CN103275956B - 一种具有木质素降解增效作用的纤维素酶CelH61及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具有木质素降解增效作用的纤维素酶CelH61及其基因和应用。本发明提供了一种来源于Humicola sp.L8的纤维素酶CelH61，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述纤维素酶的编码基因CelH61。本发明的纤维素酶具有以下性质：最适pH7.0，最适温度70℃，良好的热稳定性，在中性和碱性范围内依然保持较高酶活，与纤维二糖水解酶协同作用，在复合纤维素酶中添加可以有效提高微晶纤维素的水解效率。做为一种新型的纤维素酶制剂，可广泛用于能源、纺织等工业。

Description

一种具有木质素降解增效作用的纤维素酶CelH61及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具有木质素降解增效作用的纤维素酶CelH61及其基因和应用。

背景技术

纤维素是植物细胞壁的最主要组成成分。纤维素是由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线状结构分子，大约占干重的40～61%，（Wong KK,et al.Microbiol Rev1988,52:305-317.）。其中，木质纤维素约占干重的15～25%，是一种复杂酚类聚合物。纤维素的降解需要纤维素酶和纤维二糖水解酶将其降解到纤维寡糖，最后由葡萄糖苷酶将纤维寡糖水解得到葡萄糖。葡萄糖可再通过微生物发酵转化成乙醇等液体燃料（方诩，曲音波.纤维素酶在木质纤维素转化产糖技术中开发与应用.生物产业技术2010,4:48-51.）。

随着我国粮食生产连年扩大，各种农业和林业残余物，主要是木质纤维素，包括玉米秸秆，麦秸秆，稻草等。然而，这些农业废弃物不能充分开发利用，大多被焚烧，从而导致严重的环境污染。国内能源问题也存在很大缺口，如果能有效从木质纤维素提炼乙醇等液体燃料能同时解决以上问题，对国家经济、能源、环境保护和社会持续发展产生积极影响。目前，木质纤维素生产乙醇工艺中，可以采用酸水解和酶水解两种技术路线。由于酸水解转化率低、设备成本高，而微生物来源酶水解技术具有较高的转化率，具备潜在的产业竞争力。纤维素酶广泛存在于自然界的真菌中.按纤维素酶催化反应的最适pH值,可将其分为酸性纤维素酶(最适p H值为3～5)、中性纤维素酶(最适p H值为6～8)和碱性纤维素酶(最适pH值为8～11)（Zhang YHP,et al.Biotechnol Adv2006,24:612-481.）。

纤维素酶有着广泛的应用，例如：造纸，酿造，纺织，饲料，生物能源等领域。但是，不同的工业应用，对纤维素酶的性质的需求是不同的，如：饲料工业需要嗜酸的纤维素酶，能源、纺织工业需要中碱性的纤维素酶。目前工业应用的纤维素酶，主要来自木霉属Trichoderma reesei和Penicillium spp.，这些酶的最适pH在5.0左右，最适温度在50-60度之间，而中性、热稳定性好的酶则有更好的优势：耐热可以提高反应速率，降低底物的粘度，同时还可以抑制其他微生物的生长。

近年来，人们发现真菌来源的糖苷水解酶61家族的纤维素酶具有氧化酶活性，同时发现在瑞氏木霉纤维素酶系中添加少量61家族的纤维素酶可以大大提高玉米秸秆的水解效率，说明该家族纤维素酶是具有木质纤维素降解增效效果的酶。本专利中高温真菌Humicola sp.L8所产纤维素酶大多具有高温中性的特性，并且具有很高的微晶纤维素的降解能力。本发明中纤维素酶CelH61具有以下性质：最适pH7.0，在pH4.0～9.0范围内具有50%以上的酶活力，最适温度70℃，良好的热稳定性，在65℃处理1个小时酶活几乎没有损失，并且在高温中性条件下与复合纤维素酶协同作用可以有效提高玉米秸秆和微晶纤维素的水解效率，具有很强的增效作用。热稳定性优良并在中性和碱性范围内具有较高酶活力的特性使其在生物能源工业应用上具有很大的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的耐热中性纤维素酶。

本发明的再一目的是提供编码上述耐热中性纤维素酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述耐热中性纤维素酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述耐热中性纤维素酶的应用。

