CN102181415A - 一种耐碱木聚糖酶xyl11-1及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及耐碱木聚糖酶XYL11-1及其基因和应用，其具有如SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列，编码上述木聚糖酶的基因，其具有如SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列，以及包含该基因的重组载体、重组菌株和重组酶的应用。本发明的木聚糖酶的具有以下性质：最适pH为6.5，在pH4.5-9.0之间有50％以上的酶活；具有良好的pH稳定性，在pH4.5-12.0之间稳定。最适温度50℃，良好的热稳定性；比活2618U/mg极好的蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于造纸、动物饲料、鱼类饲料、食品、医药、酿酒、能源工业等。

Description

一种耐碱木聚糖酶XYL11-1及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐碱木聚糖酶XYL11-1及其基因和应用。

背景技术

木聚糖是半纤维素的重要组分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，广泛存在于在农业副产物如玉米芯、麦麸、米糠、秸秆、甘蔗渣等中(Prade.Biotech.and Gentic Engi.Rev..13(12)：101～131，1995)。木聚糖酶(xylanase，EC 3.2.1.8)以内切方式作用于木聚糖主链，产生不同链长的寡糖及少量的木糖，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。并分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。

木聚糖酶的工业化应用始于上世纪80年代，最初作为饲料酶制剂的一种应用于饲料行业，之后扩展到如食品(面包加工酿酒，果汁澄清)、纺织和造纸等行业。木聚糖酶的酶学性质决定了其在应用上的潜力及应用领域。例如在饲料工业用木聚糖酶应选择最适pH值在偏酸性范围内的，而造纸工业中，需要碱性木聚糖酶。近年来，有些嗜碱细菌分泌的木聚糖酶符合造纸工业的高碱性、高温的特殊要求，所以制浆造纸工业应用碱性耐高温木聚糖酶最多的行业。

人们对碱性木聚糖酶的研究较晚(Collins et al.FEMS Microbiol Rev，29(1)：3-23，2005)。在1973年，Horikoshi等(Horikoshi et al.Agric.Bio.Chem..3：2097～2103，1973)首次报道了产自细菌的木聚糖酶，从碱性细菌Bacillus sp.No.C-59-2中纯化出最适pH为6.0～8.0的木聚糖酶。从这之后，从许多碱性微生物中都分离得到了碱性木聚糖酶，这其中包括许多从Bacillus sp.中分离得到的第10和第11家族的碱性木聚糖酶(Khasin et al.Appl.Environ.Microbiol.59，1725-1730，1993；Takami et al.Nucleic Acids Res.28，4317-4331，2000)。真菌所产生的木聚糖酶一般为酸性的，但在2002年，Taneja等(Taneja K et al.Bioresour.Technol.85(1)：39～42，2002)筛选到一株嗜碱真菌Aspergillus nidulans KK299，它所产的木聚糖酶的最适pH为8.0，在pH4.0-9.5之间稳定。这是唯一报道的在碱性条件下有高活性的真菌来源的木聚糖酶。然而，随着木聚糖酶应用工业的发展，需要在在强碱环境下具有稳定性的木聚糖酶。

发明内容

本发明的目的是提供来源于真菌的耐碱木聚糖酶XYL11-1。

本发明的再一目的是提供上述木聚糖酶的基因xyl11-1。

本发明的再一目的是提供包含上述木聚糖酶基因xyl11-1的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述木聚糖酶基因xyl11-1的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备耐碱木聚糖酶XYL11-1的方法。

本发明的再一目的是提供上述耐碱木聚糖酶XYL11-1的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在造纸、饲料、食品、酿酒以及能源工业中应用新的耐碱木聚糖酶。本发明人从天然真菌Pseudallescheria sp.中克隆得到木聚糖酶XYL11-1，其适合于在造纸、饲料、食品、酿酒以及能源工业中使用。

从耐碱真菌中获得的一种耐碱木聚糖酶XYL11-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

1M FYSTLATVA LAITGAIASP AASPFDLMRR QGITPNSVGT HDGYYYSWWS

51 DGASPVTYTN LAGGSYSVQW QSGGNLVGGK GWKPGSAKNI TYSGTWTPVN

101 NGNSYLTVYG WTRNPLVEYY IIENFGEYNP GSSATPKGTV QTSEGTYNLF

151 QSTRVQQPSI EGTSTFNQYW AIRTEKRTGG TVDTGIFFDA WEKAGMPLGT

201 HDYMVVATEA YRSAGSSHIT VESPP*

其中，该酶基因编码225个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列“MFYSTLATVA LAITGAIA”。

