JP5850418B2 - キシロース代謝改変による効果的なエタノール生産法 - Google Patents
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Description
[1] キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子が染色体組込みにより導入されており、かつ少なくともトランスアルドラーゼ遺伝子およびα-グルコシドトランスポーター遺伝子からなる群から選択される一以上の遺伝子を発現するプラスミドを含む、キシロースからエタノールを高効率に生産できる遺伝子組換え酵母。
[2] キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子が染色体組込みにより導入されており、かつ、さらに少なくともトランスアルドラーゼ遺伝子およびα-グルコシドトランスポーター遺伝子からなる群から選択される一以上の遺伝子が染色体組込みにより導入されている、キシロースからエタノールを高効率に生産できる遺伝子組換え酵母。
[3] さらに、トランスケトラーゼ遺伝子を過剰発現している、[1]または[2]の遺伝子組換え酵母。
[4] トランスケトラーゼ遺伝子が酵母または細菌由来である、[3]の遺伝子組換え酵母。
[5] トランスケトラーゼ遺伝子が、Saccharomyces cerevisiaeに由来する、[4]の遺伝子組換え酵母。
[6] キシロースレダクターゼ遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子がPichia stipitisに由来し、かつキシルロキナーゼ遺伝子がSaccharomyces cerevisiaeに由来する、[1]〜[5]のいずれかの遺伝子組換え酵母。
[7] トランスアルドラーゼ遺伝子およびα-グルコシドトランスポーター遺伝子が酵母または細菌由来である、[1]〜[6]のいずれかの遺伝子組換え酵母。
[8] トランスアルドラーゼ遺伝子およびα-グルコシドトランスポーター遺伝子が、Saccharomyces cerevisiaeに由来する、[7]の遺伝子組換え酵母。
[9] キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子が染色体組込みにより導入されており、かつ、少なくともNQM1遺伝子、TKL2遺伝子またはAGT1遺伝子を欠失または不活性化している、グルコース非存在下においてキシロースからエタノールを高効率に生産できる遺伝子組換え酵母。
[10] NQM1遺伝子、TKL2遺伝子およびAGT1遺伝子がSaccharomyces cerevisiaeに由来する、[9]の遺伝子組換え酵母。
[11] 遺伝子組換え酵母がSaccharomyces cerevisiaeを宿主として作製される、[1]〜[10]のいずれかの遺伝子組換え酵母。
[12] [1]〜[11]のいずれかの遺伝子組換え酵母を用いた、キシロースからエタノールを生産する方法。
[13] [1]〜[11]のいずれかの遺伝子組換え酵母を用いた、セルロース系バイオマスから調製した糖化液からエタノールを生産する方法。
TAL、TKLおよびα-グルコシドトランスポーターのキシロース発酵における重要性を検討するために、TAL1、NQM1、TKL1、TKL2、AGT1の各遺伝子を欠損したノックアウト酵母にキシロース代謝系遺伝子発現カセットを導入して形質転換酵母を作製し、これら遺伝子組換え酵母株のキシロース発酵能を比較した。
エタノール発酵実験のために、PPP関連酵素遺伝子およびAGT1遺伝子を欠損したノックアウト酵母(ΔTAL1-Xyl株、ΔNQM1-Xyl株、ΔTKL1-Xyl株、ΔTKL2-Xyl株、およびΔAGT1-Xyl株)とそのコントロール酵母(Con-Xyl株)を、20g/lグルコースを含む合成培地(20g/l ポリペプトン、 10g/l yeast extract : YPD培地)において30℃で48時間、好気的に培養した。遠心分離により集菌後、滅菌水で洗浄し、20mlの発酵培地(45g/lキシロースを含む合成培地: YPX培地(45g/l キシロース、20g/l ポリペプトン、10g/l yeast extract)またはYPDX培地(45g/l グルコース、45g/l キシロース、20g/l ポリペプトン、10g/l yeast extract))に適量を接種した(菌体量を統一)。発酵液は攪拌棒を入れた50mlの密封型のバイアルにおいて、緩やかに攪拌しながら30℃で嫌気的に培養した。
