CN105018444A - 一种腐质霉来源的高温酸性β-葡萄糖苷酶HiBgl3C及其基因和应用 - Google Patents
一种腐质霉来源的高温酸性β-葡萄糖苷酶HiBgl3C及其基因和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新颖的特异腐质霉来源的高温酸性β-葡萄糖苷酶HiBgl3C及其基因和应用。本发明提供了一种新的高温酸性β-葡萄糖苷酶HiBgl3C，其具有如SEQ？ID？NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述高温中性β-葡萄糖苷酶HiBgl3A的基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明所提供的来源于特异腐质霉的高温酸性β-葡萄糖苷酶HiBgl3C，最适温度为60℃，最适pH为5.5，且pH稳定性较好，可耐受碱性环境；对大多数化学试剂、金属离子和葡萄糖都具备较好的耐受性，具备可观的在洗涤剂、生物乙醇等多种行业的复杂环境下的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种腐质霉来源的高温酸性β-葡萄糖苷酶HiBgl3C及其基因和应用。
背景技术
纤维素是多个葡萄糖残基以β-1,4-糖苷键连接而成的多聚物，其基本重复单位为纤维二糖。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有重要意义。纤维素可通过纤维素酶的作用降解为葡萄糖，后者可作为重要的工业原料来生产酒精、丙酮等化工产品。纤维素酶是能将纤维素降解为葡萄糖的三类酶的总称，即内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，又称纤维二糖水解酶cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)。这三种酶协同作用能够将纤维素转化成葡萄糖。
β-葡萄糖苷酶的分布较为广泛，特别是植物的种子和微生物中尤为普遍。对微生物中的β-葡萄糖苷酶的研究主要在丝状真菌、酵母、细菌、链霉菌等。β-葡萄糖苷酶在生物技术应用和生物转化方面也有很重要的应用，在纤维素水解为还原糖的过程中，依靠内切纤维素酶、外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的协同作用，然而β-葡萄糖苷酶最终把纤维二糖解离成单个的葡萄糖分子,是整个纤维素降解过程的限速步骤，β-葡萄糖苷酶活力较低就会造成纤维二糖的大量积累，积累的纤维二糖对纤维素内切和外切酶有很强烈的抑制作用，所以β-葡萄糖苷酶其性质和酶活力的高低在纤维素水解的过程中决定着总体酶活力。
现有微生物来源的β-葡萄糖苷酶pI值大多在酸性范围内，最适的pH值一般在3.5～5.5之间，可适用于较多酸性水解过程，但不能满足部分如洗涤剂、造纸和纺织工业等的中碱性水解过程的应用需求。本发明所提供的来源于特异腐质霉的高温酸性β-葡萄糖苷酶HiBgl3C，最适温度为60℃，最适pH为5.5，且pH稳定性较好，可耐受碱性环境；对大多数化学试剂、金属离子和葡萄糖都具备较好的耐受性，具备可观的在洗涤剂、生物乙醇等多种行业的复杂环境下的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的高温酸性β-葡萄糖苷酶。
本发明的再一目的是提供编码上述β-葡萄糖苷酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述β-葡萄糖苷酶的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述β-葡萄糖苷酶的应用。
本发明从腐质霉中分离得到一种新的高温酸性β-葡萄糖苷酶HiBgl3C，其氨基碱序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MGIFGLALLAAAAIARAAPNCPVVPRQASGTAAWDTAYASARAAVARLSQQDKINIVTGIGWERGPCVGNTAPVNSIGYPQLCLQDGPLGIRFATGTTAFTPGVQAASTWDVDLIRQRGEYLGAEARAVGVHVLLGPVAGALGKIPHGGRNWEGFGSDPYLAGICMAETIEAIQSQGVQACAKHYIVNEQEWMRETMSSNVDDRTMHEIYLWPFADAAHSNVASFMCSYNKINGTWACESDSVQNKLLKQELGFRGYIMSDWNAQHTTVGSANSGMDMTMPGTDFSGGNVLWGPQLNNAVNSGQVSRARLDDMATRILAAWYLVGQDKGYPQVNLRLNVQGNHKENVRAVARDGIVLLRNEGNILPLGRPSRIAVVGSGAVIGRHAQNGCQDKGCNDGALGMGWGSGSVNYPYFVAPYDAIRERASRDGTQVSLHSSDNTNGVQNVVQGADVAIVFITADSGEGYITVEGHPGDRNHLDPWHNGNQLVQAVAAANKNTIVVVHSTGPIILETILNTPGVRAVVWAGLPSQENGNAIVDILYGSTSPSGKLVYTIAKRPEDYGVSIVRGDDNFREGVFVDYRWFDQNNIEPRFEFGFGLSYTNFSYSGLSITSNARAGPATGPTIPGGPADLWETVATVTAQITNTGGVAGAEVAQLYLTLPPTAPPAGPRQLRGFTKLKLQPGQTGTATFKLRKRDLSYWDVGRQQWVVPSGRFTISVGASSRDIRLTGSIDV
其中，该酶包括734个氨基酸，N端17个氨基酸为其预测的信号肽序列“MGIFGLALLAAAAIARA”(SEQ ID NO.3)。
因此，成熟的β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的理论分子量为78.4kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
