SI24955A - Modificirana 6-fosfofrukto-1-kinaza, ki rekombinantnim celicam kvasovke Saccharomyces cerevisiae omogoča fermentativno uporabo pentoznih sladkorjev - Google Patents

Abstract

Predmet izuma je modificiran glikolitični encim 6-fosfofrukto-1-kinaza (PFK), ki bo rekombinantnim celicam kvasovke S. cerevisiae omogočal fermentacijo pentoznih sladkorjev. Izum sodi v področje genetskega inženiringa genov ter mikrobnih celic ter v področje fermentacij ali procesov za sintezo želenih kemijskih spojin, bolj natančno v področje postopkov pridobivanja fermentacijskih produktov, ki temeljijo na izražanju modificiranih genov v gostiteljski celici. Bistvo pričujočega izuma je, da temelji naspremembi gena za 6-fosfofrukto-1-kinazo (PFK), ki kodira glavni regulacijski encim glikolize, ki določa hitrost metabolnega pretoka preko tega dela primarnega metabolizma. Spremenjeni gen je lahko humanega, živalskega ali mikrobnega izvora, ali pa je hibriden. Posledica izražanja spremenjenih genov za PFK v gostiteljski celici so krajši fragmenti encima PFK, ki imajo bistveno višjo aktivnost kot nativni encim. Le-ti v kombinaciji z NADPH-specifičnim maličnim encimom omogočajo uporabo pentoznih sladkorjevter produkcijo fermentativnih produktov, še posebno 2-feniletanola.

Description

MODIFICIRANA 6-FOSFOFRUKTO-1-KINAZA, KI REKOMBINANTNIM CELICAM KVASOVKE Saccharomyces cerevisiae OMOGOČA FERMENTATIVNO UPORABO PENTOZNIH SLADKORJEV

Področje izuma

Predmet izuma je modificiran glikolitični encim 6-fosfofrukto-1-kinaza (PFK), ki bo rekombinantnim celicam kvasovke S. cerevisiae omogočal fermentacijo pentoznih sladkorjev. Izum sodi v področje genetskega inženiringa genov ter mikrobnih celic ter v področje fermentacij ali procesov za sintezo želenih kemijskih spojin, bolj natančno v področje postopkov pridobivanja fermentacijskih produktov, ki temeljijo na izražanju modificiranih genov v gostiteljski celici.

Ozadje izuma in tehnični problem

Moderno življenje temelji na odkrivanju in izkoriščanju fosilnih goriv, kar pa ima številne negativne lastnosti. Zato se je v začetku 21. stoletja pojavila potreba po alternativah, med katerimi ima največji potencial rastlinska biomasa, iz katere bi lahko pridobivali transportna goriva. Eden izmed najbolj obetavnih takšnih goriv oziroma obnovljivih virov energije je bioetanol.

Bioetanol se lahko pridobiva iz koruze ali sladkorne repe, česar pa predvsem v Evropi ni dovolj, da bi zadovoljilo vse potrebe. Novo generacijo produkcije bioetanola predstavlja pridobivanje iz lignoceluloznih substratov, katerih je v Evropi dovolj, saj je veliko agro-živilskih in lesnih odpadkov, ki poleg glukoze iz hidrolizirane celuloze vsebujejo veliko pentoznih sladkorjev, ki nastanejo pri hidrolizi hemiceluloze. Izmed teh je najbolj zastopana ksiloza, druge pentoze pa so še arabinoza, ksiluloza, luksoza, ramnoza, riboza in ribuloza.

• «

Pomemben faktor za cenovno učinkovito pridobivanje etanola iz lignoceluloznih substratov je visok izkoristek in visoka hitrost fermentacije. Tega so sposobni mikroorganizmi, ki so za industrijske aplikacije uporabni tudi zato, ker jih je enostavno gojiti in tudi genetsko spreminjati. Mikroorganizmi, ki izvajajo fermentacijo lignoceluloznih substratov, morajo zato biti:

- sposobni fermentacije pentoznih sladkorjev,

- odporni proti številnim inhibitornim spojinam iz rastlin,

- odporni proti visokim koncentracijam etanola, in

- sposobni rasti v striktno anaerobnih pogojih ali mikroaerofilnih pogojih.

Kvasovka Saccharomyces cerevisiae je odličen producent bio-etanola, saj fermentira glukozo, manozo, fruktozo in galaktozo, vendar pa ne raste na pentoznih sladkorjih. Čeprav kvasovka S. cerevisiae ne more niti fermentirati niti asimilirati ksiloze, pa to ne velja za druge vrste kvasovk. Med 200 kvasnimi vrstami, ki lahko rastejo na ksilozi, so našli 19 vrst, ki so producirale tudi etanol, in sicer v koncentraciji med 0,11,0 g/L po tem, ko so jih gojili v substratu z začetno koncentracijo 20 g ksiloze/L (Toivola in sod., 1984, Appl Environ Microbiol 47:1221-1223).

Ker pa je kvasovka S. cerevisiae široko uporabljan model za številne aplikacije produkcije bio-etanola, tudi zaradi dobre odpornosti proti visokim koncentracijam etanola, se jo zdi smiselno uporabljati tudi v metabolnem inženiringu za pridobivanje bioetanola iz rastlinskih hidrolizatov. Prednost kvasovke S. cerevisiae pred ostalimi kvasovkami pa je v tem, da je sposobna kopičiti bistveno višje koncentracije etanola, saj divji tipi dosegajo toleranco do približno 12% (v/v) etanola, industrijski sevi pa tudi bistveno več. Teoretični fermentacijski izkoristek za pretvorbo glukoze v etanol pa pri S. cerevisiae dosega celo vrednost 90-93% (Bai in sod., 2008, Biotechnol Adv 26, 1: 89-105). Zanimivo je, da kvasovka S. cerevisiae vsebuje vse ključne encime za pretvorbo ksiloze preko ksilitola do ksiluloze-5-fosfata, ki se preko pentoza fosfatne poti razgradi do fruktoze-6-fosfata in gliceraldehid-3-fosfata, ki nato vstopita v glikolizo. To so ksilozna reduktaza (EC 1.1.1.21), ksilitol dehidrogenaza (EC 1.1.1.9) in ksilulokinaza (EC 2.7.1.17), vendar pa so njihovi geni izraženi na prenizkem nivoju, da bi omogočali normalno asimilacijo ksiloze (Richard in sod., 1999, FEBS Letts 457,

1: 135-138). Po drugi strani pa uspešno uporabo ksiloze onemogočajo tudi specifične lastnosti oksidoreduktaz, ki so bodisi NADH- bodisi NADPH-odvisne, in lahko bistveno vplivajo na krhko redoks razmerje v celicah (van Maris in sod., 2006,

Antonie van Leuvenhoek 90: 391-418).

Konstrukcija sevov kvasovk, ki bi učinkovito pretvarjale potencialno fermentabilne substrate iz hidrolizatov rastlinske biomase, je eden izmed glavnih izzivov metabolnega inženiringa.

Razgradnja pentoznih sladkorjev pa ne bi pomenila le možnosti pridobivanja bioetanola, temveč tudi drugih fermentativnih produktov, ki so prav tako pomembni v industriji. Eden izmed takih je 2-feniletanol, ki je višji aromatski alkohol, ki ima karakterističen vonj po vrtnicah, zaradi česar je popularen in izjemno zaželen predvsem v kozmetični industriji ter pri izdelavi parfumov. Poleg tega se 2-feniletanol uporablja tudi v prehranski industriji, kjer ga vključujejo v pijače, sladkarije in piškote. Predstavlja tudi surovino za pridobivanje njegovih estrov, med katerimi je najbolj pomemben feniletil acetat, ki ga uporabljajo kot spojino za spreminjanje okusa ali vonja. 2-Feniletanol je sicer naravni produkt, vendar se ga za potrebe industrije največ sintetizira po kemijski poti, zato se stalno iščejo metode, s katerimi se bo 2feniletanol lahko sintetiziral v večjih količinah oziroma z boljšimi izkoristki (Etschmann in sod., 2002, Appl Microbiol Biotechnol 59: 1-8).

Tehnični problem, ki ga pričujoči izum rešuje, je torej modifikacija genov za glikolitične encime, ki bodo rekombinantnim celicam kvasovke S. cerevisiae omogočali, da bo sposobna fermentacije pentoznih sladkorjev, s čimer bi na koncu gojenja kvasovke pridobili fermentativne produkte. Izum naj omogoča enostavno uporabo genetsko spremenjenih genov in celic kvasovke S. cerevisiae, pri čemer naj bo izkoristek pridobivanja produktov fermentacije čim višji, stroški čim nižji, pridobljeni fermentativni produkti pa naj bodo v čim bolj čisti obliki (brez primesi). Poleg tega naj rešitev tehničnega problema omogoča primerno hiter prenos iz eksperimentalnega dela v kompleksne industrijske procese.

Znano stanje tehnike

Do sedaj so pri kvasovki S. cerevisiae tehnični problem reševali predvsem z vnosom heterolognih genov za razgradnjo pentoz in povišanim izražanjem določenih kvasnih genov, in sicer predvsem tistih genov, ki kodirajo encime vključene v pentoza fosfatno pot.

Med pripravo gensko spremenjenih sevov kvasovke S. cerevisiae, ki bi lahko fermentativno uporabljala določene pentozne sladkorje, so v preteklosti posvetili veliko pozornosti predvsem iskanju heterolognih genov za začetno razgradnjo ksiloze in arabinoze do D-ksiluloze-5-fosfata in izražanju teh genov pod kontrolo močnih konstitutivnih promotorjev. Fermentacijo ksiloze so tako pri kvasovki S. cerevisiae vzpostavili z vnosom in izražanjem xy/1 gena za ksilozno reduktazo (XR) in xy!2 gena za ksilitolno dehidrogenazo (XDH). Oba gena izvirata iz kvasovke Pichia stipitis, ki lahko fermentativno uporablja ksilozo (Koetter and Ciriacy, 1993, Appl Microbiol Biotechnol 38, 6: 776-783). XR encim lahko za redukcijo uporablja NADPH ali NADH, medtem ko je XDH encim NAD⁺ specifičen. Po drugi strani pa so neuravnoteženo razmerje NADH/NADPH v celicah S. cerevisiae poskušali popraviti z izražanjem gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GDP1) kvasovke Kluyveromyces lactis. GDP1 je namreč NADP⁺ specifičen encim, ki na račun znižanja produkcije NADH pri glikolizi poveča koncentracijo NADPH v celicah (Verho in sod., 2003, Appl Environ Microbiol 69(10): 5892-5897). Poskusov izboljšanja pretvorbe ksiloze preko ksilitola do Dksiluloze-5-fosfata je bilo še več in jih je opisal Passoth (2014, Molecular Mechanisms in Yeast Carbon Metabolism, 217-259).

