JP5048651B2

JP5048651B2 - ペニシリウム・フニクロサムのａｂｆＢ−１遺伝子

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Publication number: JP5048651B2
Application number: JP2008509475A
Authority: JP
Inventors: フランソワ、ジャン・マリー; パロー、ジャン−リュック; トゥーラス、オリビエ; ノア、オリビエ
Original assignee: Adisseo France SAS
Current assignee: Adisseo France SAS
Priority date: 2005-05-04
Filing date: 2006-05-03
Publication date: 2012-10-17
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Description

本発明は、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）から単離されたａｂｆＢ−１遺伝子およびこの遺伝子にコードされα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ（ａｒａｂｉｎｏｈｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅＢ）活性を有するＡＢＦＢ−１ポリペプチドに関する。

ペニシリウム・フニクロサムは、アスペルギルスファミリー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｅａｅｆａｍｉｌｙ）に属すタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）である。空気中または水中の汚染を受けやすい多数の有機基質から、この微生物が単離されることから、この真菌が、驚くほど豊かに幅広い加水分解酵素を有していることがわかる。動物用食品におけるこの酵素カクテルの使用は、天然有機物の脱重合に寄与し、それらの消化の改善を可能にする。ＷＯ９９／５７３２５には、このようなＩＭＩ３７８５３６と呼ばれるペニシリウム・フニクロサム株が記載されており、これは、特に動物用食品に適した酵素の混合物を生産する。しかしながら、ペニシリウム・フニクロサムが生産する酵素カクテルについては、幅広い生化学的な特徴づけがなされていなかった。実際、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼといったわずかな数の酵素活性のみしか、得られた発酵ブロスにおいて一般に評価されていない。これらの活性は、カクテルに存在する酵素集団の一部分のみしか反映していない。

農業由来のヘミセルロース分解（Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ）化合物は、植物組織において、セルロースに次ぐ第２の多糖貯蔵体となっている。このグループは、多種多様なヘテロ多糖によって特徴づけられ、その代表例は、キシラン、アラビナン、ガラクタン、グルカンおよびマンナンである。アラビノースは、フルフラール体として、アラビナンおよびアラビノキシラン（ａｒａｂｉｎｏｘｙｌａｎｓ）といったヘテロ多糖中に広く見受けられる。アラビナンは、α−１−５結合で連結されるアラビノフラノース（ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｅ）残基による重合体であり、Ｏ−２またはＯ−３位において、１または２のアラビノース残基で置換されていてもよい。アラビノキシランに関しては、α−Ｌ−アラビノフラノシル（ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）残基は、α−１−３およびα−１−２結合によって、本体のβ−１−４−キシロピラノシル（ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）鎖に連結する。これらの側鎖にアラビノース残基が存在すると、動物食品の消化性の強化といった様々な産業的応用において、ヘミセルロース分解化合物の酵素性加水分解が制限される。α−Ｌ−アラビノフラノシド（ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ）結合を切断する酵素は、キシラナーゼと共同して作用でき、アラビノキシランおよびアラビナンの加水分解をもたらす。

アラビナーゼ（ａｒａｂｉｎａｓｅ）活性（エンド、エキソ−アラビナーゼおよび、主に、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性）は、従って、キシラナーゼとともに、能動的におよび相乗的にヘミセルロース分解化合物の脱重合に寄与できる。ヘミセルロース分解化合物およびペクチン化合物は、植物に存在する全炭水化物の５０％に達する可能性があり、それらは動物にとって主要なエネルギー源を構成する。これらの化合物の消化性の強化は、ヘミセルロース分解化合物内におけるアラビノシル（ａｒａｂｉｎｏｓｙｌ）残基の置換の程度の減少と関連する（Ｂｒｉｃｅ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．１９８２，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１０１：９３−１００）。

Ｌ−アラビノース残基間の結合を加水分解する酵素は、細菌または糸状菌といった微生物から単離された。アラビノシダーゼ（Ａｒａｂｉｎｏｓｉｄａｓｅｓ）は、主に、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）から成り、これは、Ｌ−アラビノキシランまたはアラビナンおよびアラビノガラクタンといった化合物を由来とする、非還元型α−Ｌ−アラビノフラノシル残基を加水分解することができる。

α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）は、それらのタンパク質配列類似性に従って糖質加水分解酵素（ＧｌｙｃｏｓｉｄｅＨｙｄｒｏｌａｓｅｓ）（ＧＨ５１およびＧＨ５４）の２つのファミリーに分類された。これらの２のファミリーは、多糖体に含まれる基質に対する特異性によって異なる。第１グループ（ＧＨ５１）は、Ａ型アラビノフラノシダーゼを含み、これは、小さい線形構造をもったα−１−５連結アラビノフラノシルオリゴ糖に対してのみ作用する。第２グループは、Ｂ型アラビノフラノシダーゼ（ＧＨ５４）から成り、これは、アラビノフラノシル−オリゴ糖化合物に含まれる、側鎖のα−１，５、α−１，３およびα−１，２結合の加水分解を触媒する。