エタノール、グルコース、キシロース、キシリトール、他の副産物の濃度は高速液体クロマトグラフィー(HPLC; 日本分光株式会社)を用いて測定した。分離カラムはHPX-87Hカラム(Bio-Rad社)を用い、HPLC装置は5mM H2SO4で0.6ml/minの流速で流し、65℃で運転した。酵母の増殖は分光光度計Biowave II(WPA社)を用いて600nmでの波長を測定した。解析の結果、これら遺伝子組換え酵母間で増殖速度に顕著な違いがみられた。すなわち、ΔTKL2-Xyl株およびΔAGT1-Xyl株が最も細胞収量が高く、続いてΔNQM1-Xyl株およびCon-Xyl株が続き、ΔTAL1-Xyl株は少し増殖が見られたが、ΔTKL1-Xyl株は細胞収量が発酵中全く変化しなかった。
野生型TAL1遺伝子を作製するため、GeneBankに登録されているSaccharomyces cerevisiae TAL1遺伝子(NC_001144)(配列番号1)を参考にして、下記の二つのプライマーを設計した。尚、TAL1遺伝子の5’末端にHind III切断部位、3’末端にBamH I切断部位を認識する配列をプライマーに付加した。
5’-TAAggatccTTAAGCGGTAACTTTCTTTTCAATCAAG-3’ (配列番号3)
野生型NQM1遺伝子を作製するため、GeneBankに登録されているSaccharomyces cerevisiae NQM1遺伝子(NC_001139)(配列番号4)を参考にして、下記の二つのプライマーを設計した。尚、NQM1遺伝子の5’末端にHind III切断部位、3’末端にBamH I切断部位を認識する配列をプライマーに付加した。
5’-GAggatccTCACATTTTTTCTTCAACCAGTTTGTAC-3’ (配列番号6)
野生型TKL1遺伝子を作製するため、GeneBankに登録されているSaccharomyces cerevisiae TKL1遺伝子(NC_001148)(配列番号7)を参考にして、下記の二つのプライマーを設計した。尚、TKL1遺伝子の5’末端にEco RI切断部位、3’末端にBamH I切断部位を認識する配列をプライマーに付加した。
5’-TAAggatccTTAGAAAGCTTTTTTCAAAGGAGAAATTAGC-3’ (配列番号9)
野生型TKL2遺伝子を作製するため、GeneBankに登録されているSaccharomyces cerevisiae TKL2遺伝子(NC_001134)(配列番号10)を参考にして、下記の二つのプライマーを設計した。尚、TKL2遺伝子の5’末端にHind III切断部位、3’末端にBamH I切断部位を認識する配列をプライマーに付加した。
5’-AAggatccTTAGAAAGCTCTTCCCATAGGAGAAAGC-3’ (配列番号12)
野生型AGT1遺伝子を作製するため、GeneBankに登録されているSaccharomyces cerevisiae AGT1遺伝子(NC_001139)(配列番号13)を参考にして、下記の二つのプライマーを設計した。尚、AGT1遺伝子の5’末端にEco RI切断部位、3’末端にBamH I切断部位を認識する配列をプライマーに付加した。
5’-TAAggatccTTAACATTTATCAGCTGCATTTAATTCTC-3’ (配列番号15)
上記プラスミドYEpM4-TAL1、YEpM4-NQM1、pPGK-TKL1、pPGK-TKL2およびpPGK-AGT1をYEASTMAKER yeast transformation system 2(クロンテック社)を用いてリチウム酢酸法によりキシロース発酵性酵母MA-N4株に形質転換した。MA-N4株は、Invitrogenから購入した酵母INVSc1株に3種類のキシロース代謝系酵素(XR、XDHおよびXK)の遺伝子を構成的に発現できるカセットpAURXKXDH(WT)XRを形質転換した遺伝子組換え酵母である(特願2008-211274を参照)。まずTALおよびTKL遺伝子を様々に組み合わせた一連の遺伝子組換え酵母株を作製するために、pPGK、pPGK-TKL1およびpPGK-TKL2のいずれかをMA-N4株に形質転換し、さらにYEpM4、YEpM4-TAL1およびYEpM4-NQM1のいずれかを形質転換して、合計9種類の遺伝子組換え酵母株を作製した。すなわちMA-N4株に、酵素遺伝子を含まないYEpM4およびpPGKを導入したN4-Con1(コントロール株)、YEpM4およびpPGK-TAL1を導入したN4-TAL1、YEpM4およびpPGK-NQM1を導入したN4-NQM1、YEpM4-TKL1およびpPGKを導入したN4-TKL1、YEpM4-TKL2およびpPGKを導入したN4-TKL2、YEpM4-TKL1およびpPGK-TAL1を導入したN4-TAL1TKL1、YEpM4-TKL2およびpPGK-TAL1を導入したN4-TAL1TKL2、YEpM4-TKL1およびpPGK-NQM1を導入したN4-NQM1TKL1、YEpM4-TKL2およびpPGK-NQM1を導入したN4-NQM1TKL2である。また、MA-N4株をpPGK-AGT1を用いて形質転換して、遺伝子組換え酵母N4-AGT1株を作製した。一方、トランスポーター遺伝子を含まないpPGKを用いてMA-N4株に形質転換してN4-Con2株を作製し、コントロール株として用いた。
