CN117384891B - 一种热稳定性提高的酸性木聚糖酶及其基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的酸性木聚糖酶及其基因与应用。本发明通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的XYN10L1序列进行V65Y，H214N，S291A，S342P突变，得到了突变体XYN10L1M。本发明的木聚糖酶XYN10L1M与XYN10L1相比，耐热性提高10℃，在85℃高温下保持5min仍维持85%酶活，而XYN10L1在85℃下5min仅能维持60%的酶活；本发明的木聚糖酶具有以下性质：在pH2.0‑7.0都有较高的酶活性，pH稳定性好；具有良好的热稳定性。开发前景良好，可使其在需求高温和酸性环境的工业生产生中得到应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的酸性木聚糖酶及其基因与应用。
背景技术
半纤维素和纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，是自然界中重要的可再生资源之一，广泛应用于医药、食品、造纸、畜牧等行业。半纤维素是由D-甘露糖、D-木糖、L-阿拉伯糖或D-乳糖以直链或支链形式聚合而成的多聚糖。其中木聚糖是半纤维素的重要组分，几乎占据可更新有机碳总量的三分之一。木聚糖广泛存在于农业副产品，如玉米芯、麦麸、秸秆、甘蔗渣中，这些重要的可再生资源的有效利用一直是个难题。此外，在造纸行业的制浆过程中，含有丰富木聚糖的工业废料往往被直接排入水体，导致水体富营养化严重，破坏生态环境。另一方面，作为低聚木糖的水解产物，低聚木糖是一种具有高附加值和良好市场前景的功能性食品添加剂。
木聚糖酶应用广泛，现已应用于饲料工业、食品工业、制浆造纸等多个行业，在饲料行业，木聚糖酶可有效破坏木聚糖分子中的共价交联，降低阿拉伯木聚糖分子大小，进而降低食糜粘度，降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在食品行业中，木聚糖酶水解谷物面包粉中的木聚糖产生木寡糖，使水在戊聚糖相和谷蛋白相中重新分布，从而改善面包的质地、结构、松软度和保质期。在果汁和啤酒中，木聚糖酶能够降解果汁和啤酒中的一些多糖类物，利于果汁和啤酒的澄清。在制浆造纸行业中，经木聚糖酶处理后的漂白过程所用氯化漂白剂的用量可以相应降低至原来20%-40%漂白剂用量，且经木聚糖酶处理后的浆料耐破指数、撕裂指数和白度等参数均有提高。
专利CN 109997970 B提供了一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用，具体是在篮状菌属Talaromyces来源的酸性木聚糖酶XYNTF0的基础上通过大量突变和筛选获得的木聚糖酶突变体XYNTF01、XYNTF02、XYNTF03、XYNTF04和XYNTF05；相比于未突变的木聚糖酶，该发明得到的木聚糖酶突变体的酶活和耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的开发和应用。
专利CN 105087524 B提供一种耐高温木聚糖酶突变体。所述木聚糖酶突变体的最适作用pH值均为5.5，与野生型木聚糖酶XynPF一致，但最适作用温度为60℃，且比野生型木聚糖酶具有更强的耐热性。其中，木聚糖酶突变体XynB1在65℃条件下处理5 min后能保持43%左右的酶活，在75℃、80℃条件下处理5 min后仍能保持25%和20%左右的酶活，木聚糖酶突变体XynB2和XynB3在65℃条件下处理5 min后能保持80%以上的酶活，在75℃条件下处理5 min后仍能保持40%左右的酶活，80℃条件下处理5 min后仍能保持25%以上的酶活。所述木聚糖酶突变体可广泛应用于饲料领域，前景广阔。
由于不同工业对木聚糖酶性质需求不同，因此，获得新型具有优良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意义。开发具有高温酸性的木聚糖酶可以更好的应用于饲料、酿酒，食品工业。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种性质优良的、适合于在饲料、食品、制浆造纸等行业中应用的耐热酸性木聚糖酶。
一方面，本发明提供了一种耐热性提高的木聚糖酶突变体XYN10L1M，所述的木聚糖酶突变体XYN10L1M氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
又一方面，本发明提供了编码前述的木聚糖酶突变体XYN10L1M的核酸。
具体地，所述核酸的序列为SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO.2具有90%以上序列同源性的序列。
优选地，所述核酸的序列为SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO.2具有95%以上序列同源性的序列。
进一步优选地，所述核酸的序列为SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO.2具有98%以上序列同源性的序列。
又一方面，本发明提供了包括前述的核酸的重组载体。
具体地，所述的载体可以是质粒、噬菌体和病毒中的一种。
优选地，所述的载体是质粒。
进一步优选地，所述的载体是pPIC9K质粒。