APNCPVVPRQASGTAAWDTAYASARAAVARLSQQDKINIVTGIGWERGPCVGNTAPVNSIGYPQLCLQDGPLGIRFATGTTAFTPGVQAASTWDVDLIRQRGEYLGAEARAVGVHVLLGPVAGALGKIPHGGRNWEGFGSDPYLAGICMAETIEAIQSQGVQACAKHYIVNEQEWMRETMSSNVDDRTMHEIYLWPFADAAHSNVASFMCSYNKINGTWACESDSVQNKLLKQELGFRGYIMSDWNAQHTTVGSANSGMDMTMPGTDFSGGNVLWGPQLNNAVNSGQVSRARLDDMATRILAAWYLVGQDKGYPQVNLRLNVQGNHKENVRAVARDGIVLLRNEGNILPLGRPSRIAVVGSGAVIGRHAQNGCQDKGCNDGALGMGWGSGSVNYPYFVAPYDAIRERASRDGTQVSLHSSDNTNGVQNVVQGADVAIVFITADSGEGYITVEGHPGDRNHLDPWHNGNQLVQAVAAANKNTIVVVHSTGPIILETILNTPGVRAVVWAGLPSQENGNAIVDILYGSTSPSGKLVYTIAKRPEDYGVSIVRGDDNFREGVFVDYRWFDQNNIEPRFEFGFGLSYTNFSYSGLSITSNARAGPATGPTIPGGPADLWETVATVTAQITNTGGVAGAEVAQLYLTLPPTAPPAGPRQLRGFTKLKLQPGQTGTATFKLRKRDLSYWDVGRQQWVVPSGRFTISVGASSRDIRLTGSIDV
本发明提供了编码上述β-葡萄糖苷酶基因Hibgl3C。具体地，该基因的DNA序列如SEQ ID NO.4所示：
atgggtatcttcggtctcgcattgctggccgccgcggccattgcccgggccgcgcctaactgccctgtggtgccccgccaggcatcgggcaccgctgcttgggatacggcgtacgcctcggccagagccgccgtggcccggctttcccagcaggacaagatcaacattgtcaccggtatcggttgggagaggggcccttgcgtcggcaacacggcgcccgtcaactccatcggctatcctcagctctgcctccaggacggtcccttgggtattcgcttcgccacgggcacgaccgcttttacccccggtgttcaggcggcgtccacctgggatgttgacctgatccgccagcgtggtgagtacctgggcgcagaggctcgtgctgtcggtgttcacgtgctgctgggtcctgtggccggcgccctcggcaagattcctcatggtggacgcaactgggagggtttcggctcggacccgtacctcgcgggtatctgcatggctgagaccatcgaggccattcagtcccagggtgtccaggcctgcgccaagcactacattgtcaacgagcaggagtggatgcgtgagacgatgagcagcaatgtcgacgaccgcaccatgcacgagatttacctgtggcccttcgccgatgccgctcactccaacgtggccagcttcatgtgcagctacaacaagatcaacggcacctgggcctgcgagagcgacagcgtccagaacaagcttcttaagcaggagctcggcttccgcggctacatcatgagcgactggaacgcccagcacaccaccgtcggctccgccaacagcggcatggacatgaccatgcccggcaccgacttcagcggcggcaacgtgctctggggcccgcagctcaacaatgccgtcaactcgggccaggtttcgcgcgcccgtctcgacgacatggccacccgcatcctcgccgcctggtacctggtcggccaggacaagggctacccgcaggtcaacctccgcctcaacgtccagggcaaccataaggagaacgtgcgcgctgtggctcgcgacggcatcgttctgctccgcaacgagggcaacatcctcccgctcggccgcccgtctcgcatcgcagtcgtcggctctggtgccgtcatcggccgccacgcccagaacggctgccaggacaagggctgcaacgacggtgccctcggcatgggctggggctccggttccgtcaactacccctacttcgtcgccccctatgacgccatccgcgagcgcgccagccgcgatggcacccaggtttctctccacagctccgacaacaccaacggcgtccagaacgttgtccagggcgccgacgtcgccatcgtcttcatcacggccgactcgggcgagggttacatcaccgtcgagggccaccccggcgaccgcaaccacctcgacccctggcacaacggcaaccagctcgtgcaggcggtggccgcggccaacaagaacaccatcgtcgtggtgcacagcacgggccccatcatcctcgagaccatcctcaacacgcccggcgtccgcgctgtcgtctgggccggtctgcccagccaggagaacggcaacgccattgtggatatcctctacggctcgacctcgccgtcgggtaagctcgtgtacaccatcgccaagcgccctgaggattacggcgtcagcatcgttcgcggcgatgacaacttccgtgagggcgtgtttgtggactaccgctggttcgaccagaacaacatcgagccgcgcttcgagttcggcttcggcttgtgtacgtcattaacttaatttccttttaccctgaaacgtacgtattactgacgcattcttcttccagcctacaccaacttcagctactccggcctctccatcacctccaacgcgcgcgccggcccggccacgggcccaaccatccccggcggccccgccgacctgtgggagacggtcgccaccgtcaccgcccagatcaccaacacgggcggcgtcgccggcgccgaggtcgcccagctctacctcaccctgccgccgactgccccgcccgccggcccgcgtcagctccgcggcttcaccaagctcaagctccagcccggccagaccggcacggccacgttcaagctccgcaagagggatctcagctactgggatgtcggccggcagcagtgggttgtcccttcgggcaggtttacgattagtgtcggtgctagctcgagggatattcggttgacgggcagcattgatgtttga
本发明基于PCR的方法分离克隆了β-葡萄糖苷酶基因Hibgl3C，DNA全序列分析结果表明，去除内含子后的β-葡萄糖苷酶基因Hibgl3C cDNA全长2202bp。其中，信号肽的碱基序列为：
atgggtatcttcggtctcgcattgctggccgccgcggccattgcccgggcc(SEQ ID NO.6)。
成熟的β-葡萄糖苷酶基因HiBgl3C的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.5
gcgcctaactgccctgtggtgccccgccaggcatcgggcaccgctgcttgggatacggcgtacgcctcggccagagccgccgtggcccggctttcccagcaggacaagatcaacattgtcaccggtatcggttgggagaggggcccttgcgtcggcaacacggcgcccgtcaactccatcggctatcctcagctctgcctccaggacggtcccttgggtattcgcttcgccacgggcacgaccgcttttacccccggtgttcaggcggcgtccacctgggatgttgacctgatccgccagcgtggtgagtacctgggcgcagaggctcgtgctgtcggtgttcacgtgctgctgggtcctgtggccggcgccctcggcaagattcctcatggtggacgcaactgggagggtttcggctcggacccgtacctcgcgggtatctgcatggctgagaccatcgaggccattcagtcccagggtgtccaggcctgcgccaagcactacattgtcaacgagcaggagtggatgcgtgagacgatgagcagcaatgtcgacgaccgcaccatgcacgagatttacctgtggcccttcgccgatgccgctcactccaacgtggccagcttcatgtgcagctacaacaagatcaacggcacctgggcctgcgagagcgacagcgtccagaacaagcttcttaagcaggagctcggcttccgcggctacatcatgagcgactggaacgcccagcacaccaccgtcggctccgccaacagcggcatggacatgaccatgcccggcaccgacttcagcggcggcaacgtgctctggggcccgcagctcaacaatgccgtcaactcgggccaggtttcgcgcgcccgtctcgacgacatggccacccgcatcctcgccgcctggtacctggtcggccaggacaagggctacccgcaggtcaacctccgcctcaacgtccagggcaaccataaggagaacgtgcgcgctgtggctcgcgacggcatcgttctgctccgcaacgagggcaacatcctcccgctcggccgcccgtctcgcatcgcagtcgtcggctctggtgccgtcatcggccgccacgcccagaacggctgccaggacaagggctgcaacgacggtgccctcggcatgggctggggctccggttccgtcaactacccctacttcgtcgccccctatgacgccatccgcgagcgcgccagccgcgatggcacccaggtttctctccacagctccgacaacaccaacggcgtccagaacgttgtccagggcgccgacgtcgccatcgtcttcatcacggccgactcgggcgagggttacatcaccgtcgagggccaccccggcgaccgcaaccacctcgacccctggcacaacggcaaccagctcgtgcaggcggtggccgcggccaacaagaacaccatcgtcgtggtgcacagcacgggccccatcatcctcgagaccatcctcaacacgcccggcgtccgcgctgtcgtctgggccggtctgcccagccaggagaacggcaacgccattgtggatatcctctacggctcgacctcgccgtcgggtaagctcgtgtacaccatcgccaagcgccctgaggattacggcgtcagcatcgttcgcggcgatgacaacttccgtgagggcgtgtttgtggactaccgctggttcgaccagaacaacatcgagccgcgcttcgagttcggcttcggcttgtcctacaccaacttcagctactccggcctctccatcacctccaacgcgcgcgccggcccggccacgggcccaaccatccccggcggccccgccgacctgtgggagacggtcgccaccgtcaccgcccagatcaccaacacgggcggcgtcgccggcgccgaggtcgcccagctctacctcaccctgccgccgactgccccgcccgccggcccgcgtcagctccgcggcttcaccaagctcaagctccagcccggccagaccggcacggccacgttcaagctccgcaagagggatctcagctactgggatgtcggccggcagcagtgggttgtcccttcgggcaggtttacgattagtgtcggtgctagctcgagggatattcggttgacgggcagcattgatgtttga
