WO2011010792A2 - 알칼리성 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 에스피. 에이치피엘-002 균주, 이로부터 분리한 신규 자일라나아제 효소 및 이의 생산 방법 - Google Patents

알칼리성 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 에스피. 에이치피엘-002 균주, 이로부터 분리한 신규 자일라나아제 효소 및 이의 생산 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel strain of genus Penibacillus that produces alkaline novel xylanase.
  • biomass is the only carbon resource, so if the related technology (biorefinery) is developed, the biomass industry will replace existing petrochemical products and have a huge ripple effect on daily life and industry. If the products that can be produced using biorefinery technology are classified by characteristics, there are four types of biofuels, alternative raw materials, special functional materials, and biopolymers. It will produce industrial products that are inseparable from our daily lives.
  • the future market economic structure will be defined as biomass resources, conversion technology, and related market demand, and comprehensive development such as development of suitable resources, development of pretreatment technology, development of saccharification and fermentation system for stable development and utilization of biomass technology. Development of biorefinery technology will be essential.
  • the pretreatment methods that are being promoted worldwide include weak acid treatment, ammonia treatment, and lime treatment, and there are advantages and disadvantages for each treatment method. Therefore, it is required to develop the follow-up treatment method according to the pretreatment methods. It is difficult to establish a standard for pretreatment of biomass and standardize subsequent subsequent treatment methods because it is not possible to continuously secure a sufficient amount of biomass. Therefore, it is absolutely necessary to develop subsequent biorefinery technologies utilizing cellulose (glucan) and hemicellulose (xylan) that are separated after production by pretreatment. Since the development of glycosylase and strain for the conversion of fibrin-based biomass is a key source technology for using biomass as an effective chemical resource, it is typically a strain for mass production of saccharase of cellulose (38%) and hemicellulose (28%).
  • xylan contained in woody materials is produced as a by-product.
  • hydrolysis of xylan is mainly done by chemical methods.
  • the chemical decomposition method of xylan is a method of adding sulfuric acid to the fibrous biomass and decomposing by steam pressurization at 130 ° C., which requires an expensive device that not only consumes a large amount of energy but also withstands acid and high temperature.
  • the production cost is increased due to the disposal cost of the waste generated at this time.
  • xylan decomposing by biological methods using xylanase is economically advantageous because it consumes less energy and generates less waste compared to chemically decomposing methods, and is easy to process.
  • the problem of this enzyme system is that the enzyme activity is low, the reaction rate and decomposition rate is low, and the characteristics of the known enzymes are often insufficient for industrial use.
  • industrial production of xylanase will require mass production. Therefore, it is necessary to develop a new xylanase enzyme system with high degradability.In order to industrialize, it is necessary to establish conditions under which the recombinant strain can produce a large amount of xylan degrading enzymes, and to design new reactor design and production technology using enzymes. need.
  • xylanase gene that maintains activity even under high temperature and pH conditions by searching for a new microorganism and enzyme system instead of existing xylanase. You will be able to solve the problem. Therefore, in the development of the saccharification process of cellulose using cellulase, the technology of using xylan must be made simultaneously.
  • the use of xylan is to produce xylose using xylanase, and in this process, it is important to efficiently extract xylan from woody raw materials and secure high titer xylanase mass production technology.
  • xylanase enzyme An enzyme that decomposes and xylates xylan, the main component of hemicellulose, is generally referred to as xylanase enzyme (Biely P, Trends in Biotechnology 3 (11): 286-290, 1985).
  • Trichoderma Trichoderma
  • their enzyme productivity represents the maximum activity at substantially dominant but mainly acidic conditions compared to the bacteria that produce xylene Rana dehydratase (Tenkanen et al. , Enzyme and Microbial Technology 14 (7): 566-574, 1992).
  • Bacteria producing xylene Rana dehydratase is the difficulty Pseudomonas (Aeromonas) genus Bacillus (Bacillus) genus, Clostridium (Clostridium) genus Streptomyces (Streptomyces), An asbestos spread loose (Apspergillus) variety belonging like in In addition, there are various characteristics of xylanase produced by bacteria, and various genes encoding these enzymes have been reported.
  • xylanase enzyme The domestic and foreign technical status of xylanase enzyme is the trichoderm a sp. C-4 strains were selected but higher activity is required for industrialization (Sul et al. , Appl Microbiol Biotechnol . 66 (1): 63-70, 2004).
  • Dr. Kang Myung-kyu's team at Donghae University produces Cephalosporium sp.
  • RYM-202 strains have been selected and studied for their use in pulp processing (Kang, Myung-kyu et al., Korean Journal of Environmental Biology 17 (2): 191-198, 1999).
  • Bacillus firmus a base resistant strain, has been isolated from wastewater generated after the pulp process (Pochih Chang, Biochemical and Biophysical Research Communications 319: 1017-1025, 2004).
  • This xylanase has a high activity in a wide range from pH4 to pH11, and has a high heat resistance to show a residual activity of about 70% of the initial activity even after 16 hours incubation at 62 °C.
  • various strains have been discovered in many countries around the world, and their functions have been improved through directional evolution.
  • patents related to xylanase as a feed additive include a patent for a novel Streptomyces genus JL-2 strain producing xylanase (Korean Patent Publication No. 2001-0111986), a signal sequence of Bacillus subtilis endo xylanase. Patent for a recombinant plasmid containing a gene and a method for producing a foreign protein using the same (Korean Patent Publication No. 2000-0034279), encoding xylanase of Bacillus sp. AMX-4 strain Patents related to the novel xylanase gene (Korean Patent Publication No. 2003-0085679) and the like.
  • the enzymatic glycosylation process using xylanase is characterized by the enzyme properties required according to the biomass pretreatment method.For biomass pretreatment using acid, acid-resistant glycosylase is required, but the current pulp and paper process or bio using alkali Alkali-resistant glycosylase is required in the saccharification process after mass pretreatment. In addition, heat resistance may be required for the simultaneous process of saccharification and fermentation.
  • commercialized xylanase is mostly suitable for acidic conditions, development of xylanase that is active under alkaline conditions is required. More preferably, the development of xylanase having high activity in both acidic and alkaline conditions is required.
  • the present inventors have developed a novel alkali which can be expanded domestically as well as in-house development in order to avoid or break down the intellectual property rights of the existing xylanase and all strains producing the same.
  • a xylanase producing strain and a xylanase produced therefrom are provided.
  • Another object of the present invention is to provide an alkaline xylanase produced from the strain, a gene encoding the same, an expression vector thereof, a transformant, and a novel xylanase production method using the same.
  • Another object of the present invention is to provide a xylan decomposition agent and a decomposition method.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for processing xylan in food.
  • Another object of the present invention is to provide a feed additive and a feed manufacturing method.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for a papermaking process.
  • the present invention provides a penivacillus sp. (Sp.) HPI-002 (HPL-002) strain (KCTC11410BP) having xylanase activity.
  • the present invention also provides an alkaline xylanase produced from the strain.
  • the present invention also provides a gene encoding the xylanase.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector operably linked to the gene.
  • the present invention also provides a transformant in which the recombinant expression vector is introduced into a host cell.
  • the present invention also provides a xylanase production method using the transformant.
  • the present invention also provides a xylan degrading agent comprising the xylanase produced by the strain, the transformant or the strain or transformant.
  • the present invention also provides a composition for processing xylan in a food comprising the xylanase.
  • the present invention also provides a feed additive comprising the xylanase.
  • the present invention provides a composition for a papermaking process comprising the xylanase.
  • the present invention provides a method for decomposing xylan comprising adding a xylanase produced by the strain, the transformant or the strain or transformant to a fibrin-based biomass or xylan-containing solution.
  • the present invention provides a method for producing a feed comprising the step of adding the strain, the transformant or the xylanase produced by the strain and the transformant to the fibrin-based biomass used as animal feed.
  • the present invention also provides a use of the strain, the transformant or the xylanase produced by the strain or the transformant in the preparation of a xylan degrading agent.
  • the present invention also provides a use of the xylanase in the preparation of a xylan processing composition in food.
  • the present invention also provides a use of the xylanase in the manufacture of a feed additive.
  • the present invention provides a use of the xylanase in the production of a papermaking process composition.
  • Penibacillus Paenibacillus sp. HPL-002 and xylanase isolated from it show excellent xylan decomposition activity over relatively wide range of temperature and alkaline pH conditions, so it can be used for glycosylation of fibrous biomass as well as feed oil, paper and detergent industry. It can be usefully used to produce raw materials, special functional materials, biopolymers and the like.
  • 2 is a diagram showing the results of screening for active clones from 1,152 gDNA libraries.
  • FIG. 3 is a diagram showing an ORF analysis and the results of each ORF homology analysis.
  • Figure 4 shows the activity after separation and purification of xylanase from the transformant.
  • 5 is an optimal pH graph of xylanase activity.