Ｂアラビノフラノシダーゼ（ＡＢＦＢ）は、多数のバクテリアから単離されたが、糸状菌からも単離された。アスペルギルス属で、最も広く見受けられたが、それらはまた、トリコデルマ属、ペニシリウム属およびフザリウム属からも単離された。

ＷＯ９６／２９４１６、ＷＯ９６／０６９３５、ＷＯ２００４／０１８６６２およびＵＳ５，９８９，８８７は、アスペルギルス・ニガーのアラビノフラノシダーゼ遺伝子について記載している。タンパク質配列配置から、Ａ．ニガーａｂｆＢタンパク質が、Ｐ．フニクロサムＡＢＦＢ−１のタンパク質と７２．４％同一であることが示された。これらの出願には、動物栄養におけるポリペプチドの使用に不可欠な特徴が全く記述されていない。

Ｃｌｉｎｃｈｅらは、潜在的に葡萄酒研究に応用されるアスペルギルス・テレウス（ｔｅｒｒｅｕｓ）に由来する３つのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼについて記載している（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．（４５）２３７９２３８３１９９７）。

Ｇｉｅｌｋｅｎｓらは、アスペルギルス・ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｂｆＢ遺伝子について記載している（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４５，７３５−７４１，１９９９）。

アスペルギルス・カワチ（ｋａｗａｃｈｉｉ）およびアスペルギルス・アワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）のａｂｆＢ遺伝子は、Ｋｏｓｅｋｉらによって記述された（Ｊ．ｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９６，Ｎｏ．３，２３２−２４１，２００３）。これらの酵素は、日本のアルコール飲料である焼酎の発酵に応用されている。

糸状菌トリコデルマ・レエゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）由来のａｂｆＢ遺伝子は、Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋらによって記載された（ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３８４０−３８４６，１９９６）。

Ｐａｎａｇｉｏｔｏｕらはまた、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来の２つの細胞外アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを記載している（ＣａｎＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３：４９（１０）：６３９−４）。

Ｃａｒｖａｌｌｏらは、ペニシリウム・プルプロゲナム（ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）由来のＢ α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼについて記載している（Ｍｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．，１０７（４），３８８−３９４，２００３）。タンパク質配列配置は、Ｐ．プルプロゲナムａｂｆ１タンパク質は、Ｐ．フニクロサムＡＢＦＢ１タンパク質と８５．６％同一であることを示している。この論文中では、動物の栄養におけるポリペプチドの使用に不可欠な特徴について、全く記述されていない。

にもかかわらず、ペニシリウム・クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ａｂｎｘ遺伝子が、ＡＢＦＢ活性とはことなるアラビナーゼ活性をコード化することをＳａｋａｍｏｔｏらが記載している（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ５６０，１９９−２０４，２００４）。

しかしながら、これらのＡＢＦＢ酵素は、動物用食品への応用に要求される最適な特性を有していない。実際、動物用食品に利用するためには、ＡＢＦＢは、この飼料供給を目的とする飼料が供される処置に適合した性質を有していなければならない。特に、使用される酵素の活性は、処理される温度およびｐＨの条件において安定していなければならず、可能であれば、これらの飼料の製剤に最適であり、および、これらの飼料を消化する動物の消化器系の条件に最適でなければならない。

さらに、これらの酵素は、動物による飼料の消化性を効果的に強化させるため、ヘテロ多糖（アラビナン、アラビノキシランおよびアラビノガラクタン）に対して、幅広く作用（脱分枝）しなければならない。この飼料の消化性の強化は、それらの栄養価を増加させることを可能にする。したがって、天然の基質アラビノキシランおよびアラビナンに対する特異的（立体特異的、エナンチオ選択的）活性または親和性が増強した酵素は、動物飼料として大きな関心がある。

本発明は、動物栄養への応用に適したペニシリウム・フニクロサムのＬ−アラビノフラノシダーゼＢ（ＡＢＦＢ１）およびこの酵素をコード化する遺伝子について記載する。本発明はまた、同じ触媒性質を保存するＡＢＦＢ１の相同体、変種（ｖａｒｉａｎｔｓ）および断片に関する。

好都合には、本発明によるＡＢＦＢ酵素は、高い至適温度を有する。

本発明の別の長所は、セルロース分解およびヘミセルロース分解酵素を誘導するための条件（セルロース分解およびヘミセルロース分解酵素の生産のための産業用培養培地）にて、ペニシリウム・フニクロサムのＡＢＦＢ１の発現が、この真菌中で天然に誘導されることである。