Dokument FR2959514 opisuje pripravo industrijskega seva kvasovke Saccharomyces cerevisiae, ki vključuje: (i) izbiro seva; (ii) integracijo ekspresijske kasete v genom kvasovke; (iii) indukcijo izražanja vsaj enega gena vsakega koraka ne-oksidativnega dela pentoza fosfatne poti; in (iv) delecijo vsaj dveh kopij odprtega bralnega okvirja gena GRE3 kvasovke S. cerevisiae. Omenjena kaseta iz koraka (ii) je lahko:

a) ekspresijska kaseta s kombinacijo odprtega bralnega okvirja gena XRm kvasovke P. stipitis, ki kodira mutiran encim ksiloza reduktaza, ki uporablja NADH kot kofaktor namesto NADPH, in promoterjem in terminatorjem kvasovke S. cerevisiae, pri čemer se kaseta lahko vključi v genom;

b) ekspresijska kaseta s kombinacijo odprtega bralnega okvirja gena XDH kvasovke P. stipitis, ki kodira ksilitol dehidrogenazo s promoterjem in terminatorjem kvasovke S. cerevisiae, pri čemer se kaseta lahko vključi v genom;

c) ekspresijska kaseta s kombinacijo odprtega bralnega okvirja gena XKS1 kvasovke S. cerevisiae, ki kodira encim ksilulokinaza s promoterjem in terminatorjem kvasovke S. cerevisiae, pri čemer se kaseta lahko vključi v genom.

Dokument KR20140067947 opisuje sev kvasovke Pichia guilliermondii Υ-2 deponiran pod številko KCTC 12322BP, zmes s kulturo omenjenega seva za pridobivanje etanola in postopek produkcije etanola ali ksilitola. Omenjeni sev lahko fermentira heksoze kot tudi pentoze, pri čemer je slednje možno zaradi prisotnosti encima, ki je del metabolnega procesa ksiloze.

Dokument KR20130027984 opisuje uporabo mutirane beta-glukozidaze za namen produkcije bioetanola.

Patentna prijava US2012282664 opisuje metodo za pridobivanje etanola, ki vključuje gojenje kvasovk, ki metabolizirajo ksilozo, kar je bilo doseženo z uvedbo gena za encim pentoza fosfatne poti v genom katerekoli primerne kvasovke.

Patentna prijava CA2834053 opisuje genetsko spremenjeno kvasovko, ki vsebuje eksogene gene, ki kodirajo piruvat format liazo in acetaldehid dehidrogenazo. Kvasne celice nadalje vsebujejo genetske spremembe, ki izboljšajo uporabo glicerola, kot na primer spremembe, ki povečajo z NAD⁺ odvisno glicerol dehidrogenazno aktivnostjo, in preferenčno eno ali več izmed dihidroksiaceton kinaznih aktivnosti ter olajšajo transport glicerola v celico. Kvasne celice nadalje preferenčno vsebujejo funkcionalni eksogeni gen za ksiloza izomerazo in/ali funkcionalne gene, ki celici omogočajo pretvorbo L-arabinoze v D-ksiluloza 5-fosfat, • · pri čemer so lahko le-ti genetsko spremenjeni, da se poveča sinteza acetil-CoA. Spremenjene kvasne celice fermentirajo heksoze, pentoze, ocetno kislino in glicerol v etanol.

V patentni prijavi US2014308724 je opisan sev kvasovke, ki je zmožen uporabe pentoznih sladkorjev, kot sta ksiloza in arabinoza, katerega je možno uporabiti pri produkciji bioetanola iz biomase.

Dokument FR2974114 opisuje pridobivanje alkoholov iz celulozne ali lignocelulozne biomase, ki poleg drugih korakov vključuje tudi fermentacijo pentoznih sladkorjev z različnimi mikroorganizmi, preferenčno z divjim tipom kvasovke Pichia stipitis ali divjim tipom kvasovke Candida shehatae. Uporabijo pa se lahko tudi:

- bakterije iz rodu Bacillus, Bacteroides, Clostridium ali Thermoanaerobacter,

- rekombinantne bakterije Escherichia coli, Klebsiella oxytoca in Zymomonas mobilis,

- divji tip kvasovke Pachysolen tannophilus, Candida guilliermondii in Candida tropicalis,

- rekombinantne kvasovke S. cerevisiae, kot so jih opisali:

o Olsson in Hahn-Hagerdahl,1996, Enzyme Microb Technol 18: 312-331, o Hahn-Hagerdahl in sod., 2007, Adv Biochem Eng Biotechnol. 108:147-77, ali o Ohgren in sod., 2006, J Biotechnol 126(4):488-98; ali

- glive iz rodu Fusarium.

Dokument KR20120118787 opisuje sev kvasovke P. stipitis za uporabo pri produkciji bioetanola, ki uspešno pretvarja ksilozo v bioetanol. Sev ima utišan receptor za glukozo in vključuje enega izmed sledečih rekombinantnih vektorjev: rekombinantni vektor, ki izraža proti smerno RNA proti glukoznemu receptorju z visoko afiniteto in rekombinantni vektor, ki vključuje z metanolom inducirani promoter in glukozni receptor z visoko afiniteto, ki je vezan na promotor.

Dokument US2012270290 opisuje pridobivanje bioetanola iz pentoz, ki izvirajo iz biomase. Dokument opisuje uporabo gena ali proteina, ki se sintetizira po izražanju omenjenega gena, ki je transporter ksiloze ali L-arabinoze, pri čemer je gen izbran v skupini, v kateri so HGT2, XUT1, in ΗΧΤ2.4. Metoda za produkcijo bioetanola vključuje gojenje kvasovk z vsaj enim zgoraj omenjenim genom v prisotnosti biomase, katere del sta ksiloza in L-arabinoza.

Drugo ozko grlo pri pretvorbi ksiloze do bio-etanola s kvasovko S. cerevisiae pa predstavlja ne-oksidativni del pentoza fosfatne poti, ki se začne z vstopom Dksiluloze-5-fosfata ter njegovo pretvorbo do fruktoze-6-fosfata in gliceraldehid-3fosfata, molekul, ki nato vstopita v centralni del primarnega metabolizma - glikolizo. S ciljem, da bi povečali metabolni pretok preko tega dela presnove, so povečali izražanje naslednjih kvasnih encimov, in sicer: transaldolaze (TAL), transketolaze (TKL), riboze-5-fosfat ketol-izomeraze (RKI) in ribuloze-5-fosfat epimeraze (RPE) (Karhumaa in sod., 2005, Yeast 22: 359-368). S tako pospešeno presnovo preko pentoza fosfatne poti so omogočili rast S. cerevisiae na ksilozi, ne da bi istočasno z vnesenimi ali spremenjenimi geni pospešili pretvorbo ksiloze v D-ksilulozo-5-fosfat. To dokazuje, da kvasovka S. cerevisiae za uspešno uporabo ksiloze potrebuje bolj učinkovite gene za začetno redukcijo ksiloze do ksilitola in fosforilacijo do Dksiluloze-5-fosfata, kot tudi pospešen metabolni pretok preko pentoza fosfatne poti.

Tretja, še neopisana omejitev pri pretvorbi ksiloze do bio-etanola pa morda obstaja na nivoju glikolize, in sicer po vstopu fruktoze-6-fosfata v glikolitično pot na nivoju 6fosfofrukto-1-kinaze (PFK1) in gliceraldehid-3-fosfata na nivoju gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GDP1). Glavni regulatorni encim metabolnega pretoka preko glikolize je 6-fosfofrukto-1-kinaza (PFK1), ki omogoča bolj kompleksno kontrolo metabolnega pretoka kot ostala dva encima glikolize, ki sta heksokinaza in piruvat kinaza. PFK1 katalizira fosforilacijo fruktoze-6-fosfata (F6P) v fruktozo-1,6-bisfosfat, ob uporabi MgATP kot fosforilnega donorja. PFK1 stimulirajo fruktoza-2,6-bisfosfat (F-2.6-BP), ADP/AMP in amonijevi ioni, medtem ko citrat in ATP inhibirata encimsko aktivnost (Dunaway, 1983, Mol Celi Biochem 52:75-91). Tekom evolucije so se evkariontski PFK1 encimi razvili po podvojitvi in zlitju dveh izhodnih prokarionskih genov, tako da je molska masa evkarionskih encimov približno dvakrat večja kot prokariontskih. Aktivno mesto evkariontskega encima se je ohranilo le na Nterminalnem delu molekule, medtem ko so se tekom evolucije na C-terminalnem delu razvila alosterična vezalna mesta za vezavo inhibitornih in aktivatorskih efektorskih molekul (Poorman in sod., 1984, Nature 309:467-469).

Pri 6-fosfofrukto-1-kinazi (PFK) je bil opisan proces posttranslacijske modifikacije, in sicer najprej pri encimu glive Aspergillus niger. Modifikacija v celicah nastane po proteolitični odcepitvi velikega dela C-terminalnega konca encima, tako da iz nativnega 85 kDa encima nastane 49 kDa kratek fragment. Novo nastali encim najprej ni aktiven, po fosforilaciji treoninskega ostanka pa se aktivira, vendar ima spremenjeno encimsko kinetiko. Kratek PFK1 fragment ima višjo afiniteto do substrata (F6P), aktivatorji kot so F-2.6-BP, ADP in amonijevi ioni pa bolj povečajo njegovo aktivnost kot pri nativnem encimu. Še več, novo nastali fragment ni več inhibiran s citratom, medtem ko inhibicijo z ATP-jem prepreči prisotnost F-2,6-BP (Mesojednik in Legiša, 2005, Appl Environ Microbiol 71(3): 1425-1432; Mlakar in Legiša, 2007, Appl Environ Microbiol 72: 4515-4532). Zdi se, da nastanek visoko aktivnega kratkega fragmenta, glede na svoje kinetične karakteristike, v celicah povzroči deregulacijo metabolnega pretoka preko glikolize in pri glivi Aspegillus niger bistveno pripomore k pospešeni produkciji citronske kisline.