具体地，将核酸插入到质粒pPIC9K上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间。
又一方面，本发明提供了包括前述的核酸或重组载体的细胞。
具体地，所述的细胞为真核细胞或原核细胞。
优选地，所述的细胞可以是酿酒酵母菌、红法夫酵母菌或毕赤酵母菌。
进一步优选地，所述的细胞为毕赤酵母菌。
更进一步优选地，所述的细胞是毕赤酵母菌GS115。
又一方面，本发明提供了一种动物饲料添加剂，所述的动物饲料添加剂包括前述的木聚糖酶突变体XYN10L1M。
具体地，所述的动物包括但不限于：鸡、鸭、猪、牛和鱼。
又一方面，本发明提供了前述的木聚糖酶突变体XYN10L1M在用于制备动物饲料添加剂中的应用。
具体地，所述的动物包括但不限于：鸡、鸭、猪、牛和鱼。
又一方面，本发明提供了前述的木聚糖酶突变体XYN10L1M在酿酒中的应用。
具体地，所述的酒包括但不限于：葡萄酒、啤酒、米酒和果酒。
又一方面，本发明提供了一种制备木聚糖酶突变体XYN10L1M的方法，包括以下步骤：
（1）用前述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
（2）培养重组菌株，诱导木聚糖酶突变体XYN10L1M表达；
（3）回收并纯化所表达的木聚糖酶突变体XYN10L1M。
具体地，所述的细胞可以是用于表达蛋白的基因工程细胞，包括但不限于：植物细胞、动物细胞、细菌、酵母。
进一步具体地，所述的细胞可以是工程菌。
优选地，为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
进一步优选地，毕赤酵母菌GS115。
本发明所取得的技术效果：本发明的木聚糖酶最适pH为4.5，在pH2.0-7.0都有较高的酶活性，pH稳定性好；其热稳定性高，在30-65℃下均保持较高酶活，在85℃下温育5min，能保持85%以上的酶活，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。
附图说明
图1为重组木聚糖酶XYN10L1及其突变体XYN10L1M的最适pH。
图2为重组木聚糖酶XYN10L1及其突变体XYN10L1M的pH稳定性。
图3为重组木聚糖酶XYN10L1及其突变体XYN10L1M的最适温度。
图4为重组木聚糖酶XYN10L1及其突变体XYN10L1M的热稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试验材料和试剂
1、菌株及载体：本发明中木聚糖酶突变体基因xyn10L1M由北京睿博兴科生物技术有限公司合成获得，毕赤酵母表达载体pPIC9K及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶与连接酶购自TaKaRa公司，EcoRI货号为1611，NotI内切酶货号为1623，连接酶货号为2011A。甘露聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
（1）酵母培养基YPD（100mL）：1g蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g葡萄糖，2g琼脂，pH7.0。
（2）大肠杆菌培养基LB（100mL）：1g蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g NaCl，pH 7.0。
（3）BMGY培养基（100mL）：1g酵母提取物，2g蛋白胨，1.34g YNB，0.00004g 生物素，1g甘油。
（4）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油，其余成分均与BMGY相同，pH 4.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1里氏木霉（Trichoderma reesei）木聚糖酶突变体编码基因xyn10L1M的合成
里氏木霉的木聚糖酶XYN10L1的序列如SEQ ID NO.3所示；在其序列SEQ ID NO.3的N端连接信号肽序列SEQ ID NO.4。
本发明以来自于里氏木霉的木聚糖酶XYN10L1的序列（SEQ ID NO.3）作为参考，对其序列进行如下突变（V65Y，H214N，S291A，S342P），并在突变后序列的5’端与3’端分别加入EcoR I和Not I限制酶切位点，将序列发送至北京睿博兴科生物技术有公司进行人工合成基因。人工合成的木聚糖酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
SEQ ID NO.1序列如下：
LDTWAKKAGLKYFGSATDSPGQRERAGLEASYPQYDAIMRDTAEFGQTTPTNGMKWLFTEPEQGYFNYTEGEIVASIARETGDYLRCHALVWHSQLAPWVETTEWTPEELTEVIVRHITEVAGHWKGRCYAWDVVNEALLDDGTWRPSVFYNVLGEDFIKLAFRTAAEVDPHAKLYYNDYNLESPGPKVTGAQNIVKMLKTAGIRIDGVGLQSNLVAESHPTLDQHIDAIRSFSSLGVEVALTELDVRLTLPANATNLAEQNDAYKNIVGACVQVRGCIGVTIWDFYDPFAWVPPGPKVTGAQNIVKMLKTAGIRIDGVGLQSHLVAESHPTLDQHIDAIRPFSSLGVEVALTELDVRLTLPANATNLAEQNDAYKNIVGACVQVRGCIGVTIWDFYDPFSWVP；