  • the present invention provides penicillus sp. Having alkaline xylanase activity.
  • HPL-002 strain (KCTC11410BP) is provided.
  • strains with excellent xylan degradability were selected from soil samples containing waste wood residues.
  • the selected strains were identified as gram positive bacilli, rod-shaped cells having a cell size of 1.1 ⁇ m and cell lengths of 2.5 ⁇ m to 4 ⁇ m, and lacking flagellar mobility (see FIG. 1).
  • the strain has a 16S rRNA as set forth in SEQ ID NO: 1, and is 96.4% homologous to the Pantoea agglomerans ZFJ-15 (GenBank Accession No. EU931554) strain and has a Paenibacillus sp.
  • WPCB158 (GenBank Accession No. FJ006910) was found to be 96.3% identical, but no more homology was found. Therefore, the strain of the present invention was identified as Paenibacillus sp. It was named HPL-002 and deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on November 5, 2008. The accession number is KCTC11410BP.
  • the present invention also provides an alkaline xylanase produced from the strain.
  • the xylanase of the present invention exhibits activity under alkaline conditions of pH 8.0-9.5, and generally exhibits activity at a wide temperature range of 40-60 ° C. Preferably it shows activity in alkaline conditions of pH 8.5-9.2, and shows activity at 45-55 degreeC which is generally a wide temperature range. Most preferably it exhibits maximum activity at alkaline conditions of pH 9.0 and maximum activity at 50 ° C.
  • the amino acid sequence of the xylanase of the present invention comprises any of the following sequences: a) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; b) an amino acid sequence having at least 95% homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; c) an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3; d) an amino acid of a protein that is functionally identical to a protein comprising one or more amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, wherein said amino acid sequence is substituted, deleted, inserted, and / or added, and comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; order; And e) an amino acid sequence encoded by the DNA hybridizing under stringent conditions with the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3, wherein the amino acid sequence of the protein is functionally identical to the protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • Such stringent conditions are determined upon cleaning after hybridization.
  • One of the stringent conditions is 15 minutes with 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS at room temperature, 30 minutes with 2 ⁇ SSC, 0.5% SDS at 45 ° C, 30 minutes with 0.2 ⁇ SSC, 0.5% SDS at 50 ° C. Repeat the wash twice. More preferred stringent conditions are to use higher temperatures. The other part of the stringent conditions are carried out in the same manner, but the last two 30 minutes are washed with 0.2 ⁇ SSC, 0.5% SDS at 60 ° C.
  • Another stringent condition is to wash the last two times at 65 ° C. with 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS under these stringent conditions. Those skilled in the art can clearly set these conditions in order to obtain the stringent conditions required.
  • the present inventors have described the penivacillus sp.
  • a gDNA library of a penibacilli strain was prepared and then tested for xylanase activity.
  • One clone was selected through the above experiment (see FIG. 2), and the nucleotide sequence of the inserted fragment DNA was analyzed.
  • the DNA fragment size was 4,180 bp (SEQ ID NO: 2), and included seven ORFs in the range of 100 or more amino acids (see FIG. 3).
  • the present inventors transformed E.
  • a transformant overexpressing a large amount of novel xylanase of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 was produced. Examination of the enzyme activity of about 40 kD of novel xylanase (see FIG. 4) produced and isolated from the transformed Escherichia coli confirmed that it exhibited maximum activity at pH 9.0 and a temperature of 50 ° C. (see FIGS. 5 to 6). . Also, among the various elements added as heavy metal sources, xylanase activity was slightly decreased to 95, 84, 81, 82% by heavy metals or additives such as Na +1 , Mn +2 , Cs +2 , acetate, etc.
  • the present invention also provides a gene encoding the xylanase.
  • the gene encoding xylanase of the present invention preferably comprises any one of the following sequences: a) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3; b) a nucleotide sequence having 95% homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3; c) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; d) an amino acid of a protein that is functionally identical to a protein comprising one or more amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, wherein said amino acid sequence is substituted, deleted, inserted, and / or added, and comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; Base sequences encoding sequences; e) The base sequence of the protein which is a DNA base sequence hybridized under stringent conditions with the DNA comprising the base sequence of SEQ ID NO: 3, and functionally identical to the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector operably linked to the gene.
  • the present invention is penivacillus sp. Since the nucleotide sequence of the novel gene encoding xylanase isolated from the HPL-002 strain has been revealed, recombinant vectors containing the gene can be prepared using conventional methods known in the art.
  • the recombinant vector of the present invention may use a commercially available vector, but is not limited thereto, and those skilled in the art may prepare and use a suitable recombinant vector.
  • the present invention also provides a transformant in which the recombinant expression vector is introduced into a host cell.
  • the host cell that can be used in the present invention is not limited, but is preferably selected from the group consisting of E. coli, prokaryotic cells including bacteria, yeast, animal cells, and prokaryotic cells including insect cells, more preferably using E. coli.
  • E. coli E. coli
  • prokaryotic cells including bacteria, yeast, animal cells, and prokaryotic cells including insect cells, more preferably using E. coli.
  • the present invention is the penivacillus sp. It provides a xylanase production method comprising the step of culturing the HPL-002 strain (KCTC11410BP) or the transformant and centrifugation to obtain a crude enzyme solution.
  • the production method of the present invention may further comprise the step of purifying xylanase from the obtained crude enzyme solution.
  • the medium is penivacillus sp. It is preferable to select a medium suitable for HPL-002 strain (KCTC11410BP) or a transformant of the present invention from among commercial media known to those skilled in the art.
  • the present inventors use a specific resin binding vector for column chromatography when preparing a transformant as a method for increasing the purification efficiency while simplifying the purification process, and in the purification process, it is preferable to separate and separate only the enzyme bound to the resin. .
  • As strict conditions glutathione binding vectors, calmodulin binding vectors, maltose binding vectors, and the like can be used, and the resin for column filling is determined according to the use vector. In the present invention, but the present results using the glutathione binding vector and the resin is not limited thereto.
  • the present invention also provides a xylan degrading agent comprising the xylanase produced by the strain, the transformant or the strain or transformant.
  • the present invention also provides a use of the strain, the transformant or the xylanase produced by the strain or the transformant in the preparation of a xylan degrading agent.
  • the xylan degrading agent of the present invention can be used as the xylan degrading agent as well as the xylanase produced by the strain or the transformant.
  • the present invention also provides a composition for processing xylan in a food comprising the xylanase.
  • the present invention also provides a use of the xylanase in the preparation of a xylan processing composition in food.
  • the present invention also provides a feed additive comprising the xylanase.
  • the present invention also provides a use of the xylanase in the manufacture of a feed additive.
  • the present invention provides a composition for a papermaking process comprising the xylanase.
  • the present invention also provides a use of the xylanase in the manufacture of a papermaking process composition.
  • the xylanase of the present invention exhibits activity in alkaline conditions (pH 8.0-9.0) and generally wide temperature ranges (40-60 ° C.) (see FIGS. 5-6) and is not affected in heavy metals below 100 ⁇ M concentration. Therefore (see Table 1), it can be used for the use of new xylanase.
  • the applications currently occupying the xylanase enzyme market can be broadly categorized into food, feed and technology (Bedford and Morgana, World's Poultry Science Journal 52: 61-68, 1996).
  • food fruit and vegetable production, brewing and liquor production, bakery and confectionery
  • it is used for quality improvement through softening and refining efficiency of materials, viscosity reduction, and extraction and filtration efficiency.
  • feed market it is used to reduce non-starch carbohydrates, improve intestinal viscosity, and increase digestibility of protein and starch in feeds such as pigs, poultry and ruminants (Kuhad and Singh, Crit. Rev. Biotechnol. 13, 151-172 , 1993).
  • it is used in the papermaking process, biological whitening process, reduction of chlorine consumption, energy reduction through reduction of mechanical papermaking process, deinking effect, separation of starch and gluten, renewable fuel (bioethanol) and chemical raw material production. .
  • novel xylanase of the present invention can be usefully used for paper production and waste paper regeneration, feed addition and food quality improvement or decomposition of xylanase for industrial use, which is obvious to those skilled in the art.
  • the compositions can be formulated and formulated in a manner known to those skilled in the art.
  • the present invention provides a method for decomposing xylan comprising adding a xylanase produced by the strain, the transformant or the strain or transformant to a fibrin-based biomass or xylan-containing solution.
  • the amount of the strain, the transformant or the xylanase produced by the strain or the transformant can be adjusted by those skilled in the art.
  • the present invention provides a feed production method comprising the step of adding the strain, the transformant or xylanase produced by the strain and the transformant to the feed material of the animal.
  • the amount of the strain, the transformant or the xylanase produced by the strain or the transformant can be adjusted by those skilled in the art.