Podobna posttranslacijska modifikacija PFK1 encima je bila opisana tudi pri rakastih celicah pri človeku, in sicer pri mišičnem tipu 6-fosfofrukto-1-kinaze (PFK-M), ki je poleg jetrnega tipa (PFK-L) in trombocitnega tipa (PFK-P) ena od treh izoencimnih oblik humanega PFK. Tudi tukaj gre za proteolitičen odcep C-terminalnega dela encima in nastanka visoko aktivnega 47 kDa kratkega fragmenta, vendar pa je encim pri humanih celicah takoj po odcepu aktiven in za njegovo aktivacijo ni potrebna fosforilacija. Zelo verjetno modifikacija PFK-M bistveno vpliva na vklop tako imenovanega VVarburgovega efekta pri rakastih celicah, za katere je značilno, da presnovijo več glukoze kot normalne celice, večino glukoze pa pretvorijo v laktat, ki ga izločijo iz celic. V rakastih celicah ta proces poteka kljub zadostni količini raztopljenega kisika v okolici (Šmerc in sod., 2011, PLoS One 6, 5, e19645).

Visoko aktivne kratke fragmente lahko celice sintetizirajo tudi iz modificiranih genov, po vnosu na primernem vektorju. Pri pripravi modificiranega mt-p/frA gena glive A. niger smo v skrajšan gen morali vnesti še specifično mutacijo, ki je odstranila potrebo po fosforilaciji kratkega fragmenta PFK1, medtem ko je pri pripravi visoko aktivnega humanega PFK-M fragmenta zadoščalo primerno skrajšanje pfkM gena. Kot je opisano v patentu US 7,807,404 B2 in EP 2 010 651 B1 je po vnosu mt-p/kA gena glive A. niger v nekatere komercialne mikroorganizme bila zaznana povečana produkcija določenih metabolitov, ki imajo biotehnološko vrednost. Vendar pa se je izkazalo, da je omenjeni patentirani gen nestabilen, saj se pri sintetiziranem proteinu pojavlja problem nestruktuirane intrinzične proteinske regije.

Znani krajši fragmenti encima PFK glive A. niger so nestabilni, in posledično rekombinantne celice s takimi fragmenti ne morejo normalno delovati. Zato je cilj izuma aktiven in stabilen fragment encima 6-fosfofrukto-1-kinaza za pripravo industrijsko uporabljive rekombinantne celice z omenjenim fragmentom, ki bo ob gojenju v primernem gojišču sposobna fermentacije pentoznih sladkorjev, rezultat česar bo proizvajanje fermentativnih produktov. Modifikacij glikolitičnih encimov, ki bi omogočale hitrejši vstop vmesnih intermediatov po pretvorbi pentoznih sladkorjev (fruktoza-6-fosfata in gliceradehid-3-fosfata) v glikolizo namreč še ni bilo opisanih.

Opis izuma

Bistvo pričujočega izuma je, da temelji na spremembi gena za 6-fosfofrukto-1-kinazo (PFK), ki kodira glavni regulacijski encim glikolize, ki določa hitrost metabolnega pretoka preko tega dela primarnega metabolizma. Spremenjeni gen je lahko humanega, živalskega ali mikrobnega izvora, ali pa je hibriden. Posledica izražanja spremenjenih genov za PFK v gostiteljski celici so krajši fragmenti encima PFK, ki imajo bistveno višjo aktivnost kot nativni encim. Le-ti v kombinaciji z NADPHspecifičnim maličnim encimom omogočajo uporabo pentoznih sladkorjev ter produkcijo fermentativnih produktov, še posebno 2-feniletanola. Rast celic ter produkcija fermentativnih produktov se lahko dodatno izboljša z optimizacijo gojišč in pogojev gojenja.

V nadaljevanju bo izum podrobneje predstavljen z natančnejšim opisom ter s pomočjo slik, ki prikazujejo:

Slika 1a:	Encimska aktivnost nativnega humanega PFK-M encima pri naraščajočih koncentracijah substrata fruktoze-6-fosfata ob prisotnosti različnih koncentracij fruktoze-2,6-bisfosfata kot močnega aktivatorja evkariontskih PFK encimov.
Slika 1b:	Encimska aktivnost kratkega humanega fragmenta PFK-M encima pri naraščajočih koncentracijah substrata fruktoze-6-fosfata ob prisotnosti različnih koncentracij fruktoze-2,6-bisfosfata kot močnega aktivatorja evkariontskih PFK encimov.
Slika 2:	Rast celic s fragmentom sf PFK-M in heterolognim maličnim encimom v gojišču Sc-ura',leu s 0,05% ksilitolom, YNBQ, 5mM glutaminsko kislino, 10 μΜ FeSO4. Divji tipi kvasovke S. cerevisiae in transformante z nativnim PFK-M, vsi z ali brez heterolognega maličnega encima, na omenjenem gojišču pod semi-anaerobnimi pogoji niso rastle.
Slika 3:	Rast celic s fragmentom sf PFK-M in heterolognim maličnim encimom pod semi-anaerobnimi in anaerobnimi pogoji v gojišču Sc- ura',leu s 0,05% ksilitolom, YNBQ, 5mM glutaminsko kislino, 10 pM FeSO4.
Slika 4:	Rast celic s fragmentom sf PFK-M in heterolognim maličnim encimom v gojišču Sc-ura',leu s YNBQ, 5mM glutaminsko kislino, 10 pM FeSO4 in različnimi sladkorji - ksilitolom, ksilozo in maltozo. Kot kontrola je bilo uporabljeno enako gojišče brez sladkorja.
Slika 5:	Rast celic s fragmentom sf PFK-/M in heterolognim maličnim encimom v gojišču Sc-ura',leu s 0,05% ksilitolom, YNBQ, in 10 pM FeSO4 z različnimi viri dušika - 5 mM glutamin, 5 mM glutaminska kislina, ali 5g/L amon sulfat.

Slika 6: Rast celic s fragmentom sf PFK-M in heterolognim maličnim encimom ob različnih začetnih koncentracijah glutaminske kisline v gojišču Sc-ura',leu s 0,05% ksilitolom, YNBQ, 10 μΜ FeSO4.

Slika 7: Poraba ksilitola in produkcija feniletanola med rastjo celic s fragmentom sf PFK-M in heterolognim maličnim encimom v gojišču Sc-ura',leu s 0,05% ksilitolom, YNBQ, 5mM glutaminsko kislino, 10 μΜ FeSO₄.

Slika 8: Rast celic s fragmentom ssf PFK-M in z ali brez heterolognega maličnega encima v gojišču Sc-ura',leu s 0,05% ksilitolom, YNBQ, 5mM glutaminsko kislino, 10 μΜ FeSO₄.

Slika 9: Rast celic s hibridnim HBsf PFK-A in mišjim krajšim fragmentom msf

PFK-M z ali brez heterolognega maličnega encima v gojišču Sc-ura' ,leu' s 0,05% ksilitolom, YNBQ, 5mM glutaminsko kislino, 10 μΜ FeSO₄.

Že prej je bilo z meritvami encimske aktivnosti pri delno prečiščenem nativnem humanem PFK-M encimu in kratkih 47 kDa PFK-M fragmentih ugotovljeno, da se v prisotnosti fruktoze-2,6-bisfosfata (F-2.6-BP) poveča le afiniteta encima do substrata fruktoze-6-fosfata (F6P). Pri merjenju encimske kinetike pri kratkih PFK-M fragmentih pa se ob naraščajočih koncentracijah F-2,6-BP v sistemu zazna povečana afiniteto kot tudi maksimalna aktivnost v primeru z encimom v sistemu brez efektorja. Kot je razvidno iz Slik 1a in 1b je kratek PFK-M encim bistveno bolj aktiven kot nativni PFKM encim predvsem pri nižjih koncentracijah F6P. Podobne kinetične karakteristike smo določili tudi pri nativnem in kratkem PFK1 encimu glive A. niger. Vendar pa visoko aktivni kratki fragmenti fosfofruktokinaze v kvasnih celicah povzročijo prekomerno sintezo NADH, kar poruši krhko razmerje med NADH in NADPH, zaradi katere je rast rekombinantnih celic kvasovke S. cerevisiae onemogočena.

Kvasovka S. cerevisiae nima transhidrolaze, encima, ki pretvarja NADH v NADPH in, ki je prisoten pri nekaterih drugih mikroorganizmih (dos Santos in sod., 2004, Metab Eng 6: 352-363). Ravno tako nima citosolnega NADPH-specifičnega maličnega encima, ki je prisoten v humanih celicah.

.......

Za humane rakaste celice je značilna deregulirana glikoliza, ki jo zelo verjetno povzroči nastanek visoko aktivnih kratkih fragmentov PFK-M. Zaradi povečane porabe glukoze in pospešenega metabolnega toka preko glikolize se tvori več glikolitičnega NADH-ja, ki se re-oksidira ob redukciji piruvata v laktat, ta pa se izloči iz celic (VVarburgov efekt). Pospešen glikolitični pretok zmanjša presnovo glukoze preko pentoza fosfatne poti, ki je pomembna pot za nastajanje NADPH, koencima, ki je pomemben nosilec redukcijske moči pri anabolnih reakcijah. Rakaste celice rešujejo problem neuravnoteženega razmerja NADH/NADPH z NADPH specifičnim maličnim encimom, ki se nahaja v citosolu. Encim pretvarja malat v piruvat. Malat nastaja po poti cikla trikarboksilnih kislin v mitohondrijih in se preko obeh mitohondrijskih membran prenese v citosol. Zaradi večinske pretvorbe glukoze v piruvat (85%), se cikel trikarboksilnih kislin pri rakastih celicah napaja z glutaminom, ki je koncentracijsko najbolj zastopana aminokislina v človeškem serumu. Glutamin po deaminaciji do glutamata vstopa v cikel trikarboksilnih kislin na nivoju a-ketoglutarata. Znano je, da rakaste celične linije brez glutamina v gojišču ne morejo rasti in se razmnoževati (DeBerardinis in sod., 2007, PNAS, 49: 19345-19350).

Zato bi bilo za omilitev neuravnoteženega NADH/NADPH razmerja pri kvasnih transformantah z deregulirano glikolizo možno uporabiti podoben sistem, kot je prisoten pri rakastih celicah, in sicer z vnosom maeA gena za citosolni NADP specifični malični encim, ki ob oksidaciji malata v piruvat tvori NADPH.

