CN103343112B - 一种高温碱性木聚糖酶xyn11a及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温碱性木聚糖酶XYN11A及其基因和应用。所述木聚糖酶XYN11A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示，且本发明还提供了编码上述高温碱性木聚糖酶XYN11A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的木聚糖酶最适pH7.0，并在pH5.5-8.5范围内具有75%以上的酶活力，在pH4.0-12.0具有很好的pH稳定性；最适温度60℃。本发明的木聚糖酶XYN11A可有效降解各种不同类型的木聚糖，对纤维素类无降解作用。最为一种新型酶制剂，将在造纸、纺织工业中的应用显示出其巨大的潜力及商业价值。

Description

一种高温碱性木聚糖酶XYN11A及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温碱性木聚糖酶XYN11A及其基因和应用。

背景技术

天然的木质纤维素类生物质主要包括纤维素、半纤维素和木质素，其结构异常复杂。其中，纤维素是主骨架，木质素与半纤维素分散在纤维素之中及其周围。纤维素是自然界中分布最广，含量最多，是由脱水吡喃葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而形成的无侧链的高分子聚合物。半纤维素含量次于纤维素，它是由五碳糖（木糖和阿拉伯糖）和六碳糖（主要是甘露糖，少量的葡萄糖和半乳糖）和糖醛酸形成的异源聚合物，主要是由木糖通过β-1，4糖苷键连接而成。木质素是由4种醇单体(对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇)形成的一种复杂酚类聚合物。

半纤维素作为植物细胞壁的主要组分，是陆生植物中继纤维素之后含量最丰富的碳水化合物，约占植物干重的35%。自然界中，木聚糖是半纤维素中的代表性组分，是含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖（Collins et al.FEMS MicrobiologyReviews.2005,29:3-23.）。根据氨基酸序列同源性，木聚糖酶主要归类于GH10、11、39、43、52、62和67家族（Henrissat B,Bairoch A.New families in the classification ofglycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities.Biochem J,1993,293:781-788.）。

在饲料工业应用方面，木聚糖酶可以作为饲料添加剂，将饲料中部分木聚糖水解，使得与其相连的纤维素等物质更容易被瘤胃消化，从而改善农作物清贮饲料级谷物饲料的营养价值。在造纸工业中，碱性木聚糖酶可应用于纸浆漂白，降低漂白过程中化学药品的消耗和漂白废液中有害成分的含量，有效减轻造纸工业对环境的污染。但是在当下，瓶颈问题在于木聚糖酶在纸浆预漂工艺中的应用受到了制浆过程中的强碱性及高温等因素的制约。在纺织工业中，碱性木聚糖酶被用于棉及其混纺的纤维的生物复合酶精炼加工，能有效地去除纺织印染产品上残留杂质，达到可靠的润湿性。在食品工业中，木聚糖酶与纤维素酶协同作用可有效降低果汁黏度，有效提高果汁口味。因此，开发新型的高温碱性木聚糖酶将对推动木聚糖酶在各种工业中应用。

所以，木聚糖酶在工业中有着极其广阔的应用前景。天然的木聚糖酶越来越被意识到难以满足工业生产的需求，因此性质优良的酶的异源表达成为获得工业用酶一种有效途径。已报到的真菌来源的木聚糖酶多数在酸性条件下稳定，而在超过pH10.0后几乎丧失其活力，不能适应造纸、纺织工业中的碱性环境。另外，细菌产的木聚糖酶虽能在碱性条件下有活力，但其表达量过低限制了其工业生产前景。因此在经济利益及可行性方面，开发新型的真菌来源的高温碱性木聚糖酶将对推动木聚糖酶在实际生产中的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种高温碱性木聚糖酶XYN11A。

本发明的再一目的是提供编码上述高温碱性木聚糖酶的基因xyn11A。

本发明的另一目的是提供包含上述高温碱性木聚糖酶基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述高温碱性木聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述高温碱性木聚糖酶方法。