  • the strain of the present invention was isolated from soil samples containing waste wood residue after mushroom cultivation collected from the middle of Garasan, Geoje-gun, Gyeongnam. Soil samples were collected from 2 to 5 cm layers from the surface of the soil, and the soil was selected by passing through 2 mm after air drying. 30 g of selected soil is put into 270 ml of sterile saline solution (NaCl 8.0 g / l) and shaken with shaking incubator (37 °C, 200rpm) for about 20 minutes and left at room temperature for 30 minutes to coarse soil particles and impurities. Was precipitated to the bottom, and the supernatant was transferred to a sterile container as a first diluent.
  • sterile saline solution NaCl 8.0 g / l
  • shaking incubator 37 °C, 200rpm
  • the present inventors incubated the strain producing the highest activity xylanase isolated in Example 1 at 30 ° C., followed by Gram staining and Spore Staining, to generate spores. It was identified as Gram-positive bacilli. As a result of observing the morphology with an electron microscope, as shown in Figure 1, it was a rod having a cell size of 1.1 ⁇ m and a cell length of 2.5 ⁇ m to 4 ⁇ m, and showed no motility bacilli without flagella.
  • the present inventors have identified and separated the penivacillus sp.
  • a gDNA library having a gene fragment of 5 kb or less after genome DNA extraction was prepared.
  • DNA fragments of 1-6 kb size were made by randomly cutting the DNA extracted from the strain, and the size of the DNA fragments around 5 kb was obtained by selecting the size by electrophoresis on agarose gel. It was inserted into pCB31 plasmid vector and transformed into E. coli DH10B cells. The 1,152 clones thus prepared were tested for xylanase activity in solid, liquid phase conditions.
  • the determination of xylanase activity (xylan degradability) of isolated strains, active clones, transformants, and isolated purified enzymes was performed using one or both of the following two methods.
  • the first method is a solid culture measurement method. Soft agar double medium containing 0.5-1.0% of Birka Bio Chemika. Co. in LB medium was incubated overnight after inoculating the strains, and then cultured by Congo red staining the next day. Strains and active clones forming halo around the colonies were selected.
  • the second method was a liquid culture enzyme activity measuring method using DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) assay (Miller GL Anal Chem 31, 426-428, 1959), specifically 50 ⁇ l in 50 ⁇ l enzyme solution.
  • Substrate solution 50 mM sodium phosphate solution containing 2% Birchwood xylan, pH 6.0 was added and reacted at 50 ° C. for 20 minutes, 200 ⁇ l of DNS solution was added, followed by 5 minute treatment at 90 ° C. for absorbance at 540 nm. Measured at One unit of enzyme was defined as the enzymatic activity that produced 1 ⁇ mol of reducing sugar (xylose) in 1 minute.
  • Top 1 clones GM5-SLX1 were selected through liquid and solid culture activity tests (FIG. 2).
  • the base sequence of the fragment DNA inserted into the clone selected in Example 3-2 was analyzed.
  • the DNA fragment inserted into the plasmid was 4,180 bp (SEQ ID NO: 2), which was encoded by NCBI's Blast P or Blast N program (//www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • An open reading frame (ORF) was analyzed. Seven ORFs of size 100 or more amino acids in the ORFs analyzed were named SLX-O1, SLX-O2, SLX-O3, SLX-O4, SLX-O5, SLX-O6, SLX-O7.
  • a primer was prepared by adding Pac I and Bam HI restriction enzyme recognition sites based on the nucleotide sequence, and then amplified by PCR and inserted into a pGEM-T-Easy vector (Promega) vector to produce a recombinant plasmid. It was.
  • 1 ng of GM5-SLX1 plasmid template is composed of a primer pair consisting of a forward primer described as SEQ ID NO: 5 (5'-TTAATTAAGATGTCTACCGAAATTCCGT-3 ') and a reverse primer described in SEQ ID NO: 6 (5'-GGATCCCCATGTCTACCGAAATTC-3').
  • PCR amplification conditions were 5 minutes denaturation at 94 ° C using PCR Premix (GenetBio), followed by 30 seconds of denaturation at 94 ° C, 30 seconds of binding at 55 ° C ( Annealing), the extension of 1 minute at 72 ° C was repeated 30 times, and finally, the reaction was terminated after finishing the extension for 7 minutes at 72 ° C, and maintained at 4 ° C.
  • the product amplified by PCR was purified using GENCLEAN II Kit (Q-Biogene), and recombinant DNA was produced using T4 ligase (RBC) in the pGEM-T-Easy vector. This recombinant plasmid E.
  • the nucleotide sequence of the target DNA fragment of the transformant was confirmed to reconfirm the ORF of the novel xylanase gene of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • PCR was performed using primer pairs of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 using GM5-SLX1 plasmid as a template. PCR reaction solution and reaction conditions were the same as before.
  • the amplified product was purified and digested with Pac I (NEB) and Bam HI (NEB), and then inserted into the protein overexpression vector pIVEX-GST (Roche) to prepare a recombinant overexpression plasmid, which was then subjected to E. coli BL21 (RBC).
  • E. coli BL21 RBC
  • the transformed E. coli overexpressed xylanase was produced. After culturing the overexpressed transformant E.
  • the plasmid DNA was extracted, digested with the restriction enzyme, and then electrophoresed to confirm that the vector and the target DNA were successfully recombined.
  • the harvested cells were suspended, ultrasonically crushed, and centrifuged at 10,000 g to separate the supernatant and the precipitate, and the SDS PAGE confirmed that the target protein was overexpressed in the supernatant and the molecular weight was about 40 kD (FIG. 4).
  • Example 3-4 The activity of xylanase overexpressed and isolated from the novel xylanase overexpressing transformed Escherichia coli prepared in Example 3-4 was investigated by the method of Example 3-2 for each pH, temperature and metal ion.
  • PH control of the reaction solution was performed at pH 4 ⁇ 5 with Citric acid buffer, pH 6 ⁇ 8 with Phosphate buffer, and pH 9 ⁇ 11 with Glycine / NaOH buffer. It was.
  • As metal ions 1 mM CaCl 2 , MgCl 2 , MnCl 2 , CuCl 2 , ZnCl 2 , FeCl 3, etc. were added to investigate the effects on xylanase activity.
  • novel xylanase showed a maximum activity at pH 9.0, 50 °C as shown in Figure 6.
  • xylanase activity was slightly inhibited to 95, 84, 81, 82% by heavy metals or additives such as Na +1 , Mn +2 , Cs +2 , acetate, etc. Below 100 ⁇ M it was not affected or slightly increased enzyme activity.
  • PIVEX GST-xylanase recombinant vector (Bioprogen Co., Ltd., Korea) comprising a gene encoding a novel xylanase as set forth in SEQ ID NO: 4 was isolated from Escherichia coli BL21-Gold (DE) (Stratagene, USA).
  • Inoculated in liquid medium (LB 25 g / L) to OD 600 Stirring was carried out at 150 rpm at 37 °C until the value was 0.7.
  • IPTG isopropyl-D-thiogalactoside
  • Lysis buffer Lilysis buffer; 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM ⁇ -Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7.0
  • the cells were crushed by The crushed solution was fractionated using column chromatography (BIOLOGIC LP system, BIO RAD).
  • the selective separation and purification of xylanase only is 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl; Glutathione S-transferase binding protein was attached to a glutathione S-transferase binding protein using a GST binding resin column (Novagen) equilibrated to pH 7.0, and then treated with factor Xa protease. Thereafter, the mixture was selectively isolated and purified using Elution buffer solution (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl; pH 7.0). Purification of the enzyme activity fraction was confirmed by SDS-PAGE and xylanase enzyme activity was measured from each sample recovered in the purification step. Protein content was measured using the Bradford method (Bradford, Sigma Aldrich), BSA (bovine serum albumin) was used as a standard protein.
  • the affinity K m value for the xylan substrate was 0.06, and most of the hydrolysis products were xyloligomers.

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Abstract

본 발명은 알칼리성 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 속 균주, 이로부터 분리한 신규 자일라나아제 및 이의 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명의 신규 페니바실러스 sp. HPL-002 균주 및 자일라나아제는 다양한 섬유소 바이오매스의 주성분인 자일란을 분해함으로써 바이오 연료 및 대체원료, 특수기능물질, 바이오 폴리머, 식품 및 사료 등의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

알칼리성 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 에스피. 에이치피엘-002 균주, 이로부터 분리한 신규 자일라나아제 효소 및 이의 생산 방법
본 발명은 알칼리성 신규 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 속 균주에 관한 것이다.