SEQ ID NO.2序列如下：
TTAGATACATGGGCAAAGAAAGCTGGCTTGAAATATTTTGGGTCGGCCACAGACAGTCCTGGGCAGCGGGAACGGGCTGGACTCGAGGCGAGTTACCCGCAATACGATGCAATTATGCGAGACACGGCAGAATTTGGTCAAACGACTCCCACTAATGGTATGAAATGGCTATTTACGGAGCCTGAGCAGGGGTATTTCAACTATACCGAAGGGGAGATCGTGGCCTCGATTGCAAGAGAAACCGGTGATTACCTCCGATGTCATGCTTTAGTTTGGCACTCACAGCTTGCCCCATGGGTCGAGACGACAGAGTGGACACCGGAAGAACTGACGGAAGTTATAGTTCGGCACATAACCGAGGTGGCGGGTCACTGGAAGGGGCGATGTTATGCATGGGATGTGGTTAATGAAGCCTTACTTGATGATGGCACCTGGCGTCCTTCCGTATTTTATAACGTTTTAGGCGAGGACTTTATTAAATTGGCTTTCAGGACGGCAGCCGAAGTGGACCCTCATGCAAAACTTTACTATAACGATTACAATCTCGAGTCGCCCGGCCCGAAGGTCACGGGAGCTCAAAATATCGTAAAAATGCTGAAGACAGCTGGAATACGTATAGACGGTGTGGGTCTGCAAAGCAACTTGGTTGCTGAGTCACATCCCACCCTAGATCAACACATTGACGCGATTAGGTCATTCAGCTCCCTTGGTGTAGAGGTGGCCCTAACGGAACTGGACGTAAGGCTGACTCTTCCAGCGAATGCAACTAACCTAGCCGAACAAAATGATGCTTACAAGAACATAGTCGGGGCCTGCGTACAGGTGCGCGGATGCATCGGTGTTACAATATGGGATTTCTATGACCCATTTGCTTGGGTGCCTCCGGGACCAAAGGTTACTGGAGCTCAAAATATCGTCAAAATGCTAAAGACTGCGGGAATCCGCATTGATGGCGTCGGTCTCCAGTCTCATTTGGTTGCAGAGTCCCACCCCACTCTTGACCAACATATAGACGCGATCAGACCTTTCTCTTCTTTAGGCGTCGAAGTCGCGCTGACCGAGTTAGATGTACGTCTCACATTACCAGCGAACGCGACTAACTTGGCTGAACAGAATGATGCCTACAAGAACATTGTAGGAGCGTGCGTACAGGTTAGAGGCTGTATCGGGGTCACCATCTGGGACTTCTATGACCCGTTTTCTTGGGTCCCC
SEQ ID NO.3序列如下：
LDTWAKKAGLKYFGSATDSPGQRERAGLEASYPQYDAIMRDTAEFGQTTPTNGMKWLFTEPEQGVFNYTEGEIVASIARETGDYLRCHALVWHSQLAPWVETTEWTPEELTEVIVRHITEVAGHWKGRCYAWDVVNEALLDDGTWRPSVFYNVLGEDFIKLAFRTAAEVDPHAKLYYNDYNLESPGPKVTGAQNIVKMLKTAGIRIDGVGLQSHLVAESHPTLDQHIDAIRSFSSLGVEVALTELDVRLTLPANATNLAEQNDAYKNIVGACVQVRGCIGVTIWDFYDPFSWVPPGPKVTGAQNIVKMLKTAGIRIDGVGLQSHLVAESHPTLDQHIDAIRSFSSLGVEVALTELDVRLTLPANATNLAEQNDAYKNIVGACVQVRGCIGVTIWDFYDPFSWVP
SEQ ID NO.4序列如下：
MHVKSLTVPLLAASLPLVSGQ
实施例2 木聚糖酶突变体基因xyn10L1M的克隆
合成好的基因载体以穿刺菌的形式保存，于超净台中用无菌牙签挑取穿刺菌，并置于含Amp（工作浓度：100μg/mL）抗生素的LB摇管中，37℃，220rpm过夜培养，次日按康为世纪质粒提取试剂盒PurePlasmid Mini Kit（CW0500）说明书步骤进行实验提取含有突变体基因的载体。
根据木聚糖酶突变体基因序列，设计并合成了如下引物：
P1（SEQ ID NO.5）:
5'- GTAGAATTCTTAGATACATGGGCAAAGAAAGCTGG-3'；
P2（SEQ ID NO.6）:
5'-ATTCGCGGCCGCAAATTCAGGGGACCCAAGAAAACGGG-3'。
以提取后的载体为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5 min；然后94℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸1 min，30个循环后72℃保温10 min。得到约1240bp片段，将该片段回收后与pMD19载体相连送北京睿博兴科生物技术有限公司测序，预测蛋白分子量为44.7kDa。
根据测序得到的核苷酸序列，通过DNAMan软件将得到的核苷酸序列与xyn10L1序列进行比对，确认V65Y，H214N，S291A，S342P四处位置的突变无误。
实施例3 重组木聚糖酶的制备
