CN113330119A - 使用源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子用于组成型高表达的表面表达载体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子及其用途，更具体而言，涉及一种具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子，包含所述启动子的表达载体，以及用所述表达载体转化的微生物。用包含根据本发明的启动子的表达载体转化的微生物可以在细胞表面上有效表达靶蛋白，因此可用作疫苗载体等。此外，本发明涉及一种具有编码聚‑γ‑谷氨酸合成酶的基因pgsA的表面表达载体，以及一种使用所述载体在微生物表面上表达靶蛋白的方法。将含有插入其中的外源基因的载体转化到微生物中，并使外源蛋白能够在微生物表面上稳定表达。
Description
技术领域
本发明涉及一种源自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的半乳糖变旋酶基因启动子，更具体而言，涉及一种由SEQ ID NO：1表示的源自干酪乳杆菌半乳糖变旋酶基因启动子，包含所述启动子的表达载体和经所述表达载体转化的微生物。
此外，本发明涉及一种新载体，其使用源自芽孢杆菌(Bacillus·.)菌株并参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白(pgsA)在微生物表面上有效表达外源蛋白。而且，本发明涉及一种通过使用源自芽孢杆菌菌株并参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白在微生物表面上表达外源蛋白而产生蛋白质的方法。
背景技术
乳酸菌是食品微生物中最重要的微生物，已获得GRAS(通常被认为是安全的)地位，因此已被用于多种食品中。这些乳酸菌具有质粒、噬菌粒、转座子等，因此使得可以开发用于将基因导入细胞中的载体。而且，这些乳酸菌易于根据本领域已知的常规方法进行转化，并且由于已经建立了可食用的选择性标记基因，因此被认为最适合用于可食用用途。另外，乳酸菌具有抑制有害的肠道细菌、清洁肠道、降低血液胆固醇水平、增加营养价值、抑制病原体感染和减轻肝硬化的作用，以及抗癌作用和通过巨噬细胞活化增强免疫系统的作用。
为了在乳酸菌中产生有用的外源蛋白，必需建立高效的启动子(J.M.van derVossen et al.，Appl.Environ.Microbial.，Vol.53，pp 2452-2457，1987；Teija Koivulaet al.，Appl.Environ.Microbial.，Vol.57，pp 333-340，1991；Pascalle G.G.A.et al.，Appl.Environ.Microbial.，Vol.62，pp 3662-3667，1996)，但是对乳酸菌基因组的研究依然非常不足。在乳酸菌的基因组中，至今仅对长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NCC2705、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)V583和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WFCS 1的基因组进行了测序，目前多种乳酸菌的基因组测序的研究正在进行中。另外，作为源自乳酸菌的启动子，目前仅已知源自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)A054、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1614和克氏乳球菌(Lactococcus cremoris)Wg2基因组的启动子(Philippe Slos et al.，Appl.Environ.Microbial.，Vol.57，pp 1333-1339，1991；Teija Koivula et al.，Appl.Environ.Microbial.，Vol.57，pp 333-340，1991；J.M.van der Vossen et al.，Appl.Environ.Microbial.，Vol.53，pp 2452-2457，1987)。
近年来，在美国和欧洲，已经进行了以下研究：使用乳酸菌开发活疫苗；用于将有用的激素药物递送至肠道中的载体及为此建立有效的遗传资源；研发用于乳酸菌的插入载体。特别地，由于乳酸菌中包含的大量的未甲基化的CpG DNA、脂磷壁酸、肽聚糖等已知可作为免疫佐剂，因此，乳酸菌被认为是非常有用的疫苗载体。此外，乳酸菌具有的许多优势在于，由于乳酸菌对胆酸和胃酸具有抗性，因此可以将抗原递送至肠道中，并在肠道中诱导粘膜免疫(Jos F.M.K.Seegers，Trends Biotechnol.，Vol.20，pp 508-515，2002)。
然而，为了使用乳酸菌作为疫苗载体，必须开发一种通过将用于产生预防疾病抗体的抗原蛋白提呈至细胞内部或外部来促进抗原-抗体反应的技术。实际上，多种研究表明乳酸菌适合作为疫苗载体。这些研究包括证实其中表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的L1蛋白的乳酸菌的抗体诱导能力(Karina Araujo Aires et al.，Appl.Environ.Microbiol.Vol.72，pp 745-752，2006)，以及证实分泌和表达IL-2(白细胞介素-2)的乳酸菌菌株的疾病治疗作用(Lothar Steidler et al.，Nat.Biotechnol.Vol.21，pp 785-789，2003)。
如上所述，虽然已经积极地进行了表达靶蛋白的乳酸菌的多种应用的研发和乳酸菌的科学研究，但是仍然存在靶蛋白的表达水平不足的问题，以及当在活体内施用使用诱导型表达启动子获得的蛋白质时，蛋白质不能持续表达的问题。
另外，细胞表面展示或细胞表面表达指的是将蛋白质或肽与适当的表面锚定基序融合并在革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌、真菌、酵母或动物细胞的表面上表达的技术(LeeS.Y.，et al.，Trends Biotechnol.，21：4552，2003)。第一种细胞表面展示技术是在1980年代使用具有相对简单表面的噬菌体开发的，是一种将肽或小蛋白质与丝状噬菌体的pIII融合并表达的技术。因此，第一种细胞表面展示技术被称为表面表达系统。使用噬菌体的细胞表面展示已经用于筛选抗体、表位和高亲和力配体，但是具有可以在噬菌体表面展示的蛋白质的尺寸相对有限的局限性。因此，作为其替代方案，已经开发了使用细菌的细胞表面表达。这种细胞表面展示是一种通过使用诸如细菌或酵母的微生物的表面蛋白作为表面锚定基序在微生物表面上稳定表达外源蛋白的技术。
为了使用特定生物体的外膜蛋白在细胞表面上表达外源蛋白，应该在基因水平将合适的表面蛋白和外源蛋白彼此连接以形成融合蛋白，并且所述融合蛋白应该稳定地穿过细胞内膜并应该附着并保持在细胞表面。为此，优选将具有以下特性的蛋白质用作表面锚定基序。即，(1)所述蛋白质在N末端具有能够通过细胞内膜的分泌信号；(2)所述蛋白质应该具有可稳定附着在细胞外膜上的靶向信号；(3)所述蛋白质可以在细胞表面在不会不利地影响细胞生长的范围内大量表达，从而可以表现出高活性；以及(4)所述蛋白质无论其尺寸如何应该能够稳定表达，从而可以用于多种反应中(Georgiou et al.，TIBTECH，11：6，1993)。此外，还需要对这种表面锚定基序进行基因工程，使得将其插入到宿主细胞表面上的外膜蛋白的N末端、C末端或中央部分(Lee etal.，TIBTECH，21：45-52，2003)。
为了使蛋白质在细菌表面上表达，所述蛋白质应在其一级序列中具有使细胞中生物合成的蛋白质能够通过细胞膜的分泌信号。另外，在革兰氏阴性细菌的情况下，所述蛋白质应该穿过内细胞膜和细胞膜间隙，应该插入到并附着在外细胞膜上，并应该锚定在膜上以从膜向外突出。在细菌的情况下，这些用于将蛋白质锚定到细胞表面的具有分泌信号和靶向信号的蛋白质的例子包括表面蛋白、特定酶和毒素蛋白质。实际上，如果将这些蛋白质的分泌信号和靶向信号与适当的启动子一起使用，则所述蛋白质可以在细菌表面上成功表达。用于外源蛋白表面表达的细菌表面蛋白可以大致分为四种类型：外膜蛋白、脂蛋白、分泌蛋白和细胞表面细胞器蛋白(cell surface organ protein)。至今，已经尝试使用主要存在于革兰氏阴性细菌中的表面蛋白，例如，LamB、PhoE和OmpA，在细菌表面上表达必需的外源蛋白。然而，当使用这些蛋白质时，将外源蛋白插入到细胞表面上的突出环中，因此可以在结构上插入的蛋白质尺寸受到限制。由于要插入的外源蛋白的C末端和N末端应该在空间上彼此靠近，因此当它们相距较远时，会出现两个末端通过连接肽彼此靠近的问题。