지구온난화 및 석유자원 고갈이 예상되는 21세기를 살아가는 인류는 화석연료 대체자원 개발이라는 숙제를 안고 있으며, 이산화탄소 방출저감 등 국제 환경규제에 대응하기 위하여 태양에너지, 풍력과 수력, 원자력, 바이오매스 등을 주요 대상으로 연구하고 있다. 농업 생산 등을 포함한 각종 생물자원 부존량은 지구상에 건량으로 약 1.8 ~ 2.0×1012톤으로 추산되며, 매년 재생산되는 바이오매스의 양은 현 부존량의 약 10%인 2,000억 톤/년으로 추정하고, 이 중에서 1.83% 정도가 에너지원 또는 연료로 사용할 뿐 나머지는 자연에 방치되어 소멸되고 있다. 바이오매스는 타 대체 에너지 자원들과는 달리 유일한 탄소자원이기 때문에 관련기술(바이오리파이너리)이 개발되면 바이오매스 산업은 기존의 석유화학제품을 대체하여 일상생활과 산업 전반에 엄청난 파급효과를 일으킬 것이다. 바이오리파이너리 기술을 이용해서 생산할 수 있는 제품을 특성별로 분류하면, 바이오 연료, 대체원료, 특수기능물질, 바이오폴리머 등의 4가지가 있으며, 이러한 공정기술개발이 미래 지속성장화학기술의 중심기술이 될 것이며 우리 일상생활에서 떼어낼 수 없는 공산품들을 생산하게 될 것이다. 미래 시장경제구조가 바이오매스 자원 및 전환기술력, 관련 시장 수요로 규정될 것이며, 바이오매스의 안정적 확보 및 활용 기술개발을 위하여 한국 실정에 적합한 자원의 발굴, 전처리기술 개발, 당화 및 발효시스템 개발 등 종합적 바이오리파이너리 기술개발이 필수적으로 선결되어야 할 것이다. 이를 위해서는 국산 바이오매스에 적합한 전처리 기술, 신규 섬유소 분해효소 발굴 및 개량을 통한 효율적 당화기술, 효소재사용 등을 통한 생산단가 절감기술, C6/C5 당 동시 활용기술, 효율적 발효 및 분리정제기술, 친환경적 화합물 전환기술 등이 필수적이다. 바이오매스 활용산업은 에너지, 화학, 플라스틱, 식품 및 사료, 제약 등 매우 다양한 산업 분야에 적용되는 기술로 미래 경제체제에 미치는 파급효과가 매우 클 것이기 때문에 산업체, 학계, 연구기관의 기술 협력 계획과 강력한 정책적, 제도적 기반 확립이 필수적이다.
세계적으로 추진되고 있는 전처리 방법에는 크게 약산처리, 암모니아처리, 석회처리 등이 있으며, 각 처리 방법에 따라 장단점이 있기 때문에 전처리 방법에 따라 후속 처리방법의 개발이 요망되고 있는데, 아직까지 국내에서는 단일 종류의 바이오매스의 충분한 양을 지속적으로 확보할 수 없기 때문에 바이오매스 전처리 표준화 기술을 정립하고, 연속되는 후속 처리방법을 표준화하기 어려운 실정이다. 따라서 바이오매스 종류별 전처리 표준화기술과 접목할 것을 전제로 하여, 전처리 이후 생산 분리되는 셀룰로오스(글루칸)와 헤미셀룰로오스(자일란)를 활용하는 후속 바이오리파이너리 기술개발이 절대적으로 필요하다. 섬유소계 생물자원 전환을 위한 당화효소 및 균주개발은 생물자원을 유효 화학자원으로 이용하기 위한 핵심 원천기술이기 때문에, 대표적으로 셀룰로오스(38%)와 헤미셀룰로오스(28%)의 당화효소 대량생산을 위한 균주개발 및 기술개발에 전 세계적 관심이 집중되고 있다. 따라서 저렴한 비용으로 재생 가능한 섬유소계 바이오매스를 당화하여 다양한 바이오매스 기반 제품(Biomass-Based Products)을 생산한다면 고갈되어가는 화석연료를 대체하고 이산화탄소(CO2)를 줄여 자연환경을 보존하면서 인류의 지속적인 발전을 달성할 수 있을 것이다(Angenent et al., Trends in Biotechnology 22(9):477-485, 2004; Demain et al., Microbiology and Molecular Biology Rev. 69(1):124-154, 2005; Kamm & Kamm, Applied Microbiology and Biotechnology 64(2):137-145, 2004; Percival et al., Biotechnology Advances 24(5):452-481, 2006).
목질계 섬유소 원료를 당화하여 바이오연료와 화학원료를 생산하는 공정에서는 목질계 원료 속에 포함되어 있는 15-30%의 자일란이 부산물로 생성되는 것을 피할 수 없다. 현재까지 자일란의 가수분해는 화학적 방법으로 주로 이루어지고 있다. 자일란의 화학적 분해방법은 섬유소계 바이오매스에 황산을 첨가하고 130℃에서 스팀 가압하여 분해하는 방법으로, 많은 양의 에너지를 소모할 뿐만 아니라 산 및 고온에 견딜 수 있는 고가의 장치가 필요하다. 또한 이때 발생하는 폐기물의 처리비용 등으로 인하여 생산단가가 높아지게 된다. 이에 반하여 자일라나아제를 이용하는 생물학적 방법에 의한 자일란의 분해방법은 화학적 분해방법과 비교할 때 에너지의 소모가 적고 발생하는 폐기물 역시 소량일 뿐만 아니라, 그 처리가 용이하기 때문에 경제적으로도 매우 유리하다. 그러나 이러한 효소시스템의 문제점은 효소 역가가 낮아 반응속도 및 분해율이 낮고 기존에 알려진 효소들의 특성이 산업적으로 이용하기에 부족한 점이 많다는 것이다. 또한 산업적으로 경제적인 자일라나아제 생산을 위해서는 대량생산 체제를 갖추어야 할 것이다. 따라서 높은 분해력을 가진 신규의 자일라나아제 효소계의 개발이 필요하며, 산업화하기 위해서는 개발된 재조합 균주가 자일란 분해효소를 대량 생산할 수 있는 조건의 확립과 효소를 이용한 새로운 반응기의 설계 및 생산기술의 확립이 필요하다. 따라서 산업에 직접적인 이용을 위해서는 기존의 자일라나아제가 아닌 신규의 미생물 및 효소 시스템을 탐색하여 높은 온도 및 pH 조건하에서도 활성도를 유지하는 자일라나아제 유전자의 확보가 필요하며, 이를 통하여 기존의 특허 등으로 인해 발생하는 문제를 해결할 수 있을 것이다. 그러므로 셀룰라아제를 이용한 섬유소의 당화공정 개발에는 자일란의 이용기술도 반드시 동시에 이루어져야 할 것이다. 자일란의 이용에는 자일라나아제를 이용하여 자일로스를 생산하는 것이며, 이 과정에서 중요한 것은 목질계 원료로부터 자일란의 효율적인 추출과 고역가의 자일라나아제 대량생산기술의 확보이다.
헤미셀룰로오스의 주성분인 자일란을 자일로스로 분해하여 당화하는 효소를 일반적으로 자일라나아제 효소로 통칭하고 있다(Biely P, Trends in Biotechnology 3(11):286-290, 1985). 지금까지 보고된 자일라나아제 생산 미생물 중 트리코더마(Trichoderma) 속 곰팡이 균주들이 주로 이용되었는데, 이들의 효소 생산성은 자일라나아제를 생산하는 세균에 비해 대체로 우세하지만 주로 산성조건에서 최대 활성을 나타낸다(Tenkanen et al., Enzyme and Microbial Technology 14(7):566-574, 1992). 자일라나아제를 생산하는 세균으로는 애로모나스(Aeromonas) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 아스퍼질루스(Apspergillus) 속 등에 속하는 다양한 종류가 있으며, 세균에 따라 생산하는 자일라나아제의 특성도 다양하며, 이들 효소를 암호화하는 유전자들도 다양하게 보고되어있다.
자일라나아제 효소에 대한 국내외 기술현황으로는 경희대 정대균 박사 팀에서 섬유소 분해효소를 생산하는 Trichoderma sp. C-4 균주를 선별하였지만 산업화를 위해서는 더 높은 활성이 요구되고 있다(Sul et al., Appl Microbiol Biotechnol. 66(1):63-70, 2004). 동해대 강명규 박사 팀에서 내알카리성 자일라나아제를 생산하는 Cephalosporium sp. RYM-202 균주를 선별하여 펄프공정에 이용가능성을 연구하고 있다(강명규 외, 한국환경생물학회지 17(2):191-198, 1999). KAIST의 김정회 교수 팀에서는 Bacillus 유래의 효소(Endoxylanase)를 세포외부로 생산하는 재조합 균주인 Bacillus subtilis DB104/pJHKJ4를 구축하였다(Kim JH et al., J. Microbiol. Biotechnol., 10(4):551-553, 2000). 국외의 경우 대만에서는 혐기성 곰팡이 Neocallimastix patriciarum으로부터 유전자 복제된 자일라나아제가 방향적 효소진화 방법을 통하여 내염기성이 증가한 사례가 있으며(Yew-Loom Chen et al., Can. J. Microbiol. 47(12):10881094, 2001). 최근에는 펄프공정 후 발생하는 폐수로부터 내염기성 균주인 Bacillus firmus가 분리 동정되었다(Pochih Chang, Biochemical and Biophysical Research Communications 319:1017-1025, 2004). 이 자일라나아제는 pH4부터 pH11까지의 넓은 범위에서 높은 활성이 있으며, 62℃에서 16시간을 배양하여도 초기 활성의 70% 정도의 잔여활성을 보일 정도로 높은 내열성이 있다. 이와 같이 세계 여러 나라에서 다양한 균주를 발굴하고 방향진화적인 진화를 통하여 기능을 향상시키고 있다.