本発明による酵素はまた、その他の産業的または農工業的応用性を有する。特に、果物ジュースの処理、紙の製造、燃料または化学製品へのヘミセルロース分解性バイオマスの転換、発酵によるアルコール飲料の製造に言及してよい。

発明の詳細な説明

本発明は、以下のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含む、動物栄養における使用に適したポリペプチドに関する：
− ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチド、
− その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．２の位置２８から位置５０７の間の配列であるポリペプチド、
− α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を有するＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドの断片、
− α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を有しおよびＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド。

本発明はまた、以下のポリヌクレオチドから選択される、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性をコードするポリヌクレオチドに関する：
− その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置８４５から位置２３６８の間の配列であるポリヌクレオチド、
− その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置９２７から位置２３６８の間の配列であるポリヌクレオチド、
− 上記にように定義したポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

本発明の別の対象は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１によって表される配列またはＳＥＱＩＤＮｏ．１と相補的な配列を有するポリヌクレオチドである。

本発明はまた、以下を含む、転写の調節における、発現カセットに関する：
− 宿主生物において機能的であるプロモーター；
− 本発明によるポリヌクレオチド；および
− 同じ宿主生物において機能的であるターミネーター配列。

本発明の別の対象は、本発明によるポリヌクレオチドおよび／または本発明による発現カセットを含むベクターである。

本発明はまた、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による発現カセットおよび／または本発明によるベクターが形質転換された宿主生物に関する。

本発明の一実施態様において、宿主生物は、酵母および糸状菌から選択される。

好ましくは、宿主生物は、ペニシリウム・フニクロサム株である。

本発明はまた、本発明によるポリペプチド、本発明による宿主生物体または本発明による宿主生物の発酵ブロスを含む、動物のための栄養添加物に関する。

好ましくは、この栄養添加物は、液体の形態または粉末の形態である。

本発明の別の側面は、動物のための栄養基礎剤（ｂａｓｅ）および本発明による動物のための栄養添加物を含む飼料に関する。

本発明はまた、動物用栄養添加物または飼料の製造のための、本発明によるＡＢＦＢポリペプチドまたは本発明による宿主生物の使用に関する。

本発明の別の対象は、アラビノフラノシル−オリゴ糖化合物のα−Ｌ−アラビノフラノシル結合を加水分解するための、本発明によるＡＢＦＢポリペプチドまたは本発明による宿主生物の使用である。

ポリペプチド
本発明は、従って、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を有するＡＢＦＢポリペプチドに関する。好ましくは、これらのポリペプチドは、ペニシリウム・フニクロサムから単離される。

「α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ」という表現は、アラビノフラノシル−オリゴ糖化合物に含まれる側鎖のα−１，５、α−１，３およびα−１，２結合の加水分解を触媒する、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）Ｂ型（ＧＨ５４）を意味すると理解される。

ペニシリウム・フニクロサム株ＩＭＩ３７８５３６のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢは、ＳＥＱＩＤＮｏ．２として表される。

「動物栄養における使用に適したポリペプチド」という表現は、その特徴が動物栄養に適しているポリペプチドを意味すると理解される。動物栄養における使用に必須の特徴は、特に、酵素が活性化するｐＨおよび温度である。実際、動物の消化器系のｐＨは酸性であり、従って、酵素がこのｐＨで活性を有した状態であることが必須であるが、これは、Ｌ−アラビノース残基の加水分解において、その活性を維持させるためである。加えて、栄養添加物または動物飼料への酵素の条件づけには、処理および室温より高い温度が含まれる。使用される酵素の活性は、従って、処理条件および特に温度条件の下で安定的でなければならない。

本発明の一実施態様によると、ポリペプチドは、酸性のｐＨ、例えば５未満、好ましくは４未満のｐＨにおいて、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を示す。また、本発明の一実施態様によると、ポリペプチドは、ｐＨ２からｐＨ３．５の間で最適なα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を示す。

本発明の好ましい実施態様によると、ポリペプチドは、室温より高い温度でα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を示す。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、４０℃から７０℃の間の温度で、より好ましくは５０℃から６５℃の間の温度で、最適なα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を示す。

好ましい実施態様において、本発明によるポリペプチドは、グリコシル化される。ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドは、特に９２番目のアミノ酸および３７６番目のアミノ酸にＮ−グリコシル化部位を有する。好ましい実施態様において、ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドの、９２番目および３７６番目のアスパラギン残基がグリコシル化される。

ペニシリウム・フニクロサムのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢは、細胞外の環境に向かって真菌類から分泌される酵素である。ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドは、従って、２７アミノ酸のシグナルペプチドを含む。本発明の対象はまた、シグナルペプチドの切断後に得られる成熟したポリペプチドである。特に、本発明は、その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．２の位置２８から位置５０７の配列であるポリペプチドに関する。別の実施態様において、ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドのシグナルペプチドは、異種性の宿主生物におけるＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドの発現および分泌のために、異種性のシグナルペプチドと交換してもよい。