将表达载体pPIC9K进行双酶切(EcoR I+NotI)，同时将编码木聚糖酶突变体的基因xyn10L1M双酶切(EcoR I+NotI)，酶切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9K连接，将木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9K上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，获得含有木聚糖酶基因xyn10L1M的重组质粒pPIC9K- xyn10L1M并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/xyn10L1M。
取含有重组质粒的GS115菌株与对照菌株（即未突变的菌株GS115/xyn10L1），接种于300 mL BMGY培养液中，30℃ 200 rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃ 200 rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清，测定木聚糖酶的活力。
实施例4 重组木聚糖酶XYN10L1M的活性分析
DNS法：具体方法如下：在pH 5.0，45℃条件下，1mL的反应体系包括100 uL适当的稀释酶液，900 uL底物，反应10 min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5 min，冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。重组木聚糖酶XYN10L1M酶活为267U/mL，未突变木聚糖酶XYN10L1M为250U/mL。
实施例5 重组木聚糖酶XYN10L1M的性质测定
1、重组木聚糖酶XYN10L1M的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
将纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中45℃下进行木聚糖酶活力测定。结果（图1）表明，重组酶XYN10L1M的最适pH为4.5，在pH2.0-6.5有60%以上的相对酶活性，酶活较XYN10L1相比整体有提高。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH4.5缓冲液体系中45℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果（图2）表明木聚糖酶在pH2.0-7.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后后剩余酶活性在50%以上，相对酶活较XYN10L1相比有整体提高，这说明此酶在酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。
2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH5.0）缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在65-85℃下处理5min，再在45℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果（图3）表明其最适温度为45℃，在30-65℃下均保持较高酶活。酶的热稳定性性试验表明（图4），XYN10L1M有良好的热稳定性，在85℃下温育5min，能保持85%以上的酶活。而XYN10L1剩余酶活仅剩60%，与其相比，XYN10L1M热稳定性提升显著，具有良好的耐热性。
对比例
本发明提供了重组木聚糖酶XYN10L1Q，该酶的氨基酸序列为在SEQ ID NO.3基础上进行了V65Y，H214D，G301A突变，具体XYN10L1Q突变体及XYN10L1MQ重组酶制备方法如上述实施例。并参照本发明稳定性测定方法对重组木聚糖酶XYN10L1Q进行热稳定性测试。结果表明，在85℃下温育5min，XYN10L1Q仅剩55%的酶活。
Claims (10)
1.一种耐热性提高的木聚糖酶突变体XYN10L1M，其特征在于，所述的木聚糖酶突变体XYN10L1M氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述的木聚糖酶突变体XYN10L1M的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸的序列为SEQ ID NO.2。
4.包括权利要求2或3任一项所述的核酸的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的载体是质粒、噬菌体和病毒中的一种。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述的载体是pPIC9K质粒。
7.包括权利要求2-3任一项所述的核酸或权利要求4-6任一项所述的重组载体的细胞。
8.根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述的细胞为真核细胞或原核细胞。
9.一种动物饲料添加剂，其特征在于，所述的动物饲料添加剂包括权利要求1所述的木聚糖酶突变体XYN10L1M。
10.权利要求1所述的木聚糖酶突变体XYN10L1M在制备动物饲料添加剂中的应用。
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