ES2623288T3 - Uso de proteínas de la familia de glicólido hidrolasa 61 en el procesamiento de celulosa - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende: a) una proteína GH61 recombinantemente producida que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 2 o fragmentos de SEQ ID NO: 2 que tienen actividad GH61; y b) enzimas de celulasa que incluyen al menos una endoglucanasa (EG), al menos una ß-glucosidasa (BGL), al menos una celobiohidrolasa de Tipo 1 (CBH1), y al menos una celobiohidrolasa de Tipo 2 (CBH2).

Description

Uso de proteínas de la familia de glicólido hidrolasa 61 en el procesamiento de celulosa

Campo de la invención

La divulgación se refiere generalmente al campo de enzimas glicolíticas y su uso. Más específicamente, proporciona proteínas GH61 de Myceliophtora thermophila, y el uso de tales proteínas en la producción de azucares fermentables y etanol de biomasa celulósica.

Antecedentes

La biomasa celulósica es un recurso renovable significativo para la generación de azúcares fermentables. Estos azúcares pueden usarse para fermentación y otros procesos metabólicos para producir biocombustibles, compuestos químicos y otros productos finales comercialmente valiosos. Mientras la fermentación de azucares como glucosa a etanol es relativamente sencilla, la conversión eficiente de biomasa celulósica a azúcares fermentables supone un reto. Ladisch et al., 1983, Enzyme Microb. Technol. 5:82.

La conversión de biomasa celulósica a azucares fermentables puede comenzar con pre-tratamientos químicos, mecánicos, enzimáticos u otros pre-tratamientos para aumentar la susceptibilidad de celulosa a hidrólisis. Tal pre-tratamiento puede ir seguido de conversión enzimática de celulosa a celobiosa, celo-oligosacáridos, glucosa y otros azúcares y polímeros de azúcar, usando enzimas que rompen la celulosa. Estas enzimas son referidas colectivamente como “celulasas” e incluyen endoglucanasas, β-glucosidasas y celobiohidrolasas.

WO 2009/033071 desvela SEQ ID NO: 44 que comparte el 100% de identidad con enzima GH61 Myceliophtora thermophila de SEQ ID: 2 como aquí se desvela.

WO 2009/085935 desvela dos enzimas GH61 de Myceliophtora thermophila (SEQ ID NO: 2 y 4) y mezclas enzimáticas.

Resumen de la invención

La invención proporciona una composición: a) una proteína GH61 recombinantemente producida que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 2 o fragmentos de SEQ ID NO: 2 que tienen actividad GH61; y b) enzimas de celulasa que incluyen al menos una endoglucanasa (EG), al menos una β-glucosidasa (BGL), y al menos una celobiohidrolasa de Tipo 1 (CBH1), y al menos una celobiohidrolasa de Tipo 2 (CBH2).

La invención también proporciona un método para producir azucares fermentables de biomasa celulósica que comprende poner en contacto un sustrato celulósico con una composición, medio de cultivo o lisado celular que contiene una proteína GH61 y enzimas de celulasa, donde: a) la proteína GH61 comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 2 o un fragmento del mismo biológicamente activo; y b) las enzimas de celulasa incluyen al menos una endoglucanasa (EG), al menos una β-glucosidasa (BGL), y al menos una celobiohidrolasa de Tipo 1 (CBH1), y al menos una celobiohidrolasa de Tipo 2 (CBH2).

La invención proporciona además un método para producir un producto final a partir de un sustrato celulósico que comprende: a) poner en contacto el sustrato celulósico con una composición de la invención por lo que los azucares fermentables se producen a partir del sustrato; y b) poner en contacto los azúcares fermentables con un microorganismos en una fermentación para producir un producto final.

La invención también proporciona un método para producir un producto final a partir de un sustrato celulósico, que comprende: a) obtener azúcares fermentables producidos de acuerdo con un método de la invención; y b) poner en contacto los azúcares fermentables con un microorganismo en una fermentación para producir un producto final.

Resumen de la divulgación

Aquí se desvelan proteínas recombinantes de la familia de Glicósido Hidrolasa 61 (GH61) obtenidas de Myceliophtora thermophila, y ácidos nucleicos que codifican tales proteínas. La divulgación también proporciona proteínas GH61 aisladas y purificadas de caldo de cultivo de M. thermophila. Estas proteínas pueden usarse para aumentar la producción de productos de reacciones donde un sustrato que contiene celulosa sufre sacarificación por una o una combinación de enzimas de celulasa, como endogluconasas, β-glucosidasas y celobiohidrolasas. La adición o presencia de proteína GH61 recombinante o aislada puede aumentar la producción de enzimas de celulasa, al menos 20%, 30%, 50%, 70%, doble, triple o más.

La divulgación proporciona una composición que comprende una proteína GH61 aislada o recombinante, y un método para preparar tal composición. La proteína puede estar aislada de M. thermophila, o puede obtenerse a partir de producción recombinantes. Se proporcionan secuencias de aminoácido de veinticuatro proteínas GH61 M.

thermophila GH61 de longitud completa. Las proteínas GH61 desveladas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a una cualquiera de las proteínas enumeradas (SEQ ID NOS: 1-30) o un fragmentos de la misma bilógicamente activo. Un proteína GH61 ejemplar es GH61a (SEQ ID NO: 2). Otras proteínas GH61 ejemplares incluyen GH61o, GH61v, GH61x, GH61b y GH61e (SEQ ID Nos: 6, 13, 15, 16, 19, 30). Otras proteínas GH61 ejemplares incluyen GH61f, GH61v, GH61p, GH61g y GH61i (SEQ ID Nos: 7, 13, 20, 21, 23, 26).

En un aspecto de la divulgación, la composición preparada de acuerdo con el método de esta invención comprende una proteína GH61 aislada o recombinantes y una o más enzimas de celulasa enumeradas en esta divulgación, que incluyen aunque no se limitan a enzimas de celulasa seleccionadas de endoglucanasas (EG), βglucosidasas (BGL), celobiohidrolasas de Tipo 1 (CBH1), y celobiohidrolasas de Tipo 2 (CBH2).

Otra realización de la divulgación es un método parar producir un azúcar fermentable a partir de sustrato celulósico. Una suspensión que comprende el sustrato contacta con una composición que comprende una proteína GH61 para producir azúcares fermentables como glucosa y xilosa a partir del sustrato. La composición también puede contener una o más enzimas seleccionadas de proteínas de celulosa (endoglucanasas, β-glucosidasas, celobiohirolasas de Tipo 1, y celobiohirolasas de Tipo 2), esterasas, xilanasas, hemicelulasas, lipasas, proteasas, amilasas y glucoamilasas. El sustrato puede derivarse de, por ejemplo, trigo, paja de trigo, sorgo, maíz, arroz, cebada, bagazo de caña de azúcar, hierbas, pasto varilla, grano de maíz, mazorcas de maíz, fibra de maíz o una combinación de los mismos, ejemplificado por la paja de maíz pre-tratada.

El azúcar fermentable puede recuperarse y usarse para producir un producto final como un alcohol (como etanol o butanol), un alcohol de azúcar (como sorbitol), un ácido orgánico (como ácido láctico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido glutámico, ácido cítrico o ácido propinoico), un aminoácido (como glicina, lisina) o ácido aspártico, un ácido orgánico, un alcano, un alqueno, un diol o glicerol.

Otra realización de la divulgación es un método para aumentar la producción de azúcares fermentables en una reacción de sacarificación por una o más enzimas de celulosa, realizando la reacción en presencia de una proteína GH61 como las referidas anteriormente.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para hidrolizar un sustrato de celulosa. El sustrato contacta con una composición que comprende una o más proteínas recombinantes GH61, una o más glucosidasas (BGL) y una o más celobiohidrolasas (CBH). En algunas realizaciones de la divulgación, la composición enzimática está sustancialmente libre de endoglucanasa (EG). La hidrólisis puede dar como resultado una producción de glucosa que es al menos 20%, 30%, 50%, 70%, doble o triple o más que de la producción de la misma reacción realizada en ausencia de dicha proteína GH61.

Otra realización de la divulgación es un método para producir un producto final a partir de un sustrato celulósico. El sustrato contacta con una composición que contiene proteína GH61 como ya se ha referido bajo condiciones por las cuales se producen azúcares fermentables. Los azúcares fermentables después contactan con un microorganismo en una fermentación para producir un producto final como los enumerados arriba. Este método es adecuado para preparar un alcohol, particularmente etanol, donde el microorganismo es una levadura.

Otras realizaciones de la divulgación incluyen: a) las proteínas recombinantes GH61 ya referidas, opcionalmente producidas con un péptido heterólogo de señal; b) una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína GH61 que puede estar operativamente unida a un promotor heterólogo; c) una célula huésped que produce tales proteínas GH61 recombinantes, ejemplificadas por M. thermophila, levadura, una células huésped Chaetomium, Thielavia, Acremonium, Myceliophthora, Aspergillus, o Trichoderma.

La divulgación incorpora además el uso de una proteína GH61 recombinantemente producida en la producción de etanol. La proteína GH61 comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a una cualquiera de las proteínas enumeradas o un fragmento de las mismas que tenga actividad GH61.

Aquí se describe un ácido nucleico que codifica una proteína GH61. La divulgación también proporciona una célula que contiene una secuencia de ácido nucleico recombinantes que codifica una secuencia de proteína de esta invención (SEQ ID Nos: 1 a 30) operativamente unida a un promotor heterólogo. Las células huéspedes pueden ser (por ejemplo) células M. thermophila o células de levadura. La secuencia de ácido nucleico recombinante puede incluir SEQ ID NO. 31 o una cualquiera de SEQ ID Nos: 32 a 59. La célula también puede expresar al menos una proteína de celulasa recombinantes seleccionada de una endoglucanasa (EG), una β-glucosidasa (BGL), una celobiohidrolasa de Tipo 1 (CBH1), y/o una celobiohidrolasas de Tipo 2 (CBH2) y/o variantes de dichas proteínas de celulasa.

En un aspecto, la invención proporciona una composición que contiene una proteína GH61 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), una endoglucanasa (EG), una β-glucosidasa (BGL), una celobiohidrolasa de Tipo 1 (CBH1), y/o una celobiohidrolasa de Tipo 2 (CBH2), donde la masa combinada de la proteína GH61, EG, BGL, CHB1 y CBH2 es al menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o sustancialmente todo el total de la proteína libre de célula en la composición. Una, dos, tres o las cuatro de las enzimas CBH1, CBH2, EG y BGL que pueden estar presentes en la composición pueden ser variantes derivadas de proteínas de celulasa que ocurren de manera natural. La composición también puede ser un caldo de cultivo de celulosa que contiene proteínas de celulasa.

Aquí se describe una proteína GH61 que comprende cualquiera de las SEQ ID Nos: 3 a 30 o un fragmento secretado de la misma. Opcionalmente, la proteína comprende el fragmento secretado y la secuencia peptídica de señal correspondiente, si está presente. En un aspecto relacionado la divulgación proporciona una variante de proteína GH61 con al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99% de identidad secuencial con un polipéptido o un fragmento biológicamente activo aquí proporcionado.

Aquí se describe una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína descrita anteriormente, que puede tener la secuencia del gen que ocurre de manera natural o un fragmento del mismo. La secuencia que codifica la proteína del ácido nucleico puede estar operativamente unida a una secuencia de señal heteróloga. Típicamente, la secuencia de ácido nucleico recombinante está operativamente unida a un promotor heterólogo. Se desvela una célula huésped que contiene un ácido nucleico recombinante de la divulgación. La célula puede expresar al menos una, dos, tres o cuatro proteínas recombinantes de celulosa seleccionadas de endoglucanasas (EG), β-glucosidasas (BGL), celobiohidrolasas de Tipo 1 (CBH1), y/o celobiohidrolasas de Tipo 2 (CBH2).

Aquí se describe una composición que contiene al menos una proteína aislada que comprende una secuencia seleccionada de la parte secretada de SEQ ID Nos. 1 a 30, y/o al menos un fragmento biológicamente activo de la misma. La composición también puede contener al menos una endoglucanasa (EG), una β-glucosidasa (BGL), una celobiohidrolasa de Tipo 1 (CBH1), y/o una celobiohidrolasa de Tipo 2 (CBH2), donde la masa combinada de la proteína GH61, EG, BGL, CHB1 y CBH2 es al menos aproximadamente 70% del total de la proteína libre de célula en la composición.

En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para sacarificación (a) cultivando una célula de la invención bajo condiciones donde al menos una proteína GH61 se secreta en el caldo de cultivo, y (b) combinando el caldo y una biomasa celulósica bajo condiciones donde ocurre la sacarificación, donde (a) puede tener lugar antes o simultáneamente con (b).

En un aspecto, la divulgación proporciona un método para hidrolizar un almidón, que comprende poner el almidón en contacto con una composición que comprende una o más proteínas GH61 recombinantes y una o más amilasa(s).

Descripción de los dibujos

La FIGURA 1 está tomada de un experimento que usa proteína GH61 recombinantemente producida a partir de Myceliophtora thermophila. La proteína se probó para mejorar la actividad de celulasa usando enzimas de celulasa de un caldo de cultivo de M. thermophila. La FIGURA 1(A) muestra el porcentaje de producción mejorada de una reacción de sacarificación realizada en presencia de GH61a, en comparación con la misma reacción en ausencia de GH61a. En la FIGURA 1(B), los datos se trazan para mostrar la producción total de glucosa.

La FIGURA 2 está tomada de un experimento que usa GH61 que contiene fracciones aisladas de caldo de cultivo de M. thermophila. Las proteínas GH61, GH61f, GH61p y/o GH61a se combinaron con CBH1a y CBH2. Estos resultados demuestran que una mezcla de enzima que comprende estos componentes tiene suficiente actividad enzimática para la conversión de un sustrato de celulosa a glucosa.

La FIGURA 3 muestra el efecto de la proteína GH61a en la viscosidad de biomasa celulósica.

Descripción detallada

I. Introducción

Se determinó que el hongo filamentoso Myceliophtora thermophila produce proteínas GH61. Las proteínas GH61 aumenta la producción de azúcares fermentables cuando un sustrato que contiene celulosa sufre sacarificación por una o más enzimas de celulasa. Los azúcares fermentables producidos por sacarificación pueden

usarse, entre otros usos, en reacciones de fermentación para producir productos finales, como, pero sin limitar a, etanol.

Las proteínas GH61 pueden aislarse de células de M. thermophila. Las proteínas GH61 también pueden producirse recombinantemente expresando un ácido nucleico que codifica cualquiera de las secuencias de proteína GH61 proporcionadas en la divulgación, incluyendo secuencias de tipo salvaje y fragmentos de secuencias de tipo salvaje.

La preparación y uso de proteínas GH61, y las composiciones de la invención se describen con más detalle en las secciones a continuación.

II. Definiciones

A menos que se indique lo contrario, la práctica de la presente invención implica técnicas convencionales comúnmente usadas en biología molecular, fermentación, microbiología y campos relacionados, que son conocidas por aquellos expertos en la técnica. A menos que aquí se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tiene el mismo significado como comúnmente los entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse algunos métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos aquí descritos en la práctica o en las pruebas de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferentes. De hecho, se pretende que la presente invención no esté limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares aquí descritos, ya que estos pueden variar dependiendo del contexto en el que se usen. Los títulos aquí provistos no son limitaciones de los varios aspectos o realizaciones.

Sin embargo, con el fin de facilitar la compresión de la presente invención, más abajo se definen un número de términos. Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango. Así, cada rango numérico aquí desvelado pretende incluir cada rango numérico más estrecho que esté clasificado dentro de un rango numérico más amplio, como si tales rangos numéricos más estrechos estuvieran aquí expresamente escritos. También se pretende que cada limitación numérica máxima (o mínima) aquí desvelada incluye cada limitación numérica más baja (o más alta), como si tales limitaciones numéricas más bajas (o más altas) estuvieran aquí expresamente escritas.

Como aquí se usan, los términos “que comprende(n)” y sus cognados se usan en su sentido inclusivo (esto es, equivalentes al término “que incluye(n)” y sus correspondientes cognados).

Como aquí y en las reivindicaciones adjuntas se usa, el singular “uno”, “una”, “el”, “la” incluye la referencia plural a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a una “célula huésped” incluye una pluralidad de tales células huéspedes.

A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en una orientación de 5’ a 3’; las secuencias de aminoácido se escriben de izquierda a derecha en orientación carboxi, respectivamente. Los títulos aquí proporcionados no son limitaciones de los varios aspectos o realizaciones que pueden tenerse por referencia a la especificación como un todo. Por consiguiente, los términos definidos más abajo se definen de manera más completa por referencia a la especificación como un todo.

Como aquí se usa, una “proteína GH61” es una proteína con actividad GH61 (o “favorecedor de celulasa”). Una “proteína GH61) o un polipéptido GH61 pueden tener una secuencia de una proteína que ocurre de manera natural (de tipo salvaje) o puede comprender variaciones relativas a una proteína de tipo salvaje.

Como aquí se usan, las secuencias de proteína GH61 mostradas en las Tablas 1 y 2 (SEQ ID Nos: 1-30) se consideran secuencias de tipo salvaje.

Una proteína tiene “actividad GH61” o “actividad favorecedora de celulosa” o es “biológicamente activa” si, cuando se incluye en una reacción de sacarificación (por ejemplo, se realiza usando una endogluconasa, una βglucosidasa y celobiohidrolasas de Tipo 1 y Tipo 2) da como resultado una mayor cantidad (esto es, mayor producción) de uno o más azúcares solubles (por ejemplo, glucosa) que la reacción de sacarificación realizada bajo las mismas condiciones en ausencia de la proteína GH61. Una “variante biológicamente activa” es una variante o fragmento que conserva al menos algo (por ejemplo, al menos el 10%) de la actividad de GH61 de la proteína de tipo salvaje.

Como aquí se usa, una proteína GH61 “variante” (o polinucleótido que codifica una proteína GH61) es una proteína GH61 que comprende una o más modificaciones relativas a GH61 de tipo salvaje (o el polinucleótido de tipo salvaje que codifica GH61). Las modificaciones incluyen sustituciones, inserciones, eliminaciones y/o truncamientos de amino o carboxi de uno o más de los residuos aminoácidos (o de uno o más nucleótidos o codones en el polinucleótido). Una variante que comprende una eliminación relativa a la proteína de tipo salvaje puede ser referida como un “fragmento”.

Como aquí se usa, un “fragmento” de una proteína GH61 es (a) un polipéptido con una secuencia de tipo salvaje pero que comprende una eliminación relativa a SEQ ID Nos: 1-30 o (b) una variante de GH61 que comprende una eliminación relativa a un polipéptido de SEQ ID Nos: 1-30.

Una “sustitución” de aminoácido en una secuencia de proteína es una sustitución de un aminoácido sencillo por una secuencia con otro aminoácido.

Una sustitución de aminoácido puede ser una sustitución “conservadora”, en cuyo caso el aminoácido sustituido comparte una o más propiedades químicas con el aminoácido al que sustituye. Las propiedades compartidas incluyen las siguientes: aminoácidos básicos: arginina (R), lisina (K), histidina (H); aminoácidos ácidos: ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D); aminoácidos polares no cargados: glutamina (Q) y asparagina (N); hidrofóbicos: leucina (L), isoleucina (I), valina (V); aminoácidos aromáticos: fenilalanina (F), triptófano (W),y tirosina(Y); aminoácidos que contienen sulfuro: cisteína (C), metionina (M); aminoácidos pequeños: glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), prolina (P), cisteína (C),y metionina (M).

El término “pre-proteína” tiene un significado estándar en la técnica y se refiere a un polipéptido que incluye una región de péptido de señal en terminal amino (o secuencia líder) unida. El péptido de señal se parte de la preproteína por una peptidasa de señal simultánea a la secreción de la proteína. La parte secretada de la proteína puede ser referida como proteína “madura” o proteína “secretada”. Así, una secuencia de aminoácido de una preproteína comprenderá una parte de péptido de señal y una parte secretada (madura).

Como aquí se usan, los términos “péptido de señal tiene su significado habitual y se refiere a una secuencia de aminoácido enlazada con la terminal amino de un polipéptido, que dirige al polipéptido codificado a una secuencia secretora de célula.

La “sacarificación” se refiere a una reacción catalizada por enzima que da como resultado hidrólisis de un carbohidrato complejo a azúcares fermentables (por ejemplo, monosacáridos como glucosa o xilosa). Las enzimas pueden ser enzimas de celulosa, tales como endogluconasas, β-glucosidasas y celobiohidrolasas de Tipo 1 y Tipo 2, y combinaciones de tales enzimas de celulasa. Las enzimas de celulasa pueden ser de un caldo de cultivo de un organismo de tipo salvaje o construido con celulasa que produzca enzimas de celulasa (por ejemplo, un hongo como

M. thermophila o levadura).

La “hidrólisis” de celulosa u otro polisacárido (por ejemplo, almidón) ocurre cuando los enlaces glicosídicos entre al menos algunos de los monosacáridos adyacentes de hidrolizan, separando así los pares monómeros previamente unidos.

“Aumentar” la producción de un producto (como un azúcar fermentable) de una reacción ocurre cuando un componente particular presente durante una reacción (como una proteína GH61) provoca que se produzca más de un producto, en comparación con una reacción realizada bajo las mismas condiciones con el mismo sustrato y otros sustituyentes, pero en ausencia del componente de interés.

Los términos “mejorado/a” o “propiedades mejoradas”, como se usan en el contexto de descripción de las propiedades de una variante de GH61, se refieren a un polipéptido variante de GH61 que muestra una mejora en una propiedad o propiedades en comparación con GH61 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) o un polipéptido de referencia especificada. Las propiedades mejoradas pueden incluir, aunque no se limitan a, una mayor expresión de proteínas, una mayor termoactividad, una mayor termoestabilidad, una mayor actividad específica, una mayor especificidad de sustrato, una mayor resistencia al sustrato o a inhibición del producto final, una mayor estabilidad química, inhibición reducida por glucosa, una mayor resistencia a inhibidores (por ejemplo, ácido acético, lectinas, ácidos tánicos y compuestos fenólicos) y un perfil alterado pH/temperatura.

El término “celulasa” (o “enzima de celulasa”) se refiere en términos generales a enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces de celulosa β-1,4-glicosídicos a cadenas más cortas de celulosa, oligosacáridos, celobiosa y/o glucosa, por ejemplo, endoglucanasas, β-glucosidasas y celobiohidrolasas.

Como aquí se usa, el término “polinucleótido” se refiere a un polímero de deoxiribonucleotidos o ribonucleótidos en una forma de una cadena o doble cadena, y complementos de los mismos.