本発明はまた、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を有するＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドの断片に関する。

ポリペプチドの「断片」という用語は、部分を含み、しかしその由来となるポリペプチド全体を含まないポリペプチドを意味する。本発明は、従って、ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドの少なくとも１００、２００、３００、４００または５００アミノ酸の断片を含むポリペプチドに関する。

ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドのこの断片は、そのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を保存している。本発明は、従って、ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドの生物学的に活性な断片に関する。「生物学的に活性な断片」という用語は、その由来となるポリペプチドの機能を維持するポリペプチドの断片を意味する。ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドの生物学的に活性な断片は、従って、ペニシリウム・フニクロサムＡＢＦＢ−１ポリペプチドの機能を維持する。これらの生物学的に活性な断片は、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を有する。

ポリペプチドの断片を作製する方法およびα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を測定する技術は、当業者に周知である。

本発明の対象はまた、Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を有しており、ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチドである。好ましくは、これらのポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドと同一の特性および特に同一の触媒特性を有する。好ましくは、これらのポリペプチドは、ペニシリウム・フニクロサムのその他の株またはその他の糸状菌から単離される。あるいは、これらのポリペプチドは、例えば部位特異的変異誘発技術によって得られてもよい。

本発明の対象は、少なくとも９０％、９５％、９８％および好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸がＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドと同一性を有しているポリペプチドである。

同一なアミノ酸という表現は、２つの配列の間で不変である（ｉｎｖａｒｉａｎｔｏｒｕｎｃｈａｎｇｅｄ）アミノ酸を意味すると理解される。これらのポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドと比較して、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加または置換を含んでよい。

本発明の対象はまた、ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９８％および好ましくは少なくとも９９％の類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を示すポリペプチドである。

類似性という表現は、タンパク質または核酸配列間の類似の尺度を意味すると理解される。これらのポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチドと比較して、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加または置換を含んでもよい。スコアによって定量化される２つの配列の類似性の程度は、配列同一性のおよび／または配列保存性置換（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）のパーセンテージに基づく。

ポリペプチド間の同一性の程度および類似性の程度の評価ならびに確認の方法は、当業者に既知である。例えば、ＶｅｃｔｏｒＮＴｉ９．１．０アラインメントプログラムＡｌｉｇｎＸ（ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩＮＦＯＲＭＡＸ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ））を使用することが可能である。好ましくは、デフォルトパラメータが使用される。

本発明によるポリペプチドは、その天然の環境から単離されまたは精製される。ポリペプチドは、様々な方法によって製造してよい。これらの方法は、特に、これらのポリペプチドを天然で発現する細胞といった天然の供給源からの精製、適当な宿主細胞による組換えポリペプチドの生産および続く精製、化学合成による製造、または、最終的に、これらの様々な方法の組合せである。これらの様々な製造方法は、当業者に周知である。従って、本発明のＡＢＦＢポリペプチドは、ペニシリウム・フニクロサムから単離してよい。別の実施態様において、本発明によるＡＢＦＢポリペプチドは、本発明によるＡＢＦＢポリペプチドを発現している組換え宿主生物から単離される。

本発明の対象はまた、本発明によるポリペプチドを含む融合タンパク質、組換えタンパク質またはキメラタンパク質である。「ポリペプチド」という用語はまた、修飾されたタンパク質およびポリペプチドを意味する。

本発明によるポリペプチドは、ＡＢＦＢ活性を有し、好ましくはペニシリウム・フニクロサムＡＢＦＢ１酵素の触媒特性を保持している。特に、これらのポリペプチドは、６０℃およびｐＨ３．４にて最適な活性を示す。

ポリヌクレオチド
本発明はまた、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性をコードするポリヌクレオチドに関する。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、ペニシリウム・フニクロサムのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢをコードする。

本発明によると、「ポリヌクレオチド」という表現は、一本鎖のヌクレオチド鎖もしくはその相補鎖（ＤＮＡまたはＲＮＡタイプであってよい）、または二本鎖ヌクレオチド鎖（補完的またはゲノムＤＮＡタイプであってよい）を意味するものと理解される。好ましくは、本発明によるポリヌクレオチドは、ＤＮＡタイプであり、特に二本鎖ＤＮＡである。「ポリヌクレオチド」という用語はまた、修飾されたポリヌクレオチドを意味する。

本発明によるポリヌクレオチドは、天然の環境から単離されまたは精製される。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって記述されるように（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１９８９）、従来の分子生物学技術によって、または化学合成によって製造してよい。

第１の実施態様において、本発明は、その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置８４５から位置２３６８の間の配列であるポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮｏ．２のペニシリウム・フニクロサムＡＢＦＢ１酵素をコードする。