기존의 자일라나아제와 관련된 특허를 살펴보면 자일라나아제를 생산하는 균주를 동정한 후 이들 야생균주를 이용하거나 대장균 등을 이용한 재조합 균주를 만들어 자일라나아제를 생산하는 방법을 이용하고 있다(국제공개특허 제93/08275호, 국제공개특허 제92/01793호, 국제공개특허 제92/17573호, 대한민국 공개특허 제10-0072225호, 대한민국 공개특허 제10-02211204호, 대한민국 공개특허 제10-0411771호). 또한 사료첨가제로서의 자일라나아제 관련 특허로는 자일라나아제를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 ＷＬ-2 균주에 대한 특허(대한민국 공개특허 제2001-0111986호), 고초균 유래 엔도 자일라나아제의 신호서열 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래단백질의 제조방법에 관한 특허(대한민국 공개특허 제2000-0034279호), 바실러스 속 AMX-4(Bacillus sp. AMX-4) 균주의 자일라나아제(xylanase)를 코드화하는 신규한 자일라나아제 유전자에 관한 특허(대한민국 공개특허 제2003-0085679호) 등이 있다.
자일라나아제를 이용하는 효소적 당화공정은 바이오매스의 전처리 방법에 따라 요구되는 효소의 특성이 구분되는데, 산을 이용한 바이오매스 전처리의 경우 내산성 당화효소가 요구되지만 현행 펄프 및 제지공정이나 알칼리를 이용한 바이오매스 전처리 후 당화공정에서는 내알칼리성 당화효소가 요구된다. 또한 당화 및 발효 동시공정을 위해서는 내열성이 요구되기도 한다. 그러나 상품화된 자일라나아제는 산성 조건에 알맞은 것들이 대부분이기 때문에 알칼리 조건에서 활성을 가지는 자일라나아제의 개발이 요구되고 있다. 더욱 좋기로는 산성 및 알칼리조건 모두에서 활성이 높은 자일라나아제의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 기존의 자일라나아제 및 이를 생산하는 균주들이 모두 선진 개발국들에 의해서 과점 되고 있는 지적재산권을 회피 또는 타파하기 위하여 국내에서 자체개발함은 물론 세계적으로 영역을 확대할 수 있는 신규 알칼리 자일라나아제 생산 균주 및 이로부터 생산된 자일라나아제를 제공한다.
본 발명의 목적은 자일라나아제 활성을 갖는 신규 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주로부터 생산되는 알칼리성 자일라나아제, 이를 암호화하는 유전자, 이의 발현벡터, 형질전환체 및 이를 이용한 신규 자일라나아제 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자일란 분해제 및 분해방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 식품내 자일란 가공용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 사료첨가제 및 사료제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 제지공정용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자일라나아제 활성을 갖는 페니바실러스 에스피.(sp.) 에이치피엘-002(HPL-002) 균주(KCTC11410BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주로부터 생산되는 알칼리성 자일라나아제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용한 자일라나아제 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 포함하는 자일란 분해제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 사료첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 동물의 사료로 사용하는 섬유소계 바이오매스에 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 및 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 자일란 분해제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 식품내 자일란 가공용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 사료첨가제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 자일라나아제를 제지공정용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 신규 균주인 페니바실러스(Paenibacillus) sp. HPL-002 및 이로부터 분리한 자일라나아제는 비교적 넓은 범위의 온도 및 알칼리성 pH 조건에서 우수한 자일란 분해활성을 나타내므로 사료 산업, 제지 및 세제 산업에서는 물론 섬유질계 바이오매스의 당화공정에 활용되어 석유 대체원료, 특수기능물질, 바이오 폴리머 등의 원료를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 선발균주의 전자현미경 사진이다.
도 2는 1,152개 gDNA 라이브러리로부터 활성클론 선별 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 ORF 분석 및 각 ORF 상동성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 형질전환체로부터 자일라나아제를 분리정제 후 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 자일라나아제 활성의 최적 pH 그래프이다.
도 6은 자일라나아제 활성의 최적 온도 그래프이다.
도 7은 자일라나아제 분리정제 후 효소특성(kinetics)이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 알칼리성 자일라나아제 활성을 갖는 페니바실러스 sp. HPL-002 균주(KCTC11410BP)를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 경남 거제군 가라산 중턱에서 채취한 버섯재배 후 폐목재 잔여물이 포함된 토양시료로부터 자일란 분해능이 뛰어난 균주를 선별하였다. 상기 선별된 균주를 동정한 결과, 그람 양성 간균이며, 1.1 ㎛의 세포크기와 2.5 ㎛ 내지 4 ㎛의 세포길이를 갖는 막대형이며, 편모를 가지지 않은 운동성 없는 간균이었다(도 1 참조). 상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA를 가지며, Pantoea agglomerans ZFJ-15(GenBank 등록번호 EU931554) 균주와 96.4%의 상동성이 있고 페니바실러스(Paenibacillus) sp. WPCB158(GenBank 등록번호 FJ006910)과 96.3%가 일치함을 확인하였으나 그 이상 일치하는 상동성은 검색되지 않았기 때문에, 본 발명의 상기 균주를 페니바실러스(Paenibacillus) sp. HPL-002로 명명하였고, 한국생명공학연구원에 2008년 11월 5일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC11410BP이다.
또한, 본 발명은 상기 균주로부터 생산되는 알칼리성 자일라나아제를 제공한다.
본 발명의 자일라나아제는 pH 8.0~9.5의 알칼리 조건에서 활성을 나타내고, 대체적으로 넓은 온도범위인 40~60℃에서 활성을 나타낸다. 바람직하게는 pH 8.5~9.2의 알칼리 조건에서 활성을 나타내고, 대체적으로 넓은 온도범위인 45~55℃에서 활성을 나타낸다. 가장 바람직하게는 pH 9.0의 알칼리 조건에서 최대 활성을 나타내고, 50℃에서 최대 활성을 나타낸다.
본 발명의 자일라나아제의 아미노산 서열은 하기의 서열 중 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하다: a) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열; b) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열과 95% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열; c) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열; d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열; 및 e) 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열.
상기 엄격한 조건은 혼성화 후 세정 시에 결정된다. 엄격한 조건 중의 하나는 상온에서 6×SSC, 0.5% SDS로 15분 세정한 뒤 45℃에서 2×SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정하고, 50℃에서 0.2×SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정을 두 번 반복한다. 더 바람직한 엄격한 조건은 더 높은 온도를 이용하는 것이다. 상기 엄격한 조건의 다른 부분은 동일하게 수행하되 마지막의 두 번의 30분은 60℃에서 0.2×SSC, 0.5% SDS로 세정한다. 또 다른 엄격한 조건은 상기 엄격한 조건에서 마지막 두 번을 65℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS로 세정하는 것이다. 당업자라면 필요한 엄격한 조건을 얻기 위하여 이러한 조건을 명백히 설정할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기 페니바실러스 sp. HPL-002 균주로부터 자일라나아제 활성을 가지는 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위하여 페니바실러스 균주의 gDNA 라이브러리를 제작한 후, 자일라나아제 활성을 시험하였다. 상기 실험을 통해 1개의 클론을 선별하였고(도 2 참조), 삽입된 절편 DNA의 염기서열을 분석하였다. 분석 결과 DNA 절편의 크기는 4,180 bp이었고(서열번호 2), 아미노산 100개 이상의 범위에 7개의 ORF를 포함하였다(도 3 참조). 본 발명자들은 상기 ORF중 유전자 염기서열 상동성 검색결과 엔도-1,4-베타-자일라나아제[endo-1,4-beta-xylanase(AJ006646)와 83% 상동성을 가지는 ORF5를 대장균에 형질전환하여 자일라나아제 활성을 확인한 결과 자일라나아제 활성이 뛰어남을 확인하였다. 또한, 상기 형질전환체의 목적 DNA 절편의 염기서열을 확인하여 서열번호 3으로 기재된 염기서열의 신규 자일라나아제 유전자의 ORF를 재확인하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열의 신규 자일라나아제를 대량으로 생산하기 위하여 과발현하는 형질전환체를 제작하였다. 형질전환 대장균으로부터 생산, 분리정제한 약 40 kD의 신규 자일라나아제(도 4 참조)의 효소 활성을 조사한 결과 pH 9.0 및 온도 50℃에서 최대 활성을 나타냄을 확인하였다(도 5 내지 도 6 참조). 또한 중금속 원으로 첨가한 여러 가지 원소들 중에서 1 mM의 Na+1, Mn+2, Cs+2, 아세트산염 등의 중금속 또는 첨가물에 의해서 자일라나아제 활성이 95, 84, 81, 82%로 약간 저해되었지만, 100 μM 이하에서는 영향을 받지 않거나 효소활성을 다소 증가시키는 것으로 나타났다(표 1 참조). 아울러, 반응특성(Enzyme Kinetics)을 분석한 결과, 자일란 기질에 대한 친화도 Km 값은 0.06이었고(도 7 참조), 가수분해 산물은 대부분이 자일로올리고머 이었다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 암호화하는 유전자를 제공한다.