本发明从腐质霉(Humicola sp.L8)中分离得到一种新的耐热中性纤维素酶CelH61。

本发明提供了一种纤维素酶CelH61，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MAPKTSTFLASLTGAALVAAHGHVSHIIVNGVQYRNYDPTTDFYSGNPPTVIGWSALNQDNGFIEPNNFGTPDIICHKSAKPGGGHVTVRAGDKISIVWTPEWPESHVGPVIDYLAACNGDCETVDKTSLRFFKIDGAGYDAAAGRWAADALRANGNSWLVQIPADLKAGNYVLRHEIIALHGAANPNGAQAYPQCINIRVTGGGNNQPSGVPGTQLYKASDPGILFNPWVANPQYPVPGPALIPGAVSSIPQSRSTATATGTATRPGADTDPTGVPPVVTTTSAPAQVTTTTSSRTTSLPQITTTFATSTTPPPPAATQSKWGQCGGNGWTGPTVCAPGSSCNKLNDWYSQCI

其中，该酶包括354个氨基酸和一个终止密码子，N-端20个氨基酸为信号肽，因此，成熟的纤维素酶CelH61的理论分子量为34.9kDa

本发明的CelH61同时具有好的热稳定性，常温下，在中性和碱性的范围内均具有高活性。本发明的纤维素酶，其最适pH值为7.0，在pH4.0～10.0的范围内维持50%以上的酶活性；最适温度为70℃，在60℃和70℃具有良好的热稳定性。

本发明提供了编码上述耐热中性纤维素酶的基因celH61。具体地，该基因的序列如SEQ ID NO.2所示：

atggctcccaagacctcgacgttccttgcctccctcacgggcgccgccctcgtggccgcccacggccatgtcagccacatcattgtcaatggcgtccagtaccggaactacgaccccaccaccgacttctacagcggcaaccctccgaccgtgatcggctggtcggccctcaaccaggacaacggcttcatcgagcccaacaacttcggcacccccgacatcatctgccataagtcggccaagcccggcggcggccacgtcacggtgagggccggtgacaagatcagcatcgtctggacccccgagtggcccgagtcgcacgtcggccccgtcatcgactaccttgccgcgtgcaacggcgactgcgagacggtcgacaagacctccctccgcttcttcaagatcgacggcgccggctacgacgccgcggccggccgctgggccgccgacgctctgcgcgccaacggcaactcgtggcttgtgcagatccccgccgacctcaaggccggcaactacgtgcttcggcacgagatcatcgccctgcacggcgccgccaaccccaacggcgcccaggcctacccgcagtgcatcaacatccgcgtcaccggcggcggcaacaaccagccctcgggcgtccccggcacccagctctacaaggcctcggacccgggcatcctcttcaacccctgggtcgccaaccctcagtaccccgtcccgggcccggccctcatccccggcgccgtgagctccatccctcagagccgctcgaccgccaccgccacgggcaccgccacccgccccggcgccgacacggacccgacgggcgtccctcccgtcgtcaccaccacttctgccccggctcaggtgaccaccaccaccagcagccgcaccacctccctccctcagatcaccaccaccttcgcgaccagcaccaccccgccgcccccggccgctacccagagcaagtggggccagtgcggcggcaacggctggaccggcccgaccgtctgcgcgccgggctcgagctgcaacaagctcaacgactggtactcgcagtgcatctaa

本发明通过RT-PCR的方法分离克隆了中性纤维素酶基因CelH61，发现其没有内含子，cDNA全序列分析结果表明，中性纤维素酶CelH61的结构基因CelH61全长1065bp。成熟蛋白理论分子量为34.9kDa，将纤维素酶基因CelH61序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Myceliophthorathermophila ATCC42464的假设的glycoside hydrolase family61protein氨基酸序列一致性为72%。其包含一个61家族的催化域，富含P、T的连接区，以及一个纤维素结合结构域CBM1，说明CelH61是一种新的纤维素酶。

本发明还提供了包含上述中性纤维素酶基因celH61的重组载体，命名为pPIC-celH61。将本发明的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的纤维素酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-celH61。

本发明还提供了包含上述耐热中性纤维素酶基因celH61的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/celH61。

本发明还提供了一种制备耐热中性纤维素酶CelH61的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；

3)回收并纯化所表达的纤维素酶CelH61。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/celH61。

本发明还提供了上述耐热中性纤维素酶CelH61的应用，例如用于水解木质纤维素。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、具有木质纤维素降解增效作用并适合于在能源工业中应用新的纤维素酶。本发明的纤维素酶最适pH为7.0，在pH4.0～10.0都有较高的酶活性。其耐热特性，可使其在需求耐热环境的工业生产上应用。因此，本纤维素酶可应用于能源工业，纤维物质转化为可发酵糖的过程。

附图说明

图1重组纤维素酶CelH61的最适pH。

图2重组纤维素酶CelH61的pH稳定性。

图3重组纤维素酶CelH61的最适温度。

图4重组纤维素酶CelH61的热稳定性。

图5重组纤维素酶CelH61与其他纤维素酶协同作用

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从腐质霉(Humicola sp.L8)中分离得到一种新的中性纤维素酶CelH61。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