实际上，当使用LamB或PhoE时，插入由50至60个或更多个氨基酸组成的外源多肽会导致结构限制，从而无法形成稳定的膜蛋白[Charbit et al.，J.Immunol.，139：1658-1664(1987)；Agterberg et al.，Vaccine，8：85-91(1990)]。尽管也存在使用OmpA将外源蛋白插入到突出环中的情况，但是为了克服结构限制，仅使用含有能够锚定至外膜的最小靶向信号的一些OmpA片段。存在将β-内酰胺酶与OmpA靶向信号的C-末端通过这种方法连接在细胞表面上表达的情况。
另外，近年来，已经进行尝试使用源自假单胞菌(Pseudomonas sp.)的冰核蛋白(INP)作为革兰氏阳性细菌的外膜蛋白进行表面表达[Jung et al.，Nat，Biotechnol，16：576-560(1998)，Jung et al.，Enzyme Microb.Technol，22(5)：348-354(1998)，Lee etal.，Nat.Biotechnol，18：645-648，(2000)]。Jung等将果聚糖蔗糖酶融合至由N末端、中央重复区和C末端组成的冰核蛋白的C末端，将羧甲基纤维素酶融合至由N末端和C末端组成而没有中央重复区的冰核蛋白的C末端，诱导各个果聚糖蔗糖酶和羧甲基纤维素酶的表面表达，并测量每种酶的活性。Lee等将乙型肝炎病毒表面抗原和丙型肝炎病毒核抗原融合至由N末端，或者由N末端和C末端组成的冰核蛋白的各末端，并在大肠杆菌(E.coli)或伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)Ty21a菌株的表面上表达抗原，然后证实这些抗原可以用作复合物活疫苗。
脂蛋白也用作用于表面表达的表面蛋白。特别地，大肠杆菌的脂蛋白在其N末端具有分泌信号，并且可以穿过细胞内膜，并且在其末端的L-半胱氨酸通过共价键直接附着于细胞外膜脂质或内膜脂质。主要脂蛋白Lpp的N末端与外细胞膜结合，并且其C末端与细胞壁(肽聚糖，PG)结合，因此，当主要脂蛋白Lpp与外膜蛋白OmpA的片段连接时，它可以稳定地向细胞外膜分泌外源蛋白，并在细胞表面上表达外源蛋白[Francisco et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，489：2713-2717(1992)]。利用脂蛋白的这些特性，另一种脂蛋白TraT被用于表面表达诸如脊髓灰质炎病毒的C3表位的肽[Felici et al.，J.Mol.Biol.，222：301-310(1991)]。另外，还没有鉴定确切功能的细胞壁相关的脂蛋白(PAL)用于重组抗体的表面表达[Fuchs et al.，Bio/Technology，9：1369-1372(1991)]。在这种情况下，PAL的C末端连接至细胞壁，其N末端连接至重组抗体，所得的融合蛋白在细胞表面上表达。
穿过细胞外膜的分泌蛋白也可以用作表面蛋白。然而，在革兰氏阴性细菌的情况下，分泌的蛋白是不成熟的(developed)，仅一些分泌的蛋白质具有参与其特定分泌机制并有助于通过外膜的蛋白质。例如，克雷伯氏菌(Klebsiella)属中的支链淀粉酶是一种在N末端取代有脂质成分的脂蛋白，它与细胞外膜结合，然后被完全分泌到细胞培养基中。Kornacker等使用支链淀粉酶的N末端片段在细胞表面上表达β-内酰胺酶，但是缺点是表达的支链淀粉酶-β-内酰胺酶融合蛋白与细胞表面结合了片刻，然后释放到细胞培养基中。另外，当使用支链淀粉酶的N末端片段表达周质间隙蛋白碱性磷酸酶时，由于14种以上的蛋白质参与其分泌，因此碱性磷酸酶不能稳定地在细胞表面上表达[Kornacker，et al.，Mol.Microl.，4：1101-1109(1990)]。
源自病原微生物奈瑟氏球菌(Neisseria)并具有独特分泌机制的IgA蛋白酶在其C末端片段中具有一个信号，通过该信号N末端蛋白酶被锚定在外细胞膜上。蛋白酶到达外细胞膜并从细胞表面突出后，蛋白酶通过自身水解作用分泌到细胞培养基中。使用这个IgA蛋白酶片段，Klauser等在细胞表面上稳定表达了12-kDa的霍乱毒素B亚基[Klauser et al.，EMBO J.，9：1991-1999(1990)]。然而，由于在分泌过程中在周质间隙中发生的蛋白质折叠，融合蛋白的分泌受到抑制。
另外，在革兰氏阴性细菌的情况下，存在于表面结构上并可以用于表面表达的细胞的细胞器包括鞭毛、菌毛蛋白和纤毛。使用鞭毛的组成亚单元鞭毛蛋白稳定表达霍乱毒素B亚基和其它源自乙型肝炎病毒的肽，这些肽与各自的抗体强烈反应[Newton et al.，Science，244：70-72(1989)]。作为尝试使用看起来像线的纤毛的组成蛋白纤毛蛋白在细胞表面上表达外源肽的结果，仅小肽被成功地表达[Hedegaard et al.，Gene，85：115-124(1989)]。
除了上述通过革兰氏阴性细菌的表面蛋白表面表达外源蛋白的尝试外，最近还尝试了使用革兰氏阳性细菌的表面蛋白进行表面表达[Samuelson et al.，J.Bacteriol.，177：1470-1476(1995)]。这种尝试还需要能够穿过内部细胞膜的分泌信号和附着在细胞膜上的表面锚定基序。实际上，有如下的例子，其中使用源自猪葡萄球菌(Staphylococcushyicus)的脂肪酶作为分泌信号，使用源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A作为膜锚定基序，在革兰氏阳性细菌的表面上有效地表达了由80个氨基酸组成的疟疾血液阶段抗原和源自链球菌蛋白G的白蛋白相关蛋白。
通过研究革兰氏阴性和阳性细菌的表面的蛋白质的表达，已经开发了许多有用的蛋白质表达系统，并已在美国、欧洲和日本申请专利保护。其中，发现5个案例涉及源自革兰氏阴性细菌外膜蛋白的用途(WO9504069、WO9324636、WO9310214、EP603672和US5356797)，发现1个案例(WO9410330)涉及细胞表面细胞器菌毛蛋白的用途，还发现1个案例涉及细胞表面脂蛋白的用途。
为了使用如上所述的细菌外膜蛋白在细胞表面上表达外源蛋白，应该将合适的外膜蛋白和外源蛋白在基因水平彼此连接以形成融合蛋白，所述融合蛋白应该稳定地穿过内细胞膜，并应该附着并保持在外细胞膜上。然而，尚未开发出满足所有上述条件的表面锚定基序，并且至今现有技术保持在克服上述案例的缺点的水平。
同时，本发明人先前开发了一种新载体，其使用源自枯草芽孢杆菌Chungkookjang变种(Bacillus subtilis var.Chungkookjang)菌株的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因(pgsBCA)作为新的表面锚定基序在微生物表面上有效表达外源蛋白质，以及一种在用经所述载体转化的微生物的表面上表达靶蛋白的方法(韩国专利No.0469800)。
因此，本发明人相信，如果开发出使用上述专利中公开的表面锚定基序在乳酸菌上能够稳定且高表达抗原或表位的载体，则可以生产出一种适合人的疫苗，并且由于抗原暴露于乳酸菌的表面，因此可以有效诱导免疫反应。基于此信念，本发明人进行了筛选能够在乳酸菌上高表达靶蛋白的启动子的过程，结果发现，当使用半乳糖变旋酶基因启动子时，与使用常规启动子比较，基因表达得到改善。此外，本发明人对使用源自芽孢杆菌菌株聚-γ-谷氨酸合成酶基因(pgsA)作为新的表面锚定基序进行了广泛研究，结果，开发了一种新的载体，所述载体使用pgsA基因在微生物表面上有效表达外源蛋白，并开发了一种使用pgsA基因在微生物表面上表达大量外源蛋白的方法，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的主要目的是提供一种诱导靶基因表达增加的源自干酪乳杆菌的启动子。
本发明的另一个目的是提供一种启动子和编码靶蛋白的基因彼此连接的表达载体。
本发明的又一个目的是提供一种用表达载体转化的微生物，和使用经转化的微生物制备靶蛋白的方法。
本发明的又一个目的是提供一种使用经转化的微生物生产微生物疫苗的方法。