Pričujoči izum, ki rešuje tehnični problem modifikacije genov za glikolitične encime, ki bodo rekombinantnim celicam kvasovke S. cerevisiae omogočali fermentacijo pentoznih sladkorjev, s čimer bi na koncu gojenja kvasovke pridobili fermentacijske produkte, se nanaša na spremenjen encim PFK kot tudi na gen za spremenjen encim, ki je lahko mikrobnega, živalskega ali humanega izvora. Rešitev tehničnega problema je razdeljena na pripravo modificiranih genov za PFK, pripravo vektorjev z omenjenimi geni in genom za malični encim, pripravo rekombinantnih sevov kvasovke S. cerevisiae s transformacijo omenjenih vektorjev ter gojenje omenjenih rekombinantnih sevov. Natančnejše posamezne rešitve so opisane s pomočjo izvedbenih primerov.

• ·

Priprava fragmentov gena za encim fosfofruktokinaza in priprava gena za matični encim

Kot vektor za vnos pripravljenih genov v celice kvasovke sta bila uporabljena centromerna plazmida p416 ali p415, ki v celicah nastopata v nizkem številu kopij (Mumberg in sod., 1995, Gene 156: 119-122). Plazmid p416 vsebuje ura3 gen kot označevalec, ki popravi ura3-52 avksotrofijo sprejemnega seva, plazmid p415 pa Ieu2 gen, ki komplementira leu2-3 avksotrofno mutacijo. Vgrajeni geni so bili pod kontrolo konstitutivnega GPD promotorja. Kot vektor pa se lahko uporabi tudi katerikoli drugi primeren vektor, izražanje genov pa je lahko pod kontrolo kateregakoli primernega konstitutivnega ali inducibilnega promotorja.

Po pripravi vseh genov in vnosu v plazmide so bila nukleotidna zaporedja vstavljenih genov preverjena s sekveniranjem.

Priprava nativnega in modificiranih humanih genov

Gen za humani mišični tip 6-fosfofrukto-1-kinaze PFK-M (cDNA Clone ID2964710) je bil kupljen pri Geneservice Ltd (Cambridge, UK). Človeški nativni gen z oznako n pfkM, ki kodra nastanek 85 kDa nativnega PFK-M proteina, in skrajšani gen z oznako sf p/RM, ki kodira nastanek 47 kDa kratkega sf PFK-M fragmenta, sta bila pripravljena po postopku opisanem v članku Šmerc in sod. (2011, Plos One 6(5): e19645). Modificiran gen sf pfkM, ki kodira nastanek kratkega PFK-M fragmenta s 443 aminokislinskimi ostanki, je bil sicer prvotno narejen za raziskave VVarburgovega efekta v rakastih celicah, vendar smo z nadaljnjimi poskusi odkrili, da je fragment aktiven in stabilen v celicah kvasovke S. cerevisiae in posledično učinkovit pri pridobivanju fermentativnih produktov. Z uporabo verižne reakcije s polimerazo (PCR) smo uvedli novi restrikcijski mesti na 5' koncu (Xbal) in 3' koncu (BamHI), ki sta omogočali vgradnjo obeh genov v plazmid p416. Kot smerni začetni oligonukleotid za PCR reakcijo je bil uporabljen 5GAATTATCTAGAGCCACCATGACCCATGAAGAGCACCATGC-3', medtem ko je kot protismerni začetni oligonukleotid za vnos sf pfkM bil uporabljen 5'14

TAATTCGGATCCTTACAGGCCCTCGAAACCATC-3’ in za vnos n pfkM 5'TAATTCGGATCCTTAGACGGCAGCTTCCCC-3’.

Pripravljen je bil tudi še nekoliko krajši gen z oznako ssf pfkM, ki je kodiral nastanek še krajšega fragmenta PFK z oznako ssf PFK-M s 420 aminokislinskimi ostanki. Smerni začetni nukleotid je bil enak kot pri genih n pfkM in sf p/fcM, za protismerni začetni nukleotid pa je bil uporabljen 5TAATTCGGATCCTTAGCGAACAGCAGCATTCATGC-3'.

Aminokislinsko zaporedje nativnega encima, ki ga kodira gen n pfkM, je v seznamu zaporedij označeno s SEQ ID NO: 1, aminokislinsko zaporedje fragmenta sf PFK-M s SEQ ID NO: 2, aminokislinsko zaporedje fragmenta ssf PFK-M pa s SEQ ID NO: 3. Pričujoči izum zajema tudi fragmente PFK-M z dolžinami med 420 in 443 aminokislinskih ostankov, ki imajo po koncu zaporedja SEQ ID NO: 3 dodano eno ali več zaporednih aminokislin iz zaporedja STVRIGLIOGNRVLVVHDGFEG. Ker je znano, da se lahko različne DNA molekule prevedejo v isto aminokislinsko zaporedje, v pričujočem izumu omenjena aminokislinska zaporedja pokrivajo vsa možna nukleotidna zaporedja in nukleinske kisline, ki lahko privedejo do teh aminokislinskih zaporedij.

Priprava modificiranega mišjega gena

Gen za nativni mišji mišični tip encima PFK-M (cDNA C53048H23) smo naročili pri Source BioScience (Nottingham, UK). Krajši mišji gen z oznako msf p/frM, ki kodira nastanek 47 kDa kratkega msf PFK-M fragmenta, je bil pripravljen podobno kot humani sf pfkM gen. Za vnos v plazmid p416 smo morali uvesti specifični restrikcijski mesti (EcoRI in Xbal), kar je bilo izvedeno s PCR reakcijo s smernim začetnim oligonukleotidom 5’-GAATTAGAATTCATGACCCATGAAGAGCATC-3’ in protismernim začetnim oligonukleotidom 5’AATTATTCTAGATTACAGACCCTCAAAGCCATC-3’.

• · · • ·

.......

Aminokislinsko zaporedje fragmenta msf pfkM je v seznamu zaporedij označeno s SEQ ID NO: 4. Ker je znano, da se lahko različne DNA molekule prevedejo v isto aminokislinsko zaporedje, v pričujočem izumu omenjena aminokislinska zaporedja pokrivajo vsa možna nukleotidna zaporedja in nukleinske kisline, ki lahko privedejo do teh aminokislinskih zaporedij.

Priprava hibridnega gena

Ob pregledu z algoritmom Predicators of Natural Disorder Regions (PONDR) se je visoko aktivni fragment PFK1 glive Aspergillus niger (Capuder in sod., 2009, J Biotechnol 114: 51-57), ki ga kodira gen mt-p/frA, izkazal za nestabilnega. Zato smo se odločili stabilizirati del notranje neurejene regije glivnega proteina z zamenjavo tega dela iz humanega PFK-M encima, ki je imel višjo stopnjo stabilnosti. Skonstruirali smo hibridni gen z oznako HBsf pfkA, ki kodira encim, ki ima manj notranjih nestrukturiranih regij zaradi vključenega komplementarnega zaporedja 99 aminokislinskih ostankov iz humanega PFK-M encima. Hibridni HBsf pfkA gen je omogočal nastanek kratkega fragmenta encima PFK1 glive Aspergillus niger, z zamenjano nestabilno regijo 99 aminokislinskih ostankov, ki se nahaja med 189 in 287 aminokislinskim ostankom protismerni glivnega encima. Hibridni encim naj bi zato omogočal večjo stabilnost celic v primerjavi s celicami z že vnesenim genom mtpfkA.

Za pripravo hibridnega gena HBsf pfkA smo s prvo PCR reakcijo ločeno pomnožili 5' in 3' regijo gena, ki kodira nastanek hibridnega fragmenta PFK1 glive A. niger z zamenjano osrednjo regijo humanega kratkega PFK-M fragmenta. Uporabljeni so bili sledeči začetni oligonukleotidi:

- Smerni začetni oligonukleotid za 5’ konec mt-p/kA gena:

5’-CCATCGCACGCATATGGCTCCCCCCCAAGCTCCC-3';

- Protismerni začetni oligonukleotid za 5' konec mt-p/kA gena:

5’-GGTAGTGATGGCGTCGACGGCGTCACAGATGCGAG-3’;

- Smerni začetni oligonukleotid za osrednjo regijo sf pfkM:

5'-CGCCGTCGACGCCATCACTACCACTGCCCAG-3';

• ·· · • *

.......

- Proti smerni začetni oligonukleotid za osrednjo regijo sf pfkM'. 5’-CACACGGGTATCATATCCCAGACGCTTAACCACCAG-3’;

- Smerni začetni oligonukleotid za 3' konec mt-p/RA gena

5'-GCGTCTGGGATATGATACCCGTGTGACTGTGTTGGG-3';

- Protismerni začetni oligonukleotid za 3' konec mt-p/kA gena: 5'-TAGGCGTTTATCGCTGCTTCTAGAGGATCCTTACCCGGGATCATAG-3'.

Pri drugi PCR reakciji smo združili vse tri regije in celoten hibrid pomnožili z uporabo sledečih smernih oligonukleotidov:

- Smerni: 5’-CCATCGCACGCATATGGCTCCCCCCCAAGCTCCC-3';

- Protismerni:

5'-TAGGCGTTTATCGCTGCTTCTAGAGGATCCTTACCCGGGATCATAG-3'.

Končni produkt druge PCR reakcije smo obrezali z restriktazama Ndel in Xbal, produkte restrikcije ločili in očistili, ter te restrikcije produkte z ligacijo vstavili v vektor pALTER-Ex1, ki je bil predhodno obdelan z istima restriktazama. Nastali plazmid smo namnožili v E. coli in izolirali.

Izoliran plazmid s hibridnim genom HBsf pfkAje bil prirejen za vnos v p416 plazmid z vnosom restrikcijskega mesta za BamHI na 5’ koncu in Hindlll mesta na 3’ koncu, pri čemer sta bila uporabljena sledeča začetna oligonukleotida:

- smerni začetni oligonukleotid za 5' konec:

5’- GAATTAGGATCCGCCACCATGGCTCCCCCCCAAGCTCCCG-3’; in

- protismerni začetni oligonukleotid za 3' konec:

5’-TAATTCAAGCTTTTACCCGGGATCATAGTGCCGGCACAG-3’.