Como aquí se usa, un “gen” es una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína. El ácido nucleico puede o no tener intrones, puede o no ser recombinante y puede o no comprender además elementos que afectan a la transcripción o traslación. Para fines de esta descripción, una secuencia cADN que codifica una proteína puede ser referida algunas veces como un “gen”.

Los términos “ácido nucleico recombinantes” tienen su significado convencional. Un ácido nucleico recombinantes, o equivalentemente, “polinucleótido”, es uno que se inserta en una localización heteróloga de tal manera que no esté asociado con secuencias de nucleótidos que normalmente flanquearían el ácido nucleico

cuando se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ácido nucleico insertado en un vector o un genoma de un organismo heterólogo). De la misma manera, una secuencia de ácido nucleico que no aparece en la naturaleza, por ejemplo, una variante de un gen que ocurre de manera natural, es recombinante. Una célula que contiene un ácido nucleico recombinante, o proteína expresada in vitro o in vivo de un ácido nucleico recombinante también son recombinantes. Ejemplos de ácidos nucleicos recombinantes incluyen una secuencia de ADN que codifica una proteína que (i) esté operativamente unida a un promotor heterólogo y/o (ii) codifique un polipéptido de fusión con una secuencia de proteína y una secuencia de péptido de señal heterólogo.

Los ácidos nucleicos “hibridan” cuando se asocian, típicamente en solución. Los ácidos nucleicos hibridan debido a una variedad de fuerzas físico-químicas bien caracterizadas, como un enlace de hidrógeno, exclusión de disolvente, acumulación de base y similares. Como aquí se usan, los términos “condiciones de lavado con hibridación severa” en el contexto de experimentos de hibridación de ácido nucleico, como hibridación Southern y Northern, son dependientes de secuencia, y son diferentes bajo diferentes parámetros medioambientales. Una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, 1993 “Técnicas de laboratorio en bioquímica y bilogía molecular -Hibridación con sondas de ácido nucleico”, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York). Para polinucleótidos de al menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de baja a muy alta severidad se definen de la siguiente manera: pre-hibridación e hibridación a 42 ºC en 5xSSPE, 0,3% SDS, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y 25% formamida para severidades bajas, 35% formamida severidades medias y medias-altas o 50% formamida para severidades alta y muy altas, siguiendo los procedimientos de ensayo Southern estándar. Para polinucleótidos de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material transportador se lava finalmente tres veces cada 15 minutos usando 2xSSC, 0,2% SDS 50 ºC (severidad baja), a 55 ºC (severidad media), a 60 ºC (severidad media-alta), a 65 ºC (severidad alta) o a 70 ºC (severidad muy alta).

Los términos “vector de expresión se refieren a una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de la divulgación, y que está operativamente unido a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción (por ejemplo, un promotor, una secuencia exterminadora de transcripción, potenciadores) y opcionalmente un marcador seleccionable.

Para fines de esta divulgación, un promotor es “heterólogo” a una secuencia de gen si el promotor no está asociado por naturaleza con el gen. Un péptido de señal es “heterólogo” a una secuencia de proteína cuando la secuencia de péptido de señal no está asociad con la proteína por naturaleza.

En relación con las secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores), los términos “operativamente unido/a” se refieren a una configuración donde una secuencia reguladora está situada en una posición en relación con una secuencia codificadora de polipéptido de tal manera que la secuencia reguladora influencie en la expresión del polipéptido. En relación con una secuencia de señal, los términos “operativamente unido/a” se refieren a una configuración donde la secuencia de señal que codifica un péptido de señal de amino-terminal se fusiona con el polipéptido, de tal manera que la expresión del gen produzca una pre-proteína.

Como aquí se usan, los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan aquí intercambiablemente para referirse a un polímero de residuos de aminoácido.

Como aquí se usa, el término “aminoácido” se refiere a aminoácidos que ocurren de manera natural y sintéticos, así como análogos de aminoácidos.

Los términos “biomasa”, “sustrato de biomasa”, “biomasa celulósica”, materia prima celulósica”, “materia prima lignocelulósica” y “sustrato celulósico”, se refieren todos a materiales que contienen celulosa. Por simplicidad, los términos “sustrato celulósico” aquí se usan para referirse a materiales que contienen celulosa que pueden funcionar con celulosas (con proteínas GH61 opcionalmente presentes), típicamente después de pre-tratamiento, para producir azúcares fermentables. Los ejemplos de sustratos celulósicos incluyen, aunque no se limitan a, biomasa como madera, pulpa de madera, pulpa de papel, fibra de maíz, grano de maíz, mazorcas de maíz, residuos de grano como cáscaras de maíz, rastrojos de maíz, hierbas, trigo, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz; pasto varilla, papel sobrante, sobrante del procesamiento de papel y pulpa, plantas leñosas y herbáceas, pulpa de fruta y vegetales, grano de destilador, vaina de arroz, algodón, cáñamo, lino, sisal, bagazo de caña de azúcar, sorgo, soja, componentes obtenidos de moler granos, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de madera, serrín, matorrales y arbustos, verduras, frutas y flores y mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el material celulósico se “pre-trata”, o trata usando métodos conocidos en la técnica, como pre-tratamiento químico (por ejemplo, pre-tratamiento con amoníaco, pre-tratamiento con ácido diluido, pre-tratamiento con álcali diluido o exposición a disolvente), pre-tratamiento físico (por ejemplo, exposición a rayos o radiación), pre-tratamiento mecánico (por ejemplo, pulverización o molienda) y pre-tratamiento biológico (por ejemplo, aplicación de microorganismos que solubilizan lignina) y combinaciones de ellos, para aumentar la susceptibilidad de celulosa a hidrólisis. Los sustratos celulósicos y sus procesos se describen con más detalle más abajo.

Un sustrato celulósico se “deriva de” una fuente específica (como maíz o trigo) mediante un proceso que comprende la obtención de la fuente o una parte física de la fuente (como una mazorca de maíz o paja de trigo), y después opcionalmente pre-tratar la fuente o parte.

Una secuencia de proteína de celulasa (esto es, una variante de celulosa) se “deriva de” una secuencia de celulasa cuando se produce introduciendo variaciones en una secuencia de tipo salvaje usando mutagénesis in vitro

o métodos de evolución molecular. Típicamente, la secuencia de proteína será al menos 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95% a la secuencia de tipo salvaje.

Se dice que un sustrato celulósico está “pre-tratado” cuando ha sido procesado mediante algunos medios físicos y/o químicos para facilitar la sacarificación.

Los “azúcares fermentables” se refieren a azúcares simples (monosacáridos, disacárido y oligosacáridos cortos) como, aunque sin limitar a, glucosa, xilosa, galactosa, arabinosa, manosa y sacarosa. El azúcar fermentable es cualquier azúcar que un microorganismo pueda utilizar o fermentar.

Los términos “transformar” o “transformación”, como se usa en referencia con una célula, significan que una célula tiene una secuencia de ácido nucleico no nativo integrado en su genoma o como un episoma (por ejemplo, plásmido) que se mantiene a través de múltiples generaciones.

El término “introducido”, como se usa en el contexto de inserción de secuencia de ácido nucleico en una célula, significa conjugado, transfectado, transducido o transformado (colectivamente “transformado”) o incorporado de otra manera en el genoma, o mantenido como un episoma en una célula.

Una célula “construida por celulosa” es una célula que comprende al menos una, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro secuencias recombinantes que codifican una celulasa o variante de celulasa, y donde la expresión de la(s) celulasa(s) o variante(s) de celulasa se ha modificado en relación con la forma de tipo salvaje. La expresión de una celulasa se “modifica” cuando una variante de celulasa que ocurre de manera no natural se expresa o cuando una celulasa que ocurre de manera natura se sobreexpresa. Una manera de sobreexpresar una celulasa es unir operativamente un promotor fuerte (opcionalmente constitutivo) con la celulasa que codifica la secuencia. Otra manera de sobreexpresar una celulasa es aumentar el número de copia de un gen de celulasa heterólogo, variante o endógeno. La célula construida por celulasa puede ser una célula fúngica, como una célula de levadura o una célula fúngica filamentosa (por ejemplo, Acidothermus cellulolyticus, Thermobifida fusca, Humicola grisea, Myceliophthora thermophila, Chaetomium thermophilum, Acremonium sp., Thielavia sp, Trichoderma reesei, Aspergillus sp.). En algunas realizaciones la célula construida por celulasa es una célula M. thermophila.

El término “cultivar” se refiere a hacer crecer una población de células microbianas (por ejemplo, fúngica) bajo un medio de cultivo líquido o sólido. Algunas células cultivadas expresan o secretan proteínas, como por ejemplo proteínas GH61 o proteínas de celulasa. Cuando las células crecen en un medio líquido pueden secretarse proteínas al medio, lo que es referido mediante varios términos, incluyendo medio de cultivo celular, sobrenadante de cultivo celular y caldo de cultivo.

Como aquí se usa, el término “recuperación”, se refiere a la cosecha, aislamiento, recogida y separación de una proteína, azúcar, célula o producto final (por ejemplo, alcohol) de un caldo de cultivo o, alternativamente, medio de cultivo sólido.

Como aquí se usa, el término “aislado/a” se refiere a un ácido nucleico, polipéptido u otro componente que está parcialmente o completamente separado de componentes con los que normalmente se asocia por naturaleza (como otras proteínas, ácidos nucleicos o células).

Un producto que ha sido “purificado” es un producto que se ha enriquecido de la fuente de la que se obtiene al menos 10 veces, y opcionalmente al menos 100 veces, o al menos 1000 veces. Por ejemplo, una proteína que se obtiene de un caldo de cultivo donde representa el 0,1% de la proteína total puede purificarse para que sea el 1%, 2,5%, 10%, 25%, 50%, 80%, 95% o 100% (p/p) de la proteína en la preparación. Un producto que se ha “purificado parcialmente” se ha enriquecido de la fuente de la que se produce al menos 2 veces, al menos 5 veces, pero aún contiene al menos el 50%, y algunas veces al menos el 90% (p/p) de componentes no relacionados diferentes al disolvente.

“Fraccionar” un producto líquido como un caldo de cultivo significa aplicar un proceso de separación (como precipitina con sal, cromatografía de columna, exclusión por tamaño y filtración) o una combinación de tales procesos para obtener una solución donde una proteína desea (como una proteína GH61, una enzima de celulasa o una combinación de ellas) tenga un porcentaje mayor de proteína total en la solución que el producto líquido inicial.

Una “suspensión” es una solución acuosa donde se dispersan uno o más componentes sólido, como sustrato celulósico.

Como aquí se usa una “composición” que comprende una o más proteínas puede ser, por ejemplo, una composición libre de células que comprende la(s) proteína(s), un lisado celular, un caldo de cultivo que comprende la(s) proteína(s), por ejemplo, en forma secretada; una célula que comprende la(s) proteína(s), como una célula recombinante que expresa la(s) proteína(s); una mezcla de dos o más poblaciones celulares que expresan diferentes proteínas (por ejemplo, una célula que expresa una proteína recombinantes GH61 y una segunda célula que expresa proteína de celulasa).

Los términos “composición libre de células” se refieren a una composición que contiene proteínas donde las células y los restos celulares se han retirado, como una mezcla de celulasa purificada o un caldo de incubación celular que contiene proteína secretada, del cual se han retirado células y material insoluble.

Los términos “identidad porcentual”, “% identidad”, “idéntico porcentual” y “% idéntico” se usan intercambiablemente para referirse a una comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación. La ventana de comparación puede incluir adiciones o eliminaciones en cualquier secuencia para optimizar la alineación. El porcentaje de identidad es el número de posiciones que son idénticas entre las secuencias, dividido entre el número total de posiciones en la ventaja de comparación (incluyendo posiciones donde una de las secuencias tiene un espacio). Por ejemplo, una proteína con una secuencia de aminoácido que coincide en la posición 310 con una secuencia de GH61a (que tiene 323 aminoácidos en la forma secretada) tendrá 310/323 = 95,9% identidad con la referencia. Similarmente, una variante de proteína que tiene 300 residuos (esto es, menos que la longitud completa) y coincide la secuencia de referencia en 280 posiciones tendrá 280/300 = 93,3% identidad. Mientras la alineación y la clasificación óptimas pueden realizarse manualmente, el proceso puede facilitarse usando un algoritmo de alineación implementado por ordenador. Los ejemplos son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, descritos en Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402. Alternativamente, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácido puede determinarse usando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-53), que se ha implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al, 2000, Trends in Genetics 16: 276-77), preferentemente la versión 3,0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalización de espacio abierto de 10, penalización de extensión de espacio de 0,5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La producción de “identidad más larga” con etiqueta Needle (obtenida usando la opción the-nobrief) se usa como la identidad porcentual y se calcula de la siguiente manera: (Residuos Idénticos x 100) / (Longitud de Alineación – Número Total de Espacios en Alineación).

III. Identificación de genes GH61

Se identificaron veinticuatro proteínas GH61 endógenas a Myceliophthora thermophila como se ha descrito en el Ejemplo 1. Véase la TABLA 1 y TABLA 2 más abajo. Como se muestra en los Ejemplos 2 y 3, una proteína particular GH61 de M. thermophila con la designación GH61a (SEQ ID NO: 2) se mostró para mejorar las reacciones de sacarificación en presencia de celulasas. Similarmente, pueden usarse otras proteínas GH61 (SEQ ID Nos. 3 a 30) para mejorar la actividad de celulasa.

La TABLA 1 proporciona la secuencia de una pre-proteína GH61 (SEQ ID NO: 1), que muestra el péptido de señal nativo predicho subrayado, y la forma secretada (madura) predicha (SEQ ID NO: 2). La secuencia ID NO: 2 tiene 323 aminoácidos de longitud. Se contempla que ciertas variantes de proteína GH61a comprenderán residuos 11-323 de SEQ ID NO: 2 (incluyendo, aunque sin limitar a, fragmentos truncados amino-terminal), o tendrán al menos: aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% de identidad de secuencia con residuos 11-323 de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la variante de proteína GH61 tendrá al menos 90% identidad con residuos 11-323 de SEQ ID NO: 2 y tendrá 315 residuos de longitud.

La TABLA 2 proporciona 28 secuencias de pre-proteína GH61, con el péptido de señal nativa predicha subrayada. No se predice que GH61t y GH61n tengan péptidos de señal. Excepto donde se especifique lo contrario

o se aclare del contexto, la referencia a una o más secuencias enumeradas en la TABLA 2 se inserta para abarcar una o más de la forma de pre-proteína y la forma secretada (esto es, una proteína que comprende la secuencia entera, y una proteína que no incluye la secuencia subrayada). También se contempla que ciertas proteínas GH61 comprendan residuos 11 con la terminal C de las secuencias mostradas en la Tabla 2 (incluyendo, aunque sin limitar a, fragmentos truncados de amino-terminal), o tendrán al menos: aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% de identidad de secuencia con residuos 11 para terminal C de estas secuencias. En la Tabla 2 pueden usarse las siguientes denominaciones: B = SEQ ID NO. de proteína de longitud completa (incluyendo péptido de señal); C = Péptido de señal (Subrayado); D = Proteína

madura (No subrayado); E = Parte de D que comienza en residuo 11 de la parte secretada (esto es, entre el espacio y la terminal C, una parte truncada de amino terminal).

Los límites de péptido de señal en la TABLA 1 y TABLA 2 se predicen en base al análisis de la secuencia primaria. Es posible que el sitio real de división difiera del sitio predicho hasta en varios residuos (por ejemplo, 1-20, por ejemplo hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10). La presencia de un péptido de señal heterólogo puede también afectar al sitio de la división. Una división de péptido de señal puede determinarse expresando la secuencia de longitud completa e identificando los residuos de terminal amino de la proteína GH61 secretada. Se espera que la adición o eliminación de varios residuos en la terminal amino de la proteína madura tenga poco o ningún efecto en la actividad de la proteína secretada.

TABLA 1

Glicósido hidrolasa 61 proteína GH61a

SEQ ID NO:

Designación

1

GH61a Pe-Proteína:

2

GH61a Proteína Madura:

35 TABLA 2 Glicósido hidrolasa 61 proteína GH61a

B

Designación Secuencia (Secuencia de Péptido de Señal Putativa)

3

GH61l

4

GH61m

5

GH61n

6

GH61o

7

GH61p

8

GH61q

9

GH61 r

(continua)

10

GH61s

11

GH61t

12

GH61u

13

GH61v

14

GH61w

15

GH61x

16

GH61b

17

GH61c

18

GH61d

19

GH61e

20

GH61f

21

GH61g

22

GH61h

23

GH61i

24

GH61j

25

GH61k

26

GH61p2

27

GH61q2

28

GH61r2

29

GH61t2

30

GH61e2

IV. Ácidos nucleicos recombinantes y proteínas

En un aspecto, la divulgación proporciona ácidos nucleicos recombinantes que comprenden secuencias de

60 proteína expuestas en la TABLA 1 o TABLA 2 y variantes (por ejemplo, variantes biológicamente activas) de las mismas. La divulgación también proporciona vectores de expresión que contienen los ácidos nucleicos recombinantes, células que comprenden un ácido nucleico recombinante o vector, proteínas recombinantes producidas por tales células y métodos para usar las células y proteínas.

En un aspecto, la divulgación proporciona una secuencia de ácido nucleico recombinantes que codifica una pre-proteína que comprende SEQ ID NO: 1-30, la proteína madura (secretada) codificada en SEQ ID NO: 1-30 o un fragmento truncado amino terminal de SEQ ID NO: 1-30.

En un aspecto, la divulgación proporciona una proteína GH61 recombinante, aislada o purificada que tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 1-30, la proteína madura (secretada) codificada en SEQ ID NO: 1-30 o un fragmento truncado amino terminal de SEQ ID NO: 1-30.

En un aspecto, la divulgación proporciona una secuencia de ácido nucleico recombinantes que codifica una proteína GH61 con al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende SEQ ID NO: 1-30, la proteína madura (secretada) codificada en SEQ ID NO: 1-30 o un fragmento truncado amino terminal de SEQ ID NO: 1-30. En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona una proteína GH61 recombinante, aislada o purificada que tiene una secuencia como se ha expuesto anteriormente. En algunos casos, una sustitución conservadora de aminoácido puede ser preferente sobre otros tipos de sustituciones.

Las proteínas GH61 pueden ser proteínas endógenas aisladas de células fúngicas (por ejemplo, M. thermophila) o pueden producirse recombinantemente.

Como se analiza con más detalle más abajo, las proteínas GH61 pueden comprender un péptido de señal endógeno o heterólogo. Como se analiza con más detalle más abajo, un ácido nucleico que codifica una proteína GH61 puede unirse operativamente a un promotor, como un promotor heterólogo.

En una realización la divulgación proporciona una secuencia de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOS: 31-59.

La secuencia de ácido nucleico usada para expresar una proteína GH61 puede ser una secuencia nativa obtenida de M. thermophila que codifica la respectiva proteína, o una parte de la misma que codifica la proteína madura. GH61 ejemplares que codifican secuencias de M. thermophila se muestran en SEQ ID NOS: 31 a 59. Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína específica pueden designarse por referencia al código genético. En algunas realizaciones, se usa una secuencia que puede estar optimizada con codón para una célula huésped diferente a M. thermophila (por ejemplo, células de levadura). Véase GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; Codon W, John Peder, Universidad de Nottingham; McInerney, J. O., 1998, Bioinformatics 14: 372-73, en cuyo caso la secuencia de ácido nucleico es diferente a la secuencia que ocurre de manera natural.

En algunas realizaciones, las proteínas GH61 de la divulgación son biológicamente activas, esto es, tienen actividad GH61. La actividad GH61 puede medirse usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo métodos descritos aquí más abajo. Los polipéptidos que carecen de actividad GH61 también pueden encontrar variedad de usos, incluyendo uso para la generación de anticuerpos para purificación de proteínas GH61. Excepto que se aclare del contexto, la referencia aquí a una proteína GH61 (incluyendo variantes) se refiere a proteínas con actividad GH61.

Es preferente que las proteínas GH61 que sean variantes de SEQ ID NOS: 1-30 tengan al menos 10% de la actividad de la misma cantidad molar de la proteína de tipo salvaje de la que se derivan. Pueden tener al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de la actividad de la proteína de tipo salvaje.

Las proteínas GH61 que son de variantes de SEQ ID NOS: 1-30 pueden ser más cortas que la proteína de tipo salvaje en aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4%, aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadamente 9%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70% o aproximadamente 80% en comparación con la secuencia referencia (tipo salvaje) y/o parte de una proteína de fusión en la que una parte de proteína GH61 se une a una o más secuencias. Estas variantes pueden tener al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende SEQ ID NO: 1-30, la proteína madura (secretada) codificada en SEQ ID NO: 1-30 o un fragmento truncado amino terminal de SEQ ID NO: 1-30. Las proteínas GH61 pueden tener una eliminación interna o una eliminación en la terminal amino o carboxi en relación con una secuencia de tipo salvaje.

Las proteínas GH61 pueden comprender una eliminación en terminal amino y/o terminal carboxi y/o eliminación interna, pero donde el resto de secuencia de aminoácido es al menos aproximadamente 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia con la que se está comparando (por ejemplo, una variante GH61 de longitud completa de la divulgación). En algunas realizaciones, el dominio de enlace de quitina, o dominio GH61 se retira. En algunas realizaciones, la proteína conservar sustancialmente todas la actividad del polipéptido de longitud completa.

Una proteína GH61 madura puede tener al menos 70%, 80%, 90% o 95% identidad de secuencia con una secuencia de tipo salvaje, y tiene sustancialmente longitud completa (al menos 90% de la longitud de la secuencia de tipo salvaje).

La divulgación también proporciona una secuencia de ácido nucleico GH61 recombinante y proteína expresada de la misma, donde la proteína tiene la secuencia de GH61f, GH61a, GH61v, GH61p, GH61g y GH61i (SEQ ID Nos: 2, 7, 13, 20, 21, 23, 26), o un fragmento secretada de la misma; así como variantes al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idénticas a cualquiera de GH61f, GH61v, GH61p, GH61g y GH61i (SEQ ID Nos: 2, 13, 20, 21, 23, 26); o una cualquiera de GH61a, GH61o, GH61v, GH61x, GH61b y GH61e (SEQ ID Nos: 2, 6, 13, 15, 16, 19, 30), fragmentos y variantes de los mismas, y ácidos nucleicos que codifican tales proteínas. La divulgación también incluye vectores de expresión que comprenden una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico anteriormente mencionadas, células que comprenden tales vectores de expresión y proteínas GH61 aisladas producidas por las células. Preferentemente, la proteína variante GH61 tiene actividad potenciadora de celulasa. La proteína que codifica las secuencias puede incluir un péptido de señal heterólogo y/o puede estar operativamente unido a un promotor heterólogo.