因此，成熟的耐碱木聚糖酶XYL11-1的理论分子量为22.7kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

1SPAASPFDLM RRQGITPNSV GTHDGYYYSW WSDGASPVTY TNLAGGSYSV

51QWQSGGNLVG GKGWKPGSAK NITYSGTWTP VNNGNSYLTV YGWTRNPLVE

101YYIIENFGEY NPGSSATPKG TVQTSEGTYN LFQSTRVQQP SIEGTSTFNQ

151YWAIRTEKRT GGTVDTGIFF DAWEKAGMPL GTHDYMVVAT EAYRSAGSSH

201ITVESPP*

该木聚糖酶XYL11-1在酸性、中性和碱性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性，其最适pH值为6.5，在pH 4.5-9.0之间有50％以上的酶活；具有良好的pH稳定性，在pH 4.5-12.0之间稳定。最适温度50℃，良好的热稳定性；比活2618U/mg；极好的蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。这种性质的木聚糖酶还未曾有过报道。

本发明还提供了编码上述耐碱木聚糖酶XYL11-1的基因xyl11-1。

该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

1 ATGTTCTACT CTACTCTCGC CACGGTCGCC TTGGCCATCA CCGGCGCCATTGCCTCGCCG

61 GCCGCCTCGC CCTTCGATCT CATGAGGAGG CAAGGCATCA CTCCCAACTCGGTCGGCACC

121 CACGATGGTT ACTACTACTC TTGGTGGTCC GACGGCGCTT CCCCCGTTACCTATACCAAC

181 CTTGCGGGCG GCTCTTACAG CGTCCAGTGG CAGTCTGGTG GCAACTTGGTCGGTGGAAAG

241 GGTTGGAAGC CCGGGTCGGC TAAGAACATT ACCTACTCGG GAACCTGGACTCCGGTCAAC

301 AACGGCAACT CTGTAAGTTC CTCTAGATGG TTGGGAAAGT AGAAGAAGAGAAAGAAGGAG

361 ATGGAGTGTT TTGTAAGGGG AATGTGATTT GTTACAGCAC GAATGCTGACCCTATCCCCC

421 CCTCCCCCAA ACACCTCACT GTCTACGGCT GGACCCGTAA TCCCTTGGTCGAGTACTACA

481 TCATCGAAAA CTTCGGCGAG TACAACCCCG GAAGCTCCGC CACGCCCAAGGGCACCGTCC

541 AGACGTCGGA AGGCACGTAT AATCTCTTCC AGAGCACGCG TGTACAGCAGCCTTCCATCG

601 AGGGAACCTC CACATTCAAT CAGTACTGGG CCATCCGAAC CGAGAAGCGCACCGGCGGCA

661 CTGTTGACAC TGGTATCTTC TTCGATGCTT GGGAGAAGGC CGGTATGCCTCTCGGCACTC

721 ATGACTACAT GGTCGTCGCT ACCGAGGCTT ACAGGAGCGC TGGTAGCTCTCACATCACTG

781 TCGAGTCTCC TCCTTGA

本发明通过PCR的方法分离克隆了这一木聚糖酶基因xyl11-1，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYL11-1结构基因xyl11-1全长797bp，含有一个内含子，cDNA长678bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.4：