Aminokislinsko zaporedje hibridnega fragmenta HBsf PFKA je v seznamu zaporedij označeno s SEQ ID NO: 5. Ker je znano, da se lahko različne DNA molekule prevedejo v isto aminokislinsko zaporedje, v pričujočem izumu omenjena aminokislinska zaporedja pokrivajo vsa možna nukleotidna zaporedja in nukleinske kisline, ki lahko privedejo do teh aminokislinskih zaporedij.

Gen za malični encim

Gen maeA, ki kodira sintezo maličnega encima, je bil pripravljen kot so opisali Zelle in sod. (2011, Appl Environ Microbiol 77(3); 732-738). Za osnovo smo vzeli sfcA gen bakterije Escherichia coli, ki nosi tudi oznako maeh (Bologna in sod., 2007, J. Bacteriol 189(16): 5937-5946). S programom Codon optimization (Integrated DNA Technologies, ZDA) smo na bakterijskem sfcA genu (Gene bank gi:90111281) priredili uporabo kodonov za sintezo proteina v kvasnih celicah. Uvedli smo tudi točkovno mutacijo Asp336Gly, ki pri bakterijskem encimu spremeni specifičnost uporabe kofaktorja iz NADH v NADPH. Sintetični gen smo naročili kot gBlock pri podjetju Integrated DNA technologies (IDT, ZDA). Nukleotidno zaporedje sintetičnega gena je podano v seznamu zaporedij pod oznako SEQ ID NO: 6, aminokislinsko zaporedje pa pod oznako SEQ ID NO: 7.

Za pomnoževanje gena in za vnos primernih restrikcijskih mest za vgradnjo v vektor p415 smo uporabili sledeče začetne oligonukleotide:

smerni začetni oligonukleotid 5'TAATTCggatccGCCACCATGGAACCTAAGACTAAGAAGCAACG-3' za vnos Sam HI mesta in protismerni začetni oligonukleotid 5'TAATTCCTCGAGTTAAATACTTGTCCTACGATAGTCCCTATATTCGGCTTGCC-3’ za vnos Xho\ mesta. Pomnoženi gen smo vnesli v p415 plazmid, ki nosi leu-2 gen, ki komplementira avksotrofijo na leucin (fet/2-3).

Priprava vektorjev z omenjenimi fragmenti in genom za malični encim

Pripravljeni modificirani geni, ki kodirajo fragmente PFK, in/ali gen za malični encim na primernem vektorju se posamezno vnesejo v primeren vektor, ki je lahko katerikoli vektor, ki omogoča izražanje modificiranih genov v gostiteljskih celicah mikrobnega, rastlinskega ali živalskega izvora, prednostno v celicah kvasovke S. cerevisiae. Vektor mora imeti promotor, kontrolna zaporedja in druga zaporedja, ki tako izražanje omogočajo. Prednostno se kot vektor za modificirane gene za encim PFK uporabi plazmid p416 in za gen maeA plazmid p415. Postopek vnašanja modificiranih genov • · · • · ali gena maeA temelji na reakcijah restrikcije in ligacije, ki so izvedeni po standardnih protokolih. V splošnem se postopek izvede po sledečih korakih:

- restrikcija modificiranega gena oziroma gena maeA s primernimi restrikcijskimi encimi kot piše zgoraj v opisu priprave fragmentov;

- restrikcija vektorja z enakimi restrikcijskimi encimi kot je potekala restrikcija modificiranih genov ali gena maeA;

- ločevanje in čiščenje restrikcijskih produktov iz prejšnjih korakov; in

- ligacija restrikcijskih produktov iz prejšnjega koraka.

Priprava rekombinantnih celic kvasovke S. cerevisiae

Za pripravo rekombinantnih celic, ki bodo imele nukleinsko kislino za fragment encima 6-fosfofrukto-1-kinaza ali vektor z nukleinsko kislino za katerikoli izmed fragmentov gena za encim 6-fosfofrukto-1-kinaza opisanih zgoraj, se lahko uporabi katerakoli primerna gostiteljska celica, ki je lahko mikrobnega, rastlinskega ali živalskega izvora, prednostno pa se uporabi kvasovka S. cerevisiae zaradi njene primernosti za uporabo pri produkciji fermentativnih produktov. Za rekombinantne celice se lahko uporabi katerikoli primeren sev kvasovke S. cerevisiae, prednostno pa se za vstavljanje vektorjev z zgoraj opisanimi fragmenti gena za 6- fosfofrukto-1kinazo uporabi sev kvasovke S. cerevisiae HD114-8D, ki nima lastnih pfk genov.

Sev kvasovke S. cerevisiae HD56-5A z genotipom (MATa ura 3-52 leu2-3, 112 his3-11, 15 MAL SUC GAL) je bil uporabljen kot divji tip, medtem ko je bil njegov izogeni derivat, ki nima genov pfk1 in pfk2, uporabljen kot sprejemni sev za nativne in modificirane pfk gene, ki izvirajo iz drugih organizmov. Omenjeni sprejemni sev ima oznako HD114-8D in genotip (MATa pfk1 ::HIS3 pfk2.-:HIS3 ura 3-52 leu2-3, 112 his3-11, 15 MAL SUC GAL) (Heinisch in sod., 1996, J Biol Chem 271, 27:15928-15933).

Za vnos vektorjev v sev se lahko uporabi katerakoli izmed za to primernih metod, preferenčno pa se za vnos vektorjev uporabi transformacija. Le-ta se prednostno izvede po postopku, ki temelji na uporabi litijevega-acetata (Gietz in sod., 1992, • *

Nucleic Acids Res, 20(6): 1425). Transformante smo najprej gojili na trdnem minimalnem gojišču z dodatki (sintetično dodatno gojišče brez uracila (Υ1501 Sigma) in/ali leucina (Υ2001 Sigma)), ki je kot vir ogljika vsebovalo 2% glicerol in 2% etanol. Kot vir dušika smo uporabili kvasno dušikovo bazo (Yeast nitrogen base Υ-1251 Sigma) ob dodatku 5g/L amonijevega sulfata.

Za gojenje gostiteljskih celic, ki so sprejele nukleinsko kislino za sintezo fragmenta encima PFK ali vektor s tako nukleinsko kislino, se lahko uporabi katerokoli primerno gojišče, ki vsebuje vsaj:

- primerno minimalno gojišče z dodatki;

- 10pMFeSO₄;

- vir ogljika, ki je prednostno katerikoli pentozni sladkor, zlasti ksiloza ali ksilitol; in

- vir dušika, ki je prednostno glutaminska kislina ali glutamat.

Celice se goji pri temperaturi med 25 in 35 °C, prednostno pri temperaturi 30 °C.

Rast transformiranih kvasnih celic in uporaba pentoznih sladkorjev pri fermentaciji

Gojenje transformiranih kvasnih celic

Transformante smo pod semi-anaerobnimi pogoji gojili v polikarbonatnih sterilnih 125 mL erlenmeyericah z ventilacijskim zamaškom (Corning Cat.no. 430421). V posamezno erlenmeyerico smo nalili 100 mL gojišča, ki smo ga s 100 obrati na minuto mešali s 4 cm dolgim magnetnim mešalom. Erlenmeyerice z gojiščem smo inkubirali pri 30 C. Gojišča za fermentativno rast transformant so kot vir ogljika vsebovala maltozo, ksilozo ali ksilitol, primerno minimalno gojišče z dodatki (Yeast drop out medium, Sigma) in kvasno dušikovo bazo (ΥΝΒ) (Yeast Nitrogen Base, Sigma) ter glutamin (Q) ali glutaminsko kislino (E) v navedenih koncentracijah. V vsa gojišča smo dodali 10 μΜ FeSO₄. Po inokulaciji in pred inkubacijo smo gojišče pod sterilnimi pogoji 1 minuto prepihovali z dušikom. Vzorce smo med rastjo iz erlenmeyerice jemali s sterilnimi brizgami preko 10 cm jeklene kanile, ki smo jo v gojišče uvedli preko zamaška. Kinetiko rasti smo spremljali z meritvijo optične • · gostote gojišča pri 600 nm (OD 600), in sicer na spektro-fotometru Lambda 25 (Perkin-Elmer, Boston, US). Suha teža je bila določena na podlagi meritev optične gostote z uporabo umeritvene krivulje. Za pripravo umeritvene krivulje je bila suha teža določena po tem, ko so bile celice zbrane na suhem, predhodno stehtanem steklenem filtru z mikrovlakni (GF/A), sprane z deionizirano vodo in posušene do konstantne teže v pečici pri 105 °C. Koeficient hitrosti rasti (K') je bil določen kot naklon linearne regresije logaritemskih vrednosti naraščanja suhe teže med eksponentno fazo rasti. Generacijski čas se izračuna po formuli g = Ln2/K'.

Določanje koncentracije ksilitola

Za določevanje koncentracije ksilitola smo uporabili encimski test (Megazyme, Wicklow, Ireland) ob uporabi sorbitol dehidrogenaze in diaforaze. Pred encimskim testom smo vzorce z določenim volumnom liofilizirali in nato raztopili v enakem volumnu 50 mM Hepes pufra pH 7,5. Nastajanje formazana smo spremljali pri 492 nm.

Meritve fenil-etanola

Za določanje fenil-etanola smo uporabili plinsko kromatografijo povezano z masnim spektro-metrom (GC-MS) ob uporabi Hevvlett Packard Agilent 6890N plinskega kromatografa (Agilent Technologies, Palo Alto, CA USA). Separacijo vzorca smo izvedli na 30m dolgi in 0,25 mm široki kapilarni koloni (DB-35 ms, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) z debelino filtra 0,025 um. Kot nosilni plin smo uporabili helij s konstantno hitrostjo pretoka 0,9 mL/min. Razcepno razmerje je bilo 5:1, razcepna pretočna hitrost 4,4 mL/min in volumen vbrizga 5uL. Naraščanje temperature grelca je bilo nastavljeno od 50°C (2 min) do 300°C (5min) pri hitrosti naraščanja 30 C/min. Umeritvene krivulje, ki smo jih uporabili za določitev koncentracij posameznih metabolitov smo pripravili s standardi, ki smo jih kupili pri Sigmi.

• · · ·

Nadalje bo izum in njegovo delovanje podrobneje opisan s pomočjo primerov, ki pa ne omejujejo izuma.