본 발명의 자일라나아제를 암호화하는 유전자는 하기의 서열 중 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하다: a) 서열번호 3에 기재된 염기 서열; b) 서열번호 3에 기재된 염기 서열과 95% 상동성을 가지는 염기 서열; c) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열; d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열; e) 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 DNA 염기 서열이며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 염기 서열.
또한, 본 발명은 상기 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 페니바실러스 sp. HPL-002 균주로부터 분리한 자일라나아제를 코딩하는 신규한 유전자의 염기서열을 밝혔으므로 당업계 공지된 통상의 방법을 이용하면 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작할 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 상용화된 벡터를 이용할 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자가 적합한 재조합 벡터를 제조하여 이용하는 것도 무방하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 숙주세포는 한정된 것은 아니나, 대장균, 박테리아를 포함한 원핵세포, 효모, 동물세포, 곤충세포를 포함하는 원핵세포로 이루어진 군으로부터 선택하여 이용하는 것이 바람직하며, 대장균을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 페니바실러스 sp. HPL-002 균주(KCTC11410BP) 또는 상기 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 생산 방법은 상기 수득된 조효소액에서 자일라나아제를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 배지는 본 발명의 페니바실러스 sp. HPL-002 균주(KCTC11410BP) 또는 본 발명의 형질전환체에 적합한 배지를 당업자에게 공지된 상용 배지 중에서 선별하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 정제과정을 단순화시키면서 정제효율을 높이기 위한 방법으로 형질전환체를 제작할 때 컬럼크로마토그래피를 위한 특정 레진 결합 벡터를 사용하고, 정제과정에서는 레진에 결합된 효소만을 선별분리를 하는 것이 바람직하다. 엄격한 조건으로는 글루타치온 결합벡터, 칼모듈린 결합벡터, 말토스 결합벡터 등을 사용할 수 있으며, 컬럼 충진용 레진은 사용 벡터에 따라 결정된다. 본 발명에서는 글루타치온 결합벡터와 레진을 사용한 결과만을 제시하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 포함하는 자일란 분해제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 자일란 분해제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 자일란 분해제는 상기 균주 또는 상기 형질전환체에서 생산하는 자일라나아제뿐만 아니라 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 직접 자일란 분해제로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 식품내 자일란 가공용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 사료첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 사료첨가제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 제지공정용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 자일라나아제는 알칼리 조건(pH 8.0~9.0) 및 대체적으로 넓은 온도범위(40~60℃)에서 활성을 나타내고(도 5 내지 도 6 참조), 100 μM 농도 이하의 중금속에서는 영향을 받지 않으므로(표 1 참조), 새로운 자일라나아제의 용도로 이용될 수 있다.
현재 자일라나아제 효소시장을 점유하고 있는 용도는 크게 식품, 사료 및 기술로 분류할 수 있다(Bedford and Morgana, World's Poultry Science Journal 52:61-68, 1996). 식품(과일 및 야채생산, 양조 및 주류생산, 제빵 및 제과)시장에서는 재료의 연화 및 정제효율 개선, 점도감소, 추출 및 여과 효율증대 등을 통한 품질향상에 활용되고 있다. 사료시장에서는 돼지, 가금류, 반추동물 등의 사료의 비전분 탄수화물의 감소, 장내 점도개선, 단백질 및 전분의 소화흡수율 증대 등에 이용되고 있다(Kuhad and Singh, Crit. Rev. Biotechnol. 13, 151-172, 1993). 아울러 기술적으로는 제지공정에서 생물학적 백화공정, 염소소비의 감소, 기계적인 제지공정 단축을 통한 에너지 감소, 탈묵효과, 전분과 글루텐의 분리, 재생가능 연료(바이오에탄올) 및 화학원료생산 등에 활용되고 있다.
그러므로 본 발명의 신규 자일라나아제는 용지 생산 및 폐지 재생, 사료 첨가 및 식품의 품질 향상 또는 산업상 사용하는 자일라나아제의 분해에 유용하게 이용될 수 있으며 이는 당업자에게 자명하다. 상기 조성물들은 당업자에게 공지된 방법으로 제형화 되고 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명은 섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 상기 형질전환체가 생산하는 자일라나아제의 첨가량은 당업자에 의해 조정될 수 있다.
아울러, 본 발명은 동물의 사료 재료에 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 및 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 상기 형질전환체가 생산하는 자일라나아제의 첨가량은 당업자에 의해 조정될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 균주 분리 및 선별
<1-1> 균주 분리
본 발명의 균주는 경남 거제군 가라산 중턱에서 채취한 버섯재배 후 폐목재잔여물이 포함된 토양시료로부터 분리하였다. 상기 토양의 표층으로부터 2~5 ㎝ 층에서 토양시료를 채취, 풍건 후 2 ㎜ 채를 통과시켜 토양을 정선하였다. 정선된 토양 30 g을 270 ㎖의 멸균된 생리식염수(NaCl 8.0 g/ℓ)에 넣어서 진탕배양기(37℃, 200 rpm)로 약 20분간 진탕 후 상온에 30분 정도 방치하여 굵은 토양입자 및 불순물 등을 바닥으로 침전시킨 후 상징액을 멸균된 용기로 옮겨 1차 희석액으로 하였다. 이것을 잘 교반한 후 10 ㎖을 취하여 90 ㎖의 생리식염수에 넣어 2차 희석액 100 ㎖을 제조하고, 2차 희석액을 충분히 교반하면서 위와 같은 방법으로 10 ㎖을 취하여 90 ㎖의 생리식염수에 넣어 3차 희석액 100 ㎖을 제조하였다. 이후 동일한 방법으로 6차 희석액까지 제조하였다. 균주 분리용 TSA(Tryptic Soy Agar, Difco Co.) 배지에 3, 4, 5, 6차 희석액을 0.25 ㎖씩 3회 반복으로 분주, 균일하게 도말하여 37℃ 평상인큐베이터에서 2일간 배양 후 형성된 미생물의 콜로니를 선발하였다. 이때 콜로니의 모양, 크기, 색상 등 여러 가지 요인을 고려하여 분리하며, 분리된 콜로니는 다시 TSA 배지에서 계대 배양하여 순수한 균주를 분리하였고 이것을 모 균주로 사용하기 위하여 -70℃에 보관하였다.
<1-2> 균주 선별
순수하게 분리된 균주들 중에서 자일라나아제 활성을 가지는 활성 균주 선별은 TSA 배지에 자작나무 자일란(Fluka Bio Chemika. Co.)이 0.5~1.0% 함유된 소프트 아가 더블 배지를 만들고 균주를 접종하여 하룻밤 배양한 후 다음날 Congo-red 염색법(Theater RM, PJ. Wood. Appl Environ Microbiol 43, 777-780, 1982; Beguin P. Analytical Biochemistry, 131(2):333-336, 1983)을 통해 배양된 콜로니 주변에 투명환(Halo)을 형성하는 균주 및 활성클론을 선별하였다. 선별된 균주의 자일란 분해능을 다시 한 번 측정하여 재현성을 확인하였고, 그중 자일란 분해 능력이 가장 우수한 균주를 선발하여 자일라나아제를 생산하는 미생물로 최종 선발하였다.
<실시예 2> 균주 동정
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 가장 높은 활성을 지닌 자일라나아제를 생산하는 균주를 30℃에서 배양한 후 그람 염색(Gram Staining) 및 포자 염색(Spore Staining)을 실시한 결과, 포자를 생성하는 그람양성 간균으로 확인되었다. 전자현미경으로 그 형태를 관찰한 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이 1.1 ㎛의 세포크기와 2.5 ㎛ 내지 4 ㎛의 세포길이를 갖는 막대형(rod)이었으며 편모를 가지지 않는 운동성이 없는 간균으로 나타났다. 또한, 균주의 16S rRNA 염기서열 분석결과 서열번호 1로 기재되는 1,234 bp의 rDNA를 얻어 유전자은행 정보자료(GenBank database) 검색 결과, Pantoea agglomerans ZFJ-15(GenBank 등록번호 EU931554) 균주와 96.4%의 상동성이 있고 페니바실러스(Paenibacillus) sp. WPCB158(GenBank 등록번호 FJ006910)과 96.3%가 일치함을 확인하였으나 그 이상 일치하는 상동성은 검색되지 않았기 때문에, 본 균주를 페니바실러스 sp. HPL-002 균주로 명명하였고, 한국생명공학연구원에 2008년 11월 5일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC11410BP이다.