第２の実施態様において、本発明は、その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置９２７から位置２３６８の間の配列であるポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、シグナルペプチドの切断の後のペニシリウム・フニクロサムの成熟したＡＢＦＢポリペプチドをコードする。

本発明また、その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置８４５から位置２３６８の間の配列であるポリヌクレオチドと、および／または、その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置９２７から位置２３６８の間の配列であるポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％および好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性をコードする。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、ペニシリウム・フニクロサムのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢをコードする。

同一のヌクレオチドという表現は、２つの配列の間で不変（ｉｎｖａｒｉａｎｔｏｒｕｎｃｈａｎｇｅｄ）なヌクレオチドを意味すると理解される。これらのポリヌクレオチドは、基準となるポリヌクレオチドと比較して、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、付加または置換を含んでよい。

本発明また、その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置８４５から位置２３６８の間の配列であるポリヌクレオチドと、および／または、その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置９２７から位置２３６８の間の配列であるポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％および好ましくは少なくとも９９％の類似性を示すポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性をコードする。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、ペニシリウム・フニクロサムα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢをコードする。

類似性という表現は、タンパク質または核酸配列間の類似の尺度を意味すると理解される。これらのポリヌクレオチドは、基準となるポリヌクレオチドと比較して、少なくとも１のヌクレオチドの欠失、付加または置換を含んでよい。スコアによって定量化される２つの配列の類似性の程度は、配列同一性および／または配列保存置換のパーセンテージに基づく。

核酸配列間の同一性の程度および類似性の程度を評価および確認する方法は、当業者に周知である。例えば、ＶｅｃｔｏｒＮＴｉＶｅｃｔｏｒＮＴｉ９．１．０アラインメントプログラムＡｌｉｇｎＸ（ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩＮＦＯＲＭＡＸ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ））を使用することが可能である。好ましくは、デフォルトパラメータが使用される。

好ましくは、基準となるポリヌクレオチドとある程度の類似性を示すポリヌクレオチドは、基準となる配列の機能を維持している。この場合、ポリヌクレオチドは、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性をコードする。

発明はまた、その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置８４５から位置２３６８の間のポリヌクレオチドと、および／または、その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置９２７から位置２３６８の間のポリヌクレオチドと、選択的にハイブリダイズできるポリヌクレオチドに関する。好ましくは、選択的なハイブリダイゼーションは、平均的な厳密性の条件の下で、および好ましくは高い厳密性の条件の下で行われる。これらのポリヌクレオチドは、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性をコードする。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、ペニシリウム・フニクロサムα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢをコードする。

「選択的にハイブリダイズできる配列」という表現は、本発明によると、バックグラウンドのノイズよりも有意に高いレベルで基準となる配列とハイブリダイズする配列を意味すると理解される。選択的にハイブリダイズすることができる配列と基準となる配列との間の相互作用によって作られるシグナルのレベルは、バックグラウンドのノイズを作るその他のＤＮＡ配列の相互作用によるものよりも、通常、１０倍、好ましくは１００倍強い。選択的なハイブリダイゼーションを可能とする厳密なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である。一般に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度は、所定のｐＨおよび所定のイオン強度において、基準となる配列のＴｍよりも少なくとも５℃低い。典型的に、ハイブリダイゼーション温度は、１５〜５０ヌクレオチドのポリヌクレオチドにおいて少なくとも３０℃、および５０以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドにおいて少なくとも６０℃である。例として、ハイブリダイゼーションは、以下の緩衝液にて行われる：６ｘＳＣＣ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ、５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ。洗浄は、例えば、２ｘＳＣＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液による低い厳密性で、０．５ｘＳＣＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液による平均的な厳密性で、および０．１ｘＳＣＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液による高い厳密性で、連続的に行われる。ハイブリダイゼーションは、当然、当業者に周知の他の慣習的な方法によって実施してよい（特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる文献（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１９８９）を参照）。好ましくは、基準となるポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、基準となる配列の機能を維持している。この場合、ポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドは、その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置８４５から位置２３６８の配列であるポリヌクレオチドと、および／またはその配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置９２７から位置２３６８の配列であるポリヌクレオチドと、選択的にハイブリダイズする）は、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性をコードする。

本発明は、一般に、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。遺伝暗号の縮重のため、さまざまなポリヌクレオチドが、同一のポリペプチドをコードすることができる。

本発明の別の対象は、その配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１に示される配列であるポリヌクレオチドである。ＳＥＱＩＤＮｏ．１のポリヌクレオチドは、ペニシリウム・フニクロサムａｂｆＢ１遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）に隣接する配列を含む。それらは、特に、ａｂｆＢ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列である。ａｂｆＢ遺伝子は、その相同的な制御配列から発現されてよく、特に過剰発現には、ペニシリウム・フニクロサムによってまたはその他の糸状菌によって発現されてよい。