Izvedbeni primer I

Prvi izvedbeni primer se nanaša na fragment humanega encima PFK z oznako sf PFK-M.

S postopkom priprave fragmenta humanega encima 6-fosfofrukto-1-kinaza je bil pripravljen modificiran kratek humani gen z oznako sf pfkM, ki je kodiral nastanek aktivnega kratkega sf PFK-M fragmenta s 443 aminokislinskimi ostanki. Aminokislinsko zaporedje tega fragmenta je zapisano v SEQ ID NO: 2.

Modificiran gen sf p/frM je bil vnesen v plazmid p416 in sev kvasovke S. cerevisiae HD114-8D po postopkih opisanih zgoraj.

Rast divjega tipa kvasovke Saccharomyces cerevisiae in različnih transformant z nativnim in fragmentom sf PFK-M na ksilitolu pod semianaerobnimi pogoji

Rast celic kvasovke S. cerevisiae s fragmentom sf PFK-M smo primerjali z rastjo celic z nativnim encimom PFK-M in rastjo divjega tipa kvasovke S. cerevisiae HD565A, ki ima lastne kvasne PFK encime. Preverili smo tudi rast takšnih celic v kombinaciji z maličnim encimom. Rast v gojišču in pri pogojih kot so opisani zgoraj smo dnevno spremljali spektrofotometrično. Kot kaže slika 3 je pri vseh sevih kmalu po nacepitvi motnost v gojišču malenkostno narasla na vrednost OD₆oo okoli 0,05 nato pa se je ustavila pri vseh, razen pri sevu s fragmentom sf PFK-M v kombinaciji z maeA genom. Hitrost rasti tega seva je eksponentno naraščala do vrednosti OD₆oo med 0,6 in 0,7, ko se je začela ustavljati. Ostali sevi, tudi če so vsebovali gen maeA, niso rastli v gojišču s ksilitolom.

• ·

Rast seva s fragmentom sf PFK-M in maličnim encimom pod semianaerobnimi in anaerobnimi pogoji

Za fermentativno rast transformante s fragmentom sf PFKM in maličnim encimom na gojišču s ksilitolom je nujno potrebna nizka koncentracija kisika, saj v popolnoma anaerobnih pogojih, ko je bila membrana, ki omogoča izmenjavo plinov preko zamaška hermetično zaprta s parafilmom, rast počasnejša, kar je razvidno iz Slike 3.

Rast na različnih sladkorjih

Kot kaže slika 4 je sev s fragmentom sf PFK-M in maličnim encimom rastel tudi na gojišču z maltozo in ksilozo. Na maltozi, kjer je bila lag faza sicer daljša je bila specifična hitrost rasti primerljiva tisti na ksilitolu, vendar pa je bil donos ob koncu fermentacije nekoliko višji (OD θοο OJ)· Pri tem eksperimentu je imel sev med rastjo na ksilitolu nekoliko krajšo lag fazo kor v primeru prikazanim v Sliki 4. Na ksilozi kot edinem sladkorju je bila rast bistveno počasnejša kot na ksilitolu. Po 25 dneh je gostota celic v gojišču dosegla le vrednost OD ₆oo 0,35. Na gojišču brez dodanih pentoznih sladkorjev rasti niti po 25 dneh nismo zaznali.

Rast seva s fragmentom sf PFK-M in maličnim encimom na ksilitolu z različnimi viri dušika

Kot je razvidno iz Slike 5 je samo glutaminska kislina, ki je bila dodana gojišču, omogočala rast celic s fragmentom sf PFK-M in maličnim encimom na ksilitolu. Ob prisotnosti glutamina so se celice sicer namnožile do OD₆oo vrednosti 0,05, kasneje pa se rast ni nadaljevala. Prisotnost amon sulfata (5g/L) ni omogočala niti začetne rasti do vrednosti OD₆oo 0,5, ki smo ju zaznali ob dodatku organsko vezanega dušika z obema aminokislinama.

Pomen glutaminske kisline za rast na ksilitolu • · · · · · ···· · « β · • · · · · · ··♦ ·· ·· ··

Kako pomembna je prisotnost glutaminske kisline za rast celic s fragmentom sf PFKM in maličnim encimom na ksilitolu kažejo rezultati prikazani v Sliki 6. Ob začetni koncentraciji glutraminske kisline 5 mM in 0,05% ksilitola v gojišču zraste kultura le do Οϋθοο vrednosti 0,6, v primeru 10 mM začetne koncentracije glutamata pa je bila končna OD₆oo vrednosti več kot 1,4. Sev HD-114-8D z genom maeA, ki nima lastnih, niti heterolognih pfk genov, ima pa gen za malični encim in prazen p416 plazmid, ni rastel na gojišču s 0,05% ksilitolom in 5 mM glutaminsko kislino.

Poraba ksilitola in tvorba fenil-etanola med rastjo seva s fragmentom sf PFK-M in maličnim encimom

Kot kaže slika 7 se med rastjo celic s fragmentom sf PFK-M in maličnim encimom na ksilitolnem gojišču ob prisotnosti glutaminske kisline ksilitol sicer minimalno porablja, saj iz začetne koncentracije 50 mg/100 mL pade le za okoli 5 mg. Istočasno v gojišču nismo zaznali prisotnosti etanola, ampak fenil-etanol. Tekom fermentacije pod semianaerobnimi pogoji se je izločilo približno 3 mg te substance. Glede na to, da porabe ksilitola in tvorbe fenil-etanola nismo mogli zaznati med rastjo seva HD-114-8D z genom maeA, ki nima genov za sintezo PFK encimov, in ker celice s fragmentom sf PFK-M in maličnim encimom niso rasle na gojišču z glutaminsko kislino in brez dodanega sladkorja, domnevamo, da se večina ksilitola, ki ga porabijo celice s fragmentom sf PFK-M in genom maeA pri zgornjem eksperimentu, pretvori v feniletanol.

Izvedbeni primer II

Drugi izvedbeni primer se nanaša na dodatno skrajšan fragment humanega encima PFK z oznako ssf PFK-M, ki kodira protein s 420 aminokislinskimi ostanki.

S postopkom priprave skrajšanega humanega gena za encim PFK je bil pripravljen dodatno skrajšan humani gen z oznako ssf pfkM, ki je kodiral nastanek aktivnega kratkega fragmenta s 420 aminokislinskimi ostanki z oznako ssf PFK-M. Aminokislinsko zaporedje tega fragmenta je zapisano v SEQ ID NO: 3.

• ·

Modificiran gen ssf pfk-M je bil vnesen v plazmid p416 in sev kvasovke S. cerevisiae HD114-8D po postopkih opisanih zgoraj. Kot je razvidno iz Slike 8 je dodatno skrajšan fragment ssf PFK-M skupaj z maličnim encimom omogočal rast transformiranih celic na ksilitolnem substratu, hitrost rasti pa je bila celo nekoliko hitrejša (koeficient rasti K' 0,2891 (h'¹) kot pri celicah z daljšim fragmentom sf PFK-M in maličnim encimom (K' 0,2409). Tudi pri transformanti s krajšim fragmentom ssf PFK-M skupaj z maličnim encimom smo zaznali porabo ksilitola in produkcijo feniletanola.

Izvedbeni primer III

Tretji izvedbeni primer se nanaša na fragment mišjega encima PFK z oznako msf PFK-M.

S postopkom priprave fragmenta mišjega encima PFK je bil pripravljen 47 kDa fragment z oznako msf PFK-M. Aminokislinsko zaporedje tega fragmenta je zapisano v SEQ ID NO: 4. Krajši mišji PFK-M encim, ki ga kodira krajši mišji msf pfkM gen, ima tako kot humani 443 aminokislin. Humani in mišji kratek fragment sta si močno podobna, med njima namreč obstaja visoka stopnja homologije, in sicer je identičnih 98,2% aminokislinskih ostankov.

Modificiran gen msf pfkM je bil vnesen v plazmid p416 in sev kvasovke S. cerevisiae HD114-8D po postopkih opisanih zgoraj. Kljub temu, da je mišji fragment msf PFK-M izjemno podoben humanemu fragmentu sf PFK-A4, pa je humani omogočal nekoliko hitrejšo rast na ksilitolnem gojišču. Koeficient hitrosti rasti (K') pri humanem fragmentu sf PFK-M in maličnim encimom je imel vrednost 0,2409 (h'¹), medtem ko je pri mišjem fragmentu msf PFK-M in maličnim encimom dosegal le vrednost 0,1383 (h'¹). Kljub temu pa so celice z mišjim fragmentom izkazale podobno porabo ksilitola kot celice s humanim kratkim fragmentom, zaznali pa smo tudi kopičenje fenil etanola.

Izvedbeni primer IV

Četrti izvedbeni primer se nanaša na hibridni encim PFK z oznako HBsf PFKA

Hibridni gen HBsf p/kA, ki je bil pripravljen kot je opisano zgoraj, je omogočal nastanek kratkega fragmenta encima PFK glive Aspergillus niger, z zamenjano nestabilno regijo 99 aminokislinskih ostankov. Aminokislinsko zaporedje tega hibridnega encima je zapisano v SEQ ID NO: 5. Modificiran hibridni gen je bil vstavljen v plazmid p416 in v sev kvasovke S. cerevisiae HD114-8D kot je opisano zgoraj.

Kot kaže slika 9 so kvasne celice s hibridnim encimom HBsf PFKA in maličnim encimom v gojišču s ksilitolom rastle podobno kot celice s fragmentom sf PFK-M in maličnim encimom, kar pomeni, da lahko uporabljajo ksilitol. Med rastjo pod semianaerobnimi pogoji smo zaznali le malo počasnejšo rast (K' 0,2147 (h'¹)) v primerjavi s transformanto sf PFK-M + maeA. Celice s hibridnim genom, a brez gena za malični encim tekom skoraj 30 dnevne inkubacije niso bile sposobne rasti.

Pričujoči izum, ki se nanaša na izpopolnjene modificirane gene za encim 6fosfofrukto-1-kinaza (PFK) mikrobnega, živalskega ali humanega izvor, omogoča nastanek aktivnih krajših fragmentov encima PFK, ki celicam kvasovke S. cerevisiae omogočajo rast na ksilitolu in ksilozi. Stabilnost celic je omogočena z izražanjem gena za malični encim, ki je v celice vnesen skupaj s posameznim fragmentom. Pod semi-anaerobnimi pogoji se mora malični encim napajati z dodatkom glutamata, kot prekurzorja za sintezo malata preko cikla trikarboksilinih kislin. Med fermentativno rastjo na ksilozi ali ksilitolu se v substratu kopiči feniletanol, s čemer je rešen zastavljeni tehnični problem. Opisani izum je uporaben v aplikacijah, ki vključujejo metabolizem pentoznih sladkorjev, še posebno pri postopkih pridobivanja fermentativnih produktov, prednostno pri pridobivanju bioetanola in/ali 2-feniletanola.