1 ATGTTCTACT CTACTCTCGC CACGGTCGCC TTGGCCATCA CCGGCGCCATTGCCTCGCCG

61 GCCGCCTCGC CCTTCGATCT CATGAGGAGG CAAGGCATCA CTCCCAACTCGGTCGGCACC

121 CACGATGGTT ACTACTACTC TTGGTGGTCC GACGGCGCTT CCCCCGTTACCTATACCAAC

181 CTTGCGGGCG GCTCTTACAG CGTCCAGTGG CAGTCTGGTG GCAACTTGGTCGGTGGAAAG

241 GGTTGGAAGC CCGGGTCGGC TAAGAACATT ACCTACTCGG GAACCTGGACTCCGGTCAAC

301 AACGGCAACT CTTACCTCAC TGTCTACGGC TGGACCCGTA ATCCCTTGGTCGAGTACTAC

361 ATCATCGAAA ACTTCGGCGA GTACAACCCC GGAAGCTCCG CCACGCCCAAGGGCACCGTC

421 CAGACGTCGG AAGGCACGTA TAATCTCTTC CAGAGCACGC GTGTACAGCAGCCTTCCATC

481 GAGGGAACCT CCACATTCAA TCAGTACTGG GCCATCCGAA CCGAGAAGCGCACCGGCGGC

541 ACTGTTGACA CTGGTATCTT CTTCGATGCT TGGGAGAAGG CCGGTATGCCTCTCGGCACT

601 CATGACTACA TGGTCGTCGC TACCGAGGCT TACAGGAGCG CTGGTAGCTCTCACATCACT

661 GTCGAGTCTC CTCCTTGA

其中，信号肽的碱基序列为：ATGTTCTACT CTACTCTCGC CACGGTCGCCTTGGCCATCA CCGGCGCCAT TGCC。

将木聚糖酶基因xyl11-1cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，其与来源于Glomerella graminicolaM1.001的11家族木聚糖酶核苷酸序列一致性为67％，氨基酸序列一致性为65％。说明XYL10A是一种新的木聚糖酶。并为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因的重组载体，优选为pPIC9-xyl11-1。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xyl11-1。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/xyl11-1。

本发明还提供了一种制备耐碱木聚糖酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶的表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/xyl11-1。

本发明还提供了上述耐碱木聚糖酶的应用。

本发明的耐碱木聚糖酶XYL11-1在酸性、中性和碱性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性，其最适pH值为6.5，在pH 4.5-9.0之间有50％以上的酶活；具有良好的pH稳定性，在pH 4.5-12.0之间稳定，这是现有技术中的木聚糖酶所不能达到的。最适温度50℃，良好的热稳定性；比活2618U/mg；极好的蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。本木聚糖酶在碱性条件下有高活性，可应用于造纸工业。同时在酸性和中性条件下有高活性，符合动物消化生理特点、pH适应范围提高饲料消化能和代谢能，降低配方成本，减少环境污染；提高谷物加工副产品的营养价值，提升饲料产品品质。本木聚糖酶可应用于酿酒工业，降低物料粘度，可以有利于淀粉酶作用于淀粉层，提高淀粉利用率，增加酒精的产率。本木聚糖酶在能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。水解产物(木糖和低聚木糖)可应用在食品行业，作为增稠剂、脂肪代替物和抗冻食品添加剂；在制药工业中木聚糖与其它物质结合使用，可以延缓药物成分的释放。木聚糖的水解产物还可以进一步转化为液体燃料、单细胞蛋白、溶剂和低热量甜味剂。

附图说明

图1为xyl11-1在毕赤酵母中表达的木聚糖酶的SDS-PAGE分析，1，分子量标准；2，纯化的重组木聚糖酶；3，发酵培养上清。

图2为本发明重组木聚糖酶的最适pH值。

图3为本发明木聚糖酶的pH稳定性。

图4为本发明木聚糖酶最适反应温度。

图5为本发明木聚糖酶热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)Pseudallescheria sp.JSM-2培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH10.0。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1木聚糖酶编码基因xyl11-1的克隆

耐碱真菌Pseudallescheria sp.可以在pH 10-12生长，提取其基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第十一家族木聚糖酶基因的保守(YLA(T)VYGW和STFNQY)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1：5′-TACCTTRCYNTSTAYGGHTGG-3′；

P2：5′-ATRTAYTGRTTRAANGTNGA-3′

其中，Y＝C或T；R＝A或G；N＝A或T或C或G；H＝A或T或C。

以耐碱真菌Pseudallescheria sp.总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性3min；然后94℃变性30sec，46℃退火30sec，72℃延伸1min，32个循环后72℃保温10min。得到一约190bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～35nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.木聚糖酶XYL11-1TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。测序结果如SEQ ID NO.3所示。

实施例2木聚糖酶基因xyl11-1的RT-PCR分析

提取耐碱真菌Pseudallescheria sp.的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计恰当的引物(Xyl11-1F：5′ATGTTCTACTCTACTCTCGCCACGGTCGC-3′，Xyl11-1R：5′-TCAAGGAGGAGACTCGACAGTGATGTGAGAG-3′)扩增该单链cDNA，获得木聚糖酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。测序结果如SEQ ID NO.4所示。