（1）Phialophora sp.培养基为马铃薯培养基：1000mL200g土豆煮汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH5.0。

（2）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。

（3）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin，1%甘油(V/V)。

（4）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1腐质霉Humicola sp.L8纤维素酶编码基因CelH61的克隆

提取Humicola sp.L8基因组DNA：

根据第61家族纤维素酶基因的保守(VAAHGH和GNYVLRH)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1:5'-GTCGCNGCNCAYGGNCA-3'；

P2:5'-RTGNCKNARNACRTARTTNCC-3')。

以Humicola sp.L8总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，40℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约477bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送博迈德公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1、usp2、usp3(上游特异性引物)、dsp1、dsp2、dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.纤维素酶CelH61TAIL-PCR特异性引物

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送博迈德公司测序。拼接后CelH61纤维素酶基因全长1065bp，编码354个氨基酸和一个终止密码子，前段20个氨基酸为信号肽序列，无内含子，所编码的成熟蛋白的理论分子量为34.9kDa。

实施例2重组纤维素酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码纤维素酶的基因才、celH61双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟纤维素酶的基因片段（不包含信号肽序列）与表达载体pPIC9连接，获得含有Humicola sp.L8纤维素酶基因celH61的重组质粒pPIC-celH61并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/celH61。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定微晶纤维素酶的活力。重组纤维素酶的表达量为0.8U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组纤维素酶在毕赤酵母中得到了表达。重组纤维素酶的比活为8.6U/mg。

同样方法构建含信号肽的纤维素酶的基因，也检测到了重组纤维素酶的活性。

实施例3重组纤维素酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH7.0，70℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL微晶纤维素（Avicel），反应30min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例4重组纤维素酶CelH61的性质测定

1、重组纤维素酶CelH61的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例2纯化的重组纤维素酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物Avicel用不同pH的0.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中70℃下进行纤维素酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶CelH61的最适pH为7.0，在pH4.0～10.0有50%以上的相对酶活性。纤维素酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH7.0缓冲液体系中70℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。在pH4.0～11.0，处理后酶活保持基本不变，有很好的稳定性（图2）。

2、纤维素酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

纤维素酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为70℃。耐温性测定为纤维素酶在不同温度下处理不同时间，再在70℃下进行酶活性测定。酶的热稳定性性试验表明(图4)，CelH61有良好的热稳定性，在65℃下温育1h，酶活保持不变，70℃时其半衰期为20min。

3、不同金属离子化学试剂对CelH61酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在65℃、pH7.0条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂对重组纤维素酶的活力没有明显变化。但是Ag⁺、Hg²⁺几乎可以完全抑制其活力，而SDS，EDTA也强烈抑制其活力，Cu²⁺能提高酶的活力。

4、重组纤维素酶CelH61与纤维素酶系的协同作用

纤维素转化分析体系为25g/L微晶纤维素（Avicel）和玉米秸秆溶解到50mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)中，50℃下反应3天。其中加入每g纤维素中加入50mg CelH61,10mg纤维二糖水解酶（HiCDH）（Cellobiose dehydrogenases fromHumicola insolens strain DSM1800,GenBank accession number:AF257654），50mg混合纤维酶CelMix（Celluclast Plus，Novozymes）。水解产物利用HPLC进行分析。结果发现（图5），单独添加CelH61和HiCDH并不能对微晶纤维素进行高效水解，但添加少量CelH61和HiCDH，在与复合纤维素酶系协同作用，能有效提高纤维素酶降解微晶纤维素和玉米秸秆能力，并且随着时间的延长其水解效果更明显。说明该酶能是纤维素酶系中一个具有重要增效作用的新一类纤维素酶。

Claims (10)

1.一种耐热中性纤维素酶CelH61，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

2.一种耐热中性纤维素酶基因celH61，其特征在于，编码权利要求1所述的耐热中性纤维素酶CelH61。 

3.根据权利要求2所述的耐热中性纤维素酶基因celH61，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。 

4.包含权利要求2所述耐热中性纤维素酶基因celH61的重组载体。 

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为载体pPIC-CelH61，将权利要求2所述的耐热中性纤维素酶基因celH61插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该基因位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组载体pPIC-CelH61。 

6.包含权利要求2所述耐热中性纤维素酶基因celH61的重组菌株。 

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

8.一种制备权利要求1所述耐热中性纤维素酶CelH61的方法，其特征在于，包括以下步骤： 

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达； 

3)回收并纯化所表达的纤维素酶CelH61。 

9.权利要求1所述耐热中性纤维素酶CelH61在造纸、酿造、纺织、饲料、以及生物能源领域的应用。 

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述耐热中性纤维素酶CelH61与纤维二糖水解酶共同使用。