<실시예 3> 신규 자일라나아제 분리
<3-1> 페니바실러스 균주의 유전자 라이브러리제작 및 활성검정
본 발명자들은 상기 실시예 1과 실시예 2에서 분리 동정한 페니바실러스 sp. HPL-002 균주로부터 자일라나아제 활성을 가지는 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위하여 게놈 DNA를 추출 후 5 kb 이하 크기의 유전자 조각을 가지는 gDNA 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리의 제작은 균주로부터 추출한 DNA를 무작위 절단방법을 통하여 1~6 kb 크기의 DNA 조각들을 만들고, 아가로스 젤에서 전기영동으로 크기를 선발하여 원하는 5 kb 전후 크기의 DNA 조각을 확보하였다. 이를 pCB31 플라스미드 벡터에 삽입 후 E. coli DH10B 세포에 형질전환시켰다. 이렇게 제작된 라이브러리 1,152개의 클론을 고상, 액상 조건에서 자일라나아제 활성을 시험하였다.
<3-2> 자일라나아제 활성시험
분리된 균주, 활성클론, 형질전환체 및 분리 정제된 효소 등의 자일라나아제 활성(자일란 분해능력) 측정은 다음과 같은 2가지 방법 중 하나 또는 모두를 사용하였다. 첫 번째 방법은 고체배양 측정방법으로 LB 배지에 버치우드 자일란(Fluka Bio Chemika. Co.)이 0.5~1.0% 함유된 소프트 아가 더블 배지를 만들고 균주를 접종하여 하룻밤 배양한 후 다음날 콩고레드 염색법을 통해 배양된 콜로니 주변에 투명환(halo)을 형성하는 균주 및 활성클론을 선별하였다. 두 번째 방법은 액체배양 효소활성 측정방법으로 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 정량법(Miller G.L. Anal Chem 31, 426-428, 1959)을 사용하였고, 구체적으로는 50 ㎕의 효소용액에 50 ㎕의 기질용액(2% 버치우드 자일란이 포함된 50 mM 인산나트륨용액, pH 6.0)을 넣고 50℃에서 20분간 반응시킨 후 200 ㎕의 DNS 용액을 첨가한 다음 90℃에 5분간 처리한 후 흡광도 540 ㎚에서 측정하였다. 효소의 1유니트(unit)는 1분 동안에 1 μ㏖의 환원당(자일로스)을 생산하는 효소활성으로 규정하였다. 액체배양 및 고체배양 활성시험을 통하여 상위 1개 클론 GM5-SLX1을 선발하였다(도 2).
<3-3> 자일라나아제 활성클론 선발 및 유전자 분석
실시예 3-2에서 선발된 클론에 삽입된 절편 DNA의 염기서열을 분석하였다. 염기서열을 분석한 결과 플라스미드에 삽입된 DNA 절편의 크기는 4,180 bp(서열번호 2)이었고, 이를 NCBI의 Blast P 또는 Blast N 프로그램(//www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 암호화되어 있는 전사 해독틀(ORF, Open Reading Frame)을 분석하였다. 분석된 ORF 중 아미노산 100개 이상의 크기를 갖는 ORF 7개를 SLX-O1, SLX-O2, SLX-O3, SLX-O4, SLX-O5, SLX-O6, SLX-O7이라 이름 붙였다. 본 발명자들은 상기 ORF 중 유전자 염기서열 상동성 검색결과 엔도-1,4-베타-자일라나아제[endo-1,4-beta-xylanase(AJ006646)]와 83% 상동성을 가지는 SLX-O5(서열번호 3)를 표적으로 하여 그 염기서열을 바탕으로 PacI과 BamHI 제한효소 인식부위를 첨가한 프라이머를 제작한 뒤 PCR 증폭 후 pGEM-T-Easy 벡터(Promega) 벡터에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로, GM5-SLX1 플라스미드 주형 1 ng을 서열번호 5(5'-TTAATTAAGATGTCTACCGAAATTCCGT-3')로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6(5'-GGATCCCCATGTCTACCGAAATTC-3')로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍(10 p㏖)과 혼합한 뒤, PCR 증폭 조건은 PCR Premix(GenetBio)를 사용하여 94℃에서 5분간의 변성(Denaturation)을 수행한 후 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 결합(Annealing), 72℃에서 1분의 연장(Extension)을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 연장으로 마무리하고 4℃에서 유지한 뒤 반응을 종결하였다. PCR을 통해 증폭된 산물을 GENCLEAN II Kit(Q-Biogene)을 사용하여 정제하였고, pGEM-T-Easy 벡터에 T4 리가아제(RBC)를 사용하여 재조합 DNA를 만들었다. 이 재조합된 플라스미드를 E. coli JM109에 형질전환시켜 유전자 형질전환 대장균을 제작하였다. 상기 형질전환체를 LB 액체 배지에서 배양한 후 HiYield™ Plasmid Mini Kit(RBC)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하여 제한효소 PacI(NEB)과 BamHI(NEB)로 절단하였고, 이를 전기영동하여 목적하는 DNA 절편이 삽입되어 있음을 확인하였다. 또한, 상기 형질전환체를 실시예 3-2에서와 같이 액상의 조건에서 자일라나아제 활성을 시험한 결과 자일라나아제 활성을 보임을 확인하였다.
상기 형질전환체의 목적 DNA 절편의 염기서열을 확인하여 서열번호 4로 기재된 염기서열의 신규 자일라나아제 유전자의 ORF를 재확인하였다.
<3-4> 자일라나아제 과발현체 제작(pIVEX-GST-PX2)
상기 신규 자일라나아제를 과발현하는 형질전환체를 제작하기 위하여, GM5-SLX1 플라스미드를 주형으로 하여 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액과 반응조건은 앞에서와 동일하였다. 증폭된 산물을 정제하여 PacI(NEB)과 BamHI(NEB)으로 절단한 뒤, 단백질 과발현벡터 pIVEX-GST(Roche)에 삽입시켜 재조합 과발현 플라스미드를 제작하였고, 이를 E. coli BL21(RBC)에 형질전환하여 자일라나아제 과발현 형질전환 대장균을 제작하였다. 제작된 과발현 형질전환 대장균을 배양하여 플라스미드 DNA 추출 후 상기 제한효소를 이용하여 절단한 뒤 전기영동을 통해 벡터와 목적 DNA가 성공적으로 재조합되었는지 확인하였고, 확인된 균체를 LB 액체 배지에서(앰피실린 100 ㎍/㎖ 첨가) 18시간 배양시킨(37℃, 250 rpm, A600=1.0) 후 새로운 LB 액체 배지에 재접종하여 A600 흡광도 값이 0.4~0.6일 때 1 mM의 IPTG를 처리하고 3시간 더 배양 후 균체를 수확하였다. 수확된 균체를 현탁시켜 초음파 분쇄 후 10,000 g에서 원심분리하여 상징액과 침전물로 분리하였고, SDS PAGE를 통하여 목적한 단백질이 상징액에 과발현됨과 분자량이 약 40 kD임을 확인하였다(도 4).
<3-5> 자일라나아제 활성발현 조건 분석
실시예 3-4에서 제작한 신규 자일라나아제 과발현 형질전환 대장균으로부터 과발현 및 분리된 자일라나아제의 활성을 pH, 온도 및 금속이온별로 실시예 3-2의 방법으로 조사하였다. 반응용액의 pH 조절은 시트릭산(Citric acid) 완충용액으로 pH 4~5, 인산(Phosphate) 완충용액으로 pH 6~8, 글라이신/수산화나트륨(Glycine/NaOH) 완충용액으로 pH 9~11로 수행하였다. 금속이온으로는 1 mM의 CaCl2, MgCl2, MnCl2, CuCl2, ZnCl2, FeCl3 등을 첨가하여 자일라나아제 활성에 미치는 영향을 조사하였고, 기타 NaCl, LiCl, KCl, NH4Cl, EDTA, CsCl2, 2-ME(2-Mercaptoethanol), DTT(Dithiothreitol), PMSF(Penylmethylsulfonyl fluoride), 아세트산염, 푸르푸랄(furfural) 등의 염을 첨가하여 자일라나아제 활성발현에 미치는 영향을 조사하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 신규 자일라나아제는 pH 9.0에서, 도 6에서 나타난 바와 같이 50℃에서 최대 활성을 나타내었다. 또한, 표 1에 나타난 바와 같이 1 mM의 Na+1, Mn+2, Cs+2, 아세트산염 등의 중금속 또는 첨가물에 의해서 자일라나아제 활성이 95, 84, 81, 82%로 약간 저해되었지만, 100 μM 이하에서는 영향을 받지 않거나 효소활성을 다소 증가시키는 것으로 나타났다.