本发明的再一个目的是提供一种方法：包括：源自芽孢杆菌菌株并且参与聚-γ-谷氨酸的合成的外膜蛋白，作为能够在微生物表面上表达大量外源蛋白的新的表面锚定基序；使用选择的外膜蛋白，构建在微生物表面上可表达外源蛋白或肽的用于表达靶蛋白的表面表达载体；以及在通过用表面表达载体转化获得的转化体的表面上有效表达外源蛋白。
技术方案
为了达到上述目的，本发明提供了一种源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子。
在本发明中，所述启动子可由SEQ ID NO：1表示。
本发明还提供了一种靶基因与启动子的末端连接的表达载体和用所述表达载体转化的微生物。
本发明还提供了一种启动子、聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因和编码靶蛋白的基因彼此连接的微生物表面表达载体，和用所述表达载体转化的微生物。
在本发明中，靶蛋白可以是抗原。具体而言，靶蛋白可以是选自激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号蛋白或其片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白、结合域、肽、抗原、粘附蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节因子、凝血因子和植物生物防御诱导蛋白中的任意一种。
在本发明中，聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因可以是pgsA、pgsB和pgsC中的任一种或更多种。
本发明还提供了一种通过培养经转化的微生物在微生物表面上表达靶蛋白的方法。
本发明还提供了一种用于生产微生物疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过培养用微生物表面表达载体转化的微生物在微生物表面上表达抗原；和(b)回收在其表面上具有表达的抗原的微生物。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于表达靶蛋白的表面表达载体，所述表面表达载体包括：编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA；和编码靶蛋白的基因。
在本发明中，基因pgsA可以源自产生聚-γ-谷氨酸的芽孢杆菌菌株。
在本发明中，编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA可以具有SEQ ID NOs：18至22和29至31中的任一核苷酸序列。优选地，编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA可以具有SEQ ID NOs：18至21和29至31中的任一核苷酸序列。
在本发明中，可以将接头插入到编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA的末端，可以将编码靶蛋白的基因插入到插入的接头中。
在本发明中，靶蛋白可以是其中靶蛋白的氨基酸序列的一部分已经被去除或以定点方式突变从而有利于表面表达的蛋白。
本发明还提供了一种用表面表达载体转化的微生物。在本发明中，用于转化的微生物可以是经过修饰使得其不产生参与表达的靶蛋白降解的细胞内或细胞外蛋白酶，从而有利于靶蛋白的细胞表面表达的微生物。
在本发明中，微生物可以是乳酸菌。在本发明中，乳酸菌的实例包括乳杆菌(Lactobacillus sp.)、链球菌(Streptococcus sp.)和双歧杆菌(Bifidobacterium sp)。一般地，作为宿主，乳杆菌可以选自嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、植物乳杆菌(L.plantarum)、发酵乳杆菌(L.ferementum)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、约氏乳杆菌LJI(L.johnsonii LJI)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)和保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)；链球菌可以是嗜热链球菌(S.thermophilus)；以及双歧杆菌可以选自婴儿双歧杆菌(B.infantis)、双歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、伪长双歧杆菌(B.psuedolongum)、短双歧杆菌(B.breve)、乳酸双歧杆菌(B.lactis)Bb-12和青春双歧杆菌(B.adolescentis)。更优选地，微生物是乳杆菌。
本发明还提供了一种用于靶蛋白的细胞表面表达的方法，所述方法包括以下步骤：通过培养经转化的微生物在细胞表面上表达靶蛋白；和回收具有在其表面上表达的靶蛋白的细胞。
在本发明中，靶蛋白可以是选自激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号蛋白或其片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白、结合域、肽、抗原、粘附蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节因子、凝血因子和植物生物防御诱导蛋白中的任意一种。
本发明还提供了一种通过将上述方法产生的并在其表面上具有表达抗原的细胞施用于除了人类以外的脊椎动物来诱导体液免疫或细胞免疫的方法。
本发明还提供了一种在除了人类以外的脊椎动物中产生抗体的方法，所述方法包括：通过将上述方法产生的并在其表面上具有表达抗原的细胞施用于脊椎动物来诱导免疫反应；和回收由免疫反应产生的抗体。
本发明还提供了一种用于表达靶蛋白的表面表达载体，其中，所述载体被应用于革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。
本发明还提供了一种在革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞的表面上表达靶蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过将编码靶蛋白的基因插入到微生物表面表达载体中构建重组载体；(b)用重组载体转化革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞；和(c)通过培养经转化的宿主细胞在经转化的宿主细胞表面上表达靶蛋白。
有益效果
本发明提供了一种能够在乳酸菌上高表达靶蛋白的源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶启动子，以及提供了一种包含所述启动子的表达载体。由于载体包含将靶蛋白锚定在微生物表面的基因，靶蛋白可以在使用所述载体获得的转化体中有效地在细胞表面上表达，因此乳酸菌可以用作疫苗载体。
另外，根据本发明的用于表达靶蛋白的表面表达载体可以稳定地表达靶蛋白。根据本发明的用于表达靶蛋白的表面表达载体可以在重组微生物的表面上表达靶蛋白，同时组成性地表达靶蛋白，因此可以有效地用于生产抗原以生产必需的疫苗。
附图说明
图1示出获得本发明的半乳糖变旋酶启动子的方法；
图2示出使用本发明的半乳糖变旋酶启动子构建的表面表达载体的遗传图谱；
图3示出进行蛋白质印迹以测定通过各个启动子在用本发明的表达载体转化的乳酸菌上的靶蛋白表达水平的结果；
图4示出表明通过本发明的表达载体的靶蛋白在微生物表面上表达的共聚焦荧光显微镜观察的结果；
图5示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-PgsA-EGFP的遗传图谱；
图6示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA1(pgsA基序1-60 a.a)-EGFP的遗传图谱；
图7示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA2(pgsA基序1-70 a.a)-EGFP的遗传图谱；
图8示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA3(pgsA基序1-80 a.a)-EGFP的遗传图谱；
图9示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA4(pgsA基序1-100 a.a)-EGFP的遗传图谱；