別の実施態様において、ａｂｆＢ遺伝子は、さまざまな宿主生物（例えば細菌、酵母および真菌類）で発現させてよい。ａｂｆＢ遺伝子は、本発明によるＳＥＱＩＤＮｏ．１プロモーターの調節によって、異種性のプロモーターの調節によって、宿主生物にて発現されてよい。

発現カセット
本発明による一実施態様によると、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当業者に周知のクローン技術を使用して、発現カセットに挿入される。この発現カセットは、本発明によるポリペプチドをコードする配列の転写および翻訳に必要な要素を含む。

好都合に、この発現カセットは、宿主細胞にポリペプチドを製造させることを可能にする要素およびこの発現の調節に必要な要素の両方を含む。

これらの発現カセットは、転写の調節において、以下を含む：
− 宿主生物で機能的であるプロモーター；
− 本発明によるポリヌクレオチド；
− 同宿主生物にて機能的であるターミネーター配列。

あらゆる種類のプロモーター配列を、本発明による発現カセットに使用してよい。プロモーターの選択は、特に、関心ある遺伝子の発現のために選択される宿主生物に依存する。あるプロモーターは構成的な発現を可能とし、一方でその他のプロモーターは、反対に、誘導可能な発現を可能とする。真菌類において機能的なプロモーターの中では、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素のためのプロモーターが特に言及されてよい（Ｒｏｂｅｒｔｓｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅｔ．１５：１７７−１８０，１９８９）。細菌において機能的であるプロモーターの中では、Ｔ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターが特に言及されてよい（Ｓｔｕｄｉｅｒｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：６０−８９，１９９０）。酵母において機能的であるプロモーターの中では、ＧＡＬ１遺伝子のためのプロモーター（Ｅｌｌｅｄｇｅｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ．８８：１７３１−１７３５，１９９１）またはＳ．セレビジエＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーターが言及されてよい。これらの全てのプロモーターは、文献に記述されており、および当業者に周知である。

ペニシリウム・フニクロサムの発現のために、発現カセットは、例えば、ヒストンＨ４．Ｂプロモーター、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｙｌａｃｉｄ）プロテアーゼプロモーターまたはｃｓｌ１３プロモーター（ＷＯ００／６８４０１）を含むものが選択されるだろう。

本発明による発現カセットは、さらに、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現のために必要なその他の何れかの配列を含んでよく、例えば、宿主生物体によって製造されるポリペプチドの分泌を可能とする調節因子またはシグナル配列を含んでよい。特に、発現カセットに挿入されるコード配列の発現のレベルを増加させることが可能な何れかの調節配列を使用することが可能である。本発明によると、特に、調節プロモーター配列との組み合わせで、プロモーターとコード配列との間に位置するその他の制御配列（例えば転写活性化因子（「エンハンサー」））を使用することが可能である。

多種多様なターミネーター配列が、本発明による発現カセットに使用することが可能であり、これらの配列は、転写の終了およびｍＲＮＡのポリアデニル化を可能にする。選択された宿主生物において機能的である何れのターミネーター配列も使用してよい。

ペニシリウム・フニクロサムの発現のために、発現カセットは、例えば、ヒストンＨ４．Ｂターミネーター、アスパラギン酸プロテアーゼターミネーターまたはｃｓｌ１３ターミネーター（ＷＯ００／６８４０１）を含むものが選択される。

本発明の対象はまた、本発明による発現カセットを含むポリヌクレオチドであり、好都合には、本発明による発現カセットは、ベクターに挿入される。

ベクター
従って、本発明はまた、本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは１つの発現カセットを含む、宿主生物を形質転換するための複製または発現ベクターに関する。このベクターは、特に、本発明によるポリヌクレオチドまたは発現カセットが挿入されたプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスに相当してよい。これらのベクターを構築するための、およびこれらのベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入するための技術は、当業者に周知である。一般に、特にポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を誘導するために、宿主細胞において自己を維持し、自己複製しまたは増殖可能な何れかのベクターを使用することが可能である。当業者は、形質転換する宿主生物に依存して、および使用する形質転換技術に依存して、適切なベクターを選択するだろう。

本発明によるベクターは、特に、宿主生物におけるベクターの複製および／または本発明によるポリペプチドの発現のために、宿主生物への形質転換に使用される。

本発明はまた、以下のステップを含む、発明によるポリペプチドを製造する方法に関する：
− 宿主生物を、本発明による発現カセットを含む発現ベクターでおよび／または本発明によるポリヌクレオチドで形質転換する、
− 宿主生物によって生産されるポリペプチドを単離する。