Sin pretender estar ligado a un particular mecanismo de acción, en presencia de GH61, la hidrólisis de polímeros de azúcar (por ejemplo, sustratos de celulosa) por las enzimas produce más producto durante un periodo de tiempo particular, procede más rápidamente o se completa más rápido cuando la proteína GH61 está presente, en comparación con una reacción similar bajo las mismas condicione donde la proteína GH61 está ausente.

Las proteínas GH61 de la divulgación que tienen actividad potenciadora de celulosa pueden identificarse usando métodos estándares para mapear la función en un polipéptido, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, puede expresarse una variante truncada y después probarse en un ensayo de actividad de GH61. Pueden introducirse truncamientos adicionales hasta que se pierda la actividad, en cuyo punto podría identificarse la unidad funcional mínima de la proteína. Los fragmentos que contienen cualquier parte de la proteína por debajo del tamaño identificado serán típicamente funcionales, como lo serían las construcciones de fusión que contengan al menos el núcleo funcional de la proteína.

Para generar variantes biológicamente activas que incorporan uno o más cambios de aminoácido en una secuencia que codifica GH61 (cualquiera de SEQ ID Nos: 1 a 30), pueden introducirse sustituciones en la secuencia de proteína y la proteína expresada para la retención de actividad.

Puede usarse una estrategia de mutación aleatoria o semi-aleatoria para generar una gran colección de variantes activas. Los textos estándares PROTOCOLOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR (Ausubel et al., eds.) y CLONACIÓN MOLECULAR: UN MANUAL DE LABORATORIO (Sambrook et al., eds.) describen técnicas que emplean mutagénesis química, mutagénesis de casete, degeneración de oligonucleótidos, preparación mutua de oligonucleótidos, mutagénesis con escaneo de enlazador, mutagénesis con escaneo de alanina y PCR propenso a error. Otros métodos eficientes incluyen las cepas mutantes de E. coli de Stratagene (Greener et al., Methods Mol. Biol. 57: 375, 1996) y la técnica de mezcla de ADN de Maxygen (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 724, 1997; Harayama, Trends Biotechnol. 16:76, 1998; Patentes de Estados Unidos 5.605.793 y 6.132.970). Para aumentar la variación, puede usarse una tecnología que genera más cambios abruptos, como técnica de mezcla de ADN.

Pueden usarse kits disponibles comercialmente para obtener variantes, incluyendo el Sistema de Mutagénesis Dirigido al Sitio GeneTailor™ vendido por InVitrogen™ Life Technologies; el Kit de Mutagénesis Aleatorio BD Diversify™, vendido por BD Biosciences/Clontech; Template Generation System™, vendido por MJ Research Inc., la cepa mutante de E. coli XL1-Red™, vendido por Stratagene; y el kit de Mutagénesis Aleatoria GeneMorph®, también vendido por Stratagene. Al emplear cualquiera de estos sistemas junto con un ensayo adecuado de actividad GH61, pueden generarse y probarse variantes de una manera con un alto rendimiento.

Alternativamente o además de, el usuario puede emplear una estrategia de evolución dirigida. Véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos 7.981.614; Mëtodos para generar polinucléotidos que tienen las características deseadas; US 2011/0034342: Método para generar una población optimizada y diversa de variantes; Patente de Estados Unidos 7.795.030: Métodos y composiciones para ingeniería celular y metabólica; Patente de Estados Unidos 7.647.184: Alto rendimiento evolutivo dirigido por mutagénesis racional; Patente de Estados Unidos

6.939.689: Re-montaje de ácido nucleico mediado por exonucleasa en evolución dirigida; y Patente de Estados

Unidos 6.773.900: Selección final en evolución dirigida. La mutagénesis puede realizarse de acuerdo con cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica, incluyendo mutagénesis aleatoria y específica de sitio. La evolución dirigida puede realizarse con cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica para investigar la producción de variantes incluyendo la mezcla.

Los métodos de mutagénesis y evolución dirigida son bien conocidos en la técnica. Véase las patentes de Estados Unidos Números 5.605.793, 5.830.721, 6.132.970, 6.420.175, 6.277.638, 6.365.408, 6.602.986, 7.288.375, 6.287.861, 6.297.053, 6.576.467, 6.444.468, 5.811238, 6.117.679, 6.165.793, 6.180.406, 6.291.242, 6.995.017, 6.395.547, 6.506.602, 6.519.065, 6.506.603, 6.413.774, 6.573.098, 6.323.030, 6.344.356, 6.372.497, 7.868.138, 5.834.252, 5.928.905, 6.489.146, 6.096.548, 6.387.702, 6.391.552, 6.358.742, 6.482.647, 6.335.160, 6.653.072, 6.355.484, 6.03.344, 6.319.713, 6.613.514, 6.455.253, 6.579.678, 6.586.182, 6.406.855. 6.946.296, 7.534.564, 7.776.598, 5.837.458, 6.391.640, 6.309.883, 7.105.297, 7.795.030, 6.326.204, 6.251.674, 6.716.631, 6.528.311, 6.287.862, 6.335.198, 6.352.859, 6.379.964, 7.148.054, 7.629.170, 7.620.500, 6.365.377, 6.358.740, 6.406.910, 6.413.745, 6.436.675, 6.961.664, 7.430.477, 7.873.499, 7.702.464, 7.783.428, 7.747.391, 7.747.393, 7.751.986, 6.376.246, 6.426.224, 6.423.542, 6.479.652, 6.319.714, 6.521.453, 6.368.861, 7.421.347, 7.058.515, 7.024.312, 7.620.502, 7.853.410, 7.957.912, 7.904.249, y todos los homólogos relacionados que no son de Estados Unidos; Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]; Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]; Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767; y WO 2009/152336.

En algunas realizaciones, una proteína GH61 de la divulgación tiene una secuencia de aminoácido que está codificada por un ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones severas (esto es, severidad media alta, alta o muy alta) con el complemento de SEQ ID NO: 31-59 y comprende actividad GH61.

V. Ensayos de Actividad GH61

La actividad potenciadora de celulasa de proteínas GH61 de la divulgación puede determinarse usando cualquier ensayo adecuado de actividad GH61. Por ejemplo, se obtiene una proteína GH61 purificada o recombinante de esta divulgación y después se analiza para actividad GH61 combinándolo con enzimas de celulasa en una reacción de sacarificación, y se determina si hay un aumento en producción de glucosa, en comparación con la misma reacción de sacarificación realizada sin el GH61.

En una técnica, la actividad GH61 puede analizarse combinando sustrato celulósico con enzimas de celulasa (por ejemplo, 5-10 mg de peso total de enzimas de celulasa por gramo de sustrato) en presencia y ausencia de proteína GH61. En algunas realizaciones las enzimas de celulasa son un conjunto definido de enzimas recombinantes de celulasa de M. thermophila.

En otra técnica, se usa el caldo de un cultivo de M. thermophila de tipo salvaje (con o sin la complementación de la proteína GH61). La actividad GH61 se demuestra por una mayor producción de glucosa en presencia de GH61 exógeno (eso es, más allá de cualquier mejora resultante de GH61 endógeno en el caldo).

También es posible usar un caldo complementado con una o más enzimas purificadas.

Las enzimas adecuadas incluyen enzimas recombinantes aisladas clonadas de M. thermophila, como endogluconasa (EG), β-glucosidasa (BGL); celobiodrilasa de Tipo 1 (CBH1) y/o celobiodrolasa de Tipo 2 (CBH2) en cualquier combinación adecuada para el sustrato elegido para producir un producto medible. Las enzimas de celulasa ejemplares que pueden usarse para analizar la actividad GH61 pueden tener secuencias de aminoácido seleccionadas de cualquiera de SEQ ID Nos: 61 a 68.

En un ensayo ejemplar para medir actividad GH61 de M. thermophila derivada de proteínas GH61 y proteínas variantes, las enzimas de celulasa usadas son M. thermophila BGL1 (SEQ ID NO:66; Badhan et al., Bioresour Technol. 2007 Feb; 98(3):504-10); M. thermophila CBH1 (SEQ ID NO:67; Park JI et al., Badhan et al., Bioresour Technol. 2007 Feb;98(3):504-10); and M. thermophila CBH2 (SEQ ID NO:68). En algunas realizaciones, también se usa endoglucanasa: M. thermophila EG2 (SEQ ID NO: 65; Rosgaard L. et al., Prog. 2006; 22(2):493-8; Badhan et al., supra).

Alternativamente, pueden usarse preparaciones comercialmente disponibles que comprenden una mezcla de enzimas de celulasa, como Laminex™ y Spezyme™ de Genencor International, Rohament™ de Rohm GmbH, y Celluzyme™,Cereflo™ y Ultraflo™ de Novozymes Inc.

Los ensayos con enzimas de celulosa se hacen típicamente a 50 ºC, pero también pueden hacerse a 35, 45, 55, 60 o 65 ºC. La proteína GH61 y las enzimas se combinan con el sustrato y se incuban para producir azúcares fermentables. Los azúcares después se recuperan y se cuantifican para producir glucosa. Un sustrato adecuado es paja de trigo (por ejemplo, paja de trigo pre-tratada). Otros sustratos celulósicos enumerados en esta divulgación pueden usarse como una alternativa, incluyendo rastrojo de maíz pre-tratado con ácido sulfúrico (véase la patente de Estados Unidos 7.868.227) y otros sustratos descritos en la Sección XII más abajo.

También puede usarse un método de ensayo que proporciona Harris et al., 2010, Biochemistry 49:33053316. En este método, el rastrojo de maíz se pre-trata con ácido sulfúrico, se lava, incuba con enzimas de celulosa y GH61 durante varios días, y después la producción de azúcares se cuantifica mediante refracción.

Otro método de ensayo se proporciona en la patente de Estados Unidos Nº 7.868.227. En este método, el sustrato celulósico es PCS (rastrojo de maíz pre-tratado con calor y ácido sulfúrico diluido; WO 2005/074647); una mezcla de enzima de celulosa es Cellulcast®, una mezcla de enzimas de celulasa del hongo Trichoderma reesei, disponible en Sigma-Aldrich. La hidrólisis de PCS se realiza en un volumen total de reacción de 1,0 mL y una concentración de PCS de 50 mg/mL en 1 mM de sulfato de manganeso, 50 mM de tampón de acetato de sodio pH

5.0. La proteína de la prueba se combina con la mezcla de celulasa base en concentraciones relativa entre 0 y 100% de proteína total. La composición de proteína se incuba con PCS a 65 ºC durante 7 días. La producción combinada de glucosa y celobiosa puede medirse mediante detección de índice de refracción.

La actividad GH61 se calcula como un incremento en la producción de glucosa a partir del sustrato por la(s) celulasa(s) en presencia de proteína GH61, en comparación con la misma mezcla de reacción en ausencia de proteína GH61. Típicamente, el incremento es dependiente de dosis en al menos un rango triple de concentraciones. La actividad GH61 puede expresarse como un grado de “sinergia” como se analiza en el Ejemplo 8.

La adición o presencia de proteína GH61 recombinante o aislada puede aumentar la producción del producto a partir de enzimas de celulasa, por ejemplo, al menos 1%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, 30%, 50%, 70%, doblar, triplicar o más.

VI. Expresión de proteínas GH61

El cultivo celular, genética recombinante, ingeniería de proteínas y técnicas de fermentación que pueden emplearse en la expresión, producción y uso de las proteínas GH61, composiciones y otros productos de esta divulgación son conocidos en la técnica. Por conveniencia, ciertos aspectos se describen brevemente más abajo. Aunque se describen principalmente en el contexto de expresión de proteínas GH61, se apreciará que los mismos métodos, células, etc., pueden usarse para expresar proteínas de celulasa y otras proteínas como, aunque sin limitar a, las descritas aquí en otro punto.

En algunas realizaciones de la divulgación, la construcción comprende además secuencias reguladoras, por ejemplo, un promotor, operativamente unido a la proteína que codifica la secuencia. Aquellos expertos en la técnica conocen grandes números de vectores y promotores adecuados.

Péptido de señal

En algunas realizaciones de la divulgación, una proteína GH61 puede incluir un péptido de señal, para que cuando se exprese en una célula huésped, la forma madura (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) se secrete en un caldo de cultivo celular. La proteína GH61 (o variante) puede incluir su péptido de señal nativo correspondiente como se muestra en la TABLAS 1 y 2. Alternativamente, una secuencia de ácido nucleico recombinantes que codifica una proteína que comprende SEQ ID NO: 2, o la parte secretada de una cualquiera de SEQ ID Nos: 3 a 30, una parte truncada de amino terminal de una cualquiera de SEQ ID Nos: 2 a 30, o una variante de los mismos que tenga un péptido heterólogo de señal fusionado con terminal N.

Pueden usarse varios péptidos de señal, dependiendo de la célula huésped y otros factores. Los péptidos de señal útiles para células huéspedes fúngicas filamentosas incluyen los péptidos de señal obtenidos de TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, amilasa neutral de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, celulasa de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa, y celobiohidrolasa II de T. reesei (TrCBH2).

Los péptidos de señal útiles para células huéspedes bacterianas son los péptidos de señal obtenidos a partir de los genes para amilasa maltógenica de Bacillus NCIB 11837, α-amylase de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, β-lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutrales de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y prsA Bacillus subtilis. Más péptidos de señal se describen en Simonen and Palva, 1993, Microbiol Rev 57:109-137.

Los péptidos de señal útiles para células huéspedes de levadura también incluyen aquellos de los genes de alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, SUC2 invertasa de Saccharomyces cerevisiae (véase Taussig y Carlson,

1983, Nucleic Acids Res 11:1943-54; SwissPro,Nº de acceso. P00724), y otros. Romanos et al., 1992, Yeast 8:423

488. Las variantes de estos péptidos de señal y otros péptidos de señal son adecuados.

La divulgación también proporciona proteínas recombinantes que comprenden un péptido de señal mostrado en la Tabla 1 o Tabla 2 fusionado con terminal amino de una proteína heteróloga (esto es, una proteína con la que no se asocia por naturaleza, que puede ser una proteína diferente a una proteína GH61). Así, los péptido de señal mostrados en la Tabla 1 y 2 pueden usarse para provocar secreción de una proteína heteróloga recombinantemente expresada en una célula huésped. En algunas realizaciones la célula huésped es Myceliophthora thermophila.

Promotores

Con el fin de obtener altos niveles de expresión en una célula particular a menudo es útil expresar la variante GH61 de la presente divulgación bajo el control de un promotor heterólogo. Una secuencia de promotor puede unirse operativamente a la región 5’ de la secuencia que codifica GH61 usando métodos rutinarios.

Los ejemplos de promotores útiles para expresión de GH61s incluyen promotores de hongos. En algunas realizaciones, puede usarse una secuencia promotora que conduce la expresión de un gen diferente a un gen GH61 en una cepa fúngica. Como un ejemplo no limitativo, puede usarse un promotor fúngico de un gen que codifica una endoglucanasa. En algunas realizaciones, puede usarse una secuencia promotora que conduce la expresión de un gen GH61 en una cepa fúngica diferente a la cepa fúngica de la que la variante GH61 se derivó. Como un ejemplo no limitativo, si la variante GH61 se deriva de C1, puede usarse un promotor de T. reesei gen GH61 o un promotor como el descrito en WO 2010107303, como, aunque sin limitar a las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29 en WO 2010107303.

Los ejemplos de otros promotores adecuados útiles para dirigir la transcripción de las construcciones de nucleótido de la presente divulgación en una célula huésped fúngica filamentosa son promotores obtenidos de genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutral de Aspergillus niger, ácido estable alfa-amilasa de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, acetamidasa de Aspergillus nidulans, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para alfa-amilasa neutral de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae) promotes como cbh1, cbh2, egl1, egl2, pepA, hfb1, hfb2, xyn1, amy, y glaA (Nunberg et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:2306 -2315, Boel et al., 1984, EMBO J. 3:158185 and EPA 137280), y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos. En un huésped de levadura, los promotores útiles pueden ser de los genes de enolasa de Saccharomyces cerevisiae (eno-1), galactokinasa de Saccharomyces cerevisiae (gal1), alcohol dehidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP), y 3-fosfoglicerato quinasa de S. cerevisiae. Otros promotores útilese para células huéspedes de levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488. Los promotores asociaos a producción de quitinasa en hongos también pueden usarse. Véase, por ejemplo, Blaiseau y Lafay, 1992, Gene 120243-248 (hongo filamentoso Aphanocladium album); Limon et al., 1995, Curr. Genet, 28:478-83 (Trichoderma harzianum).

Los promotores conocidos para expresión de control de genes en células procarióticas o eucarióticas o los virus y que pueden usarse en algunas realizaciones de la invención incluyen promotor SV40. Promotor E. coli lac o trp, promotor fago lambda PL, promotor tac, promotor T7 y similares. En células huéspedes bacterianas, los promotores adecuados incluyen los promotores obtenidos de E. coli lac operon, gen agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), gen levansucransa de Bacillus subtilis (sacB), gen α-amilasa de Bacillus licheniformis (amyl), gen amilasa maltogénico de Bacillus stearothermophilus (amyM), gen α-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), genes de Bacillus subtilis xy/A y xy/B y gen procariótico β-lactamasa.

Pueden usarse cualquier otra secuencia promotora que conduzca la expresión en una célula huésped adecuada. Las secuencias promotoras adecuadas pueden identificarse usando métodos bien conocidos. En una técnica, una secuencia promotora putativa se une a una secuencia 5’ que codifica una proteína reportera, la construcción se transfecta a la célula huésped (por ejemplo, C1) y el nivel de expresión de la reportera se mide. La expresión de la reportera puede determinarse midiendo, por ejemplo, niveles de mARN de la secuencia reportera, una actividad enzimática de la proteína reportera o la cantidad de proteína reportera producida. Por ejemplo, la actividad promotora puede determinarse usando la proteína verde fluorescente como secuencia codificadora (Henriksen et al., 1999, Microbiology 145: 729-34) o un gen reportero lacZ (Punt et al., 1997, Gene, 197: 189-93). Los promotores funcionales pueden derivarse de secuencias promotoras que ocurren de manera natural mediante métodos de evolución dirigidos. Véase, por ejemplo, Wright et al., 1005, Human Gene Therapy, 16: 881-892.

Los promotores adicionales incluyen aquellos de M. thermophila, proporcionados en la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 13/214.406 presentada el 22 de agosto de 2010, así como en WO 2010/107303.

Vectores

La presente invención hace uso de construcciones recombinantes que comprenden una secuencia que codifica GH61 como se ha descrito anteriormente. Las construcciones de ácido nucleico de la presente divulgación comprenden un vector, como un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, un cromosoma artificial bacteriano (CAB), un cromosoma artificial de levadura (CAL) y similares, donde se ha insertado una secuencia de ácido nucleico de la divulgación. Los polinucleótidos de la presente divulgación pueden incorporarse en una cualquiera de una variedad de vectores de expresión adecuados para expresar un polipéptido. Los vectores adecuados incluyen secuencias de ADN de cromosomas, de no cromosomas y sintéticas, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos, ADN fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN fago, ADN viral como virus vacuna, adenovirus, virus de viruela aviar, pseudorrabia, adenovirus, virus asociado con adeno, retrovirus y similares. Puede usarse cualquier vector que convierte material genético en una célula y, si se desea réplica, que sea replicable y viable en el huésped relevante.

La divulgación proporciona vectores de expresión para provocar que una proteína GH61 se produzca a partir de una célula huésped adecuada, que puede ser un hongo (por ejemplo, M. thermophila o levadura). Puede seleccionarse cualquier vecotr de, aunque sin limitarse a, derivados de vectores virales; plásmidos bacterianos, ADN fago; baculovirus, plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN fago, y vectores lanzaderas recombinantes. El vector puede introducirse en una célula huésped con un polinucleótido que codifica GH61 para que esté operativamente unido a un promotor que está activo en la célula huésped. El vector se selecciona para expresar la proteína codificada, y puede replicar como un episoma en la célula huésped planeada, o integrarse en el genoma de la célula huésped.

En un aspecto particular la presente divulgación proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido GH61 operativamente unido a un promotor heterólogo. Los vectores de expresión de la presente divulgación pueden usarse para transformar una célula huésped apropiada para permitir que el huésped exprese la proteína GH61. Los métodos para expresión recombinantes de proteínas en hongos y otros organismos son bien conocidos en la técnica, y un número de vectores de expresión están disponibles o pueden construirse usando métodos rutinarios. Véase, por ejemplo, Tkacz y Lange, 2004, ADVANCES IN FUNGAL BIOTECHNOLOGY FOR INDUSTRY, AGRICULTURE, AND MEDICINE, KLUWER ACADEMIC/PLENUM UBLISHERS. Nueva York; Zhu et al., 2009, Construcción de dos vectores de entrada para expression de gen en plásmido de hongos. 6:128-33; Kavanagh, K. 2005, FUNGI: BIOLOGY AND APPLICATIONS Wiley.

Células huéspedes

Las proteínas GH61 de la divulgación pueden expresarse en una célula huésped que comprende un ácido nucleico recombinantes que codifica la proteína GH61. La célula huésped puede también expresar otras proteínas de interés, particularmente una o más enzimas de celulasa que funcionan en concierto con la proteína GH61 en el proceso de sacarificación. En una realización la célula huésped es una célula construida con celulasa. Así, las enzimas de celulasa pueden expresarse endógenamente por la célula huésped, o pueden expresarse a partir de otros ácidos nucleicos.

En otra técnica, dos o más poblaciones de células huéspedes, cada una expresando una proteína diferente

o un conjunto de proteínas (por ejemplo, una proteína GH61 y una celulasa) pueden cultivarse juntas. Las dos células huéspedes pueden ser iguales o pueden ser de diferente especie celular. Las células que expresan proteína GH61 y las células que expresan enzimas de celulasa pueden combinarse y cultivarse juntas para producir composiciones de esta invención que contienen tanto proteínas GH61 como enzimas de celulasa. Alternativamente, el caldo de cultivo de cada población celular puede recogerse por separado, fraccionarse opcionalmente para enriquecer las actividades respectivas y después mezclarse para producir la combinación deseada.

Las células huéspedes fúngicas incluyen, aunque no se limitan a Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycota, Zygomycota, Fungi imperfecti. En algunas realizaciones, las células huéspedes fúngicas preferentes son células de levadura, y células fúngicas filamentosas, incluyendo todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina y Oomycota. Hawksworth et al., en Ainsworth y Bisby’s DICTIONARY OF THE FUNGI, 8ª edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK. Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular compuesta por quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos, y son morfológicamente distintos de la levadura. Trichoderma también puede ser una Fuente de una o más celulasas para su uso con combinación con proteínas GH61.

La célula huésped puede ser de una especie de Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Azospirillum, Bjerkandera, Cellulomonas, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Clostridium, Coccidioides, Cochliobolus, Coprinus, Coriolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Dictyostelium, Diplodia, Elizabethkingia, Endothia, Erwinia, Escherichia, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Gluconacetobacter, Humicola, Hypocrea, Kuraishia, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Nicotiana, Paenibacillus, Penicillium, Periconia, Phaeosphaeria, Phlebia, Piromyces, Podospora, Prevotella, Pyricularia, Rhizobium, Rhizomucor, Rhizopus, Ruminococcus, Saccharomycopsis, Salmonella, Schizophyllum, Scytalidium, Septoria, Sporotrichum, Streptomyces, Talaromyces, Thermoanaerobacter, Thermoascus, Thermotoga, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, Trichoderma, Tropaeolum,

Uromyces, Verticillium, Volvariella, Wickerhamomyces, o telemorfos o anamorfos, y sinónimos y equivalentes taxonómicos de los mismos.

Una célula huésped ejemplar es levadura. Ejemplos son Candida, Hansenula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, or Yarrowia. La levadura puede ser Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia quercuum, Pichia pijperi, Pichia stipitis, Pichia methanolica, Pichia angusta, Kluyveromyces lactis, Candida albicans, or Yarrowia lipolytica.

Una célula ejemplar puede ser Myceliophthora thermophila, algunas veces referida como quot;C1quot;. Como aquí se usa, el término “C1” se refiere a Myceliophthora thermophila, incluyendo una cepa fúngica descrita por Garg (Véase, Garg, Mycopathol., 30: 3-4 [1966]). Como aquí se usa, quot;Chrysosporium lucknowensequot; incluye las cepas descritas en las patentes de Estados Unidos Números: 6.015.707, 5.811.381 y 6.573.086; Publicaciones de patentes de Estados Unidos Números: 2007/0238155, US 2008/0194005, US 2009/0099079; Publicaciones de patentes internacionales Números: WO 2008/073914 y WO 98/15633, e incluyen, sin limitación Chrysosporium lucknowense Garg 27K, VKM-F 3500 D (Nº Acceso VKM F-3500-D), C1 cepa UV13-6 (Nº Acceso. VKM F-3632 D), C1 cepa NG7C-19 (Nº Acceso VKM F3633 D), y C1 cepaUV18-25 (VKM F-3631 D), todos depositados en la Colección Rusa de Microorganismos de la Academia Rusa de Ciencias (VKM), Bakhurhina St. 8, Moscú, Rusia, 113184, y cualquier derivado de los mismos. Aunque inicialmente se describen como Chrysosporium lucknowense, C1 puede considerarse actualmente una cepa de Myceliophthora thermophila. Otras cepas de C1 incluyen células depositadas bajo número de acceso ATCC 44006, CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures) 122188, CBS 251.72, CBS 143.77, CBS 272.77, CBS122190, CBS122189, y VKM F-3500D. Los derivados C1 ejemplares incluyen organismos modificados donde uno o más genes o secuencias endógenas se han eliminado o modificado y/o uno o más genes o secuencias heterólogas se han introducido. Los derivados incluyen, aunque no se limitan a, UV18#100f Δalpl, UV18#100f Δpyr5 Δalp1, UV18#100.f Δalp1 Δpep4 Δalp2, UV18#100.f Δpyr5 Δalp1 Δpep4 Δalp2 y UV18#100.f Δpyr4 Δpyr5 Δalp1 Δpep4 Δalp2, como se describe en WO 2008073914 y WO 2010107303.

En algunas realizaciones la célula huésped puede ser de la especie Trichoderma, como T. longibrachiatum, T. viride, Hypocrea jecorina or T. reesei, T. koningii, yT. harzianum. Alternativamente, la célula huésped puede ser de la especie, Aspergillus, como A. awamori, A. funigatus, A. japonicus, A. nidulans, A. niger, A. aculeatus, A. foetidus, A. oryzae, A. sojae, y A. kawachi. Alternativamente, la célula huésped es de la especie Fusarium, como F. bactridioides, F. cerealis, F. crookwellense,

F. culmorum, F. graminearum, F. graminum. F. oxysporum, F. roseum, y F. venenatum.

La célula huésped también puede ser de la especie Neurospora, como N. crassa. Alternativamente, la célula huésped es de la especie Humicola, como H. insolens, H. grisea, and H. lanuginosa. Alternativamente, la célula huésped es de la especie Mucor, como M. miehei y M. circinelloides. La célula huesped puede ser de la especie Rhizopus, como R. oryzae y R. niveus. Alternativamente, la célula huésped es de la especie Penicillum, como P. purpurogenum, P. chrysogenum, y P. verruculosum.

Alternativamente, la célula huésped es de la especie Thielavia, como T. terrestres. Alternativamente, la célula huésped es de la especie Tolypocladium, como T. inflatum y T. geodes. Alternativamente, la célula huésped es de la especie Trametes, como T. villosa yT. versicolor. Alternativamente, la célula huésped es de la especie Chrysosporium, como C. lucknowense, C. keratinophilum, C. tropicum, C. merdarium, C. inops, C. pannicola, y C. zonatum. En una realización particular, la huésped es C. lucknowense.

Alternativamente, la célula huesped es un alga como Chlamydomonas (como C. reinhardtii)y Phormidium

(P. sp. ATCC29409).

Alternativamente, la célula huésped es una célula procariótica. Las células procarióticas adecuadas incluyen células bacterianas Gram-positivas, Gram-negativas y Gram-variables. Ejemplos de células huéspedes bacterianas incluyen especies de Bacillus (como B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. stearothermophilus y

B. amyloliquefaciens), Streptomyces (por ejemplo, S. ambofaciens, S. achromogenes, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. griseus, y S. lividans), y Streptococcus (como S. equisimiles, S. pyogenes, y S. uberis).

Los ejemplos no limitativos de tipos de células en esta sección incluyen Aspergillus aculeatus, Azospirillum irakense KBC1, Bacillus sp. GL1, Cellulomonas biazotea, Clostridium thermocellum, Thermoanaerobacter brockii, Coccidioides posadasii, Dictyostelium discoideum, Elizabethkingia meningoseptica, Erwinia chrysanthemi, Escherichia coli, Gluconacetobacter xylinus, Hypocrea jecorina, Kuraishia capsulata, Nicotiana tabacum, Paenibacillus sp. C7, Penicillium brasilianum, Periconia sp. BCC 2871, Phaeosphaeria avenaria, Prevotella albensis, Rhizobium leguminosarum, Rhizomucor miehei, Ruminococcus albus, Saccharomycopsis fibuligera, Salmonella

typhimurium, Septoria lycopersici, Streptomyces coelicolor, Talaromyces emersonii, Thermotoga maritima, Tropaeolum majus, Uromyces viciae-fabae, y Wickerhamomyces anomalus.

Las cepas que pueden usarse en la práctica de la invención (tanto cepas procarióticas como eucarióticas) pueden obtenerse de cualquier fuente adecauda, incluyendo, aunque sin limitar a la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) u otros depósitos biológicos como Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y la Colección de Cultivos Patentes para Servicio de Investigación Agrícola, Centro de Investigación Regional del Norte (NRRL).

Las células huéspedes pueden modificarse genéticamente para tener características que mejoran la manipulación genética, secreción de proteínas, estabilidad de proteínas u otras propiedades deseables para expresión o secreción de proteína. Por ejemplo, el bloqueo de la función Alp1 da como resultado una célula que es deficiente de proteasa. El bloqueo de la función pyr5 da como resultado una célula con un fenotipo deficiente de pirimidina. Las células huéspedes pueden modificarse para eliminar secuencias codificadoras de proteína celulasa endógena o de otra manera eliminar la expresión de una o más celulasas endógenas. La expresión de una o más celulasas endógenas no deseadas puede inhibirse para aumentar la proporción de celulasas de interés, por ejemplo, mediante mutagénesis química o UV y la selección posterior. La recombinación homóloga puede usarse para inducir modificaciones dirigidas a genes dirigiendo específicamente un gen in vivo para suprimir la expresión de la proteína codificada.

Transformación y Cultivo Celular

Los polinucleótidos de la divulgación, que codifican proteínas GH61, proteínas de celulasa u otras proteínas, pueden introducirse en células huéspedes para expresión. El polinucleótido puede introduicrse en las células como un episoma auto-replicante (por ejemplo, vector de expresión), o puede integrarse establemente en el ADN de la célula huésped.

La introducción de un vector o una construcción de ADN en una célula huésped puede efectuarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo aunque sin limitar a, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano, electroporación u otras técnicas comunes (Véase Davis et al., 1986, MÉTODOS BÁSICOS ENBIOLOGÍA MOLECULAR; Sambrook et al (2001) Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York; “Guía para Genética de Levadura y Biología Molecular”, C. Guthrie y

G. Fink, Eds., Métodos en Enzimología 350 (Academic Press, San Diego, 2002). En algunas realizaciones, el polinucleótido que se introduce en la célula huésped permanece en el genoma o en el plásmido u otro vector establemente mantenido en la célula y es capaz de heredarse por la progenie. La transformación estable se realiza típicamente transformando la célula huésped con un vector de expresión que comprende el polinucleótido de interés junco con un gen marcador seleccionable (por ejemplo, un gen que confiera resistencia a un antibiótico). Solamente aquellas células huéspedes que han integrado secuencias de polinucleótido del vector de expresión en su genoma sobrevivirán a la selección con el marcador (por ejemplo, antibiótico). Estas células huéspedes establemente formadas pueden después propagarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Las células huéspedes construidas pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados como sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar el polinucleótido GH61. Las referencias generales en las técnicas de cultivo celular y medios nutrientes incluyen MANIPULACIÓN GENÉTICA EN HONGOS, Benett, J. W., et al., Ed. Academic Press, 1985; MÁS MANIPULACIÓN GENÉTICA EN HONGOS,Benett, J. W., et al., Ed. Academic Press, 1991; Y EL MANUAL DE MEDIOS MICROBIOLÓGICOS, CRC Press, Boca Ratón, FL, 1993. Las condiciones de cultivo para células huéspedes C1 se describen en US 2008/0194005, US 2003/0187243, WO 2008/073914 y WO 01/79507. Las condiciones de cultivo, como temperatura, pH y similares, son aquellas previamente usadas con la célula huésped seleccionada para expresión, y será aparente para aquellos expertos en la técnica. Como se ha anotado, hay disponibles muchas referencias que describen el cultivo y producción de muchas células, incluyendo células de bacterias, plantas y animales (especialmente mamíferos) y de arqueobacterias. Atlas y Parks (eds.). El Manual de Medios Microbiológicos (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. Se encuentra más información para cultivo celular en bibliografía comercial disponible como Catálogo de Cultivo Celular para Investigación de Ciencia Viva (1998) de Sigma-Aldrich, Inc (St. Louis, MO) (“Sigma-LSRCCC”) y, por ejemplo, El Catálogo de Cultivos de Plantas y Complementos (1997) también de Sigma-Aldrich, Inc (St. Louis, MO) (“Sigma-PCCS”).

Enriquecimiento y Purificación de Proteínas

Un polipéptido expresado puede recuperarse de células o caldo. Opcionalmente, una proteína puede enriquecerse (por ejemplo, purificarse o purificarse parcialmente) usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede aislarse del medio nutriente mediante procedimientos convencionales incluyendo, aunque sin limitar, centrifugación, filtración, extracción, secado con pulverización, evaporación, cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio de ion, enlace de fase sólida, afinidad, interacción hidrofóbica, cromatoenfoque y por exclusión de tamaño) y/o filtración o precipitación. Las etapas de replegar la proteína pueden

usarse, como se desea, para finalizar la configuración de la proteína madura. Finalmente, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) puede emplearse en las etapas finales de purificación. Véase, por ejemplo, Parry et al., 2001, Biochem. J. 353: 117, y Hong et al., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 73: 1331. Otros métodos de purificación bien conocidos en la técnica incluyen aquellos expuestos en Sandana (1997) Bioseparación de Proteína, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Métodos de Proteínas, 2ª Edición, Wiley-Liss, NY; Walker (1996) El Manual de Protocolos de Proteínas, Humana Press, NJ; Harris y Angal (1990) Aplicaciones de Purificación de Proteínas: Una Técnica Práctica, IRL Press en Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Purificación de Proteínas: Principios y Práctica, 3ª Edición, Springer Verlag,NY; Janson y Ryden (1998) Purificación de Proteínas: Principios, Métodos y Aplicaciones de Alta Resolución, Segunda Edición, Wiley-VCH, NY; y Walker (1998) Protocolos de Proteínas en CD-ROM, Humana Press, NJ; PURIFICACIÓN DE PROETÍNAS: PRINCIPIOS, MÉTODOS DE ALTA RESOLUCIÓN Y APLICACIONES, J. C. Janson (Ed.), Wiley 2011; EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE ALTORENDIMIENTO: MÉTODOS Y PROTOCOLOS, S. A., Doyle (Ed.) Humana Press 2009.

Técnicas generales

Los polinucleótidos que codifican proteínas GH61 y otras proteínas pueden prepararse, por ejemplo, mediante síntesis química usando el método clásico de fosforamidita descrito en Beaucage, et al., 1981, Tetrahedron Letters, 22: 1859-69 o el método descrito por Matthes, et al., 1984, EMBO J. 3:801-05. Los oligonucleótidos de hasta aproximadamente 40 bases se sintetizan individualmente, después se unen (por ejemplo, mediante métodos de ligación enzimática o química, o métodos mediados por polimerasa) para formar esencialmente cualquier secuencia continua deseada.

Los textos generales que describen técnicas biológicas moleculares que incluyen el uso de vectores, promotores, métodos de amplificación in vitro que incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacciónen cadena de la ligasa (LCR) son Berger y Kimmel, GUÍA PARA TÉCNICAS DE CLONACIÓN MOLECULAR, MÉTODOS EN ENZIMOLOGÍA volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al.,CLONACIÓN MOLECULAR -UN MANUAL DE LABORATORIO (2ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 y PROTOCOLES ACTUALES EN BIOLOGÍA MOLECULAR, F. M. Ausubel et al., eds. Current Protocols (como suplemento a lo largo de 2009).

VII. Purificación de proteínas GH61 endógenas de caldo de cultivo

Como una alternativa a la expresión recombinante de proteínas HG61 de esta divulgación, las proteínas GH61 secretadas pueden fraccionarse del caldo de cultivo de Myceliophthora thermophila que produce y secreta una

o más proteínas endógenas con actividad GH61. De la misma manera, GH61 endógeno no secretado puede recuperarse mediante lisis de células de M. thermophila.

Las proteínas GH61 de esta divulgación pueden obtenerse a partir de células que expresan proteínas GH61 usando técnicas estándares de separación de proteínas, como las descritas anteriormente, y siguiendo la actividad GH61 durante el fraccionamiento con un ensayo adecuado de actividad GH61.

Como se ilustra en los Ejemplos, cuando se aísla la proteína de caldo de cultivo de M. thermophila, una combinación efectiva es cromatografía en un grupo fenilo que presente resina, seguido de cromatografía de intercambio de anión. Como resultado de las técnicas de separación, la actividad específica de la proteína GH61 (la actividad observada en un ensayo de actividad por unidad total de proteína) puede aumentar aproximadamente 10, aproximadamente 25, aproximadamente 100, aproximadamente 250, aproximadamente 1000 veces o más.

Una vez que la actividad GH61 se ha fraccionado de una fuente adecuada, las fracciones pueden recombinarse entre sí y/o con proteínas GH61 recombinantes en cualquier combinación (véase Ejemplos). Tales fracciones o combinaciones pueden después usarse para promover la actividad de una o más celulasas, como aquí se describe. Las proteínas GH61 purificadas o recombinantes de esta divulgación, y combinaciones de ellas, pueden provocar un aumento en el índice de actividad de celulasa para conversión de biomasa celulósica u otro sustrato a azúcares fermentables en al menos aproximadamente 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente duplicar, al menos aproximadamente cuadriplicar o más.

Al usar tales técnicas de separación de proteínas en combinación con un ensayo de actividad GH61, se ha determinado que las fracciones de proteína que tienen datos de secuencia completa o parcial correspondientes a GH61f, GH61a, GH61v, GH61p, GH61g, y GH61i (SEQ ID NOs: 2, 7, 13, 20, 21, 23, 26) tienen la habilidad para mejorar la actividad de celulasa de acuerdo con su clasificación como una proteína GH61 (Véase Ejemplos).

VIII: Celulasas

Las proteínas GH61 de esta divulgación son útiles para aumentar la producción de azúcares fermentables en una reacción de sacarificación con una o más enzimas de celulasa. La proteína GH61 y las enzimas de celulasa pueden producirse en la misma célula o en células diferentes. En cada caso, las enzimas de celulasa pueden expresarse a partir de una región codificadora recombinante o a partir de un gen constitutivo. Las enzimas de celulasa pueden proporcionarse en forma de un caldo de cultivo o sobrenadante, o purificarse hasta el punto que se desee.

Las celulasas para uso en la presente invención pueden derivase de cualquier organismo que produzca celulasas, y pueden expresarse en, para ilustración pero sin limitación, cualquier célula aquí descrita. En algunas realizaciones las celulasas se derivan de y/o se expresan en un hongo filamentoso (por ejemplo, especie Myceliophthora, Aspergillus Azospirillum, y Trichoderma) o célula de levadura. Para ilustración, pueden usarse las celulasa derivadas de cualquiera de las siguientes células. Por ejemplo, muchos hongos (incluyendo pero sin limitar a especies de Thielavia, Humicola, Chaetomium, Neurospora, Chaetomidium, Botryosphaeria, Trichophaea, Aspergillus, Schizophyllum, Agaricus, Sporotrichium, Corynascus, Myceliophthora, Acremonium, Thermoascus, Alternaria, Botryotinia, Phanerochaete, Claviceps, Cochliobolus, Cryphonectria, Emericella, Fusarium, Gibberella, Hypocrea, Irpex, Magnaporthe, Nectria, Neosartorya, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Sclerotinia, Sordaria, Talaromyces, Trichoderma, y Volvariella. Por ejemplo, Acremonium thermophilum; Agaricus bisporus; Alternaria alternate; Aspergillus aculeatus; Aspergillus clavatus; Aspergillus flavus; Aspergillus fumigatus; Aspergillus nidulans; Aspergillus niger; Aspergillus oryzae; Aspergillus terreus; Botryotinia fuckeliana; Chaetomium thermophilum; Phanerochaete Chrysosporium; Claviceps purpurea; Cochliobolus carbonum; Cryphonectria parasitica; Emericella nidulans; Fusarium oxysporum; Fusarium poae; Fusarium venenatum; Gibberella avenacea; Gibberella pulicaris; Gibberella zeae; Humicola grisea; Hypocrea koningii; Hypocrea lixii; Hypocrea virens; Irpex lacteus; Magnaporthe grisea; Nectria haematococca; Neosartorya fischeri; Neurospora crassa; Penicillium chrysogenum; Penicillium decumbens; Penicillium funiculosum; Penicillium janthinellum; Penicillium marneffei; Penicillium occitanis; Penicillium oxalicum; Phanerochaete chrysosporium; Pleurotus sp. ’Florida’; Podospora anserine; Polyporus arcularius; Sclerotinia sclerotiorum; Sordaria macrospora; Talaromyces emersonii; Talaromyces stipitatus; Thermoascus aurantiacus; Trichoderma sp.; Trichoderma viride; Trichoderma reseipdb; Volvariella volvacea. En una realización la célula es M. thermophila.

Endoglucanasa (EG)

La divulgación proporciona una célula que expresa una proteína GH61 en combinación con una endoglucanasa recombinantes. Los términos “endoglucanasa” o “EG” se refieren a un grupo de enzimas de celulasa clasificadas como E.C. 3.2.1.4. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos internos β-1,4.

Por ejemplo, la célula puede contener una secuencia recombinante de polinucleótido que codifica la proteína EG. La secuencia de polinucleótido EG puede estar operativamente unida a un promotor heterólogo y/o la secuencia de polipéptido EG comprende una señal de secuencia. La proteína EG puede expresarse como una preproteína, que se secreta de la célula con la pérdida simultánea del péptido de señal.

EG puede comprender una endoglucanasa endógena de M. thermophila como EG2a de M. thermophila (véase WO 2007/109441) o una variante de la misma. EG puede ser de S. avermitilis, con una secuencia expuesta en el acceso GenBank NP_821730, o una variante como la descrita en US 2010/0267089 A1. EG puede ser un Thermoascus aurantiacus EG, o un EG endógeno de una bacteria, una levadura, o un hongo filamentoso diferente de M. thermophila. De hecho, se contempla que cualquier EG adecuado encontrará uso en combinación con las proteínas GH61 aquí proporcionadas. No se pretende que la presente invención esté limitada a ninguna EG específico.

β-Glucosidasa (BGL)

La divulgación proporciona una célula que expresa una proteína GH61 en combinación con una βglucosidasa recombinante. Los términos “β-glucosidasa”, “celobiodasa” o “BGL” se refieren a un grupo de enzimas de celulasa clasificados como E.C. 3.2.1.21. Estas enzimas hidrolizan celobiosa a glucosa.

Por ejemplo, la célula puede contener una secuencia de polinucleótido recombinantes que codifica la proteína BGL, donde la secuencia de polinucleótido está operativamente unida a un promotor heterólogo y/o secuencia de señal. La proteína BGL puede expresarse como una pre-proteína, que se secreta de la célula con pérdida simultanea del péptido de señal.

BGL puede ser una M. thermophila BGL1 o una variante de la misma. La BGL1 puede comprender la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 66, o es una variante de las mismas, o una variante descrita en US 2011/0129881 A1. Alternativamente, la BGL es de Thermoascus aurantiacus (TaBGL), que tiene una secuencia expuesta como SEQ ID NO: 61, o es una variante de la misma, o una variante como las descritas en US 2011/0124058 A1.

Alternativamente, la BGL es de Azospirillum irakense (CelA), que tiene una secuencia expuesta como SEQ ID NO: 62, o una variante de la misma, o una variante descrita en US 2011/0114744 A1. Alternativamente, BGL se describe en la TABLA 1 de la solicitud PCT Nº PCT/US2010/038902. Alternativamente, la BGL es una BGL endógena de una bacteria, una levadura, un hongo filamentosos diferente a M. thermophila. También se contempla el uso de variantes de BGLs que ocurren de manera natural. De hecho, se contempla que cualquier BGL adecuada encontrará uso en combinación con las proteínas GH61 aquí proporcionadas. No se pretende que la presente invención se limite a ninguna BGL específica.