图10示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA5(pKV-pgsA 1-188 a.a)-EGFP的遗传图谱；
图11示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA6(pgsA基序25-60 a.a)-EGFP的遗传图谱；
图12示出使用于酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA7(pgsA基序25-70 a.a)-EGFP的遗传图谱；
图13示出使用干酪乳杆菌作为宿主的根据本发明的表面表达载体pKV-Pald-pgsA8(pgsA基序25-100 a.a)-EGFP的遗传图谱；
图14描述了显示本发明的用各个表面表达载体pKV-Pald-pgsA1至pKV-Pald-pgsA8转化的干酪乳杆菌中EGFP蛋白的表面表达的蛋白质印迹图。
具体实施方式
实施例2：使用半乳糖变旋酶启动子的用于EGFP蛋白表达的表面表达载体(pKV-Pgm-pgsA-EGFP)的构建
为了构建用于由半乳糖变旋酶启动子诱导表达的EGFP蛋白的表达的表达载体，将源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶启动子插入到具有可在大肠杆菌和干酪乳杆菌中复制的RepE作为复制起点的载体中，然后将源自枯草芽孢杆菌Chungkookjang变种的表面锚定基序pgsA引入到启动子的下游。然后，将使靶基因能够插入到pgsA基因的羧基末端的BamHI和XbaI限制酶位点加入其中，从而构建包含半乳糖变旋酶启动子的pKV-Pgm-pgsA载体。作为pgsA基因，使用在韩国专利No.0469800中公开的pgsA基因。
通过使用合成的EGFP基因片段作为模板以及SEQ ID NOs：4和5的引物进行PCR，获得EGFP基因。
结果，获得了在其5′末端包含BamHI限制酶位点和在其3′末端包含XbaI限制酶位点的DNA片段。将获得的包含EGFP基因的755-bp的DNA片段用BamHI和XbaI酶切，并连接至pKV-Pgm-pgsA载体的pgsA的C末端，从而构建了当转化成乳酸菌宿主时，能够在细胞表面上表达EGFP蛋白的表达载体pKV-Pgm-pgsA-EGFP(图2)。
一方面，本发明涉及一种源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子。
在本发明中，为了获得半乳糖变旋酶基因启动子，通过PCR方法扩增干酪乳杆菌的基因组，使用基因克隆技术分离源自干酪乳杆菌的700-bp启动子(SEQ ID NO：1)。本发明的半乳糖变旋酶启动子是诱导干酪乳杆菌中存在的半乳糖变旋酶基因的表达的启动子。一般而言，启动子包含RNA聚合酶结合区以诱导转录起始，RNA合成的程度取决于启动子的核苷酸序列。为此原因，基因的表达水平可以根据启动子的种类而变化。
为了测定本发明的启动子的表达诱导能力，将EGFP基因插入到各个包含所述启动子的表达载体和包含常规醛缩酶启动子的表达载体中，用各个构建的载体转化干酪乳杆菌。然后，通过蛋白质印迹测定各个启动子诱导表达的EGFP的表达水平。结果，可以证实，使用包含半乳糖变旋酶启动子的载体获得的转化体中EGFP的表达水平有效提高，并且本发明的启动子的表达诱导能力也比常规醛缩酶启动子更强。
另一方面，本发明还涉及一种包含半乳糖变旋酶启动子和编码靶蛋白的基因的表达载体，以及用所述表达载体转化的微生物。
一般而言，表达载体最低限度地需要能够转录的启动子、启动子下游表达靶蛋白的基因、在微生物中可以通过自身复制被扩增的基因和用于选择靶向载体的选择标记基因，除了靶基因以外的所述基因可以根据载体的骨架和选择的宿主细胞而变化。在载体构建中最低限度地需要的基因对于本领域技术人员是众所周知的，并且可以根据表达条件和靶基因的预期用途容易地选择。一般而言，载体的骨架可以具有pWV01或pAMβ1的复制起点，但是本发明的范围不限于此。
可以使用多种方法和手段将用于表达不仅仅是靶蛋白还有包含调节区的基因的载体或DNA序列引入到合适的宿主细胞中。例如，可以使用生化方法，例如转化、转染、结合、原生质体融合和磷酸钙沉淀，或物理方法，例如DEAE(二乙氨乙基)葡聚糖和电穿孔。
将表达载体引入到合适的宿主细胞中之后，可以使用本领域已知的常规技术仅筛选转化体。换言之，可以使用适合宿主细胞生长的含抗生素的选择培养基来筛选含有能够表达靶基因的载体的转化体。
另一方面，本发明涉及一种半乳糖变旋酶启动子、聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因和编码靶蛋白的基因彼此连接的微生物表面表达载体，以及用所述表面表达载体转化的微生物。
作为表面锚定基序的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因包含在启动子的下游，其中表面锚定基序在载体的DNA序列中位于启动子和靶蛋白之间。表面锚定基序的基因在靶基因的表面表达中起决定性作用，因为它与靶蛋白的起始部分连接，从而在编码为氨基酸序列后，诱导表达的蛋白结合至细胞膜的脂质。将表面锚定基序的基因与启动子和靶基因连接的方法可以通过本领域技术人员容易实践的常规技术进行，包括PCR、限制酶消化和连接。
在本说明书中，术语“宿主”或“微生物”指的是益生革兰氏阳性乳酸菌。益生微生物的一般选择标准包括以下：(i)源自人类的微生物；(ii)对胆汁、酸、酶和氧气稳定；(iii)粘附至肠粘膜的能力；(iv)在人胃肠道中的定植潜力；(v)抗微生物物质的产生；和(vi)明显的有效性和安全性。基于这样的标准，显然乳酸菌是生物相容的并且对人体无害。因此，与使用细菌菌株生产疫苗的常规方法不同，用于预防或治疗疾病为了递送基因或蛋白质，当使用乳酸菌作为宿主的转化体应用于人体时，不需要对细菌菌株进行解毒的步骤。
在本发明中，微生物的实例包括乳杆菌(Lactobacillus sp.)、链球菌(Streptococcus sp.)和双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)。一般地，作为宿主，乳杆菌可以选自嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、植物乳杆菌(L.plantarum)、发酵乳杆菌(L.ferementum)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、约氏乳杆菌LJI(L.johnsoniiLJI)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)和保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)；链球菌可以是嗜热链球菌(S.thermophilus)；以及双歧杆菌可以选自婴儿双歧杆菌(B.infantis)、双歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、伪长双歧杆菌(B.psuedolongum)、短双歧杆菌(B.breve)、乳酸双歧杆菌(B.lactis)Bb-12和青春双歧杆菌(B.adolescentis)。更优选地，微生物是乳杆菌。
在本发明中，构建了表达EGFP的表达载体(pKV-Pgm-pgsA-EGFP)，其包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含：启动子，该启动子与表面锚定基序pgsA连接，并且可以表达作为靶基因的EGFP基因；以及通过将表达载体插入到干酪乳杆菌中构建了表达EGFP的转化体。
由本发明的具有改善的基因表达能力的启动子表达的靶蛋白在细胞表面上表达，因此本发明的经转化的微生物可以用作疫苗。
另一方面，本发明涉及一种使用用表面表达载体转化的乳酸菌生产微生物疫苗的方法。
疫苗是为了预防疾病而使用活生物体刺激免疫系统的药物。免疫激活是指通过在生物体内产生抗体、刺激T淋巴细胞或刺激其它免疫细胞(例如巨噬细胞)有效去除抗原的过程。本领域技术人员容易理解与这些细节有关的免疫学的详细概述(Barrett，J.T.，Textbook of Immunology，1983)。
可以将表达靶蛋白的经转化的微生物疫苗作为抗原施用于哺乳动物，优选人类。