표 1
Figure PCTKR2010003643-appb-T000001
<실시예 4> 신규 자일라나아제의 대량 생산
서열번호 4로 기재되는 신규 자일라나아제를 암호화하는 유전자(서열번호 3)를 포함하는 pIVEX GST-xylanase 재조합 벡터(Bioprogen Co., Ltd., Korea)를 대장균 BL21-Gold(DE)(Stratagene, USA)에 형질전환시킨 후 액체배지(LB 25 g/L)에 접종하여 O.D.600 값이 0.7이 될 때까지 37℃에서 150 rpm으로 교반 배양하였다. 목표 단백질의 대장균 세포내 발현을 유도하기 위하여, 상기 현탁액에 IPTG(isopropyl-D-thiogalactoside)를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가한 후에 2시간 더 배양하였다. 배양액을 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 회수한 침전물을 PBS로 3회 세척하였다. 세척된 침전물을 다시 용해용 완충용액(Lysis buffer; 50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7.0)에 재현탁 후 초음파 파쇄기(Cosmo Bio Co., LTD)를 이용하여 균체를 파쇄하였다. 파쇄 용액은 컬럼크로마토그래피(BIOLOGIC LP system, BIO RAD)를 사용하여 분획하였다. 이때 자일라나아제만의 선택적 분리 및 정제는 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl; pH 7.0으로 평형화된 글루타치온에스-트렌스퍼라아제 컬럼(GST binding resin column, Novagen)을 사용하여 글루타치온에스-트렌스퍼레이즈 결합단백질(Glutathione S-transferase binding protein)에 부착 시킨후, factor Xa protease를 처리한 후, 완충용액(Elution buffer solution; 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl; pH 7.0)을 이용하여 선택적으로 분리 및 정제하였다. 효소 활성 분획의 정제여부를 SDS-PAGE로 확인하였고 정제 단계에서 회수한 각각의 시료로부터 자일라나아제 효소 활성을 측정하였다. 단백질 함량은 브래드포드 방법(Bradford, Sigma Aldrich)을 이용하여 측정하였고, 표준 단백질로는 BSA(bovine serum albumin)를 사용하였다.
그 결과, 글루타치온 레진 컬럼크로마토그래피 법으로 간편하게 다량의 자일라나아제를 생산할 수 있었다. 또한 레진에 결합된 자일라나아제 상태로도 자일라나아제 활성이 변화되지 않는 특성을 보여주었기 때문에 효소고정화 방법을 통한 고효율 전환공정에 적용할 수 있을 것이다. 상기 방법에 의해 정제된 효소는 정제하기 전의 효소보다 4.7배 이상의 활성을 나타내었다. 효소활성은 pH 9.0, 50℃에서 50 유닛 이상의 고활성을 나타내었다.
<실시예 5> 대량생산된 신규 자일라나아제의 효소 특성
효소의 특성을 알아보기 위하여 정제된 자일라나아제를 시험관에 넣고 다양한 양의 자작나무 자일란을 포함하는 50 mM Tris-Hcl(pH 9.0) 완충용액을 넣었다. 반응 혼합물을 50℃에서 20분간 반응시켜서 효소반응 속도(Lineweaver-Burk)를 알아보았다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 자일란 기질에 대한 친화도 Km 값은 0.06이었고, 가수분해 산물은 대부분이 자일로올리고머 이었다.
Figure PCTKR2010003643-appb-I000001
Figure PCTKR2010003643-appb-I000002

Claims (23)

  1. 자일라나아제 활성을 갖는 페니바실러스 sp. HPL-002 균주(KCTC11410BP).
  2. 제1항의 균주로부터 생산되는 알칼리성 자일라나아제.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 자일라나아제는 하기의 서열 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 자일라나아제:
    a) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열;
    b) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열과 95% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열;
    c) 서열번호 3에 기재된 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열;
    d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열; 및,
    e) 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 자일라나아제는 pH 8.5 ~ 9.2에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 자일라나아제.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 자일라나아제는 45℃ 내지 55℃에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 자일라나아제.
  6. 제 2항의 자일라나아제를 암호화하는 유전자.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 유전자는 하기의 서열 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 유전자:
    a) 서열번호 3에 기재된 염기 서열;
    b) 서열번호 3에 기재된 염기 서열과 95% 상동성을 가지는 염기 서열;
    c) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열;
    d) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열;
    e) 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 DNA 염기 서열이며, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 염기 서열.
  8. 제 6항의 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터.
  9. 제 8항의 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체.
  10. 제 9항에 있어서, 숙주세포는 대장균을 포함한 원핵세포, 효모, 동물세포, 곤충세포를 포함하는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  11. 배지에 제 1항의 페니바실러스 sp. HPL-002 균주(KCTC11410BP) 또는 제 9항의 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 수득된 조효소액에서 자일라나아제를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  13. 제 1항의 균주, 제 2항의 자일라나아제 또는 제 9항의 형질전환체를 포함하는 자일란 분해제.
  14. 제 2항의 자일라나아제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물.
  15. 제 2항의 자일라나아제를 포함하는 사료첨가제.
  16. 제 2항의 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물.
  17. 섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 제 1항의 균주, 제 2항의 자일라나아제 또는 제 9항의 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 재생 가능 연료 또는 화학 원료의 생산 공정에 이용되는 것을 특징으로 하는 자일란 분해 방법.
  19. 동물의 사료 재료에 제 1항의 균주, 제 2항의 자일라나아제 또는 제 9항의 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법.
  20. 제 1항의 균주, 제 2항의 자일라나아제 또는 제 9항의 형질전환체를 자일란 분해제의 제조에 이용하는 용도.
  21. 제 2항의 자일라나아제를 식품내 자일란 가공용 조성물의 제조에 이용하는 용도.
  22. 제 2항의 자일라나아제를 사료첨가제의 제조에 이용하는 용도.
  23. 제 2항의 자일라나아제를 제지공정용 조성물의 제조에 이용하는 용도.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102181415A (zh) * 2011-03-08 2011-09-14 武汉新华扬生物股份有限公司 一种耐碱木聚糖酶xyl11-1及其基因和应用
CN103343112A (zh) * 2013-07-09 2013-10-09 武汉新华扬生物股份有限公司 一种高温碱性木聚糖酶xyn11a及其基因和应用
CN108004186A (zh) * 2018-01-09 2018-05-08 北京工商大学 一种产可水解制备高聚合度ｘｏｓ木聚糖酶的菌株及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070082329A (ko) * 2006-02-16 2007-08-21 한국생명공학연구원 신규한 패니바실러스 ｓｐ. ＨＹ-8 균주 및 이로부터분리한 자일라나제
US20070224325A1 (en) * 2004-02-20 2007-09-27 Novozymes A/S Xylanase
US20090155238A1 (en) * 2006-02-14 2009-06-18 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070224325A1 (en) * 2004-02-20 2007-09-27 Novozymes A/S Xylanase
US20090155238A1 (en) * 2006-02-14 2009-06-18 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
KR20070082329A (ko) * 2006-02-16 2007-08-21 한국생명공학연구원 신규한 패니바실러스 ｓｐ. ＨＹ-8 균주 및 이로부터분리한 자일라나제

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK 16 June 2009 'RecName: Full=Endo-1, 4-beta-xylanase B; Short=Xylanase B; AltName: Full=1, 4-beta-D-xylan xylanohydrolase B.' Database accession no. 069231 *
MARTA M. SANCHEZ ET AL: 'Paenibacillus barcinonensis sp. nov., a xylanase-producing bacterium isolated from a rice field in the Ebro River delta' INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY vol. 55, no. 2, 2005, pages 935 - 939 *
O. GALLARDO ET AL: 'Characterization of a Paenibacillus cell-associated xylanase with high activity on aryl-xylosides: a new subclass of family 10 xylanases' APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY vol. 61, no. 3, 2003, pages 226 - 233 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102181415A (zh) * 2011-03-08 2011-09-14 武汉新华扬生物股份有限公司 一种耐碱木聚糖酶xyl11-1及其基因和应用
CN103343112A (zh) * 2013-07-09 2013-10-09 武汉新华扬生物股份有限公司 一种高温碱性木聚糖酶xyn11a及其基因和应用
CN103343112B (zh) * 2013-07-09 2014-12-24 武汉新华扬生物股份有限公司 一种高温碱性木聚糖酶xyn11a及其基因和应用
CN108004186A (zh) * 2018-01-09 2018-05-08 北京工商大学 一种产可水解制备高聚合度ｘｏｓ木聚糖酶的菌株及应用

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