Zaporedja

SEQ ID NO; 1

MTHEEHHAAKTLGIGKAIAVLTSGGDAQGMNAAVRAWRVGIFTGARVFFVHEGYQ

GLVDGGDHIKEATWESVSMMLQLGGTVIGSARCKDFREREGRLRAAYNLVKRGITN

LCVIGGDGSLTGADTFRSEWSDLLSDLQKAGKITDEEATKSSYLNIVGLVGSIDNDF

CGTDMTIGTDSALHRIMEIVDAITTTAQSHQRTFVLEVMGRHCGYLALVTSLSCGAD

VWFIPECPPDDDWEEHLCRRLSETRTRGSRLNIIIVAEGAIDKNGKPITSEDIKNLWK

RLGYDTRVTVLGHVQRGGTPSAFDRILGSRMGVEAVMALLEGTPDTPACWSLSG

NQAVRLPLMECVQVTKDVTKAMDEKKFDEALKLRGRSFMNNWEVYKLLAHVRPPV

SKSGSHTVAVMNVGAPAAGMNAAVRSTVRIGLIOGNRVLVVHDGFEGLAKGOIEEA

GWSYVGGWTGQGGSKLGTKRTLPKKSFEQISANITKFNIQGLVIIGGFEAYTGGLEL

MEGRKQFDELCIPFWIPATVSNNVPGSDFSVGADTALNTICTTCDRIKQSAAGTKR

RVFIIETMGGYCGYLATMAGLAAGADAAYIFEEPFTIRDLQANVEHLVQKMKTTVKR

GLVLRNEKCNENYTTDFIFNLYSEEGKGIFDSRKNVLGHMQQGGSPTPFDRNFATK

MGAKAMNWMSGKIKESYRNGRIFANTPDSGCVLGMRKRALVFQPVAELKDQTDFE

HRIPKEQWWLKLRPILKILAKYEIDLDTSDHAHLEHITRKRSGEAAV

SEQ ID NO: 2

MTHEEHHAAKTLGIGKAIAVLTSGGDAQGMNAAVRAWRVGIFTGARVFFVHEGYQ

GLVDGGDHIKEATWESVSMMLQLGGTVIGSARCKDFREREGRLRAAYNLVKRGITN

LCVIGGDGSLTGADTFRSEWSDLLSDLQKAGKITDEEATKSSYLNIVGLVGSIDNDF

CGTDMTIGTDSALHRIMEIVDAITTTAQSHQRTFVLEVMGRHCGYLALVTSLSCGAD

WVFIPECPPDDDWEEHLCRRLSETRTRGSRLNIIIVAEGAIDKNGKPITSEDIKNLWK

RLGYDTRVTVLGHVQRGGTPSAFDRILGSRMGVEAVMALLEGTPDTPACWSLSG

NQAVRLPLMECVQVTKDVTKAMDEKKFDEALKLRGRSFMNNWEVYKLLAHVRPPV

SKSGSHTVAVMNVGAPAAGMNAAVRSTVRIGLIOGNRVLVVHDGFEGL

SEQ ID NO: 3

MTHEEHHAAKTLGIGKAIAVLTSGGDAQGMNAAVRAWRVGIFTGARVFFVHEGYQ

GLVDGGDHIKEATWESVSMMLQLGGTVIGSARCKDFREREGRLRAAYNLVKRGITN

LCVIGGDGSLTGADTFRSEWSDLLSDLQKAGKITDEEATKSSYLNIVGLVGSIDNDF

CGTDMTIGTDSALHRIMEIVDAITTTAQSHQRTFVLEVMGRHCGYLALVTSLSCGAD

VWFIPECPPDDDWEEHLCRRLSETRTRGSRLNIIIVAEGAIDKNGKPITSEDIKNLWK

RLGYDTRVTVLGHVQRGGTPSAFDRILGSRMGVEAVMALLEGTPDTPACWSLSG

NQAVRLPLMECVQVTKDVTKAMDEKKFDEALKLRGRSFMNNWEVYKLLAHVRPPV

SKSGSHTVAVMNVGAPAAGMNAAVR

SEQ ID NO: 4

MTHEEHHAAKTLGIGKAIAVLTSGGDAQGMNAAVRAWRVGIFTGARVFFVHEGYQ

GLVDGGEHIREATWESVSMMLQLGGTVIGSARCKDFREREGRLRAAHNLVKRGITN

LCVIGGDGSLTGADTFRSEWSDLLNDLQKDGKITAEEATKSSYLNIVGLVGSIDNDF

CGTDMTIGTDSALHRIVEIVDAITTTAQSHQRTFVLEVMGRHCGYLALVTSLSCGAD

VWFIPECPPDDDWEEHLCRRLSETRTRGSRLNIIIVAEGAIDKNGKPITSEDIKNLWK

RLGYDTRVTVLGHVQRGGTPSAFDRILGSRMGVEAVMALLEGTPDTPACWSLSG

NQAVRLPLMECVQVTKDVTKAMDEKRFDEAIKLRGRSFMNNWEVYKLLAHVRPPV

SKGGLHTVAVMNVGAPAAGMNAAVRSTVRIGLIQGNRVLWHDGFEGL

SEQ ID NO: 5

MAPPQAPVQPPKRRRIGVLTSGGDAPGMNGWRAWRMAIHSDCEAFAVYEGYEG

LVNGGDMIRQLHWEDVRGWLSRGGTLIGSARCMEFRERPGRLRAAKNMVLRGIDA

LWCGGDGSLTGADVFRSEWPGLLKELVETGELTEEQVKPYQILNIVGLVGSIDNDM

SGTDATIGCYSSLTRICDAVDAITTTAQSHQRTFVLEVMGRHCGYLALVTSLSCGAD

WVFIPECPPDDDWEEHLCRRLSETRTRGSRLNIIIVAEGAIDKNGKPITSEDIKNLWK

RLGYDTRVTVLGHTQRGGAACAYDRWLSTLQGVEAVRAVLDMKPEAPSPVITIREN

KILRMPLMDAVQHTKTVTKHIQNKEFAEAMALRDSEFKEYHFSYINTSTPDHPKLLLP

ENKRMRIGIIHVGAPAGGMNQATRAAVAYCLTRGHTPLAIHNGFPGLCRHYD

SEQ ID NO: 6

ATGGAACCTAAGACTAAGAAGCAACGTTCTTTATACATTCCTTATGCTGGTCCAG

TTTTGTTGGAGTTCCCACTACTGAATAAAGGCTCAGCTTTTAGTATGGAGGAAAG

GAGAAATTTCAATCTGTTGGGCTTATTACCGGAAGTAGTCGAAACTATAGAAGAA

CAGGCTGAAAGGGCATGGATTCAATATCAAGGCTTCAAGACTGAAATTGATAAG

CACATTTACTTACGTAACATACAGGATACAAACGAAACACTTTTCTATAGATTGGT • ·

AAATAACCATTTAGATGAGATGATGCCTGTTATTTACACTCCTACTGTTGGCGCC

GCTTGCGAGAGATTTAGTGAGATATACAGGAGAAGCAGAGGGGTCTTTATCTCC

TATCAAAATAGACATAACATGGATGATATCTTACAAAACGTCCCCAACCACAATA

TTAAAGTTATTGTAGTTACTGATGGGGAAAGAATTCTAGGACTGGGTGACCAAG

GCATAGGCGGTATGGGTATCCCAATTGGAAAACTTTCTTTATACACGGCATGCG

GTGGTATTTCCCCTGCCTATACACTTCCAGTTGTGCTAGACGTGGGCACTAAT

AACCAACAGCTATTAAACGATCCTCTATATATGGGGTGGAGGAATCCTAGAATAA

CTGACGATGAGTACTATGAATTTGTTGATGAATTTATTCAAGCTGTCAAGCAGAG

ATGGCCCGATGTGTTGCTTCAATTTGAGGATTTCGCACAAAAAAATGCAATGCCA

TTATTAAATCGTTACAGAAATGAAATTTGTTCATTTAACGATGATATTCAAGGAAC

CGCCGCCGTTACCGTCGGTACATTAATTGCCGCGTCCAGAGCCGCGGGGGGTC

AGCTGTCTGAAAAAAAGATTGTATTCCTTGGTGCCGGTTCAGCTGGCTGCGGCA

TCGCTGAAATGATTATCGCTCAAACACAAAGGGAAGGCTTAAGTGAAGAAGCTG

CCAGGCAAAAAGTTTTTATGGTTGGTAGATTCGGACTGCTTACTGACAAGATGC

CAAATTTGTTGCCTTTCCAAACCAAGTTAGTTCAGAAAAGGGAAAATTTATCTGA

CTGGGATACTGACTCCGACGTTCTTTCATTGCTTGACGTCGTTAGGAACGTTAAA

CCTGATATTTTGATTGGAGTCTCAGGCCAAACCGGTCTATTTACCGAAGAAATT

ATAAGAGAGATGCACAAGCATTGTCCAAGACCCATCGTGATGCCGTTATCAAAT

CCAACATCAAGGGTCGAAGCTACACCTCAGGATATTATTGCATGGACTGAAGGT

AACGCCTTAGTCGCTACCGGTTCTCCATTTAATCCTGTAGTCTGGAAGGACAAA

ATATATCCGATAGCACAATGTAACAATGCTTTTATATTTCCAGGTATAGGATTGG

GAGTGATTGCCTCTGGTGCGTCCAGAATAACAGACGAAATGCTAATGTCCGCTA

GTGAAACACTGGCCCAATACAGTCCATTAGTTTTAAATGGAGAGGGCTTGGTTC

TTCCTGAACTTAAGGATATACAGAAAGTGAGTAGAGCGATCGCATTTGCAGTCG

GTAAGATGGCTCAACAACAGGGCGTAGCCGTAAAAACCAGTGCAGAAGCTCTG

CAACAGGCTATAGATGACAATTTTTGGCAAGCCGAATATAGGGACTATCGTAGG

ACAAGTATTTAA

SEQ ID NO: 7

MEPKTKKQRSLYIPYAGPVLLEFPLLNKGSAFSMEERRNFNLLGLLPEWETIEEQA

ERAWIQYQGFKTEIDKHIYLRNIQDTNETLFYRLVNNHLDEMMPVIYTPTVGAACERF

SEIYRRSRGVFISYQNRHNMDDILQNVPNHNIKVIWTDGERILGLGDQGIGGMGIPI • ·

GKLSLYTACGGISPAYTLPWLDVGTNNQQLLNDPLYMGWRNPRITDDEYYEFVDE

FIQAVKQRWPDVLLQFEDFAQKNAMPLLNRYRNEICSFNDDIQGTAAVTVGTLIAAS

RAAGGQLSEKKIVFLGAGSAGCGIAEMIIAQTQREGLSEEAARQKVFMVGRFGLLTD

KMPNLLPFQTKLVQKRENLSDWDTDSDVLSLLDWRNVKPDILIGVSGQTGLFTEEII

REMHKHCPRPIVMPLSNPTSRVEATPQDIIAWTEGNALVATGSPFNPWWKDKIYPI

AQCNNAFIFPGIGLGVIASGASRITDEMLMSASETLAQYSPLVLNGEGLVLPELKDIQ

KVSRAIAFAVGKMAQQQGVAVKTSAEALQQAIDDNFWQAEYRDYRRTSI

Claims (15)