可以使用标准技术进行疫苗组合物的制备。适于向受试者施用的剂量根据基因产物的抗原性而变化，并且可以是疫苗可以充分诱导常规免疫应答的量。剂量可以通过常规实验程序容易地确定。疫苗的一般初始剂量为0.001至1mg抗原/kg体重。根据需要，可以增加剂量以提供优选的保护水平，或者以多次剂量使用疫苗。剂量可以由本领域技术人员确定，也可以取决于多种因素而变化，例如配制方法、施用方式、受试者的年龄、体重和性别、病理状况、饮食、施用持续时间、施用途径、排泄率和响应灵敏度。
为了使疫苗有效地产生抗体，抗原性物质应该在活体内释放，使得可以实现接种疫苗的受试者中的抗体产生机制。因此，必须优先在活体内引入基因产物的微生物载体用于免疫反应。为了刺激由本发明的转化体呈递的抗原的优选反应，优选通过内服、胃肠道插管或以气雾剂形式直接向肠或肺施用疫苗，即使如静脉注射、肌内注射或皮下注射的施用方法也是可以的。
对于疫苗组合物内服施用于受试者，疫苗组合物优选以亲液形式，例如，胶囊形式提供。胶囊以包含Eudragate S、Eudragate L、乙酸纤维素、邻苯二甲酸纤维素或羟脯氨酰基甲基纤维素的肠溶衣的形式提供。胶囊可以原样使用，也可以在将其重构为亲液性物质如悬浮液后施用。优选在pH值适于经转化的微生物生存的缓冲液中进行重构。为了保护经转化的微生物和疫苗免于胃酸，优选在每次施用疫苗之前施用碳酸氢钠制剂。可以选择性地将疫苗制备用于肠胃外给药、鼻腔给药或乳房内给药。
包含本发明的启动子和包含编码能够作为抗原的靶蛋白的基因的经转化的乳酸菌可以在消化道粘膜中形成菌落的同时表现出期望的功效，从而可以获得期望的功效。另外，上述乳酸菌可以在维持所需的转化特性的同时共同施用载体中的选择抗生素以顺利形成定植，并且可以控制在转化体中在细胞分裂期间能够发育的不具有载体的不希望的乳酸菌的发育。可以使用本领域已知的任何常规技术容易地进行抗生素的选择过程，并且可以在上述过程中使用的选择的抗生素可以根据表达载体中包含的抗生素基因而变化。
此外，在本发明中，使用PgsA基因片段进行了下面实施例4中构建的表面表达载体(pKV-Pald-PgsA-EGFP)的改进，使得它可以在乳酸细菌宿主中更稳定地表现出高基因表达水平。
首先，在PgsA片段中，通过使用表面表达载体(pKV-Pald-PgsA-EGFP)作为模板和SEQ ID NOs：8至17的引物进行PCR，获得分别含有1-60a.a、1-70a.a、1-80a.a、1-100a.a和1-188a.a的PgsA片段。
结果，获得了含有醛缩酶启动子和各个PgsA基序片段的DNA片段。各个DNA片段在其5′末端含有SphI限制酶位点，在其3″末端含有BamHI限制酶位点。将获得的各DNA片段用SphI和BamHI处理以获得片段。另外，可以证实，PgsA1至A5基序片段分别具有SEQ ID NOs：18至22的核苷酸序列。
同时，在PgsA片段中，通过使用表面表达载体(pKV-Pald-PgsA-EGFP)作为模板和SEQ ID NOs：23至28的引物进行PCR，获得分别含有25-60 a.a、25-70 a.a和25-100 a.a的PgsA片段。
结果，获得了含有各个PgsA基序片段的DNA片段。各个DNA片段在其5′末端含有EcoRV限制酶位点，在其3′末端含有BamHI限制酶位点。将获得的各DNA片段用EcoRV和BamHI处理以获得片段。另外，可以证实，PgsA基序片段分别具有SEQ ID NOs：29至31的核苷酸序列。
本发明的一个目的是提供一种方法，包括：选择源自芽孢杆菌菌株并参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白，作为能够在微生物表面上表达大量外源蛋白的新的表面锚定基序；使用选择的细胞外膜蛋白构建能够在微生物表面上表达外源蛋白或肽的表面表达载体；并在使用表面表达载体获得的转化体的表面上有效表达外源蛋白。
为了实现上述目的，本发明提供了一种包含编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA的微生物表面表达载体，以及用所述载体转化的菌株。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种使用微生物表面表达载体在转化的菌株的表面上表达外源蛋白质的方法。
由pgsA基因编码的蛋白质是芽孢杆菌中存在的外膜蛋白，并且是参与聚-γ-谷氨酸合成的蛋白质，聚-γ-谷氨酸是由枯草杆菌(Bacillus subtilis)IFO3336(Natto；Biochem.Biophy.Research Comm.，263，6-12，1999)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ATCC9945(Biotech.Bioeng.57(4)，430-437，1998)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)(J.Bacteriology，171，722-730，1989)等产生的可食用的、水溶性的、阴离子型且可生物降解的聚合物。
分离自枯草芽孢杆菌IFO3336的外膜蛋白由总共922个氨基酸组成，并且由gsB、pgsC和pgsA构成。pgsB由393个氨基酸组成，pgsC由149个氨基酸组成，以及pgsA由380个氨基酸组成。Ashiuchi等克隆了源自枯草芽孢杆菌的聚-γ-谷氨酸合成酶基因，将该基因转化到大肠杆菌中，并在大肠杆菌中观察了该基因的合成[Ashiuchi et al.，Biochem.Biophy.Res.Communications，263：6-12(1999)]。
然而，尚未发现聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的pgsA蛋白的详细作用和功能。然而，在复合物的蛋白质中，pgsB是酰胺连接酶系统，并且pgsB的N末端的特定氨基酸与细胞膜或细胞壁相互作用，以及pgsA在其N末端和C末端具有亲水性特定氨基酸序列。因此，推测这些氨基酸具有在pgsB的帮助下可以通过内细胞膜的分泌信号，以及靶向和粘附信号。
本发明人进行的研究表明，参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白由于其一级氨基酸序列结构和性质，作为在细胞表面上表达外源蛋白的表面锚定基序有许多优点。优点如下，第一，参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白可以在细胞表面上大量表达，用于聚-γ-谷氨酸的合成和细胞外分泌。第二，即使在细胞周期的静止期中，参与聚-γ-谷氨酸合成的表达的外膜蛋白也能稳定地维持。第三，在结构上，pgsA从细胞表面突出。第四，参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白源自革兰氏阳性细菌的表面，并且不仅可以在多种革兰氏阳性细菌的表面而且可以在革兰氏阴性细菌的表面稳定地表达。
本发明的一个目的是提供一种有用的载体，其能够利用参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白的特性在细菌表面上表达外源蛋白。特别地，根据本发明的用于表达靶蛋白的表面表达载体包括包含在参与合成聚-γ-谷氨酸的外膜蛋白的一级序列中的分泌信号和靶向信号。
本发明的另一个目的是提供一种使用表面表达载体在微生物表面上表达外源蛋白的方法，所述表面表达载体利用了参与聚-γ-谷氨酸的合成的外膜蛋白的特性。特别地，本发明提供了一种生产外源蛋白的方法，所述方法通过使用参与聚-γ-谷氨酸的合成的外膜蛋白在微生物表面上表达外源蛋白，使得外源蛋白能够被有效地使用而无需细胞破坏或蛋白分离/纯化过程。
在本发明中，术语“靶蛋白”或“外源蛋白”指的是不能正常存在于表达所述蛋白的经转化宿主细胞中的蛋白。例如，当操纵源自病毒或源自肿瘤的蛋白质以使其在乳酸菌中人工表达时，所述蛋白质将被称为“外源蛋白”或“靶蛋白”。