成熟蛋白理论分子量为78.4kDa，将β-葡萄糖苷酶基因Hibgl3C成熟编码序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，确定HiBgl3C是一种新的β-葡萄糖苷酶。
本发明提供了包含上述β-葡萄糖苷酶基因Hibgl3C的重组载体，选为pPIC-Hibgl3C。将本发明的β-葡萄糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的β-葡萄糖苷酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Hibgl3C。
本发明还提供了包含上述β-葡萄糖苷酶基因Hibgl3C的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌，优选为重组菌株Hibgl3C。
本发明还提供了一种制备β-葡萄糖苷酶基因HiBgl3C的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组β-葡萄糖苷酶基因HiBgl3C表达；
3)回收并纯化所表达的β-葡萄糖苷酶基因HiBgl3C。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/Hibgl3C。
本发明还提供了上述β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的应用。
附图说明
图1β-葡萄糖苷酶的最适pH。
图2重组β-葡萄糖苷酶的pH稳定性。
图3重组β-葡萄糖苷酶的最适温度。
图4重组β-葡萄糖苷酶的热稳定性。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：本发明从腐质霉(Humicola insolens Y1 CGMCC 4573)中分离得到一种新的β-葡萄糖苷酶HiBgl3C。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。桦木木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)腐质霉(Humicola insolens Y1 CGMCC 4573)培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH自然。
(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH自然)。
(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。
(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH自然。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1腐质霉(Humicola insolens Y1 CGMCC 4573)β-葡萄糖苷酶编码基因bgl3C的克隆
根据H.insolens基因组测序序列，设计基因特异性引物：
PF:GGGACTAGTATGGGTATCTTCGGTCTCGC
PR:GGGGCGGCCGCTCAAACATCAATGCTGCCCGTC
提取腐质霉Humicola insolens Y1 CGMCC 4573RNA，反转录得到cDNA。以Humicola insolens Y1 CGMCC 4573cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min30s，35个循环后72℃保温10min。得到一约2200bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送睿博兴科生物技术有限公司测序。
测序结果为β-葡萄糖苷酶基因Hibgl3C基因2151bp(去除信号肽)，编码717个氨基酸和一个终止密码子。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为78.4kDa。
实施例2重组木聚糖酶的制备
将表达载体pPIC9进行双酶切(Spe I+Not I)，同时将编码β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的基因bgl3C双酶切(Spe I+Not I)，切出编码成熟β-葡萄糖苷酶的基因片段(不包含信号肽序列)与表达载体pPIC9连接，获得含有腐质霉β-葡萄糖苷酶基因Hibgl3C的重组质粒pPIC-Hibgl3C并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/Hibgl3C。
以同样的方法构建包含完整基因的重组毕赤酵母菌株。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导48h后，离心收集上清。测定β-葡萄糖苷酶的活力。SDS-PAGE结果表明，重组β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中得到了表达。
实施例3重组β-葡萄糖苷酶的活性分析
β-葡萄糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pNPG所生成的产物对硝基苯酚(pNP)的量。
反应步骤：125μl 2mM pNPG底物与125μl缓冲液混匀，加入250μl适当稀释的酶液，于60℃反应10min，加入1.5mL 1M的Na2CO3终止反应，使用分光光度计测定OD405值。