本发明的另一目的是提供上述高温碱性木聚糖酶的应用。

本发明提供了一种高温碱性木聚糖酶XYN11A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MVSFTTLLTAVATAVSAVTASPLEALKRGIQPGTGVHDGYFYSFWTDGRGYVDFNNGPRGSYRVSWSNVNNWVGGKGWNPGPPRRIAYNGTWNNWNVNSYLALYGWTTNPLVEYYIVEAYGSYNPSSGAARLGTIEDDGGVYDIYRTRRINQPSIIGTASFDQYWSVRRQKRVGGTIDTGKHFDEWRRQGNLQLGAWNYMIMATEGYQSSGSAEIEVRSLD*

其中，该酶基因编码221个氨基酸，N端20个氨基酸为信号肽序列如SEQ ID NO.3所示：

MVSFTTLLTAVATAVSAVTA    20

因此，成熟的高温碱性木聚糖酶XYN11A的理论分子量为24.8kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

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本发明的木聚糖酶XYN11A同时具有优良的pH稳定性，而中温和高温范围内均具有高活性。本发明的木聚糖酶，其最适pH值为7.0，在pH5.5～8.5的范围内维持75%以上的酶活性；在pH4.0～12.0之间,酶活很稳定;最适温度为60℃。

本发明提供了编码上述高温碱性木聚糖酶基因xyn11A。具体地，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：

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本发明通过RT-PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因xyn11A，cDNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYN11A基因xyn11A全长666bp。其中，信号肽的碱基序列如SEQ ID NO.6所示：

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因此，成熟的木聚糖酶XYN11A的基因序列如SEQ ID NO.5所示：

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成熟蛋白理论分子量为24.8kDa，将木聚糖酶基因xyn11A序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，确定木聚糖酶基因xyn11A是一种新的木聚糖酶基因。

本发明还提供了包含上述高温碱性木聚糖酶基因xyn11A的重组载体，优选为pPIC9-xyn11A。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xyn11A。

本发明还提供了包含上述高温碱性木聚糖酶基因xyn11A的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组毕赤酵母菌株GS115/xyn11A。

本发明还提供了一种制备上述高温碱性木聚糖酶XYN11A的方法，包括以下步骤：

1）用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶XYN11A的表达；以及

3）回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN11A。

其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/xyn11A。

本发明还提供了上述高温碱性木聚糖酶XYN11A的应用，优选其在水解木聚糖及其在造纸、纺织工业中的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在造纸、纺织工业中应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适pH7.0，并在中性偏碱性范围内具有75%以上的酶活力；具有很好的pH稳定性，37℃下作用1h后，在pH4.0-12.0之间,剩余酶活性均在95%以上；最适温度60℃。此外，木聚糖酶XYN11A可有效降解各种不同类型的木聚糖，而不降解纤维素，可以有效降解漂白纸浆中的木聚糖部分而不影响纤维素。因此，本木聚糖酶将在造纸、纺织工业中的应用显示出其巨大的潜力。

附图说明

图1重组木聚糖酶的最适pH。

图2重组木聚糖酶的pH稳定性。

图3重组木聚糖酶的最适温度。

图4重组木聚糖酶的热稳定性。

图5重组木聚糖酶的SDS-PAGE图。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Promega公司。底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

（1）重组毕赤酵母菌培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH5.0。

（2）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。

（3）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin，1%甘油(V/V)。

（4）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1木聚糖酶编码基因Xyn11A的克隆

木聚糖酶基因xyn11A来源于腐殖霉。提取腐殖霉基因组DNA：

培养3天后将菌丝体高速离心后取入研钵中，液氮冻制研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，加入2mL CTAB提取液，70℃水浴锅裂解2h，每隔10min混匀一次,在4℃下12000rpm离心10min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于室温静置10min后，4℃下12000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入0.2mL TE溶解，置于-20℃备用。