优选地，靶蛋白的实例包括但是不限于传染性微生物、源自免疫疾病的抗原或源自肿瘤的抗原，例如，真菌病原体、细菌、寄生虫、蠕虫、病毒或引起过敏的物质。更优选地，抗原的实例包括破伤风类毒素、流感病毒血凝素或核蛋白、白喉类毒素、HIV gp120或其片段、HIV gag蛋白、IgA蛋白酶、胰岛素肽B、马铃薯粉痂菌(Spongospora subterranea)抗原、弧菌病(Vibriose)抗原、沙门氏菌(Salmonella)抗原、肺炎球菌(pneumoniae)抗原、RSV(呼吸道合胞病毒)抗原、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)外膜蛋白、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)菌毛蛋白、淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae pilin)菌毛蛋白、黑素瘤相关抗原(TRP2、MAGE-1、MAGE-3、gp100、酪氨酸酶、MART-1、HSP-70、β-HCG)、包括源自HPV-16、-18、-31、-35或-45的E1、E2、E6和E7的人乳头瘤病毒抗原、CEA肿瘤抗原、正常或突变ras蛋白、正常或突变的p53、Muc1和pSA，以及本领域众所周知的抗原，它们源自以下：霍乱、白喉、嗜血杆菌、甲型肝炎、乙型肝炎、流感、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌性肺炎、小儿麻痹症、狂犬病、风疹、破伤风、结核病、阿狄森氏病、免疫原、过敏原、包括实体瘤和血源性肿瘤的癌症，获得性免疫缺陷综合征和参与移植排斥，例如肾脏、心脏、胰腺、肺、骨骼和肝脏移植排斥的因素；和抗原诱导自身免疫。
因此，通过本发明的表面表达方法产生的靶蛋白可以用于多种应用。这些应用包括有效生产抗体和酶，以及生产用于筛选抗原的肽库、粘附或吸附蛋白和新的生理活性物质。
本发明的范围包括所有的表面表达载体，其包含参与聚-γ-谷氨酸的合成的所有种类的基因，包括编码源自芽孢杆菌菌株并参与聚-γ-谷氨酸的合成的外膜蛋白的基因。
另外，可以将根据本发明的包含聚-γ-谷氨酸合成酶基因的表面表达载体应用于所有类型的菌株，以在微生物表面上表达外源蛋白。优选地，表面表达载体可以应用于革兰氏阴性细菌，更优选地大肠杆菌(E.coli)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和志贺氏菌(Shigella)，并且可以应用于革兰氏阳性细菌，优选地芽孢杆菌(Bacillus)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、产单核细胞李氏杆菌(Lysteria monocytogenes)和链球菌(Streptococcus)。使用上述菌株产生所有类型的外源蛋白的方法都包括在本发明的范围内。
根据需要，可将限制酶识别位点插入到聚-γ-谷氨酸合成酶基因的N末端或C末端，并且将其中具有这些插入的限制酶位点的表面表达载体全部包括在本发明的范围内。
具体而言，本发明提供了表面表达载体pKV-Pald-pgsA1至pKV-Pald-pgsA8，其包含源自芽孢杆菌菌株的聚-γ-谷氨酸合成酶基因pgsA，并且利用插入到pgsAC末端的限制酶识别位点，可以容易地将多种外源基因克隆到其中。
本发明提供了表面表达载体pKV-Pald-pgsA1至pKV-Pald-pgsA8，其在参与聚-γ-谷氨酸合成的外膜蛋白复合物中包含外膜复合物pgsA，并且可以在革兰氏阳性细菌的表面上，通过以将EGFP蛋白的N末端连接到pgsA的C末端而获得的融合蛋白形式表达EGFP蛋白。
特别地，在本发明的一个实例中，参与聚γ-谷氨酸合成的外膜蛋白基因pgsA获得自枯草芽孢杆菌Chungkookjang变种(KCTC 0697BP)，但是使用获得自产生聚-γ-谷氨酸的任何芽孢杆菌菌株的pgsA构建载体，或者使用载体在微生物表面上表达外源蛋白也包括在本发明的范围内。例如，使用源自与枯草芽孢杆菌Chungkookjang变种存在的pgsA基因的核苷酸序列具有至少80％的序列同源性的任何菌株的pgsA基因构建载体，或者所述载体在微生物表面上表达外源蛋白也包括在本发明的范围内。
在本发明的另一个实例中，使用被选作模型蛋白的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)检查蛋白质是否在大肠杆菌细胞表面上有效表达。“增强型绿色荧光蛋白(EGFP)”是活体内发射绿光使得能够容易地观察表达相应蛋白的细胞的基因，并且具有能够在荧光显微镜下观察的优点。GFP是一种源自水母(维多利亚多管水母属Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白，已在多个研究领域用作基因表达的重要标记。EGFP是GFP的突变体，是由GFP氨基酸序列中第64位的亮氨酸取代了苯丙氨酸和第65位的苏氨酸取代了丝氨酸所致，并且具有比原始GFP显示更强的荧光信号的优点。
本发明人通过将EGFP基因插入到上述构建的重组载体pKV-Pald-pgsA1至pKV-Pald-pgsA8中来构建了表面表达载体，用各个表面表达载体转化干酪乳杆菌，然后培养经转化的干酪乳杆菌以诱导蛋白质表达，并通过收集一定量的培养物获得蛋白质。通过SDS-PAGE分析获得的蛋白质，并使用抗EGFP抗体进行蛋白质印迹，结果证实，将EGFP蛋白成功插入到构建的重组载体pKV-Pald-pgsA1至pKV-Pald-pgsA8中并在细胞表面上表达。
另外，在上述实施例中，EGFP蛋白被用作外源蛋白，但是任何其它蛋白质如酶、抗原、抗体、粘附蛋白或吸附蛋白也可以被用作外源蛋白。
下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不限于这些实施例。
特别地，在以下实施例中，将pgsA基因用作构建表面表达载体的基序，但是对于本领域技术人员显而易见的是，如在以申请人的名义提交的在先专利申请(WO2003/014360)中所公开的，使用pgsB、pgsC或其组合也可表现出与使用pgsA得到的结果相似的结果。
另外，在以下实施例中，构建了用于革兰氏阳性细菌的表面表达载体，并且干酪乳杆菌用作宿主细胞，但是对于本领域技术人员显而易见的是，除了干酪乳杆菌之外的任何革兰氏阳性细菌可以用作宿主细胞，并且革兰氏阴性细菌和除了革兰氏阳性细菌以外的其它细菌可以用表面表达载体转化。
实施例1：构建源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶启动子
通过PCR自干酪乳杆菌获得对应于半乳糖变旋酶基因启动子区的700-bp的DNA片段。
为此，在基础MRS培养基(含1％酪蛋白水解物、1.5％酵母提取物、2％右旋糖、0.2％柠檬酸铵、0.5％乙酸钠、0.01％硫酸镁、0.05％硫酸镁和0.2％磷酸氢二钾；AcumediaManufacturers，Inc.)中培养干酪乳杆菌。将1x109培养的干酪乳杆菌细胞破碎以获得溶液。溶液用作PCR的模板。
为了有利于在基因克隆中插入到载体中，将SphI和XhoI限制酶位点位于各个引物的末端(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)。作为使用引物进行PCR的结果，获得了全长700bp的扩增产物(SEQ ID NO：1)。将PCR扩增产物克隆到pGEM-Teasy载体(Promega Co.，USA)中，并分析其核苷酸序列(图1)。
实施例2：使用半乳糖变旋酶启动子的用于EGFP蛋白表达的表面表达载体(pKV-Pgm-pgsA-EGFP)的构建
为了构建用于由半乳糖变旋酶启动子诱导表达的EGFP蛋白的表达的表达载体，将源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶启动子插入到具有可在大肠杆菌和干酪乳杆菌中复制的RepE作为复制起点的载体中，然后将源自枯草芽孢杆菌Chungkookjang变种的表面锚定基序pgsA引入到启动子的下游。然后，将使靶基因能够插入到pgsA基因的羧基末端的BamHI和XbaI限制酶位点加入其中，从而构建含有半乳糖变旋酶启动子的pKV-Pgm-pgsA载体。作为pgsA基因，使用在韩国专利No.0469800中公开的pgsA基因。
通过使用合成的EGFP基因片段作为模板以及SEQ ID NOs：4和5的引物进行PCR，获得EGFP基因。
结果，获得了在其5′末端含有BamHI限制酶位点和在其3′末端含有XbaI限制酶位点的DNA片段。将获得的含有EGFP基因的755-bp的DNA片段用BamHI和XbaI切割，并与pKV-Pgm-pgsA载体的pgsA的C末端连接，从而构建了当转化到乳酸菌宿主中时，可以在细胞表面上表达EGFP蛋白的表达载体pKV-Pgm-pgsA-EGFP(图2)。
实施例3：通过蛋白质印迹分析靶蛋白表达和表达诱导强度
在这个实施例中，用在实施例2中构建的表达载体pKV-Pgm-pgsA-EGFP转化干酪乳杆菌。培养经转化的干酪乳杆菌，并分析EGFP蛋白在其表面上的表达。
为了与常规醛缩酶启动子比较，检查新的半乳糖变旋酶启动子的表达诱导能力，通过将作为报告基因的EGFP基因连接至各个启动子来构建表达载体，并用各个表达载体转化干酪乳杆菌。另外，通过蛋白质印迹测定EGFP的表达水平。