Celobiohidrolasa de Tipo 1 y Tipo 2

La divulgación proporciona una célula que expresa una proteína GH61 en combinación con una celobiodrilasa recombinante de Tipo 1. Los términos “celobiohidrolasa”, “exoglucanasa”, exo-celobiodrilasa” o “CBH” se refieren a un grupo de enzimas de celulasa clasificadas como E.C. 3.2.1.91. Las celobiohidroasas de Tipo 1 (CBH2) hidrolizan celobiosa en un proceso del extremo reductor las cadenas de celulosa. Las celobiodrilasas de Tipo 2 (CBH3) hidrolizan celobiosa en un proceso del extremo no reductor las cadenas de celulosa.

Por ejemplo, la célula puede contener una secuencia de polinucleótido recombinante que codifica la proteína CBH, donde la secuencia de polinucleótido está operativamente unida a un promotor heterólogo y/o secuencia de péptido de señal. La proteína CBH puede expresarse como una pre-proteína, que se secreta de la célula con pérdida simultanea del péptido de señal.

La célula puede ser una célula M. thermophila, y puede ser una celobiodrolasa endógena, como CBH1a, que tiene una secuencia expuesta en SEQ ID No. 63 o 67 o una variante de la misma. Alternativamente, CBH1 es una CBH1 endógena de una bacteria, una levadura, un hongo filamentosos diferente a M. thermophila o una variante de CBH1s que ocurren de manera natural. De hecho, se contempla que cualquier CBH adecuada encontrará uso en combinación con las proteínas GH61 aquí proporcionadas. No se pretende que la presente invención se limite a ninguna CBH específica.

IX.: Composiciones libres de células donde la proteína GH61 se combina con enzimas de celulasa

En un aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende al menos una proteína GH61 aquí descrita (por ejemplo, que comprende una secuencia de SEQ ID NO. 1-30, que comprende una parte secretada de la proteína GH61, que comprende una parte truncada de terminal amino de la proteína GH61, y variantes biológicamente activas de las mismas), en combinación con al menos una, al menos dos, al menos tres o más celulasas seleccionadas de EGs, BGLs, CBH1s y/o CBH2s, donde la masa combinada de EG, BGL, CBH1 y/o CBH2 es al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60% o al menos aproximadamente 70% de la proteína total libre de célula en la composición. La proteína GH61 (ya sea en caldo o en forma parcialmente purificada) puede combinarse con celulasas de M. thermophila o de otros organismos productores de celulasa (incluyendo, por ejemplo, organismos enumerados más abajo).

En algunas composiciones de la invención, la proteína GH61 comprende SEQ ID NO: 2; y (a) la CBH1 es una variante CBH1a de M. thermophila con al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, algunas veces al menos aproximadamente 90%, y algunas veces al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 63 o 67; y/o (b) la CBH2 es una variante CBH2b de M. thermophila con al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, algunas veces al menos aproximadamente 90%, y algunas veces al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 64 o 68; y/o (c) la BGL es una variante BGL1 de M. thermophila con al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, algunas veces al menos aproximadamente 90%, y algunas veces al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 60 o 66.

La composición también puede ser un medio de cultivo celular (esto es, caldo de cultivo) que contiene GH61 recombinante secretado y proteínas de celulasa. Tale medios pueden producirse cultivando células recombinantes descritas aquí anteriormente bajo condiciones donde una combinación de enzimas (por ejemplo, proteínas GH61, EG, CBH y/o BGL) se expresa y secreta. El medio de cultivo celular puede estar esencialmente libre de células, por ejemplo, retirándolas mediante centrifugación o filtración. Una composición para degradar celulosa puede producirse cultivando células recombinantes descritas anteriormente bajo condiciones donde las enzimas (por ejemplo, proteínas GH61, EG, CBH y/o BGL) se expresan y secretan, opcionalmente retirando las células del medio, y opcionalmente enriqueciendo el medio para aumentar la concentración de proteínas.

X. Uso de proteínas GH61 en reacciones de sacarificación

Las reacciones de sacarificación pueden realizarse exponiendo un sustrato celulósico (por ejemplo, biomasa pre-tratada) a una proteína GH61 y celulasa, que funcionan en concierto para hidrolizar una celulosa y producir azúcares fermentables.

Típicamente, las celulasas incluyen al menos una endoglucanasa (EG), al menos una β-glucosidasa (BGL), al menos una celobiohidrolasa de Tipo 1 (CBH1), y/o al menos una celobiohidrolasa de Tipo 2 (CBH2).

Las células y composiciones de la invención (incluyendo el caldo de cultivo o lisados celulares) pueden usarse en la producción de azúcares fermentables de biomasa celulósica. El sustrato de biomasa puede convertirse a un azúcar fermentable (a) pre-tratando opcionalmente un sustrato celulósico para aumentar su susceptibilidad a hidrólisis; (b) contactando el sustrato celulósico opcionalmente pre-tratado de la etapa (a) con una composición, medio de cultivo o lisado celular que contenga una proteína GH61 y celulasas bajo condiciones adecuadas para la producción de celobiosa y azúcares fermentables (por ejemplo, glucosa).

En una realización, para realizar una reacción de sacarificación, cada una de las proteínas GH61 y enzimas de celulasa referidas anteriormente pueden purificarse parcialmente o sustancialmente, y las proteínas purificadas se combinan con el sustrato celulósico. En otra realización las varias proteínas individuales se expresan recombinantemente en diferentes células, y los medios que contienen las proteínas secretadas se añaden a la biomasa.

Las composiciones pueden reaccionar con el sustrato a una temperatura en el rango de aproximadamente 25º C a aproximadamente 110 ºC, de aproximadamente 30º C a aproximadamente 90 ºC, de aproximadamente 30º C a aproximadamente 80 ºC, de aproximadamente 40º C a aproximadamente 80 ºC, de aproximadamente 35º C a aproximadamente 75 ºC, de aproximadamente 55º C a aproximadamente 100 ºC o a aproximadamente 90 ºC. El proceso puede realizarse a un pH en un rango de desde aproximadamente pH 3,0 a aproximadamente 8,5, desde aproximadamente pH 3,5 a aproximadamente 8,5, desde aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente 7,5, desde aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente 7,0 y desde aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente 6,5. Los tiempos de reacción para convertir un sustrato particular de biomasa en un azúcar fermentable pueden variar pero el tiempo óptimo de reacción puede determinarse fácilmente. Los tiempos ejemplares de reacción pueden estar en el rango de desde aproximadamente 1 a aproximadamente 240 horas, desde aproximadamente 5 a aproximadamente 180 horas y desde aproximadamente 10 a aproximadamente 150 horas. Por ejemplo, el tiempo de incubación puede ser al menos 1 hora, al menos 5 h, al menos 10 h, al menos 15 h, al menos 25 h, al menos 50 h, al menos 100 h o al menos 180 h.

En algunas realizaciones, los polipéptidos de GH61 de la presente divulgación se usan en combinación con otros ingredientes opcionales como al menos un tampón o un surfactante. En algunas realizaciones, se usa al menos un tampón con el polipéptido de GH61 de la presente divulgación (opcionalmente combinado con otras enzimas) para mantener un pH deseado en la solución donde se emplea GH61. Los tampones adecuados son bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, se usa al menos un surfactante con la GH61 de la presente divulgación. Los cationes (por ejemplo, Cu++, Mn++, Co++, Mg++ y Ca++ en concentraciones de 0,001 a 50 mM, de 5 µM a 1 mM, de 10-50 µM a 10-20 µM) pueden incluirse en la reacción.

Las combinaciones ejemplares de la proteína GH61 y celulasas incluyen: proteína GH61 con una o más endoglucanasas (EG); (BGL); proteína GH61 con una o más 1 (CBH1); o proteína GH61 con una o más celobiohidrolasas de Tipo 2 (CBH2). Otras combinaciones son proteína GH61 con EG y BGL; proteína GH61 con EG y CBH1; proteína GH61 con EG y CBH2; proteína GH61 con BGL y CBH1; proteína GH61 con BGL y CBH2, o proteína GH61 con CBH1 y CBH2. Otras combinaciones son proteína GH61 con EG, BGL, y CBH1; proteína GH61 con EG, BGL, y CBH2; proteína GH61 con EG, CBH1, CBH2; proteína GH61 con BGL, CBH1, y CBH2; y proteína GH61 con todos de EG, BGL, CBH1, y CBH2. Otras enzimas enumeradas en esta divulgación pueden incluirse en una o más de estas combinaciones.

En algunas realizaciones de la divulgación, la mezcla de enzimas comprende una GH61 aislada como aquí se proporciona y al menos una o más de una celobiodrolasa de tipo 1 como CBH1a, una CBH2b aislada, una endoglucanasa aislada (EG) como una endoglucanasa de tipo 2 (EG2), o una endoglucanasa de tipo 2 (EG2), y/o una β-glucosidasa aislada (BGL). En algunas realizaciones, al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45% o al menos 50% de la mezcla de enzimas es GH61. En algunas realizaciones, la mezcla de la encima comprende además una celobiodrolasa tipo 1a (por ejemplo, CBH2a), y GH61, donde las enzimas juntas comprenden al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75% o al menos 80% de la mezcla de la enzima. En algunas realizaciones, la mezcla de la enzima comprende además una β-glucosidasa (BGL), GH61, CBH2b, donde las tres enzimas juntas comprenden al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80% o al menos 85% de la mezcla de enzimas. En algunas realizaciones, la mezcla de la enzima comprende además una endoglucanasa (EG), GH61, CBH2b, CBH1a, BGL donde las cinco enzimas juntas comprenden al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85% o al menos 90% de la mezcla de la enzima. En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende GH61, CBH2b, CBH1a, BGL y al menos una EG, en cualquier proporción adecuada para la reacción deseada.

En algunas realizaciones, la composición de la mezcla de enzimas comprende celulasas aisladas en las siguientes proporcionares por peso (donde el peso total de las celulasas es 100%); aproximadamente 20%-10% de BGL, aproximadamente 30%-25% de CBH1a, aproximadamente 10%-30% de GH61, aproximadamente 20%-10% de EG1b, y aproximadamente 20%-25% de CBH2b. En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende celulasas aislada en las siguientes proporciones por peso: aproximadamente 20%-10% de GH61, aproximadamente 25%-15% de BGL, aproximadamente 20%-30% de CBH1a, aproximadamente 10%-15% de EG, y aproximadamente 25%-30% de CBH2b. En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende celulasas aislada en las siguientes proporciones por peso: aproximadamente 30%-20% de GH61, aproximadamente 15%-10% de BGL, aproximadamente 25%-10% de CBH1a, aproximadamente 25%-10% de CBH2b, aproximadamente 15%-10% de EG. En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende celulasas aislada en las siguientes proporciones por peso: aproximadamente 40-30% de GH61, aproximadamente 15%-10% de BGL, aproximadamente 20%-10% de CBH1a, aproximadamente 20%-10% de CBH2b, y aproximadamente 15%-10% de EG.

En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende celulasas aislada en las siguientes proporciones por peso: aproximadamente 50-40% de GH61, aproximadamente 15%-10% de BGL, aproximadamente 20%-10% de CBH1a, aproximadamente 15%-10% de CBH2b, y aproximadamente 10%-5% de EG. En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende celulasas aislada en las siguientes proporciones por peso: aproximadamente 10%-15% de GH61, aproximadamente 20%-25% de BGL, aproximadamente 30%-20% de CBH1a, aproximadamente 15%-5% de EG, y aproximadamente 25%-35% de CBH2b. En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende celulasas aislada en las siguientes proporciones por peso: aproximadamente 15%5% de GH61, aproximadamente 15%-10% de BGL, aproximadamente 45%-30% de CBH1a, aproximadamente 25%-5% de EG1b, y aproximadamente 40%-10% de CBH2b. En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende celulasas aislada en las siguientes proporciones por peso: aproximadamente 10% de GH61, aproximadamente 15% de BGL, aproximadamente 40% de CBH1a, aproximadamente 25% de EG, y aproximadamente 10% de CBH2b.

En algunas realizaciones, el componente de enzima comprende más de una enzima CBH2b, CBH1a, EG, BGL y/o GH61 (por ejemplo, 2, 3 ó 4 enzimas diferentes) en cualquier combinación adecuada. En algunas realizaciones, una composición de mezcla de enzimas de la invención comprende además al menos una proteína y/o enzima adicional. En algunas realizaciones, las composiciones de mezcla de enzimas de la presente invención comprenden además al menos un enzima adicional diferente a GH61, BGL, CBH1a, GH61 y/o CBH. En algunas realizaciones, las composiciones de mezcla de enzimas de la invención comprenden además una celulasa adicional, diferente a la variante de GH61, BGL, CBH1a, GH61 y/o CBH. En algunas realizaciones, el polipéptido GH61 de la invención está también presente en mezclas con enzimas de no-celulasa que degradan celulosa, hemicelulosa, pectina y/o lignocelulosa y/o enzimas descritas aquí más abajo.

Realizaciones ejemplares de M. thermophila

Para ilustración y no limitación, se proporcionan las siguientes realizaciones ejemplares:

Una realización de la divulgación es una célula huésped que es una célula M. tehrmophila que expresa una proteína recombinantes que comprende SEQ ID NO: 1-30, que comprende una parte secretada de la proteína GH61, que comprende una parte truncada de terminal amino de la proteína GH61 y variantes biológicamente activas de las mismas. En algunos casos, la célula expresa una GH61 seleccionada de SEQ ID Nos: 3 a 12 o la proteína secretada correspondiente, o una GH61 seleccionada de SEQ ID Nos: 13 a 256 o la proteínas secretada correspondiente.

La divulgación proporciona una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína GH61. En algunos aspectos, la divulgación proporciona una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico recombinantes que codifica una proteína con al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, o al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la parte secretadas de una cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 30, que comprenden una parte secretada de la proteína GH61 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), que comprenden una parte truncada de terminal amino de la proteína GH61, y variantes biológicamente activas de las mismas. La secuencia de ácido nucleico recombinante puede codificar una proteína con al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos

aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con una proteína GH61 enumerada en la TABLA 1 o TABLA 2.

El ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótido mostrada en cualquiera de SEQ ID Nos: 31 a 59, o un fragmento de la misma, o un ácido nucleico que se hibrida con SEQ ID Nos: 31-59 (o la secuencia exactamente complementaria) bajo condiciones severas (esto es, severidad media alta, alta o muy alta), y que codifica un polipéptido con actividad GH61. Alternativamente, el ácido nucleico puede codificar un polinucleótido que es al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99%, idéntico a cualquiera de tales secuencias o fragmentos, donde el ácido nucleico codifica y puede expresarse para proporcionar un polipéptido con actividad GH61. Opcionalmente, tales secuencias de ácido nucleico pueden optimizarse con codón para expresión en una especie particular, como una levadura, como se describe en otro punto en esta divulgación.

En una realización de la divulgación, una célula huésped expresa al menos una GH61 recombinante que comprende una cualquiera de SEQ ID Nos: 1 a 30, y/O al menos una proteína GH61 recombinante que tiene al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con SEQ ID Nos: 1 a 25; y también expresa:

a) una proteína EG recombinante con al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, algunas veces al menos aproximadamente 90% y algunas veces al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con M. thermophila EG2a (SEQ ID NO: 65); y/o

b) una proteína CBH1a recombinante con al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, algunas veces al menos aproximadamente 90% y algunas veces al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 63 o 67; y/o

c) una proteína CBH2b recombinante con al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, algunas veces al menos aproximadamente 90% y algunas veces al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 64 o 68; y/o

d) una proteína BGL recombinante con al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, algunas veces al menos aproximadamente 90% y algunas veces al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 60, 61, 62 o 66.

En ciertas realizaciones de la divulgación, la célula expresa al menos una, al menos dos, al menos tres (por ejemplo, b-d) o las cuatro de (a), (b), (c) y (d).

XI. Sacarificación en ausencia de EG exógeno

En un aspecto, la divulgación proporciona un método para hidrolizar un sustrato celulósico que comprende combinar una proteína GH61 con enzimas de β-glucosidasa (BGL) y celobiodrolasa (CBH), en una composición sustancialmente libre de endoglucanasa (EG). Se apreciará que la actividad de tipo EG a la que contribuyó una proteína GH61 no es considerada una endoglucanasa. Como se ilustra en el ejemplo más abajo, una reacción de sacarificación puede realizarse en presencia de una proteína GH61, una β-glucosidasa, y una o más enzimas de celobiodrolasa, sin EG recombinante o sin EG añadido, o sustancialmente libre de EG. Bien celobiodrolasa de Tipo 1

o de Tipo 2 o ambas pueden estar presentes. En ausencia de EG, GH61 puede aumentar la producción de una reacción de sacarificación por BGL y CBH sencilla en más de 1,5 o 1,7 veces.

Se dice que una reacción está “sustancialmente libre” de endoglucanasa si (a) no haya actividad de endoglucanasa detectable en la reacción, o (b) la cantidad de esa enzima EG presente sea inferior a 2%, a menudo inferior a 1%, a menudo inferior a 0,5%, a menudo inferior a 0,2% y a menudo inferior a 0,1% (p/p) de la cantidad de BGL presente, o (c) la cantidad de esa enzima EG presente sea inferior a 2%, a menudo inferior a 1%, a menudo inferior a 0,5%, a menudo inferior a 0,2% y a menudo inferior a 0,1% (p/p) de la cantidad de CBH presente, o (d) la cantidad de esa enzima EG presente sea inferior a 2%, a menudo inferior a 1%, a menudo inferior a 0,5%, a menudo inferior a 0,2% y a menudo inferior a 0,1% (p/p) de la cantidad de GH61 presente, o (e) la cantidad de esa enzima EG presente sea inferior a 2%, a menudo inferior a 1%, a menudo inferior a 0,5%, a menudo inferior a 0,2% y a menudo inferior a 0,1% (p/p) de la cantidad de celulosa total presente.

XII. Composiciones que comprenden otras enzimas

Las enzimas adicionales que pueden actuar en concierto para hidrolizar un sustrato celulósico (tal como celulosa o un sustrato que contiene almidón) en el proceso de sacarificación pueden incluirse en las composiciones