通过比较木聚糖酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因有1个内含子，cDNA长678bp，编码225个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列。所测出的基因xyl11-1的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的木聚糖酶基因序列进行同源比较，最高一致性为67％，氨基酸序列最高一致性为65％，证明从Pseudallescheria sp.、中分离克隆得到的编码木聚糖酶的基因为新基因。

实施例3重组木聚糖酶的制备。

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码木聚糖酶的基因xyl11-1双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Pseudallescheria sp.JSM-2木聚糖酶基因xyl11-1的重组质粒pPIC-xyl11-1并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/xyl11-1。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导48h后，离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。重组木聚糖酶的表达量为37U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。

实施例4重组木聚糖酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH6.5，50℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例5重组木聚糖酶XYL11-1的性质测定

1、重组木聚糖酶XYL11-1的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例4纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中50℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图2)表明，XYL11-1的最适pH为6.5，在pH 4.5～9的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的50％以上。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH6.5缓冲液体系中50℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明，木聚糖酶在pH 4.5～12.0的范围内稳定，说明此酶具有较好的耐碱性。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在50℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，其最适温度为50℃。酶的热稳定性性试验表明，40℃处理60min后，剩余酶活还有60％左右，50℃处理处理10min后，酶活性依然维持在25％以上。

3、木聚糖酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的木聚糖(4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，Sigma From birchwood)为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.5)缓冲液体系中，50℃下测定酶活性，计算出其在50℃下的k_m值。经测定，此木聚糖酶在50℃下以木聚糖为底物的k_m值为4.05mg/mL，最大反应速度V_max为1127μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对XYL11-1酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为5和10mmol/L。在50℃、pH6.5条件下测定酶活性。结果表明：低浓度的Cu²⁺和β-巯基乙醇对木聚糖酶XYL11-1有明显的激活作用。低浓度的Mg²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Pb³⁺和SDS对酶活有轻微的抑制作用。其余金属离子在低浓度时对XYL11-1的酶促反应无显著影响。高浓度的Cr³⁺和β-巯基乙醇对酶活有明显的激活作用。高浓度的Co²⁺、Fe³⁺和Pb³⁺、Mn²⁺和SDS对酶活有部分(＜40％)的抑制作用。高浓度的Cu²⁺对酶活有很强的抑制作用，Hg²⁺可使酶完全失活。高浓度的其它离子对酶活影响不大。

5、木聚糖酶抗蛋白酶能力测定如下：

将纯化的XYL11-1(100μgml^-1)与不同的蛋白酶，包括：胰蛋白酶(pH 7.6，25℃)，一α-胰凝乳蛋白酶(pH 7.8，25℃)，胶原蛋白酶(pH 7.4，37℃)，枯草杆菌蛋白酶A(pH7.4，37℃)和蛋白酶K(pH 7.5，37℃)，按1∶10(蛋白酶：XYL11-1，w/w)的比例混合温浴。温浴30分钟或60分钟后，在pH 6.5及50℃条件下测定酶活性。实验结果表明木聚糖酶XYL11-1用胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，胶原蛋白酶和蛋白酶K处理30min或60min后，木聚糖酶的活力均维持在90％以上。枯草杆菌蛋白酶A胃处理后的XYL11-1的酶活是处理前的70-80％。说明XYL11-1有很强的抗蛋白酶降解的能力。

Claims (10)

1.一种耐碱木聚糖酶XYL11-1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种耐碱木聚糖酶XYL11-1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种耐碱木聚糖酶基因xyl11-1，其特征在于，编码权利要求1或2所述的木聚糖酶XYL11-1。

4.如权利要求3所述的木聚糖酶基因xyl11-1，其特征在于，其碱基序列如SEQID NO.3所示。

5.如权利要求3所述的木聚糖酶基因xyl11-1，其特征在于，其碱基序列如SEQID NO.4所示。

6.包含权利要求3、4、或5所述木聚糖酶基因xyl11-1的重组载体。

7.包含权利要求3、4或5所述木聚糖酶基因xyl11-1的重组载体pPIC9-xyl11-1。

8.包含权利要求3、4或5所述木聚糖酶基因xyl11-1的重组菌株。

9.一种制备碱性木聚糖酶XYL11-1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求6重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶的表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYL11-1。

10.权利要求1或2所述的耐碱木聚糖酶XYL11-1的应用。

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