宿主生物
本発明の対象はまた、本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチドもしくは発現カセットまたはベクターを宿主生物に組み込むことによる、宿主生物を形質転換する方法である。ポリヌクレオチドは、宿主生物のゲノムに組み込んでよく、または宿主生物において安定に複製させてよい。宿主生物を形質転換する方法は、当業者に周知であり、および文献に十分記載されている。

本発明はまた、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターで形質転換される宿主生物に関する。宿主生物という表現は、本発明によると、特に、細菌、酵母および真菌類から選択される、単細胞性のまたは多細胞性の、下等または高等の、何れかの生物を意味すると理解される。宿主生物という表現は、非ヒト生物を意味すると理解される。好都合に、酵母は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビジエ、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびシュワンニオマイセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）から選択される。真菌類は、アスペルギルス属およびペニシリウム属から選択され、好ましくは、ペニシリウム・フニクロサム、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチおよびトリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｋｏｎｉｎｇｉｉ）から選択される。好ましい実施態様において、宿主生物は、本発明によるＡＢＦＢポリペプチドを発現または過剰発現するペニシリウム・フニクロサム株である。

ベクターを構築する技術、宿主生物の形質転換、およびこれらの生物における異種性タンパク質の発現は、文献に広く記述されている（ＡｕｓｕｂｅｌＦ．Ｍ．ｅｔａｌ．，“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ１ａｎｄ２，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＨａｎｄｂｏｏｋ，１９８２）。

食品添加物および飼料
本発明は、従って、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を提供する食品添加物に関する。この種の酵素活性の摂取は、食品の消化を増強し、およびその栄養価の増加を可能にする。

栄養添加物という表現は、栄養特性または消化性を改善するために、一般に少量で、意図的に食物に添加される物質を意味すると理解される。動物のための栄養添加物は、例えば、ビタミン、ミネラル塩、アミノ酸および酵素を含んでよい。

典型的に、動物のための栄養添加物は、本発明によるポリペプチド、本発明による宿主生物または本発明による宿主生物の発酵ブロスを含む。従って、本発明によるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を有するポリペプチドは、ペニシリウム・フニクロサム株から、または動物のための栄養添加物の製造のための組換え宿主生物体から精製し、または単離することが可能である。あるいは、ＡｂｆＢポリペプチドを生産するペニシリウム・フニクロサム株または宿主生物を、動物のための栄養添加物の製造に直接使用してよい。本発明の好ましい実施態様において、ペニシリウム・フニクロサム株のまたは本発明による宿主生物の発酵ブロスの培養上清は、動物のための栄養添加物の製造に使用される。この実施態様は、ＡＢＦＢポリペプチドがペニシリウム・フニクロサム株または宿主生物に分泌される場合に特に有利である。通常、この培養上清は、栄養添加物の製造のために濃縮され、または凍結乾燥される。

従って、本発明はまた、以下の工程を含む、ＡＢＦＢ酵素を製造する方法に関する：
ａ）ＡＢＦＢの発現を誘導する条件の下、ペニシリウム・フニクロサム株または本発明による形質転換された宿主生物を培養する、
ｂ）ＡＢＦＢ酵素を含む培養上清を分離する。

この培養上清または発酵ブロスは、次に、食品添加物または飼料の製造のために、濃縮または凍結乾燥してよい。

宿主生物が培地にＡＢＦＢ酵素を分泌しない場合、細胞を破壊しおよび細胞抽出物を精製する付加的な工程が必要であってよい。

本発明による栄養添加物は、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を含むが、その他の栄養的な物質（例えばビタミン、アミノ酸またはミネラル塩）を含んでもよい。

本発明による添加物は飼料の消化性を増加させ、これによって、特に穀類（小麦、オオムギ、トウモロコシ、オート麦、ライ麦等）および油粕（大豆、ヒマワリ、アブラナ等）に基づく食事の栄養価のより良い強化に貢献する。

本発明はまた、本発明による栄養的基礎剤および栄養添加物を含む飼料に関する。これらの飼料は、通常、ミール（ｍｅａｌｓ）または顆粒（ｇｒａｎｕｌｅｓ）の形態で提供され、これらには、本発明による添加物が組み込まれる。

飼料という表現は、動物の食料として用いることができる何れかのものを意味すると理解される。

飼料は、本発明によるポリペプチド、本発明による宿主生物、または本発明による宿主生物の発酵ブロスを含む。

集中的な動物育種（ｉｎｔｅｎｓｉｖｅａｎｉｍａｌｂｒｅｅｄｉｎｇ）のために、これらの飼料は、通常、栄養基礎剤および栄養添加物を含む。

栄養基礎剤という表現は、例えば、動物および／または植物由来の穀類、タンパク質および脂肪の混合物から成る、動物飼料糧食（ｔｈｅａｎｉｍａｌｆｅｅｄｒａｔｉｏｎ）の主要部を構成するものを意味すると理解される。