o incorporarse en los métodos de esta invención. Tales enzimas incluyen, aunque no se limitan a, xilanasas, hemicelulasas, amilasas, esterasas y celulasas, α -glucosidasas, aminopeptidasas, carbohidrasas, carboxipeptidasas, catalasas, quitinasas, cutinasas, ciclodextrina glicosiltransferasas, deoxirribonucleasas, αgalactosidasas, β-galactosidasas, glucoamilasas, glucocerebrosidasas, invertasas, lacasas, lipasas, manosidasas, mutanasas, oxidasas, enzimas pectinolíticas, peroxidasas, fosfolipasas, fitasas, polifenoloxidasas, ribonucleasas y trans-glutaminasas, así como otras celulosas (por ejemplo, celobiodrolasas de tipo 1 y tipo 2, endoglucanasas y βglucosidasas). Las mezclas de celulasa para hidrólisis enzimática eficiente de celulosa son bien conocidos (Véase, por ejemplo, Viikari et al., 2007, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 108: 121-45; y publicaciones de patentes de Estados Unidos 2009/0061484; US 2008/0057541; y US 2009/0209009). En algunas realizaciones, las mezclas de enzimas purificadas que ocurren de manera natural o recombinantes se combinan con materia prima celulósica o un producto de hidrólisis de celulosa. En algunas realizaciones, una o más poblaciones, cada una produciendo una o más celulosas que ocurren de manera natural o recombinantes, se combinan con materia prima celulósica o un producto de hidrólisis de celulosa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una endoxilanasa. Las endoxilanasas (EC 3.2.1.8) catalizan la endohidrólisis de 1,4-β-D-enlaces xilosídicos en xilanos. Esta enzima también puede referirse como endo-1,4-β-D-xilanasa o 1,4-β-D-xilano xilanohidrolasa. En algunas realizaciones, una alternativa es EC 3.2.1.136, o glucuronoarabinoxilano endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar 2,4 enlaces xilosídicos en glucuronoarabinoxilanos.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona la menos una GH61 y al menos una β-xilosidasa. β-xilosidasas (EC 3.2.1.37) catalizan la hidrólisis de 1,4-β-D-xilanos, para retirar los residuos sucesivos de D-xilosa de las terminales no reductoras. Esta enzima puede también referirse como xilano, 1,4-βxilosidasa, 1,4-β-D-xilano xilohidroasa, exo 1,4-β-xilosidas o xilobiasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una α-L-arabinofuranosidasa. α-L-arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55) catalizan la hidrólisis de residuos alfa-Larabinofuranosidasa no reductoras de terminal. La enzima actúa en alfa-L-arabinofuranosidasas, alfa-L-arabinans que contiene (1,3)-y/o (1,5)-uniones, arabinoxilanos y arabinogalactanos. Alfa-L-arabinofuranosidasa es también conocida como arabinosidasa, alfa-arabinosidasa, alfa-Llarabinosidasa, alfa-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa, poliscarárido alfa-L-arabinofuranosidasa, alfa-L-arabinofuranosidasa hidrolasa, Larabinosidasa y alfa-L-arabinananasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una alfa-glucuronidasa. Alfa-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) catalizan la hidrólisis de una alfa-D-glucuronidasa a Dglucuronato y un alcohol.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una acetilxilanesterasa. Acetilxilanesterasas (EC 3.1.72) catalizan la hidrólisis de grupo de acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato alfa-naftilo, y acetato p-nitrofenilo.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos un feruloil esterasa. Feruil esterasas (EC 3.1.1.73) tienene actividad 4-hidroxi-3-metoxicinamoil-azúcar hirolasa (EC 3.1.1.73) que cataliza la hidrólisis del grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir de un azúcar esterificado, que es normalmente arabinosa en sustratos “naturales”, para producir ferulato (4-hidroxi-3-metoxicinamato). Feruloil esterasa es también conocido como esterasa de ácido ferúlico, esterasa de hidroxicinamoil, FAE-III, cinamoil éster hidrolasa, FAEA, cinnAE, FAE-I o FAE-II.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una coumaroil esterasa. Coumaroil esterasas (EC 3.1.1.73) catalizan una reacción de la forma: coumaroil-sacárido + H2O) coumarato + sacárido. En algunas realizaciones, el sacárido es un oligosacárido o un polisacárido. Esta enzima también puede ser referida como trans-4-coumaroil esterasa, trans-p-coumaroil esterasa, p-coumaroil esterasa o ácido p-coumárico esterasa. La enzima también se clasifica en EC 3.1.1.73 de manera que también puede ser referida como feruoil esterasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una alfa-galactosidasa. Alfa-galactosidadas (EC 3.2.1.222) catalizan la hidrólisis de residuos de β-D-galactosa no reductora de terminal en β-D-galactosidos. En algunas realizaciones, el polipéptido es también capaz de hidrolizar αL-arabinosidos. Esta enzima también puede ser referida como exo-(1-gt;4)-β-D-galactanasa o lactasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una beta-mananasa. Beta-mananasas (EC 3.2.1.78) catalizan la hidrólisis aleatoria de enlaces 1,4-β-D manosídicos en mananos, galactomananos y glucomananos. Esta enzima también puede ser referida como manano endo-1,4-βmanosidasa o endo1,4-mananasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una beta-manosidasa. Beta-manosidadas (EC 3.2.1.25) catalizan la hidrólisis de residuos β-D-manosa no reductores de terminal en β-D-manosidos. Esta enzima también puede ser referida como mananansa o manasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una glucoamilasa. Glucoamilasas (EC 3.2.1.3) catalizan la liberación de D-glucosa de extremos no reductores de moléculas oligo-y poli-sacáridos. La glucoamilasa es a menudo considerada un tipo de amilasa conocido como amilo-glucosidasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una amilasa. Amilasas (EC 3.2.1.1) son enzimas divisoras de almidón que degradan el almidón y compuestos relacionados hidrolizando los enlaces α-1,4 y/o α-1-6 glucosídicos de una manera que actúa endo-o exo-. Las amilasas incluyen α-amilasas (EC 3.2.1.1); β-amilasas (3.2.1.2), amilo-amilasas (EC 3.2.1.3), α-glucosidasas (EC 3.2.1.20), pululanasas (EC 3.2.1.41) e isoamilasas (EC 3.2.1.68). En algunas realizaciones, la amilasa es α-amilasa. En algunas realizaciones una o más enzimas que degradan pectina se incluyen en las mezclas de enzimas que comprenden GH61 de la presente divulgación. Una pectinasa cataliza la hidrólisis de pectina en unidades más pequeñas como oligosacárido o sacáridos monoméricos. En algunas realizaciones, las mezclas de enzimas comprenden cualquier pectinasa, por ejemplo una edo-poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endogalactanasa, una pectina acetil esterasa, ujna endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa ramosidasa, exo-galacturonasa, una exo-poligalacturoanto liasa, una ramnogalacturonano hirolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa y/o una xilogalactruronasa.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una endopoligalacturonasa. Endo-poligalacturonasas (EC 3.2.1.15) catalizan la hidrólisis aleatoria de enlaces 1,4, α-Dgalactosidurónicos en pectato y otros galacturonanos. Esta enzima puede también referirse como poligalacturonasa pectina depolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa, poli-α-1,4-galacturonido glicanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli (1,4-α-D-galacturonido) glicanohidrolasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una pectina metil esteras. Pectin metil esterasas (EC 3.1.1.11) catalizan la reacción: pectina + n H2O = n metanol + pectato. La enzima también puede ser conocida como pectinesterasa, pectina, demetoxilasa, pectina metoxilasa, pectina metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectina pectilhidrolasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una endo-galactanasa. Endo-galactanasas (EC 3.2.1.89) catalizan la endohidrólisis de enlaces 1,4-β-D-galactosídicos en arabinogalactanos. La enzima también puede ser conocida como arabinogalactano endo-1,4-β-galactosidasa, endo1,4-β-galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactano 4-β-D-galactanohidrolasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una pectina acetil esterasa. Pectina acetil esterasa catalizan la desacetilación de los grupos de acetilo en los grupos hidroxilos de residuos GaIUA de pectina.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una endo-pectina liasa. Endo-pectina liasas (EC 4.2.2.10) catalizan la división eliminativa de (1→4)-α-Dgalacturonano metil éster para dar oligosacáridos con grupos 4-deoxi-6-O-metil-α-D-galacto-4-enuronosil en sus extremos no reductores. La enzima también puede ser conocida como pectina liasa, pectina trans-eliminasa; endopectina liasa, transeliminasa polimetilgalacturónica, pectina metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o (1→4)-6-O-metil--α-D-galacturonano liasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una pectanto liasa. Pectato liasas (EC 4.2.2.2) catalizan la división alternativa de (1→4)-α-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-deoxi-α-D-galacto-4-enuronosil en sus extremos no reductores. La enzima también puede ser conocida como transeliminasa poligalacturónica, transeliminasa de ácido péctico, poligalacturonato liasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, liasa de ácido péctico, liasa péctica, ácido α-1,4-D-endopoligalacturonico liasa, PGA liasa, PPasa-N, ácido endo-α-1,4-poligalacturonico liasa, ácido poligalacturónico liasa, pectina trans-eliminasa, ácido poligalacturónico trans-eliminasa o (1→4)-α-D galacturonano liasa.

En algunas realizaciones adiconales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una alfa-ramnosidasa. Alfa-ramnosidadas (EC 3.2.1.40) catalizan la hirólisis de residuos α-L-ramnosa no reductores de terminal en un α-L-ramnosidasa N o α-L-ramnosidasa ramnohidrolasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una exo-galacturonasa. Exo-galacturonasas (EC 3.2.1.82) hidrolizan ácido péctico del extremo no reductor, liberando

digalacturonato. La enzima también puede ser conocida como exo-poli-α-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa.

En algunas realizaciones adicionales, la pesente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una galacturano 1,4-alfa-galacturonidasa. Galacturano 1,4-alfa-galacturonidasas (EC 3.2.1.67) catalizan una racción del siguiente tipo: (1,4,α-D-galacturonido)n + H2O = (1,4,α-D-galacturonido)n-i + D-galacturonato. La enzima también puede ser conocida ocmo poli [1-gt;4) alfa-D-galacturonido] galacturonohidrolasa, exopoligalacturonasa, poli(galacturonato) hidrolasas, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonoasa, expololi-D-galacturonasa o poli (1,4,α-Dgalaturonido) galacturonohidrolasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una exopoligalacturonato liasa. Exopoligalacturonato liasas (EC 4.2.2.9) catalizan la división eliminativa de 4-(4deoxi-α-D-galacto-4-enuronosil)-D-galacturonato del extremo reductor de pectato (esto es, pectina desterificada). Esta enzima también puede ser conocida como pectato disacárido-liaso, pectato exo-liaso, ácido exopéctico transeliminasa, exopectato liasa, ácido exopoligalacturónico trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o liasa disacárido redutor de extremo de (1→4)-α-galacturonano.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una ramnogalacturonanasa. Ramnogalacturonanasa hidrolizan el enlace entre ácido galactorsilurónico y ramnopiranosilo de una manera endo en estructuras de ramnogalactruronano estrictamente alternativas, que consisten en el disacárido [(1,2-alfa-L-ramnoil-(1,4)-alfa-ácido galactosilurónico].

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una ramnogalacturonano liasa. Ramnogalacturonano liasas dividen enlaces α-L-Rhap-(1→4)-α-GalpA de una manera endo en ramnogalacturonano mediante eliminación de beta.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una ramnogalacturonano acetil esterasa. Ramnogalacturonano acetil esterasas catalizan la desacetilación de la red central de residuos alternantes de ramnosa y ácido galacturónico en ramnogalacturonano.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa. Ramnogalacturonano galacturonohidrolasas hidrolizan ácido galacturónico del extremo no reductor de estructuras de ramnogalactacturonano estrictamente alternantes ende una manera exo. Esta enzima también puede ser conocida como xilogalacturonano hidrolasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una endo-arabinanasa. Endo-arabinanasas (EC 3.2.1.99) catalizan endohidrólisis de enlaces 1,5-αarabinofuranosídicos en 1,5-arabinanos. La enzima también puede ser conocida como endo-arabinasa, arabinana endo-1,5-α-L-arabinosidadas, endo-1,5-α-L-arabinanasa y endo-α-1,5-arabanasa; endo-arabanasa o 1,5-α-Larabinana, 1,5-α-L-arabinanohidrolasa.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una enzima que participa en la degradación de lignina en una mezcla de enzimas. La despolimerización de lignina enzimática puede realizarse mediante peroxidasas de lignina, peroxidasas de manganeso, lacasas y dehidrogenasas de celobiosa (CDH), a menudo trabajando en sinergia. Estas enzimas extracelulares a menudo son referidas como “encimas modificadoras del lignina” o “EMLs”. Tres de estas enzimas comprenden dos peroxidasas que contienen hemoglobina glicosiladas: lignina peroxidasas (LIP); peroxidasa dependiente de Mn (MNP); y lacasa peroxidasa que contiene cobre (LCC):

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61y al menos una lacasa. Las lacasas son enzimas de oxidasa que contienen cobre que se encuentran en muchas plantas, hongos y microorganismos. Las lacasas son enzimáticamente activas en fenoles y moléculas similares y realizan una oxidación de electrones. Las lacasas pueden ser poliméricas y la forma enzimáticamente activa puede ser un dímero o trímero.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una peroxidasa dependiente de Mn. La actividad enzimática de peroxidasa dependiente de Mn (MnP) es dependiente de Mn2+. Sin estar ligado a ninguna teoría, se ha sugerido que el papel principal de esta enzima es oxidar Mn2+ a Mn3+ (Véase, por ejemplo, Glenn et al., Arch. Biochem. Biophys., 251:688-696 [1986]). Posteriormente, los sustratos fenólicos se oxidan por el Mn3+ generado.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una lignina peroxidasa. La lignina peroxidasa es una hemoglobina extracelular que cataliza la despolimerización oxidativa de soluciones diluidas de lignina polimérica in vitro. Algunos de los sustratos de LiP, más notablemente 3,4dimetoxibenbil alcohol (veratril alcohol, VA), son compuestos activos redox que han demostrado actuar como mediadores redox. VA es un metabolito secundario producido al mismo tiempo que LiP mediante cultivos

ligninolíticos de P. chrysosporium y sin estar ligado a ninguna teoría, se han propuesto para que funcionaen como un mediador redox fisiológico en la oxidación LiP-catalizada de lignina in vivo (Véase, por ejemplo, Harvey, et al., FEBS Lett., 195-242-246 [1986])

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una proteasa, amilasa, glucoamilasa y/o una lipasa que participa en la degradación de celulosa.

Como aquí se usa, el término “proteasa” incluye enzimas que hidrolizan enlaces de péptido (peptidasas), así como enzimas que hidrolizan enlaces entre péptidos y otras fracciones, como azúcares (glicopeptidasas). Muchas proteasas se caracterizan bajo EC 3.4, y son adecuadas para su uso en la invención. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen, cisteína proteasas que incluyen pepsina, papaína y serina proteasas que incluyen quimotripsinas, carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas.

Como aquí se usa, el término “lipasa” incluye enzimas que hidrolizan lípidos, ácidos grasos y acilglicéridos, incluyendo fosfoglicéridos, lipoproteínas, diacilgliceroles y similares. En plantas, los lípidos se usan como componente estructural para limitar la pérdida de agua y la infección de patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, así como cutina y suberina.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos una expansina o una proteína de tipo expansina, tal como swollenina (Véase, por ejemplo, Salheimo et al., Eur. J. Biochem., 269:42002-4211 [2002]) o una proteína de tipo swollenina. Las expansinas estaán implicadas en la liberación de la estructura de pared celular durante el crecimiento celular de la planta. Las expansinas se han propuesto para interrumpir el enlace de hidrógeno entre celulosa y otros polisacáridos de pared celular sin tener actividad hidrolíticas. De esta manera, se piensa que permiten el deslizamiento de fibras de celulosa y el aumento de la pared celular. Swollenina, una proteína de tipo expansina contiene un dominio de la Familia 1 del Módulo de Enlace de Carbohidrato N-terinal (CBD) y un dominio de tipo expansina C-terminal. En algunas realizaciones, una proteína de tipo expansina o una proteína de tipo swollenina comprende uno o ambos de dichos dominios y/o interrumpe la estructura de paredes celulares (como interrumpir la estructura de celulosa), opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores.

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos un producto polipéptido de una proteína integrante de celulosa, andamio o una proteína de tipo andamio, por ejemplo CipA o CipC de Clostridium thermocellum o Clostridium cellulocitycum respectivamente. Los andamios y las proteínas integrantes de celulosa son sub-unidades multi-funcionales que pueden organizar sub-unidades celulolíticas en un complejo multi-enzima. Esto se consigue mediante la interacción de dos clases complementarias de dominio (esto es, un dominio de cohesión en andamio y un domino de acoplamiento molecular en cada unidad enzimática). La sub-unidad de andamio también tiene un módulo que se enlaza con celulosa que media la unión de la celulosa con su sustrato. Un andamio o proteína que integra celulosa para los fines de esta invención pueden comprender uno o ambos de estos dominios.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una GH61 y al menos una proteína inducida por celulosa o proteína moduladora, por ejemplo como la codificada por el gen cip1 cip2 o genes similares de Trichoderma reesei (Véase, por ejemplo, Foreman et al., J. Biol. Chem. 278: 31988-31997 [2003]).

En algunas realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona al menos una GH61 y al menos un miembro de cada una de las clases de los polipéptidos descritos anteriormente, varios miembros de una clase de polipéptido, o una combinación de estas clases de polipéptidos para proporcionar mezclas de enzimas adecuadas para varios usos.

En algunas divulgaciones de la invención, la mezcla de enzimas comprende otros tipos de celulasas, seleccionadas aunque no limitadas a celobiohirolasa, endoglucanasa, β-glucosidasa y proteína glicósido hidrolasa 61 (GH61). Estas enzimas pueden ser enzimas de tipo salvaje o recombinantes. En algunas realizaciones, la celobiodrolasa es una celobiohidrolasa de tipo 1 (por ejemplo, T. reesei celobiohidrolasa I). En algunas realizaciones, la endoglucanasa comprende un dominio catalítico derivado del dominio catalítico de una endoglucanasa de Streptomyces avermitilis (Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2010/0267089). En algunas realizaciones, la al menos una celulasa se deriva de Acidothermus cellulolyticus, Thermobifida fusca, Humicola grisea, Myceliophthora thermophila, Chaetomium thermophilum, Acremonium sp., Thielavia sp, Trichoderma reesei, Aspergillus sp., o una Chrysosporium sp. Las enzimas de celulasa de la mezcla de celulasa trabajan juntas dando como resultado una descristalización e hidrólisis de la celulosa de un sustrato de biomasa para producir azúcares fermentables, como, aunque sin limitar a, glucosa.

Algunas mezclas de celulasa para hidrólisis enzimática eficiente son conocidas (Véase, por ejemplo, Viikari et al., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 108:121-45 [2007]; y publicaciones de solicitudes de patentes de Estados Unidos Números US 2009/0061484, US 2008/0057541 y US 2009/0209009). En algunas realizaciones, las mezclas de enzimas purificadas que ocurren de manera natural o recombinantes se combinan con materia primar celulósica o

un producto de hidrólisis de celulosa. Alternativamente o además de, una o más poblaciones celulares, cada una produciendo una o más celulasas que ocurren de manera natural o recombinantes, se combinan con materia primar celulósica o un producto de hidrólisis de celulosa.

En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende celulasas purificadas comercialmente disponibles. Las celulasas comerciales son conocidas y están disponibles (por ejemplo, celulasa C2730 de Trichoderma reesei ATCC No. 25921 disponible en Sigma-Aldrich, Inc.; y C9870 ACCELLERASE® 1500, disponible en Genencor).

XIII. Sustrato celulósico

Los sustratos celulósicos pueden derivarse de cualquier material que contenga celulosa, tal como biomasa derivada de plantas, animales o microorganismos, y pueden incluir residuos agrícolas, industriales o forestales, desechos industriales o municipales, y cultivos terrestres y acuáticos que crecen para fines energéticos. Los “sustratos celulósicos” abarcan ampliamente cualquier material vivo o muerto que contenga un sustrato de polisacárido, incluyendo aunque sin limitar a, celulosa, almidón, otras formas de polímeros de carbohidrato de cadena larga, y mezclas de tales fuentes. Puede o no montarse enteramente o principalmente a partir de glucosa o xilosa, y pueden también contener opcionalmente varios otros monómeros de pentosa o hexosa. La xilosa es una aldopentosa que contiene cinco átomos de carbono y un grupo aldehído. Es el precursor de hemicelulosa, y a menudos es un constituyente principal de biomasa.

Los sustratos celulósicos a menudos se proporcionan como materias primas de lignocelulosa que pueden procesarse antes de hidrólisis por celulasas. Como aquí se usan, los términos “materia prima de lignocelulosa” se refieren a cualquier tipo d biomasa de planta como, aunque sin limitar a, cosechas cultivada (por ejemplo, hierbas, incluyendo hierbas C4 como pasto varilla, espartina, centeno, miscanthus, hierba cinta o cualquier combinación de ellas), residuos que procesan azúcar, por ejemplo, aunque sin limitar a, bagazo (por ejemplo, bagazo de azúcar de cañal, pulpa de remolacha o una combinación de ellas), residuos agrícolas (por ejemplo, rastrojo de soja, rastrojo de maíz, fibra de maíz, paja de arroz, paja de caña de azúcar, arroz, vainas de arroz, paja de cebada, mazorcas de maíz, paja de trigo, paja de canola, paja de avena, vainas de avena, fibra de maíz, cáñamo, linaza, sisal, algodón o cualquier combinación de ellos), pulpa de fruta, pulpa vegetal, granos de destilador, biomasa forestal (por ejemplo, madera, pulpa de madera, pulpa de papel, fibra de pulpa de madera reciclada, serrín, madera dura, como madera de álamo, madera blanda, o una combinación de ellos). Además, en algunas realizaciones, la materia prima de lignocelulosa comprende material celulósico de desecho y/o materiales forestales de desecho, incluyendo aunque sin limitar a, desechos del procesamiento de papel y pulpa, papel de periódico, cartón y similares. La biomasa también puede comprender plantas transgénicas que expresan ligninasa y/o enzimas de celulasa (US 2008/0104724 A1).

En algunas realizaciones, la materia prima lignocelulósica comprende una especie de fibra, mientras en algunas realizaciones alternativas, la materia prima celulósica comprende una mezcla de fibras que se originan de diferentes materias primas lignocelulósicas. En algunas otras realizaciones, la materia prima lignocelulósica comprende materia prima lignocelulósica fresca, materia prima lignocelulósica parcialmente seca, materia prima lignocelulosica completamente seca, y/o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la materia prima lignocelulósica comprende celulosa en una cantidad superior a aproximadamente 20%, más preferentemente superior a 30%, más preferentemente superior a 40% (p/p). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el material lignocelulósico comprende desde aproximadamente 20% a aproximadamente 90% (p/p) de celulosa, o cualquier cantidad entre ellas, aunque en algunas realizaciones, el material lignocelulósico comprende menos de aproximadamente 19%, menos de aproximadamente 18%, menos de aproximadamente 17%, menos de aproximadamente 16%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 14%, menos de aproximadamente 13%, menos de aproximadamente 12%, menos de aproximadamente 11%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 9%, menos de aproximadamente 8%, menos de aproximadamente 7%, menos de aproximadamente 6%, menos de aproximadamente 5% de celulosa (p/p). Además, en algunas realizaciones, la materia prima lignocelulósica comprende lignina en una cantidad superior a aproximadamente 10%, más típicamente en una cantidad superior a aproximadamente 15% (p/p). En algunas realizaciones, la materia prima lignocelulósica comprende pequeñas cantidades de sacarosa, fructosa y/o almidón.

La materia prima lignocelulósica generalmente se somete a una reducción de tamaño mediante métodos que incluyen, aunque no se limitan a, moledura, pulverización, agitación, triturado, compresión/expansión u otros tipos de acción mecánica. La reducción de tamaño mediante acción mecánica puede realizarse mediante cualquier tipo de equipo adaptado para tal fin, por ejemplo, aunque sin limitar a, moledores con martillo, picadoras con cubo, prensas con rollos, refinadoras y licuadoras. En algunas realizaciones, al menos el 90% por peso de las partículas producidas a partir de la reducción de tamaño tienen longitudes inferiores a entre aproximadamente 1/16 y aproximadamente 4 (la medición puede ser por un volumen o una longitud media de peso). En algunas realizaciones, el equipo usado para reducir el tamaño de partícula es un moledor con martillo o una trituradora. Después de la reducción de tamaño, la materia prima se licua en agua, ya que esto facilita el bombeo de la materia prima. En algunas realizaciones, la materia prima lignocelulósica de tamaño de partícula inferior a aproximadamente 6 pulgadas no requiere reducción de tamaño. La biomasa puede opcionalmente pre-tratarse para aumentar la

susceptibilidad de la celulosa a hidrólisis mediante pre-tratamientos químicos, físicos y biológicos (como explosión de vapor, reducción a pulpa, pulverización, hidrólisis ácida, exposición a disolventes y similares, así como combinaciones de los mismos).

En algunas realizaciones, la materia primar se licua antes del pre-tratamiento. En algunas realizaciones, la consistencia del lodo de materia prima es entre aproximadamente 2% y aproximadamente 3% y más típicamente entre aproximadamente 4% y aproximadamente 5%. En algunas realizaciones, el lodo se somete a una operación de remojo en agua y/o ácido antes del pre-tratamiento. En algunas realizaciones, el lodo se desagua usando cualquier método adecuado para reducir el uso de vapor o químicos antes del pre-tratamiento. Ejemplos de dispositivos para desaguar incluyen, aunque no se limitan a, prensas presurizadas con tornillos (Véase, por ejemplo WO 2010/022511), filtros presurizados o extrusoras.

Como aquí se usan, los términos “materia prima lignocelulósica pre-tratada” y “lignocelulosa pre-tratada” se refieren a materias primas lignocelulósicas que se han sometido a procesos físicos y/o químicos para hacer la fibra más accesible y/o receptiva a las acciones de las enzima celulolíticas. Así, “materia prima lignocelulósica pretratada” es un ejemplo de un “sustrato celulósico pre-tratado”. En algunas realizaciones, el pre-tratamiento se realiza para hidrolizar hemicelulosa y/o una parte de la misma presente en la materia lignocelulósica a pentosa monomérica y azúcares de hexosa (por ejemplo, xilosa, arabinosa, manosa, galactosa y/o cualquier combinación de las mismas). En algunas realizaciones, el pre-tratamiento se realiza para que ocurra casi una hidrólisis completa de la hemicelulosa y una pequeña cantidad de conversión de celulosa o glucosa. En algunas realizaciones, típicamente se usa una concentración ácida en el lodo acuoso de desde aproximadamente 0,2% (p/p) a aproximadamente 2% (p/p)

o cualquier cantidad intermedia, para el tratamiento de la materia prima lignocelulósica. Cualquier ácido adecuado encuentra uso en estos métodos, incluyendo aunque sin limitar a, ácido hidroclórico, ácido nítrico y/o ácido sulfúrico. En algunas realizaciones, el ácido usado durante el pre-tratamiento es ácido sulfúrico. La explosión en vapor es un método de realizar el pre-tratamiento con ácido de materia prima (Véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos Nº 4.461.648). Otro método para pre-tratar el lodo de materia prima incluye un pre-tratamiento continuo (esto es, la materia primar lignocelulósica se bombea a través de un reactor continuamente). Estos métodos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (Véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos Nº 7.754.457.