TALの活性測定は、反応によって生成されるNADHの特異的な340nmの吸収度の減少を30℃でモニターすることによって行った。54mMのF6P、0.7mMのE4P、0.2mMのNADH、0.34Uのグリセロール脱水素酵素(以下、「GDH」と記載)、および1Uのトリオースリン酸イソメラーゼ(以下、「TIM」と記載)を含む84mMトリエタノールアミン緩衝液(pH 7.6)990μl中において、1μmolのNAD +を1分間に生成するために必要な量を、TALの1ユニットと定義した。
エタノール発酵実験のために、PPP関連酵素発現酵母(N4-TAL1株、N4-NQM1株、N4-TKL1株、N4-TKL2株、N4-TAL1TKL1株、N4-TAL1TKL2株、N4-NQM1TKL1株、およびN4-NQM1TKL2株)とそれらのコントロール酵母(N4-Con1)、またAGT1発現酵母(N4-AGT1株)とそのコントロール酵母(N4-Con2)を、20g/lグルコースを含む栄養要求性培地(6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids、20g/l グルコース、2g/l 検定したいアミノ酸を除いたdrop out mix : SCD培地)において30℃で48時間、好気的に培養した。遠心分離により集菌後、滅菌水で洗浄し、20 mlの発酵培地(5g/lグルコースと16g/lキシロースを含む栄養要求性培地: SCDX培地)に適量を接種した(菌体量を統一)。発酵液は攪拌棒を入れた50 mlの密封型のバイアルにおいて、緩やかに攪拌しながら30℃で嫌気的に培養した。
エタノール、グルコース、キシロース、キシリトール、他の副産物の濃度は高速液体クロマトグラフィー(HPLC; 日本分光株式会社)を用い、実施例3と同様の方法で運転した。酵母の増殖は分光光度計Biowave II(WPA社)を用いて600 nmでの波長を測定した。解析の結果、これら全ての遺伝子組換え酵母間でそれほど増殖速度の違いはみられなかったが、細胞収量についてはN4-TAL2株が最も高く、逆にN4-TKL1株が最も低かった。またこれら全ての遺伝子組換え酵母間において、グルコースは最初の9時間の間に全て消費した。
Claims (11)
- キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子が染色体組込みにより導入されており、かつα-グルコシドトランスポーター遺伝子を発現するプラスミドを含む、キシロースからエタノールを高効率に生産できる遺伝子組換え酵母。
- キシロースレダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子が染色体組込みにより導入されており、かつ、さらにα-グルコシドトランスポーター遺伝子が染色体組込みにより導入されている、キシロースからエタノールを高効率に生産できる遺伝子組換え酵母。
- さらに、トランスケトラーゼ遺伝子及び/又はトランスアルドラーゼ遺伝子を過剰発現している、請求項1または2に記載の遺伝子組換え酵母。
- トランスケトラーゼ遺伝子及び/又はトランスアルドラーゼ遺伝子が酵母または細菌由来である、請求項3に記載の遺伝子組換え酵母。
- トランスケトラーゼ遺伝子及び/又はトランスアルドラーゼ遺伝子が、Saccharomyces cerevisiaeに由来する、請求項4に記載の遺伝子組換え酵母。
- キシロースレダクターゼ遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子がPichia stipitisに由来し、かつキシルロキナーゼ遺伝子がSaccharomyces cerevisiaeに由来する、請求項1〜5のいずれか1項記載の遺伝子組換え酵母。
- α-グルコシドトランスポーター遺伝子が酵母または細菌由来である、請求項1〜6のいずれか1項記載の遺伝子組換え酵母。
- α-グルコシドトランスポーター遺伝子が、Saccharomyces cerevisiaeに由来する、請求項7に記載の遺伝子組換え酵母。
- 遺伝子組換え酵母がSaccharomyces cerevisiaeを宿主として作製される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の遺伝子組換え酵母。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の遺伝子組換え酵母を用いた、キシロースからエタノールを生産する方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の遺伝子組換え酵母を用いた、セルロース系バイオマスから調製した糖化液からエタノールを生産する方法。
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