由于本实验室将Humicola sp.S8菌株进行全基因测序，根据第十一家族木聚糖酶基因序列设计合成了表达引物P1，P2：

P1:5'-GGGGAATTCAGCCCGCTTGAGGCCCTC-3'；

P2:5'-GGGGCGGCCGCTTAATCCAGCGACC-3'。

以腐殖霉总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸60s，30个循环；72℃保温10min。得到一约600bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

测序结果显示XYN11A木聚糖酶基因全长666bp（SEQ ID NO.4），编码221个氨基酸（SEQ ID NO.1）和一个终止密码子。N端20个氨基酸为预测的信号肽（SEQID NO.3）。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为24.8kDa。

实施例2重组木聚糖酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将扩增到编码木聚糖酶的基因xyn11A（不含信号肽）双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有木聚糖酶基因xyn11A的重组质粒pPIC9-xyn11A并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/xyn11A。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清，测定木聚糖酶的活力。重组菌株GS115/xyn11A的重组木聚糖酶的表达量为206.5U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。重组木聚糖酶的比活为1275U/mg。

对于含信号肽的完整木聚糖酶进行同样的试验操作，也检测到重组木聚糖酶的酶活。

实施例3重组木聚糖酶的活性分析

纯化重组菌株GS115/XYN11A所产重组木聚糖酶，使用DNS法进行活性分析。

DNS法：具体方法如下：在pH7.0，60℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例4重组木聚糖酶XYN11A的性质测定

1、重组木聚糖酶XYN11A的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例3纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下测定其最适pH。桦木木聚糖在不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中37℃下进行酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶XYN11A的最适pH为7.0，在pH5.5-8.5有75%以上的相对酶活性。木聚糖酶在以上各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH7.0缓冲液体系中60℃下测定酶活性，以研究酶的pH稳定性。结果（图2）表明木聚糖酶在pH4.0-12.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在95%以上，这说明此酶在中性和碱性范围内具有很好的pH稳定性。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH7.0）缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果（图3）表明其最适温度为60℃。酶的热稳定性性试验表明（图4），XYN11A在60℃下温育1h，能保持原有的酶活性的40%。

3、木聚糖酶的K_m值测定方法如下：

以不同浓度的桦木木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH7.0）缓冲液体系中，60℃下测定酶活性，计算出其在60℃下的K_m值。经测定，K_m值为2.7mg/mL，最大反应速度V_max为2100μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对XYN11A酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入5mmol/L的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在60℃、pH7.0条件下测定酶活性。结果表明（表1），Cu²⁺、Cr³⁺、Ag⁺对酶活有部分抑制作用，SDS强烈抑制其活性，而Mn²⁺和巯基乙醇对酶活都有一定的促进作用，其它金属离子和EDTA对酶活的影响不大。

表1.各种化学试剂及离子的对木聚糖酶XYN11A的影响

5、重组木聚糖酶的底物特异性

该酶除可作用于桦木木聚糖外，对于榉木木聚糖、可溶性小麦阿拉伯木聚糖也有较高的降解作用（表2），但该酶不降解纤维素钠。其桦木木聚糖降解产物主要为木糖、木二糖、木三糖和其他寡糖。

表2.木聚糖酶XYN11A底物特异性

Claims (9)

1.一种高温碱性木聚糖酶XYN11A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。 

2.一种高温碱性木聚糖酶基因xyn11A，其特征在于，编码权利要求1所述的高温碱性木聚糖酶XYN11A。 

3.根据权利要求2所述的高温碱性木聚糖酶基因xyn11A，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示。 

4.包含权利要求2或3所述高温碱性木聚糖酶基因xyn11A的重组载体。 

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-xyn11A，将权利要求2所述的高温碱性木聚糖酶基因xyn11A插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xyn11A。 

6.包含权利要求2或3所述高温碱性木聚糖酶基因xyn11A的重组菌株。 

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。 

8.一种制备高温碱性木聚糖酶XYN11A的方法，其特征在于，包括以下步骤： 

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶XYN11A的表达；以及 

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN11A。 

9.权利要求1所述高温碱性木聚糖酶XYN11A用于水解木聚糖的应用。