En algunas realizaciones, se usa álcali en el pre-tratamiento. A diferencia del pre-tratamiento con ácido, el pre-tratamiento con álcali puede no hidrolizar el componente de hemicelulosa de la materia prima. Más bien el álcali reacciona con grupos ácidos presentes en hemicelulosa para abrir la superficie del sustrato. En algunas realizaciones, la adición de álcali altera la estructura de cristal de la celulosa para que sea más susceptible para hidrólisis. Los ejemplos de álcali que encuentran uso en el pre-tratamiento incluyen, aunque no se limitan a, amoniaco, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio e hidróxido de sodio. Un método de pre-tratamiento con álcali es explosión de suspensión de amoniaco, explosión de fibra de amoniaco o expansión de fibra de amoniaco (Proceso “AFEX”; Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Números 5.171.592; 5.037.663; 4.600.590; 6.106.888; 4.356.196; 5.939.544; 6.176.176; 5.037.663 y 5.171.592). Durante este proceso, la materia prima lignocelulósica contacta con amoniaco o hidróxido de amonio en un recipiente de presión durante un tiempo suficiente que permita al amoniaco o hidróxido de amonio alterar la estructura de cristal de las fibras de celulosa. Después la presión se reduce rápidamente, lo que permite que el amoniaco destelle o caliente y explote la estructura de fibra de celulosa. En algunas realizaciones, el amoniaco destellado después se recupera usando métodos conocidos en la técnica. En un método alternativo, se utiliza un pre-tratamiento con amoniaco diluido. El método con el pre-tratamiento de amoniaco diluido utiliza más soluciones diluidas de amoniaco o hidróxido de amonio que AFEX (Véase, por ejemplo, WO 2009/045651 y US 2007/0031953). Este proceso de pre-tratamiento puede o no producir monosacáridos.

Un proceso adicional de pre-tratamiento para su uso en la presente invención incluye tratamiento químico de la materia primar con disolventes orgánicos, en métodos tales como aquellos que utilizan líquidos orgánico en sistemas de pre-tratamiento (Véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos Nº 4.556.430). Estos métodos tienen la ventaja de que los líquidos de punto de ebullición bajo pueden recuperarse y reusarse fácilmente. Otros pretratamientos, como el proceso Organosolv™, también usa líquidos orgánicos (Véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos Nº 7.465.791.). Someter la materia prima a agua presurizada también puede ser un método adecuado de pre-tratamiento (Véase, por ejemplo, Weil et al., (1997) Appl. Biochem. Biotechnol. 68(1-2): 21-40).

En algunas realizaciones, la materia prima lignocelulósica pre-tratada se procesa después del pretratamiento mediante cualquiera de varias etapas, como dilución con agua, lavado con agua, amortiguación, filtración

o centrifugación o cualquier combinación de estos procesos, antes de hidrólisis enzimática, como será familiar para aquellos expertos en la técnica. El pre-tratamiento produce una composición de materia prima pre-tratada (por ejemplo, un “lodo de materia primar pre-tratada”) que contiene un componente soluble que incluye azúcares resultantes de la hidrólisis de la hemicelulosa, opcionalmente ácido acético y otros inhibidores, y sólidos que incluyen materia prima y lignina no hidrolizada. En algunas realizaciones, los componentes solubles de la composición de materia prima pre-tratada se separan de los sólidos para producir una fracción soluble. En algunas realizaciones, la fracción soluble, incluyendo azúcares liberados durante el pre-tratamiento y otros componentes solubles (por ejemplo, inhibidores), se envía después a fermentación. Sin embargo, en algunas realizaciones donde la hemicelulosa no se hidroliza de manera efectiva durante el pre-tratamiento, se incluyen una o más etapas

adicionales (por ejemplo, una etapa adicional de hidrólisis y/o etapas de tratamiento enzimático y/o tratamiento adicional con álcali y/o ácido) para producir azúcares fermentables. En algunas realizaciones, la separación se realiza lavando la composición de materia prima pre-tratada con una solución acuosa para producir un chorro de lavado y un chorro de sólidos que comprende la materia prima pre-tratada no hidrolizada.

Alternativamente, el componente soluble se separa de los sólidos sometiendo a la composición de materia prima pre-tratada a una separación sólidos-líquido, usando cualquier método adecuado (por ejemplo, centrifugación, microfiltración, filtración de placas, filtración de flujo cruzado, filtración de presión, filtración de vacío, etc.). Opcionalmente, en algunas realizaciones, se incorpora una etapa de lavado en la separación sólidos-líquidos. En algunas realizaciones, los sólidos separados que contienen celulosa sufren después hidrólisis enzimática con enzimas de celulasa con el fin de convertir la celulosa en glucosa. En algunas realizaciones, la composición de materia primar pre-tratada se introduce en el proceso de fermentación sin separación de los sólidos contenidos. En algunas realizaciones, los sólidos no hidrolizados se someten a hidrólisis enzimática con enzimas de celulasa para convertir la celulosa en glucosa después del proceso de fermentación. La lignocelulosa pre-tratada se somete a hidrólisis enzimática con enzimas de celulasa.

El pre-tratamiento produce una composición de materia prima pre-tratada (por ejemplo, lodo de materia prima pre-tratada) que contiene un componente soluble que incluye los azúcares resultantes de la hidrólisis de hemicelulosa, opcionalmente ácido acético y otros inhibidores, y sólidos que incluyen materia prima y lignina no hidrolizada.

Los componentes solubles de la composición de materia prima pre-tratada pueden separarse de los sólidos para producir una fracción soluble para su uso en la reacción de sacarificación.

La separación puede realizarse lavando la composición de materia prima pre-tratada con una solución acuosa para producir un chorro de lavado, y un chorro de sólidos que comprende materia prima pre-tratada no hidrolizada. Alternativamente, el componente soluble se separa de los sólidos sometiendo a la composición de materia prima pre-tratada a una separación sólidos-líquido, usando métodos como centrifugación, microfiltración, filtración de placas, filtración de flujo cruzado, filtración de presión y/o filtración de vacío. Opcionalmente, puede incorporarse una etapa de lavado en la separación sólidos-líquidos. Los sólidos separados que contienen celulosa pueden después someterse a hidrólisis enzimática con enzimas de celulasa para conversión de celulosa a glucosa.

La lignocelulosa adecuadamente preparada puede someterse a hidrólisis enzimática usando una o más enzimas de celulasa en presencia de una o más proteínas GH61 o preparaciones de acuerdo con esta invención.

La hidrólisis de componentes de hemicelulosa y celulosa de una materia prima lignocelulosica produce un hidrolisado lignocelulósico que comprende xilosa y glucosa. Otros azúcares típicamente presentes incluyen galactosa, manosa, arabinosa, fucosa, ramnosa o una combinación de ellos. Con independencia de los medios para hidrolizar la materia prima lignocelulósica (hidrólisis ácida completa o pre-tratamiento químico con o sin posterior hidrólisis enzimática), la xilosa y glucosa forman generalmente una gran proporciona de los azúcares presentes.

Si el hidrolisado lignocelulósico es un hidrolisado de hemicelulosa resultante del pre-tratamiento ácido, xilosa será el azúcar predominante y menores cantidades de glucosa estarán presentes, porque una cantidad modesta de hidrólisis de celulosa típicamente ocurre durante el pre-tratamiento. En este caso, la xilosa puede formar entre aproximadamente 50 y aproximadamente 90% de peso del contenido total de carbohidrato del hidrolisado de celulosa. Si el hidrolisado lignocelulósico resulta del pre-tratamiento secuencial y la hidrólisis enzimática de la materia prima lignocelulósica (esto es, sin una etapa de separación de sólidos después del pre-tratamiento), la xilosa puede formar entre aproximadamente 30 y aproximadamente 50% de peso del contenido total de carbohidrato. La cantidad relativa de xilosa presente en el hidrolisado lignocelulósico dependerá de la materia primar y el pretratamiento que se emplee.

Los componentes solubles del sustrato hidrolizado pueden separarse de los sólidos para producir una fracción soluble. La fracción soluble (incluyendo azúcares liberados durante hidrólisis, y algunas veces inhibidores) pueden después usarse para fermentación. Si la hemicelulosa no se hidroliza de manera efectiva durante el pretratamiento, puede ser deseable incluir una etapa adicional de hidrólisis o etapas con enzimas o un tratamiento adicional con álcali o ácido para producir azúcares fermentables.

XIV: Fermentación de azúcares

Los azúcares fermentables producidos en las reacciones de sacarificación usando proteínas GH61 de la divulgación pueden usarse para producir varios productos finales de interés.

En algunas realizaciones, los azúcares se usan en un proceso de fermentación para producir productos finales. El término “fermentación” se usa ampliamente para referirse al cultivo de un microorganismo o un cultivo de microorganismos que usan azúcares simples, tales como azúcares fermentables, como una fuente de energía para

obtener un producto deseado. En una realización diferente, la biomasa celulósica puede tratarse con una composición de esta invención para preparar comida para animales.

Los productos finales incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, butanol), acetona, aminoácidos (por ejemplo, glicina y lisina), ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido 3-hidroxipropinoico, ácido acrílico, ácido succínico, ácido málico, ácido fumárico o ácido úrico), glicerol, dioles (como 1,3 propanodiol o butanodiol), hidrocarburos con 1-20 átomos de carbono (por ejemplo, ésteres de cadena larga), alcoholes de azúcar (por ejemplo, xilitol), alcoholes grasos y β-lactamo y otros productos finales.

Puede usarse cualquier microorganismo para convertir azúcar en el hidrolisado de azúcar a etanol u otros productos de fermentación. Estos incluyen levaduras del género Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces y Candida. Pueden usarse levaduras comercialmente disponibles, tales como levadura Turbo, Ethanol Red® Safdistil®, Thermosacc®, Fermiol®, Fermivin® o Superstart™.

La levadura puede producirese genéticametne para azúcares de hexosa y pentosa a un producto final, incluyendo aunque sin limitar etanol. Alternativamente, la levadura puede ser una cepa que haya sido capaz de fermentar xilosa y glucosa mediante uno o más métodos no recombinantes, como evolución adaptiva o mutagénesis y selección aleatoria. Por ejemplo, la fermentación puede realizarse con levadura Saccharomyces recombinantes. La levadura recombinante es una cepa que ha sido capaz de fermentar xilosa mediante incorporación recombinantes de genes que codifican xilosa reductasa (XR) y xilitol dehidrogenasa (XDH) (Patentes de Estados Unidos 5.789.210, 5.866.382, 6.582.944 y 7.527.927 y EP 450 530), y/o genes que codifican una o más xilosa isomerasa (XI) (Patentes de Estados Unidos 6.475.768 y 7.622.284). Además, la cepa de levadura modificada puede sobreexpresar un gen endógeno o heterólogo que codifica xiluquinasa (XK): otra levadura puede fermentar azúcares de hexosa y pentosa a al menos un producto final, incluyendo aunque sin limitar, etanol, como levadura de los géneros Hansenula, Pichia, Kluyveromyces yCandida (WO 2008/130603).

Un rango típico de temperatura para la fermentación de una azúcar a etanol usando Saccharomyces spp. está entre aproximadamente 25 ºC y aproximadametne 37 ºC, aunque la temperatura puede ser más alta (hasta 55 ºC) si la levadura se ha modificado naturalmente o genéticamente para ser termoestable. El pH de una fermentación típica que emplea Saccharomyces spp. está entre aproximadamente 3 y aproximadamente 6, dependiendo del pH óptimo del microorganismo de fermentación. El azúcar hidrolisado también puede complementarse con nutrientes adicionales necesarios para el crecimiento y fermentación del microorganismo para fermentación. Por ejemplo, extracto de levadura, aminoácidos específicos, fosfato, fuentes de nitrógeno, sales, elementos de trazas y vitaminas (Verduyn et al., 1992, Yeast 8(7):501-170, Jørgensen, 2009, Appl Biochem Biotechnol, 153:44-57 and Zhao et al., 2009, Journal of Biotechnology, 139:55-60). Típicamente, la fermentación se realiza bajo condiciones anaeróbicas, aunque también pueden usarse condiciones aeróbicas o microaeróbicas.

Así, la invención proporciona procesos para producir un producto de fermentación, done el método comprende: proporcionar las células huéspedes recombinantes como aquí se proporcionan, un medio de fermentación que comprende azúcares fermentables como glucosa y/o xilosa; y contactar el medio de fermentación con las células huéspedes fúngicas recombinantes bajo condiciones adecuadas para generar el producto de fermentación. En algunas realizaciones, los procesos comprenden además la etapa de recuperar el producto de fermentación. En algunas realizaciones adicionales, la etapa de fermentación se realiza bajo condiciones microaérobicas o aeróbicas. En algunas realizaciones, la etapa de fermentación se realiza bajo condiciones anaeróbicas. En algunas realizaciones, el medio de fermentación comprende producto de un proceso de sacarificación.

Las proteínas GH61 y celulasas de la presente divulgación pueden utilizarse en cualquier método usado para generar alcoholes u otros biocombustibles a partir de celulosa, y no se limitan necesariamente a los aquí descritos. Dos métodos comúnmente empleados son el método de la sacarificación separada y fermentación (SHF) (véase, Wilke et al., Biotechnol. Bioengin. 6: 155-75 (1976)) o el método de sacarificación simultánea y fermentación (SSF) desvelado por ejemplo en las patentes de Estados Unidos Nº 3.990.944 y 3.990.945.

El método SHF de sacarificación de la presente invención comprende las etapas de contactar una celulasa de proteína GH61 con una celulasa que contiene sustrato para romper enzimáticamente la celulasa en azúcares fermentables (por ejemplo, monosacáridos como glucosa), contactar los azúcares de fermentación con un microorganismo productor de alcohol para producir alcohol (por ejemplo, etanol o butanol) y recuperar el alcohol. En algunas realizaciones, puede usarse el método de bioprocesamiento consolidado (CBP), donde la producción de celulasa del huésped es simultánea a la sacarificación y fermentación, bien de un huésped o de un cultivo mezclado.

Además de los métodos SHF, puede usarse un método SSF. En algunos casos, los métodos SSF dan como resultado una mayor eficiencia de producción de alcohol que el que produce el método SHF (Drissen et al., Biocatalysis and Biotranformation 27: 27-35 (2009)). Una desventaja de SSF sobre SHF es que se necesitan temperaturas más altas para SSF que para SHF.

En una realización, la presente invención usa polipéptidos de celulasa que tienen mayor termoestabilidad

que una celulasa de tipo salvaje.

EJEMPLOS

5

Ejemplo 1. Identificación de proteínas GH61 en M. tehrmophila

Se obtuvo la secuencia genómica de una cepa fúngica de tipo salvaje de M. thermophila. Se analizó el

10

genoma entero para identificar y evaluar regiones codificadoras de proteína. Se seleccionaron veinticuatro proteínas endógenas para la cepa M. thermophila en base a factores que incluyen la presencia de motivos de secuencia de

familia 61 de glicohidrolasa (GH61) (dominios Pfam). Los dominios Pfam se identificaron usando el algoritmo

software “PFAM V.24”, desarrollado por Welcome Trust Sanger Institute (Henrissat et al., 1995, Proc Natl Acad Sci

USA 92: 7090-94).

15

La TABLA 1 proporciona la secuencia de pre-proteína GH61 (SEQ ID NO: 1) y la forma secretada predicha

(madura) (SEQ ID NO: 2). La proteína madura se designó “GH61a””. La TABLA 2 proporciona la secuencia de otras

pre-proteínas GH61, con el péptido de señal nativo predicho subrayado. Dos de las proteínas en la TABLA 2 no se

predicen por tener péptidos de señal.

20

En la TABLA 3, más abajo, se muestra la numeración secuencial y el análisis de estructura de dominio de

los polinucléotidos correspondientes.

25

30

35

40

45

50

55

TABLA 3: Numeración de secuencia y análisis de dominio

Designación de Proteína SEQ ID Ácido nucleico Proteína PFAM Dominio laboratorio NO SEQ ID NO

GH61a 1 31 GH61—CBM_1 GH61l 3 32 Chitin_bind_3--GH61

10 GH61m 4 33 GH61 GH61n 5 34 GH61 GH61o 6 35 GH61—GH61-CBM_1 GH61p 7 36 GH61-GH61

15 GH61q 8 37 GH61

GH61r 9 38 GH61

GH61s 10 39 GH61 20

GH61t 11 40 GH61 GH61u 12 41 GH61 GH61v 13 42 GH61

25 GH61w 14 43 GH61 GH61x 15 44 GH61 GH61b 16 45 GH61 GH61c 17 46 GH61

30 GH61d 18 47 GH61

GH61e 19 48 GH61

GH61f 20 49 GH61—CBM_1 35

GH61g 21 50 GH61—CBM_1 GH61h 22 51 GH61 GH61i 23 52 GH61

40 GH61j 24 53 GH61 GH61k 25 54 GH61 GH61p2 26 55 GH61--GH61 GH61q2 27 56 GH61

45 GH61r2 28 57 GH61

GH61t2 29 58 GH61

GH61e2 30 59 GH61 50

SEQ ID NO: 7 tiene un segundo dominio GH61 (GH61-GH61), SEQ ID Nos: 1, 20, 21 tienen la estructura GH61CBM1 (donde “CBM1” es un módulo 1 que se enlaza a carbohidrato), SEQ ID NO: 6 tiene la estructura GH61

55 GH61-CBM1, SEQ ID Nos: 4, 5, 8-19 y 22-25 tienen la estructura GH61, SEQ ID NO: 3 tiene la estructura Chitin_bind_3-GH61 (donde “Chitin_bind_3” es módulo 3 que se enlaza con quitina). SEQ ID Nos: 26-30 son secuencias alternativas correspondientes a los genes que codifican SEQ ID Nos: 7-9, 11 y 19, respectivamente.

Ejemplo 2. Expresión recombinantes de proteínas GH61

60 Entre las proteínas GH61 identificadas en el Ejemplo 1, se seleccionaron ciertos ejemplos para expresión en base a la estructura predicha y a aspectos funcionales, como si la proteína se secretaría de la célula, y su estructura de dominio.

Las seis proteínas GH61 enumeradas en la siguiente tabla se clonaron individualmente en un vector de expresión bajo el control de un promotor CHI (constitutivo a la célula diana) y se trasformaron en una cepa de M. thermophila designada “CF-405” que se ha adaptado para ser deficiente en producción de celulasas endógenas.

TABLA 4: Proteínas GH61 expresadas recombinantemente

Designación de laboratorio

Proteína SEQ ID NO

GH61a

2

GH61o

6

GH61v

13

GH61x

15

GH61b 16 GH61e 19, 30

Las células transformadas que expresaban la proteína GH61 recombinantes se seleccionaron y se prepararon cultivos sembrados. Las células de progenie se cultivaron durante 5 días, y se recogió el caldo que contenía la proteína GH61 secretada (“caldo GH61”).

Ejemplo 3. Actividad potenciadora de celulasa de proteína GH61

Se recogió el caldo de células que expresaban la proteína GH61 que comprendía SEQ ID NO: 2 (Ejemplo 2), y el nivel de GH61 recombinante se cuantificó mediante SDS-PAGE. Se realizaron ensayos de celulasa para determinar si la adición de la proteína GH61 mejoró la hidrólisis de material celulósico por las enzimas de celulasa.

El caldo de cultivo se recogió de un cultivo de una cepa de M. thermophila designado “CF-402” que sobreexpesa β-glucosidasa. Los ensayos de digestión de celulasa se realizaron usando el caldo con y sin GH61 añadido. Las reacciones se hicieron en 96 placas de pocillo profundo Costar en un volumen de reacción total de aproximadamente 80 microlitros. Las reacciones se realizaron a 55 ºC usando preparaciones del sustrato que contenía celulosa de paja de trigo que se había pre-tratado bajo condiciones ácidas (de ahora en adelante referido como “paja de trigo pre-tratada”). Se añadieron 8,1 mg de proteína de caldo por gramo de sustrato (0,82%) a cada muestra. Además, las muestras tuvieron 0 (control), 0,22%, 0,44% o 0,66% proteína de caldo GH61 añadida (concentración total final de proteína de caldo 0,81%, 1,03%, 1,25% o 1,47%). En los pocillos de control sin GH61 añadido, se usó agua para ajustar el volumen para que la carga de sustrato fuera igual en todos los pocillos. En otros experimentos, se añadieron 6-10 mg de proteína de caldo por gramo de sustrato (0,6-1%) a cada muestra, a una concentración total final de proteína de caldo de 0,6-1,7%.

La FIGURA 1 muestra producción adicional de glucosa sobre el control (caldo sin GH61 añadida) después de 48 horas de incubación. En la FIGURA 1(A), se muestra el porcentaje de producción mejorada sobre el control. En la FIGURA 1(B), se trazan los datos para mostrar la producción total de glucosa.

Ejemplo 4. Sobreexpresión de GH61a en una cepa CXP

Construcción de genes GH61a recombinantes

Se aisló ADN genómico de la cepa M. thermophila designada “CF-409”. Esta cpa produce endógenamente endoglucanasa, β-glucosidasas, celobiohidrolasa Tipo 1, y celobiohidrolasa Tipo 2. El procedimiento fue de la siguiente manera. El inóculo de las hijas se sombró en un medio de cultivo y se dejó crecer durante 72 horas a 35 ºC. La alfombrilla micelar se recogió mediante centrifugación, se lavó y se añadieron 50 µL de tampón de extracción de ADN (200 M Tris pH 8.0; 250 mM NaCl; 125 mM EDTA; .5% SDS). Los micelios se molieron con un moledor cónico, se re-extrajeron con 250 µL de tampón de extracción y la suspensión se centrifugó. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo que contenía 300 µL isopropanol. El ADN se recogió mediante centrifugación, se lavó dos veces con 70% etanol y se volvió a disolver en 100 µL de agua desionizada.