1. Fragment encima 6-fosfofrukto-1-kinaza, ki je lahko mikrobnega, živalskega ali humanega izvora, ali je hibrid sestavljen iz delov encimov mikrobnega in humanega izvora, in ima aminokislinsko zaporedje izbrano v skupini, v kateri so zaporedja SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 in SEQ ID NO: 5 in zaporedja, ki imajo po koncu zaporedja SEQ ID NO: 3 dodano eno ali več zaporednih aminokislin iz aminokislinskega zaporedja STVRIGLIOGNRVLVVHDGFEG.

2. Nukleinska kislina, ki kodira aminokislinsko zaporedje kateregakoli fragmenta encima 6-fosfofrukto-1-kinaza po zahtevku 1.

3. Postopek priprave nukleinske kisline po zahtevku 2 za skrajšan fragment encima 6-fosfofrukto-1-kinaza humanega izvora po zahtevku 1, značilen po tem, da se izvede tako, da se humani nativni gen z oznako n pfkM, ki kodra nastanek 85 kDa nativnega PFK-M proteina, pomnoži s PCR reakcijo tako, da nastane dodatno skrajšan modificiran gen z oznako ssf pfkM z restrikcijskim mestom za Xbal na 5' koncu in restrikcijskim mestom za BamHI na 3' koncu, pri čemer se uporabita sledeča začetna oligonukleotida:

- smerni:

5'-GAATTATCTAGAGCCACCATGACCCATGAAGAGCACCATGC-3',

- protismerni: 5’- TAATTCGGATCCTTAGCGAACAGCAGCATTCATGC-3’, ki kodira fragment encima 6-fosfofrukto-1-kinaza z oznako ssf PFK-M.

4. Postopek priprave nukleinske kisline po zahtevku 2 za fragment encima 6fosfofrukto-1-kinaza živalskega izvora po zahtevku 1, značilen po tem, da se izvede tako, da se gen za mišji mišični tip PFK1 pomnoži s PCR reakcijo tako, da nastane skrajšan gen z oznako msf pfkM z restrikcijskim mestom za EcoRI na 5’ koncu in restrikcijskim mestom za Xbal na 3' koncu, pri čemer se uporabita sledeča začetna oligonukleotida:

- smerni: 5’- GAATTAGAATTCATGACCCATGAAGAGCATC-3’; in

- protismerni: 5’- AATTATTCTAGATTACAGACCCTCAAAGCCATC-3’, ki kodira fragment mišjega encima 6-fosfofrukto-1-kinaza z oznako msf PFK-M.

5. Postopek priprave nukleinske kisline po zahtevku 2 za hibriden encim 6fosfofrukto-1-kinaza po zahtevku 1, značilen po tem, da vključuje sledeče korake:

a) pomnoževanje 5' in 3' regije gena, ki kodira nastanek fragmenta PFK1 glive A. niger s PCR reakcijo, pri čemer se uporabita sledeča začetna oligonukleotida:

- smerni za 5’ regijo:

5’-CCATCGCACGCATATGGCTCCCCCCCAAGCTCCC-3';

- protismerni za 5' regijo:

5’-GGTAGTGATGGCGTCGACGGCGTCACAGATGCGAG-3’;

- smerni za 3' regijo:

5'-GCGTCTGGGATATGATACCCGTGTGACTGTGTTGGG-3';

- protismerni za 3' regijo:

5'-TAGGCGTTTATCGCTGCTTCTAGAGGATCCTTACCCGGGATCATAG3';

b) pomnoževanje s PCR reakcijo osrednjo regijo fragmenta sf pfkM, ki je skrajšan humani gen za encim 6-fosfofrukto-1-kinaza, pri čemer se uporabita sledeča začetna oligonukleotida:

- smerni: 5-CGCCGTCGACGCCATCACTACCACTGCCCAG-3'

- protismerni: 5’-CACACGGGTATCATATCCCAGACGCTTAACCACCAG-3’

c) združitev vseh treh regij v drugi PCR reakciji;

d) pomnoževanje hibrida z uporabo sledečih oligonukleotidov:

- smerni: 5’-CCATCGCACGCATATGGCTCCCCCCCAAGCTCCC-3';

- protismerni:

5'-TAGGCGTTTATCGCTGCTTCTAGAGGATCCTTACCCGGGATCATAG3';

e) restrikcija produkta iz prejšnjega koraka ter vektorja pALTER-Ex1 z restriktazama /Vete/ in Xbal·,

f) ločevanje in čiščenje produktov restrikcije iz prejšnjega koraka;

g) ligacija produktov restrikcije iz prejšnjega koraka;

h) transformacija celic E. coli z ligacijsko mešanico iz prejšnjega koraka in gojenje teh celic;

i) izolacija plazmida iz celic iz prejšnjega koraka;

j) uvedba restrikcijskih mest za BamHI in Hindlll v izolirani plazmid iz prejšnjega koraka s PCR reakcijo, pri čemer se uporabita sledeča začetna oligonukleotida:

- smerni za 5' konec:

5’-GAATTAGGATCCGCCACCATGGCTCCCCCCCAAGCTCCCG-3’;

- protismerni za 3’ konec:

5’-TAATTCAAGCTTTTACCCGGGATCATAGTGCCGGCACAG-3’.

6. Vektor za izražanje, ki vsebuje nukleinsko kislino po kateremkoli izmed zahtevkov od 2 do 5, ali nukleinsko kislino, ki kodira fragment humanega encima 6fosfofrukto-1-kinaza z aminokislinskim zaporedjem SEQ ID NO: 2.

7. Vektor za izražanje po zahtevku 6, značilen po tem, da nadalje vsebuje konstitutiven ali inducibilen promotor, kontrolna zaporedja in druga zaporedja, ki omogočajo izražanje nukleinske kisline po kateremkoli izmed zahtevkov od 2 do 5 ali nukleinske kisline, ki kodira fragment humanega encima 6-fosfofrukto-1-kinaza z aminokislinskim zaporedjem SEQ ID NO: 2 v katerikoli primerni gostiteljski celici, prednostno v celici kvasovke Saccharomyces cerevisiae.

8. Vektor za izražanje po zahtevku 6 ali zahtevku 7, značilen po tem, da je lahko vektor za izražanje katerikoli primeren vektor, prednostno pa je vektor plazmid p416.

9. Postopek priprave vektorja za izražanje po kateremkoli izmed zahtevkov od 6 do 8, značilen po tem, da vključuje sledeče korake:

a) restrikcija nukleinskih kislin po kateremkoli izmed zahtevkov od 3 do 5 ali nukleinske kisline, ki kodira fragment humanega encima 6-fosfofrukto-1-kinaza z aminokislinskim zaporedjem SEQ ID NO: 2, s primernimi restrikcijskimi encimi;

b) restrikcija vektorja z enakimi encimi kot je potekala restrikcija nukleinskih kislin v predhodnem koraku;

c) ločevanje in čiščenje restrikcijskih produktov iz predhodnih korakov;

• · · · ·

d) ligacija restrikcijskih produktov iz prejšnjega koraka.

10. Gostiteljska celica z vneseno nukleinsko kislino po kateremkoli izmed zahtevkov od 2 do 5, z nukleinsko kislino, ki kodira fragment humanega encima 6fosfofrukto-1-kinaza z aminokislinskim zaporedjem SEQ ID NO: 2, ali z vnesenim vektorjem po kateremkoli izmed zahtevkov od 6 do 8.

11. Gostiteljska celica po zahtevku 10, značilna po tem, da nadalje vsebuje in izraža gen za malični encim maeA.

12. Gostiteljska celica po zahtevku 10 ali zahtevku 11, značilna po tem, da je lahko mikrobnega, rastlinskega ali živalskega izvora, prednostno pa je gostiteljska celica kvasovka S. cerevisiae, zlasti sev kvasovke S. cerevisiae HD114-8D.

13. Gojenje gostiteljske celice po kateremkoli izmed zahtevkov od 10 do 12 v kateremkoli primernem gojišču, ki vsebuje glutaminsko kislino ali glutamat kot vir dušika.

14. Uporaba fragmentov encima 6-fosfofrukto-1-kinaza z aminokislinskim zaporedjem izbranim v skupini, v kateri so SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 in zaporedja, ki imajo po koncu zaporedja SEQ ID NO: 3 dodano eno ali več zaporednih aminokislin iz aminokislinskega zaporedja STVRIGLIOGNRVLVVHDGFEG, nukleinskih kislin, vektorjev za izražanje in/ali gostiteljskih celic po kateremkoli izmed predhodnih zahtevkov pri aplikacijah, ki vključujejo metabolizem pentoznih sladkorjev.

15. Uporaba po zahtevku 14, značilna po tem, da je aplikacija, ki vključuje metabolizem pentoznih sladkorjev, pridobivanje fermentativnih produktov, prednostno pridobivanje bioetanola ali 2-feniletanola.