  Y  P  T  D  I  R  M  T  T  L  A
M  Y  E  V  I  K  M  G  G  F  N  K  G  G  L  N
F  D  A  K  V  R  R  A  S  F  E  P  E  D  L  F
L  G  H  I  A  G  M  D  A  F  A  K  G  F  K  V
A  Y  K  L  V  K  D  G  V  F  D  R  F  I  E  E
R  Y  K  S  Y  R  E  G  I  G  A  E  I  V  S  G
K  A  N  F  K  T  L  E  E  Y  A  L  N  N  P  K
I  E  N  K  S  G  K  Q  E  L  L  E  S  I  L  N
Q  Y  L  F  S  E  *
Figure IDA0000048814550000011
Figure IDA0000048814550000021
Figure IDA0000048814550000031
Figure IDA0000048814550000041
Figure IDA0000048814550000051
Figure IDA0000048814550000061
Figure IDA0000048814550000081
Figure IDA0000048814550000091
Figure IDA0000048814550000101
Figure IDA0000048814550000111
Figure IDA0000048814550000121
Figure IDA0000048814550000131
Figure IDA0000048814550000141
Figure IDA0000048814550000151
Figure IDA0000048814550000161
Figure IDA0000048814550000171
Figure IDA0000048814550000181

Claims (12)

1.能够(i)以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖；和/或(ii)在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高的生长速率；和/或(iii)实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的经转化微生物；
其中所述微生物已经用引起微生物过表达醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化和/或其中所述微生物已经用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化；并且，
所述微生物已经用至少一种编码木糖异构酶的表达载体转化或所述微生物已经用至少一种编码木糖还原酶和D-木酮糖还原酶的表达载体转化；和/或
所述微生物已经用引起微生物过表达木糖异构酶的启动子转化或所述微生物已经用引起微生物过表达木糖还原酶和D-木酮糖还原酶的启动子转化；而且
其中所述微生物是经转化酵母。
2.依照权利要求1的微生物，其中所述戊醛糖选自下组：木糖，阿拉伯糖，核糖和来苏糖。
3.依照权利要求1或2的微生物，其中所述戊酮糖是木酮糖。
4.包含依照权利要求1-3任一项的微生物的接种物。
5.包含依照权利要求1-3任一项的微生物的培养液。
6.用于制备能够(i)生成戊糖衍生化合物；和/或(ii)以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖；和/或(iii)在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高的生长速率；和/或(iv)实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的经转化微生物的方法；
所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊糖衍生化合物；
其中所述微生物已经用引起微生物过表达醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化和/或其中所述微生物已经用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化；并且，
所述微生物已经用至少一种编码木糖异构酶的表达载体转化或所述微生物已经用至少一种编码木糖还原酶和D-木酮糖还原酶的表达载体转化；和/或
所述微生物已经用引起微生物过表达木糖异构酶的启动子转化或或所述微生物已经用引起微生物过表达木糖还原酶和D-木酮糖还原酶的启动子转化；而且
其中所述微生物是经转化酵母。
7.依照权利要求6的方法，其中所述编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列在编码它的表达载体中。
8.用于生成戊糖衍生化合物的方法，其中所述方法包括在培养基中培养依照权利要求1-3任一项的微生物或通过权利要求6或权利要求7的方法制备的微生物。
9.用于生成生物燃料的方法，其中所述方法包括在培养基中培养依照权利要求1-3任一项的微生物或通过权利要求6或权利要求7的方法制备的微生物的步骤。
10.依照权利要求9的方法，其中所述方法进一步包括自培养液获得生物燃料的步骤。
11.微生物用于生成戊糖衍生产物的用途；其中所述微生物是：
(a)能够(i)以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖；和/或(ii)在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高的生长速率；和/或(iii)实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的经转化微生物，其中所述微生物已经用引起微生物过表达醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化和/或其中所述微生物已经用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化；或
(b)通过权利要求6或7的方法制备的微生物。
12.微生物用于生成生物燃料的用途，其中所述微生物是：
a)能够(i)以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖；和/或(ii)在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高的生长速率；和/或(iii)实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的经转化微生物，其中所述微生物已经用引起微生物过表达醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化和/或其中所述微生物已经用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化；或
(b)通过权利要求6或7的方法制备的微生物。
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