La secuencia GH61a ADN se amplificó de células CF-409 usando cebadores PchiC1GH61a_F y TcbhC1GH61a_R. Se realizó reacción PCR usando la Polimerasa Phusion, a 98 ºC durante 30’’, seguido de 35 ciclos de 98 ºC durante 10’’, 72 ºC durante 1’ y la extensión final a 72 ºC durante 5’. El producto resultante se clonó en el vector 3’ pC1DX20PhR al promotor chi1 para crear un vector de expresión que expresó la transcripción de proteína GH61 bajo el control del promotor chi1 (pC1DX20PhR-GH61a) usando técnica de clonación In-fusion (kit de clonación In-Fusion Advantage™ PCR con potenciador clonador, Clontech Cat. No. 639617 de acuerdo con las instrucciones del fabricante).

PchiC1GH61a_F tacttcttctccaccATGTCCAAGGCCTCTGCTCT SEQ ID NO:69 TcbhC1GH61a_R ggatccgaattcttaTTACAAACACTGGGAGTACCA SEQ ID NO:70

Preparación de protoplasto para transformación CXP

Las células M. thermophila (quot;CF-405quot;, una cepa eliminada Alp1) se inocularon en 100 mL de medio de crecimiento en un matraz Erlenmeyer de 500 mL usando 106 esporas/ml. El cultivo se incubó durante 24 horas a 35 ºC, 250 rpm. Para cosechar el micelio, el cultivo se filtró sobre un filtro estéril Myracloth™ (Calbiochem) y se lavó con 100 mL solución 1700 mosmol NaCl/CaCl2 (0.6 M NaCl, 0.27 M CaCl2·H2O). El micelio lavado se transfirió a un tubo de 50 mL y se pesó. Se disolvió cailasa (20 mg/gramo micelio) en 1700 mosmol NaCl/CaCl2 y se esterilizó con UV durante 90 segundos. Se añadieron 3 ml de solución estéril Caylase en el micelio lavado que contenía el tubo y se mezcló. Se añadieron 15 mL adicionales de solución 1700 mosmol NaCl/CaCl2 en el tubo y se mezcló.

La suspensión micelio/Caylase se incubó a 30 ºC, 70 rpm durante 2 horas. Los protoplastos se cosecharon filtrándolos a través de un filtro estéril Myracloth en un tubo estéril de 50 mL. Se añadieron 25 mL de STC frío al flujo y giró a 2720 rpm durante 10 min a 4 ºC. El gránulo se volvió a suspender en 50 mL sTC (1.2 M sorbitol, 50 mM CaCl2·H2O, 35 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl) y se centrifugó de nuevo. Después de las etapas de lavado, el gránulo se volvió a suspender en 1 mL STC.

Transformación

En el fondo de un tubo estéril de 5 mL se colocó en una pipeta ADN plásmido y se añadieorn 1 µL de ácido auintricarboxílico y 100 µL de protoplasto. El contenido se mezcló y el protoplasto con el ADN se incubó a temperatura ambiente durante 24 min. Se añadieron 1,7 ml de solución PEG4000 (60% PEG4000 [glicol de polietileno, peso medio molecular 4000 Daltons], 50 mM CaCl2·H2O, 35 mL NaCl, 10 mM Tris-HCL) y se mezclaron cuidadosamente. La solución se mantuvo a temperatura ambiente durante 20 min. El tubo se llenó con STC, se mezcló y centrifugó a 2500 rpm durante 10 min a 4 ºC. STC se vertió y el gránulo se volvió a suspender en el resto de STC y se colocó en placas en placas de medio mínimo. Las placas se incubaron durante 5 días a 35 ºC. Las colonias se volvieron a manchar y se comprobaron para presencia de plásmido integrado. Varias aislados se seleccionaron y probaron para la expresión de GH61a.

La transformación se realizó en cepas CF405. Los transformantes de GH61a se probaron para sobreexpresión de GH61 en SDS-PAGE para la presencia de la banda extra que se confirmó mediante análisis MS-MS.

Ejemplo 5. Purificación de proteínas GH61 de sobrenadante de celulasa

En este experimento, la actividad de proteína GH61 se fraccionó del sobrenadante del cultivo de una cepa de M. thermophila designada “CF-401”. CF-401 se derivó de CDXF que tiene una eliminación de genes CDH1 y CDH2. Esta cepa produce endógenamente endoglucanasa, β-glucosidasas, celobiohidrolasa Tipo 1, y celobiohidrolasa Tipo 2.

Para prepara para cromatografía, el sobrenadante completo de celulasa de CF-401 se aclaró mediante centrifugación a 12.000 rpm durante 35 minutos. El sobrenadante se filtró después a través de una membrana PES™ de 0,22 µm, que después se concentró y se intercambió con tampón en un tampón 25 mM bis-tris, pH 5,7. Se añadió sulfato de amonio saturado en 25 mM bis-tris a una concentración final de ≈50 g/L proteína en 0,9 M sulfato de amonio y 20-25 mM bis-tris. Esta solución se cargó inmediatamente en una columna FF de Fenilo (High Sub) (una columna de flujo rápido empaquetada con Phenyl-Sepharose™) y se enjuagó con 0,9 M sulfato de amonio en 25 mM bis-tris hasta que el A280 cayó cerca del punto de partida. La proteína se eluyó con un gradiente de 0,9 M sulfato de amonio en 25 mM bis-tris a 0 M sulfato de amonio en 25 mM bis-tris, sobre aproximadamente 10 volúmenes de columna. Las fracciones se recogieron (25 en este caso) de acuerdo con los picos del cromatograma (A280). Para inhibir el crecimiento simultaneo, se añadió NaN3 a todas las fracciones hasta una concentración final de 0,05%. Después de mantener un gel SDS-PAGE en cada fracción, las fracciones similares se combinaron para crear grupos con un mínimo conjunto de componentes. Aquí, de las 25 fracciones producidas, resultaron 11 grupos. Para preparar la siguiente columna, cada grupo se concentró hasta ≈150 mL usando una unidad de filtración de flujo tangencial equipada con membranas 50 kDa MWCO PES™. El volumen de la solución de proteína se devolvió después a 500 mL con DI agua, y se concentró de nuevo a ≈150 mL; esta etapa se repitió 5 x y la solución se sometió a intercambio de tampón de manera efectiva.

Cada uno de los 11 grupos derivados de CF-401 se fraccionó además con una columna Q (resina de intercambio iónico de amonio cuaternario). Después de la cuantificación de proteína total usando un ensayo BCA (ácido bicinconínico), se prepararon solucionese de 50 g/L proteína en 10 mM bis-tris pH 7,5 tampón para cada grupo. Después de su aplicación a la columna, la resina se lavó con 10 mM bis-tris, pH 7,5 hasta que A280 cayó cerca del punto de partida. La proteína unida se eluyó después con 1 M NaCl en 10 mM Bis-Tris, pH 7,5 usando un gradiente gradual (5% durante 10 minutos), y se mantuvo en esa concentración hasta que el pico de proteína

comenzó a bajar continuamente. Para analizar, se mantuvo un gel SDS-PAGE en cada fracción, y las fracciones con composiciones similares se agruparon. Cada una de estos grupos de segunda fase después se desalaron/concentraron con filtración de flujo tangencial.

En total, 79 grupos de enzimas derivadas de CF-401 se prepararon en este ensayo. Para ayudar en la carga en el ensayo de sacarificación, cada proteína total para cada grupo se midió usando el ensayo de proteína BCA.

Ejemplo 6. Uso de proteínas GH61 para promover la sacarificación

Las enzimas GH61 fraccionadas de acuerdo con el ejemplo previo se probaron en sacarificación en presencia de sistemas de celulasa completa obtenidas a partir de una cepa de célula designada “CF-404”. Estas células se derivaron de la cepa CF-401 y sobreexpresaron β-glucosidasa. Como un experimento de control, 0,21% (generalmente 0,1-4%) de CF-404 se añadió a 0,61% (generalmente 0,6-1,5%) de CF-401. Así, la carga de proteína total fue igual en todas las reacciones. Estas mezclas después se incubaron con 110 g/L glucano (paja de trigo pretratada) a 55 ºC, pH 4,6-5 durante 53 horas. Al finalizar el experimento, las reacciones se enfriaron mediante la adición de 10 mM de ácido sulfúrico. Para análisis de glucosa, las muestras se analizaron usando un Agilent HPLC 1200 equipado con columna de exclusión iónico HPX-87H (300 mM x 7,8 mM) con 5 mM H2SO4 como una fase móvil a una velocidad de flujo de 0,6 ml/min a 65 ºC. El tiempo de retención de la glucosa fue 9,1 minutos.

Un ejemplo que demuestra una producción mejorada de glucosa se muestra en la Tabla 5.

TABLA 5: Sacarificación mejorada usando fracciones de GH61

0,21% GH61

Glucosa producida SEQ ID NO

complementando 0,61%

(g/L) correspondiente

CF-404

GH61

gt;30 20

GH61

gt;35 2

GH61

gt;35 13

GH61

gt;30 7

GH61

gt;30 21, 26

GH61

gt;35 23

Control (CF-404)

28,9 ± 0,66

La secuencia de proteína parcial se obtuvo a partir de espectrometría de masa y se comparó con las secuencias que codifican proteínas identificadas en la secuencia del genoma de M. thermophila (Ejemplo 1) usando el software de alineación BIFX disponible en Bioinformatics Organization, Hudson MA. La concordancia con las secuencias conocidas de M. thermophila se muestra en la tabla anterior.

Ejemplo 7. Combinación mínima de proteína para convertir celulosa en glucosa

Las enzimas de M. thermophila, CBH1 CBH2 se combinaron con varias combinaciones de las proteínas GH61; GH61a, GH61f y GH61p, y se ensayaron en varias concentraciones relativas para la habilidad para convertir glucano en glucosa. El sobrenadante de la cepa CF-401 (que comprende celulasas y proteínas GH61) también se ensayaron para comparación. Para 110 g/L glucano, las producciones máximas posibles de glucosa son aproximadamente de 135 a 145 g/L:

Las reacciones se sacarificación se realizaron en 110 g/L carga de glucano de paja de trigo pre-tratada en pH 5,0 a una temperatura de 55 ºC a 950 rpm en un volumen total de 95 µL en 96 placas de pocillos profundos de alto rendimiento (HTP). Se añadieron 81 g/L xilosa y 128 mM acetato a la paja de trigo pre-tratada. β-glucosidasa en exceso (en relación con glucano) también se complementó para liberar la inhibición del producto de celobiosa. La celulasa completa (caldo de células CP-401), así como enzimas individuales se caracterizaron por ensayos estándares BCA para cuantificación total de proteína. Las respuestas a dosis de las mezclas de enzimas se realizaron añadiendo proteína conocida total (calculada como peso de proteína añadida / peso glucano). Los niveles de proteína total probados fueron 0,73 y 3% (peso proteína añadida / peso glucano). Una respuesta a dosis se midió en pH 5,0 a 55 ºC durante 72 horas. Se usaron las siguientes combinaciones de enzimas (en combinación con BGL1):

a. Cultivo sobrenadanete CF-401 (Control; contiene las 4 enzimes + proteínas GH61)

b.

50%(CBH1a+ CBH2b) + 50% GH61f

c.

50%(CBH1a+ CBH2b) + 50% GH61p

d.

50%(CBH1a+ CBH2b) + 25% GH61f + 25%GH61p

e.

50%(CBH1a+ CBH2b) + 16.6% GH61a+16.6% GH61f+16.6% GH61p

Las reacciones se templaron a las 72 horas mediante la adición de 10 mM de ácido sulfúrico. Para análisis de glucosa, las muestras se analizaron usando un Agilent HPLC 1200 equipado con columna de exclusión iónica HPX-87H (300 mM x 7,8 mM) con 5 mM H2SO4 como una fas móvil a una velocidad de flujo de 0,6 mL/min a 65 ºC. El tiempo de retención de la glucosa fue 9,1 minutos.

La FIGURA 2 muestra los resultados. Las enzimas de celulasa CBH1 y CBH2 se combinaron con varias proteínas GH61. El experimento control (línea de puntos) fue cultivo sobrenadante de células CF-401 que contiene una pluralidad de enzimas de celulasa y actividad endógena de GH61. La carga total de proteína se añadió en las proporciones especificadas en la figura.

Estos resultados establecen que una enzima mínima fijada es capaz de conseguir niveles de glucosa similares al control: específicamente, las celulasas CBH1 y CBH2, combinadas con una o más de GH61f, GH61p y GH61a. Todas las combinaciones generaron producciones de glucosa más altas que el caldo de cultivo de CP-401. Así, es posible conseguir las máximas conversiones teoréticas usando un conjunto mínimo de enzimas. Esto también demuestra que la mezcla mínima de enzimas aquí usada tiene todos los componentes necesarios para la conversión completa de celulosa a glucosa. Sin embargo, se contempla que las combinaciones adicionales de enzimas encontrarán uso en los procesos de sacarificación.

Ejemplo 8. Sinergia de actividad de GH61 con otras enzimas derivadas de CXP

Este ejemplo describe una evaluación de GH61a para sinergia con otras enzimas derivadas de M. thermophila como CBH1a, CBH2b y EG2.

Las reacciones de sacarificación se realizaron en una carga de 110 g/L glucano de paja de trigo pre-tratada en pH 5,0 a una temperatura de 55 ºC a 950 rpm en un volumen total de 95 µL en 96 placas de pocillos profundos de alto rendimiento (HTP). Se añadieron 81 g/L xilosa y 128 mM acetato a la paja de trigo pre-tratada. β-glucosidasa en exceso (p/p glucano) también se complementó para liberar la inhibición del producto de celobiosa. La celulasa completa así como enzimas individuales se caracterizaron por ensayos estándares BCA para cuantificación total de proteína.

TABLA 6: Sinergia de GH61a con enzimas derivadas de M. thermophila y mezclas de enzimas

Enzimas CBH1a% CBH2b% CH61a% EG2% Carga de Producción Grado de complementadas proteína de glucosa sinergia

con GH61a (peso total (g/L) proteína añadida

/peso

glucano) CBH1a 0,39% -0,18% -0,57% gt;15 gt;1,6 CBH2b -0,30% 0,18% -0,48% gt;35 gt;1,3

EG2 -0,18% 0,20% 0,38% gt;25 gt;1,2 CBH1a+CBH2b 0,39% 0,30% 0,18% -0,87% gt;75 gt;1,7

CBH2b+EG2

- 0,30% 0,18% 0,20% 0,68% gt;40 gt;1,1

CBH1a+CBH2b

0,39% 0,30% 0,18% 0,20% 1,07% gt;75 gt;1,4

+ EG2

0,68% - 0,37% 0,20% 1,25% gt;75 gt;1,7

1,35%

1,20% 0,37% 0,20% 3,12% gt;125 gt;1,6

1,35%

1,20% 0,74% 0,20% 3,49% gt;125 gt;1,5

Para un sistema de enzima que comprende dos enzimas A y B, el grado de sinergia se calculó mediante la 5 siguiente fórmula:

Grado de Sinergia =

La producción de glucosa mostrada en la tabla es la producción obtenida de la combinación de GH61 y las enzimas. Esto se divide por la producción de glucosa medida por separado para GH61 y la mezcla de enzimas (no mostrada) para cuantificar la sinergia entre las dos.

15 Los resultados muestran que GH61a tiene sinergia con todos los sistemas de enzimas derivados de M. thermophila probados. Para la conversión completa de celulosa a glucosa, la presencia de GH61a es beneficiosa.

Ejemplo 9. Usar GH61a para reducir viscosidad de paja de trigo pre-tratada

GH61a purificado de M. thermophila se evaluó para determinar la función enzimática y para evaluar cualquier actividad de tipo endo-glucanasa para reducción en longitud de cadena de celulosa, permitiendo así una reducción en viscosidad.

GH61a sola o en combinación con EG2 se probaron para reducción de viscosidad en paja de trigo pre

25 tratada en carga de glucano de 75 g/L glucano y en pH 5,0, 50 ºC. Las pruebas de reducción de viscosidad se realizaron (ciclo de 30 minutos a 80 RPM) en un viscómetro RVA-super4 (Newport Scientific, Australia) en un peso total de 21 g.

La FIGURA 3 muestra los resultados. La adición de 0,02% GH61a en relación con glucano mostró aproximadamente 2-3% de reducción de viscosidad en pH 5, 50 ºC. En comparación, la adición de 0,01% M. thermophila EG2 en relación con glucano mostró aproximadamente 19% de reducción de viscosidad bajo las mismas condiciones. Con una combinación de 0,02% GH61a y 0,01% EG2, la reducción total de viscosidad fue aproximadamente 21%.

SECUENCIAS

5

Secuencias de celulasa ejemplares

10

Precursor C1 BGL1: SEQ ID NO: 60

Precursor TaBGL (Thermoascus aurantiacus): SEQ ID NO: 61

Precursor CeIA BGL (Azospirillum irakense): SEQ ID NO: 62:

C1 CBH1a: SEQ ID NO: 63

Precursor C1 CBH2a: SEQ ID NO: 64

M. thermophila Endoglucanasa 2 (EG2): SEQ ID NO: 65

M. thermophila Beta-glucosidasa (BG): SEQ ID NO: 66

M. thermophila Celobiohidrolasa Tipo 1a (Cbh1a): SEQ ID NO: 67

M. thermophila Celobiohidrolasa Tipo 2b (CBH2b): SEQ ID NO: 68

Secuencia codificadora de GH61a

SEQ ID Nos: 32 a 59 aparecen en el Listado Secuencial formal para esta divulgación.

El uso de proteínas GH61 no pretende limitarse de ninguna manera a la teoría como su modo de acción.

5 Teóricamente, la producción del producto puede aumentar por la acción de la proteína GH61 en el sustrato, por interacción de la proteína GH61 directamente con una o más enzimas de celulasa en una mezcla, reduciendo la viscosidad de la mezcla de reacción o mediante otro mecanismo. La actividad de GH61 puede seguirse de manera empírica usando métodos de ensayo descritos en esta divulgación, sin conocer el mecanismo de operación de la proteína GH61 que se está usando.

DERRAME DE SECUENCIA

[0297]

lt;110gt; Codexis, Inc.

15 Rao, Kripa Clark, Louis Campopianio, Onorato Szabo, Lorand Torok, Janos Baidyaroy, Dipnath

lt;120gt; Uso de Proteínas de la Familia Glycoside Hydrolase GH61 Facilitar el procesamiento de la celulosa

lt;130gt; 90834-818317

lt;150gt; US 61/375,788 25 lt;151gt; 2010-08-20

lt;160gt; 70

lt;170gt; PatentIn version 3.5

lt;210gt; 1

lt;211gt; 342

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Myceliophthora thermophila

lt;400gt; 1

Claims (15)

1. Reivindicaciones

   1. Una composición que comprende: a) una proteína GH61 recombinantemente producida que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 2 o fragmentos de SEQ ID NO: 2 que tienen actividad GH61; y b) enzimas de celulasa que incluyen al menos una endoglucanasa (EG), al menos una β-glucosidasa (BGL), al menos una celobiohidrolasa de Tipo 1 (CBH1), y al menos una celobiohidrolasa de Tipo 2 (CBH2).

2. 2.

   La composición de la reivindicación 1, donde la proteína GH61: a) aumenta la producción de glucosa en al menos un 20% en una reacción donde la celulosa sufre sacarificación por una combinación de enzimas que comprende EG, BGL, CBH1 y CBH2, en comparación con la misma reacción en ausencia de la proteína GH61; b) comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 2; c) comprende SEQ ID NO: 2; o un fragmento de la misma que tiene actividad GH61.

3. 3.

   La composición de la reivindicación 1 o 2, donde las enzimas de celulasa son: a) recombinantes; b) enzimas fúngicas, y/o c) de M. thermophila.

4. 4.

   La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la composición se obtiene: a) expresando un gen que codifica la proteína GH61 en una población de célula huésped, y expresando al menos un gen que codifica una enzima de celulasa en otra población de célula huésped; o b) expresando un gen que codifica la proteína GH61 y al menos un gen que codifica una enzima de celulasa en el mismo tipo de célula huésped.

5. 5.

   La composición de la reivindicación 4, donde el gen codifica una proteína GH61 que comprende un péptido de señal heterólogo.

6. 6.

   Un método para producir azúcares fermentables a partir de biomasa celulósica que comprende contactar un sustrato celulósico con una composición, medio de cultivo o lisado celular que contiene una proteína GH61 y enzimas de celulasa, donde:

   a) la proteína GH61 comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 89% idéntica a la SEQ ID NO: 2 o un fragmento biológicamente activo de la misma; y b) las enzimas de celulasa incluyen al menos una endoglucanasa (EG), al menos una β-glucosidasa (BGL), al menos una celobiohidrolasa de Tipo 1 (CBH1), y al menos una celobiohidrolasa de Tipo 2 (CBH2).

7. 7.

   El método de la reivindicación 6, donde: a) antes de dicho contacto, el sustrato se pre-trata; b), la composición, medio de cultivo o lisado celular comprende además una o más enzimas seleccionadas de esterasas, xilanasas, hemicelulasas, lipasas, proteasas, amilasas, glucoamilasas y combinaciones de ellas; c) el sustrato celulósico se deriva de trigo, paja de trigo, sorgo, maíz, arroz, cebada, bagazo de caña de azúcar, hierbas, pasto varilla, grano de maíz, mazorcas de maíz, fibra de maíz o una combinación de los mismos, y donde el sustrato es opcionalmente paja de trigo derivada; y/o d) el azúcar fermentable comprende glucosa.

8. 8.

   El método de la reivindicación 6 o 7, donde la composición, medio de cultivo o lisado celular comprende GH61 aislado y al menos una o más de una endoglucanasa aislada (EG), una β-glucosidasa aislada (BGL), una celobiohidrolasa de Tipo 1 aislada (CBH1), y/o una celobiohidrolasa de Tipo 2 aislada (CBH2).

9. 9.

   Un método para producir un producto final a partir de un sustrato celulósico, que comprende: a) contactar el sustrato celulósico con una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, por lo que se producen azúcares fermentables a partir del sustrato; y b) contactar los azúcares fermentables con un microorganismo en una fermentación para producir un producto final.

10. 10.

    El método de la reivindicación 9, que es una proceso simultáneo de sacarificación y fermentación.

11. 11.

    El método de la reivindicación 9, donde la sacarificación del sustrato celulósico y dicha fermentación ocurren consecutivamente.

12. 12.

    Un método para producir un producto final a partir de un sustrato celulósico, que comprende:

    a) obtener azúcares fermentables producidos de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8; y b) contactar los azúcares fermentables con un microorganismo en una fermentación para producir un producto final.

13. 13.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde el producto final es un alcohol.

14. 14.

    El método de la reivindicación 13, donde el alcohol es etanol.

15. 15.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, donde el microorganismo es una levadura.