首先，将用本发明的表面表达载体转化的重组干酪乳杆菌在30℃下在MRS培养基(乳酸杆菌MRS，Becton Dickinson and Company Sparks，美国)中静置培养，以诱导EGFP蛋白的表面表达。
通过对培养的干酪乳杆菌全细胞进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并使用抗EGFP的特异性抗体进行蛋白质印迹来分析融合蛋白的表达。
具体而言，用在相同细胞浓度下获得的蛋白质使诱导了蛋白质表达的重组干酪乳杆菌全细胞变性以制备样品。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品，然后将分离的蛋白质转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜(Bio-Rad)上。将其上具有转移的蛋白质的PVDF膜在封闭缓冲液(50mM Tris-HCl，5％脱脂奶，pH 8.0)中封闭1小时，然后与在封闭缓冲液中1∶1,000稀释的针对EGFP的抗兔多克隆一级抗体孵育1小时。孵育结束后，将膜用缓冲液清洗，并在封闭液中1∶10,000稀释的HRP(辣根过氧化物酶)偶联的抗兔二级抗体孵育1小时。孵育完成后，将膜用缓冲液洗涤，将洗涤的膜用底物(Lumigen PS-3 acridan，H2O2)显色约2分钟。然后，通过CCD照相机观察针对EGFP的特异性抗体与融合蛋白之间的特异性结合。
图3示出进行蛋白质印迹以测定用本发明的细胞表面表达载体转化的重组干酪乳杆菌全细胞上EGFP蛋白的表达水平的结果。在图3中，泳道SM代表蛋白质尺寸标记；泳道1代表干酪乳杆菌(空载体)上的表达；泳道2和3代表干酪乳杆菌(pKV-Pgm-pgsA-EGFP)上的表达；泳道4代表干酪乳杆菌(pKV-Pald-pgsA-EGFP)上的表达。
可以证实，本发明的表达载体pKV-Pgm-pgsA-EGFP(泳道2和3)表达了靶蛋白，并且还显示出靶蛋白的表达水平高于表达载体pKV-Pald-pgsA-EGFP(泳道4)。这表明本发明的半乳糖变旋酶启动子可以稳定表达存在于表达载体中的靶蛋白，并且与醛缩酶启动子相比可以更强地表达靶蛋白(图3)。
实施例4：通过共聚焦荧光显微镜观察两种靶蛋白在微生物表面上的表达
为了检查本发明的表面表达载体的表达水平，通过共聚焦显微镜(Carl ZeissLSM800)观察荧光图像。
将用本发明的表面表达载体(pKV-Pgm-pgsA-EGFP)转化的重组干酪乳杆菌在30℃下在MRS培养基(乳酸杆菌MRS，Becton Dickinson and Company Sparks，美国)中静置培养以诱导EGFP蛋白的表面表达。接下来，使所述蛋白与针对EGFP的特异性抗体结合，然后用Alexa488(绿色)免疫染色。然后，通过共聚焦显微镜观察EGFP在细胞表面的表达。
结果，如图4所示，可以证实，在用本发明的表面表达载体转化的重组干酪乳杆菌中稳定地表现出荧光。
因此，期望可以将本发明的表面表达载体转化到乳酸菌中，与常规疫苗生产方法不同，不需要菌株解毒步骤，并且可以更强地表达靶蛋白，表明它可用于微生物疫苗的生产。
实施例5：构建表面表达载体pKV-Pald-pgsA-EGFP
为了构建用于EGFP表达的载体，使用表面表达载体pKV-Pald-PgsA-E7(参见韩国专利No.10-1471043)，将编码EGFP蛋白的基因插入到表面表达载体的PgsA的C末端，以得到能够在乳酸菌表面上表达EGFP蛋白的载体pKV-Pald-PgsA-EGFP。
首先，去除在pKV-Pald-PgsA-E7载体中与pgsA融合的HPV16E7基因，将编码EGFP的基因插入到载体中。使用合成的EGFP基因片段作为模板，使用SEQ ID NOs：6和7的引物进行PCR。
结果，获得了包含EGFP基因的755-bp的片段，在其5′末端包含BamHI限制酶位点，在其3′末端包含XbaI限制酶位点。通过用BamHI和XbaI限制酶处理来切割获得的DNA片段，获得741-bp片段。
用BamHI和XbaI切割pKV-Pald-PgsA-E7，以去除HPV16E7基因区并且获得载体区。
将用BamHI和XbaI切割的含E7基因的DNA片段与用相同限制酶切割的载体连接，从而构建pKV-Pald-PgsA-EGFP(图5)。
实施例6：表面表达载体中PgsA基序的改进
在这个实施例中，对在实施例5中构建的表面表达载体(pKV-Pald-PgsA-EGFP)中的PgsA基因片段进行了改进，使得所述载体在乳酸菌宿主中可以表现出高表达水平。
首先，在PgsA片段中，通过使用表面表达载体pKV-Pald-PgsA-EGFP为模板和以下引物进行PCR，获得分别含有1-60a.a、1-70a.a、1-80a.a、1-100a.a和1-188a.a的PgsA片段。
PgsA基序1-60 a.a
PgsA基序1-70 a.a
PgsA基序1-80 a.a
PgsA基序1-100 a.a
PgsA基序1-188 a.a
结果，获得了包含醛缩酶启动子和各个PgsA基序片段的DNA片段。各个DNA片段在其5′末端包含SphI限制酶位点，在其3′末端包含BamHI限制酶位点。将获得的各个DNA片段用SphI和BamHI处理以获得片段。另外，可以证实PgsA1至PgsA5基序片段分别具有以下核苷酸序列。
PgsA 1-60 a.a片段序列(PgsA1)
PgsA 1-70 a.a片段序列(PgsA2)
PgsA 1-80 a.a片段序列(PgsA3)
PgsA 1-100 a.a片段序列(PgsA4)
PgsA 1-188 a.a片段序列(PgsA5)
将pKV-Pald-PgsA-EGFP用SphI和BamHI切割以除去醛缩酶启动子和PgsA基因区并且获得载体区。
将用SphI和BamHI切割并含有醛缩酶启动子和各个PgsA基序片段基因的各个DNA片段与用相同限制酶切割的载体连接，从而构建改进的载体(图6至图10)。
同时，在PgsA片段中，使用表面表达载体(pKV-Pald-PgsA-EGFP)作为模板和以下引物进行PCR，分别获得了包含25-60 a.a、25-70 a.a和25-100 a.a的PgsA片段。
PgsA基序25-60 a.a
PgsA基序25-70 a.a
PgsA基序25-100 a.a
结果，获得了包含各个PgsA基序片段的DNA片段。各个DNA片段在其5′末端包含EcoRV限制酶位点，在其3′末端包含BamHI限制酶位点。将获得的各个DNA片段用EcoRV和BamHI处理以获得片段。另外，可以证实PgsA基序片段分别具有以下核苷酸序列。
PgsA 25-60 a.a片段序列(PgsA6)
PgsA 25-70 a.a片段序列(PgsA7)
PgsA 25-100 a.a片段序列(PgsA8)
用EcoRV和BamHI切割pKV-Pald-PgsA-EGFP以去除PgsA基因并获得载体区。
将用EcoRV和BamHI切割并含有各个PgsA基序片段基因的各个DNA片段与用相同限制酶切割的载体连接，从而构建改进的载体(图11至图13)。
实施例7：通过用改进的PgsA基序的表面表达载体转化获得的转化体的表达分析
在这个实施例中，用实施例5中构建的用各个改进的PgsA基序的表面表达载体转化干酪乳杆菌，并培养经转化的重组干酪乳杆菌，并分析其上EGFP蛋白的表达。检查在经转化的重组干酪乳杆菌中与任一改进的片段pgsA1至pgsA8融合的EGFP蛋白是否表达。
将用包含各个PgsA基序片段的各个表面表达载体转化的重组干酪乳杆菌在30℃下在MRS培养基(乳酸杆菌MRS，Becton Dickinson and Company Sparks，美国)中静置培养，以诱导与参与聚-γ-谷氨酸合成的任一基因片段pgsA1至pgsA8的C末端融合的EGFP蛋白的表面表达。
通过对培养的干酪乳杆菌全细胞进行SDS-聚酰胺凝胶电泳并使用抗EGFP的特异性抗体进行蛋白质印迹来分析融合蛋白的表达。
具体而言，用在相同细胞浓度下获得的蛋白质使诱导了蛋白质表达的重组干酪乳杆菌全细胞变性以制备样品。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品，然后将分离的蛋白质转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜(Bio-Rad)上。将其上具有转移的蛋白质的PVDF膜在封闭缓冲液(50mM Tris-HCl，5％脱脂奶，pH8.0)中震摇封闭1小时，然后与在封闭缓冲液中1∶1000稀释的针对EGFP的抗兔多克隆一级抗体孵育1小时。孵育完成后，将膜用缓冲液洗涤，并在封闭液中1∶10,000稀释的HRP(辣根过氧化物酶)偶联的抗兔二级抗体孵育1小时。孵育完成后，将膜用缓冲液洗涤，将洗涤的膜用底物(Lumigen PS-3 acridan，H2O2)显色约2分钟。然后，通过CCD照相机观察针对EGFP的特异性抗体与融合蛋白之间的特异性结合(图14)。