酶活单位的定义：1个β-葡萄糖苷酶活性单位(U)定义为在给定反应条件下，每分钟分解底物pNPG生成1μmol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量。
实施例4重组β-葡萄糖苷酶的性质测定
测定实施例2获得重组β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的性质
1、重组β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
将实施例2纯化的重组β-葡萄糖苷酶HiBgl3C在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物pNPG用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中60℃下进行β-葡萄糖苷酶活力测定。结果(图1)表明，β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的最适pH为5.5。β-葡萄糖苷酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH6.0缓冲液体系中60℃下测定酶活性，以研究酶的pH稳定性。结果(图2)表明β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的pH耐受性。
2、β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的最适温度及热稳定性测定方法如下：
β-葡萄糖苷酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为β-葡萄糖苷酶在不同温度下处理不同时间，再在最适温度下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为60℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，β-葡萄糖苷酶HiBgl3C在50℃下保持相对稳定，温育1h后能保留最大酶活力90％以上的酶活。
3、β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的酶动力学测定方法如下：
用不同浓度的pNPG和纤维二糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系中，60℃下测定酶活性，计算出其在60℃下的Km值。经测定，以pNPG为底物时的Km值为0.20mM，最大反应速度Vmax为244.6μmol/min·mg；以纤维二糖为底物时的Km值为6.64mM，最大反应速度Vmax为119μmol/min·mg。
4、不同金属离子化学试剂对β-葡萄糖苷酶HiBgl3C酶活的影响测定如下：
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为5mmol/L。在50℃、pH6.0条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂对重组β-葡萄糖苷酶的活力没有影响或有一定的促进作用，但SDS部分抑制其酶活力，分别表现出最适条件下48％的酶活力，说明其对SDS具有一定的耐受性，可用于洗涤剂制备中。Ag+使该酶几乎完全失活。
5、重组β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的底物特异性
对多种多糖、天然糖苷和合成物pNPG等底物，在最适条件下测定酶活力，研究β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的底物特异性，结果如表1所示。HiBgl3C表现出对槐糖和异黄酮类大豆苷具有高水解活性，对其他天然糖苷也有较好的活性，应用范围较广。
表1.β-葡萄糖苷酶HiBgl3C底物特异性分析
Claims (8)
1.高温中性β-葡萄糖苷酶HiBgl3C，其特征在于，其氨基碱序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.高温酸性β-葡萄糖苷酶的基因Hibgl3C，其特征在于，编码权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶HiBgl3C。
3.如权利要求2所述的高温酸性β-葡萄糖苷酶的基因Hibgl3C，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
4.包含权利要求2所述高温酸性β-葡萄糖苷酶的基因Hibgl3C的重组载体。
5.包含权利要求2所述高温酸性β-葡萄糖苷酶的基因Hibgl3C的重组载体pPIC-Hibgl3C。
6.包含权利要求2所述高温酸性β-葡萄糖苷酶的基因Hibgl3C的重组菌株。
7.一种制备重组β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组β-葡萄糖苷酶HiBgl3C表达；
3)回收并纯化所表达的β-葡萄糖苷酶HiBgl3C。
8.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶HiBgl3C的应用。
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| CN114752582B (zh) * | 2022-03-24 | 2023-08-08 | 天津科技大学 | 一种葡萄糖耐受性提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105018444B (zh) | 2018-11-27 |
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