图14示出用于与本发明进行比较作为对照的包含未改进的pgsA重组表达载体pKV-Pald-pgsA的干酪乳杆菌的表达图(泳道6和11)，和包含根据本发明的改进的pgsA1至pgsA8的重组表达载体pKV-Pald-pgsA1至pgsA8的干酪乳杆菌的表达图(泳道1至5和泳道7至10)。
具体而言，在图14中，泳道1代表用与PgsA基序1-60a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道2代表用与PgsA基序1-70a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道3代表用与PgsA基序1-80a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道4代表用与PgsA基序1-100a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道5代表用与PgsA基序1-188a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道6代表用pKV-Pald-PgsA-EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达。
另外，在图14中，泳道7代表用与PgsA基序26-50a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道8代表用与PgsA基序25-70a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道9代表用与PgsA基序25-100a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道10代表用与PgsA基序1-188a.a融合的EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；泳道11代表用pKV-Pald-PgsA-EGFP转化的重组干酪乳杆菌上的蛋白表达；
可以证实，包含改进的PgsA基序片段的EGFP融合蛋白的表达比未经改进的表面表达载体pKV-Pald-pgsA-EGFP的EGFP融合蛋白的表达更强。
工业实用性
本发明涉及一种新的载体，其使用源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子和源自芽孢杆菌菌株并参与聚-γ-谷氨酸的合成的外膜蛋白在微生物表面上有效表达外源蛋白。由于载体包含将靶蛋白锚定在微生物表面上的基因，因此靶蛋白可以在使用所述载体获得的转化体中有效地在细胞表面上表达，从而乳酸菌可以用作疫苗载体。另外，根据本发明的用于表达靶蛋白的表面表达载体可以稳定地表达靶蛋白。根据本发明的用于表达靶蛋白的表面表达载体可以在重组微生物的表面上表达靶蛋白，同时组成性地表达靶蛋白，因此可以有效地用于生产抗原以生产需要的疫苗。因此，本发明是工业实用性的。
序列表文本
Claims (25)
1.一种源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子。
2.根据权利要求1所述的启动子，其具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
3.一种表达载体，包含：权利要求1所述的启动子；和编码靶蛋白的基因。
4.一种用权利要求3所述的表达载体转化的微生物。
5.一种微生物表面表达载体，在所述微生物表面表达载体中，权利要求1所述的启动子、编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因和编码靶蛋白的基因彼此连接。
6.根据权利要求5所述的微生物表面表达载体，其中，所述靶蛋白是抗原。
7.根据权利要求5所述的微生物表面表达载体，其中，所述聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因是pgsA、pgsB和pgsC中的任意一种或更多种。
8.一种用权利要求5至7中任一项所述的微生物表面表达载体转化的微生物。
9.根据权利要求8所述的微生物，所述微生物是乳酸菌。
10.根据权利要求5所述的微生物表面表达载体，其中，所述编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因是pgsA，并且具有SEQ ID NOs：18至21和29至31中任一项的核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的微生物表面表达载体，其中，基因pgsA源自产生聚-γ-谷氨酸的芽孢杆菌菌株。
12.根据权利要求10所述的微生物表面表达载体，其中，编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因pgsA具有SEQ ID NO：22的核苷酸序列。
13.根据权利要求10所述的微生物表面表达载体，其中，接头被插入到基因pgsA的末端，并且所述编码靶蛋白的基因被插入到所插入的接头中。
14.根据权利要求10所述的微生物表面表达载体，其中，所述靶蛋白是该靶蛋白的氨基酸序列的一部分已经被去除或者以定点方式突变使得有利于表面表达的蛋白。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的微生物表面表达载体，其中，所述载体应用于革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。
16.一种用权利要求10至14中任一项所述的微生物表面表达载体转化的微生物。
17.根据权利要求16所述的微生物，其中，用于转化的微生物是为了有利于所述靶蛋白的细胞表面表达，经过修饰使得其不产生参与所表达的靶蛋白的降解的胞内或胞外蛋白酶的微生物。
18.根据权利要求16所述的微生物，所述微生物是乳酸菌。
19.一种用于在微生物表面上表达靶蛋白的方法，所述方法包含培养权利要求8所述的转化的微生物。
20.一种用于产生微生物疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过培养用权利要求6所述的微生物表面表达载体转化的微生物在微生物表面上表达抗原；和
(b)回收其表面上具有表达的抗原的微生物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述微生物是乳酸菌。
22.一种用于靶蛋白的细胞表面表达的方法，所述方法包括以下步骤：通过培养权利要求16所述的转化的微生物在细胞表面上表达所述靶蛋白；和回收其表面上具有表达的靶蛋白的细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述靶蛋白是选自激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号蛋白或其片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白、结合域、肽、抗原、粘附蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节因子、凝血因子和植物生物防御诱导蛋白中的任意一种。
24.一种通过将通过权利要求23所述的方法产生的其表面上具有表达的抗原的细胞施用于除了人类以外的脊椎动物来诱导体液免疫或者细胞免疫的方法。
25.一种在革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞的表面上表达靶蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过将编码所述靶蛋白的基因插入到权利要求24所述的靶蛋白的表面表达载体中来构建重组载体；
(b)用所述重组载体转化所述革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞；和
(c)通过培养转化的宿主细胞在所述革兰氏阴性或革兰氏阳性宿主细胞的表面上表达所述靶蛋白。
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