動物のための栄養基礎剤は、これらの動物のための飼料に適しており、および当業者に周知である。通常、例えば、これらの栄養基礎剤は、トウモロコシ、小麦、エンドウおよび大豆を含む。これらの栄養基礎剤は、それが意図される様々な動物種の要求に適している。これらの栄養基礎剤は、栄養添加物（例えばビタミン、ミネラル塩およびアミノ酸）を含んでよい。

好ましい実施態様において、本発明は、単胃の動物のための飼料、および、特に飼鳥類（ｐｏｕｌｔｒｙ）およびブタのための飼料に関する。飼鳥類は、特に産卵鶏（ｌａｙｉｎｇｈｅｎｓ）、ブロイラー、シチメンチョウおよびカモを含む。ブタは、特に肉豚（ｇｒｏｗｉｎｇ−ｆｉｎｉｓｈｉｎｇｐｉｇｓ）および子ブタを含む。

Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性のアッセイ方法の開発
Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性は、４０時間後に、０．１５％ｐｒｏｖａｓｏｙおよび０．３％セルロースから成る混合添加物を使用して、Ｍ２培地のＰ．フニクロサム培養液から評価した。サンプルを、４８時間および７２時間の培養液から採取した。培養は、２００ｍｌ容三角フラスコを用いて、有効量を５０ｍｌとして行った。活性は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）中で、５ｍＭパラ−ニトロフェニル−（Ｌ−アラビノフラノシド（ＰＮＰＡＦ）を加水分解することで決定した。５０μｌの培養上清を、５０℃で１５分間予熱した２５０μｌの基質とともにインキュベートした。反応は、５００μｌの０．５ＭＮａＯＨを添加することで停止した。ｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰ）の放出は、１７０００Ｍ−１．ｃｍ−１のモル吸光係数で、４０５ｎｍで評価する。酵素ユニットは、上記の条件において１分当り１μｍｏｌのＰＮＰＡＦを加水分解する酵素の量として定義される。Ｐ．フニクロサムの培養において、培養の４８時間後に２０ｍＵ．ｍｌ−１および７２時間後に１１２ｍＵ．ｍｌ−１であった。これらの結果は、文献と一致しており、アスペルギルス・ニガーにおいて、１００〜６００ｍＵ．ｍｌ−１のオーダーの活性が、培養に使用される誘導物質によって観察された。

サッカロマイセス・セレビジエへのＰ．フニクロサムａｂｆＢＯＲＦのクローニング
Ｐ．フニクロサム由来のゲノムＤＮＡから開始し、一組のプライマー（ＨｉｎｄＩＩＩａｂｆＢ／ＸｂａＩａｂｆＢ）を用いて、９４℃ ３０秒；６２℃ ３０秒；７２℃ １分３０秒の条件で３０サイクルによるＰＣＲにより、ａｂｆＢ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物は、市販のベクターｐＧＥＭ−Ｔ（ｔｍ）ｅａｓｙにクローン化した。
ＰＣＲプライマー対の配列
ＸｂａＩ−ａｂｆＢ−１：＞５’−ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＴＴＣＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＡＣＣＡＧ−３’＜
ＨｉｎｄＩＩＩ−ａｂｆＢ−１：＞５’−ＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＣＴ−３’＜。

１５３４ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片をベクターｐＧＥＭ−Ｔから切り出し、シャトルベクターｐＪＬ５２（ｐｌａｃ１９５−ＰＧＫ／ＣＹＣ１）に、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位でサブクローニングした。異種性の発現のために、ａｂｆＢ遺伝子は、従って、ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｓ．セレビジエ）をコード化する遺伝子の構成的ＰＧＫプロモーターおよびチトクロムＣ酸化酵素活性をコード化する遺伝子のＣＹＣ１ターミネーター（Ｓ．セレビジエ）に調節させた。新規の発現カセットをｐＯＴ−０１と呼ぶ。

Ｓ．セレビジエ株ＪＦ＃１１９４（ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ）（ｕｒａ３−５２栄養要求性を有する株ＣＥＮ．ＰＫ１２２に由来するクローン）に、発現ベクターｐＯＴ−０１を形質転換させた（酢酸リチウム／ヒートショック方法）。形質転換体株は、ウラシルを含まない選択的なプレート（ＵＲＡ３マーカー）で、表現型の補完により選択した。

培養上清中のアラビノフラノシダーゼＢ活性の有無を試験するために、６つの形質転換体を選択した。形質転換体は、５０ｍｌのウラシルを含まないＹＮＢ培地（野生型対照株以外）で２４時間培養した。アラビノフラノシダーゼ活性は、先行する段落に記述した方法を用いて、培養上清にて試験した。

最適ｐＨの決定
Ｐ．フニクロサム由来のアラビノフラノシダーゼＢ活性をコードするａｂｆＢ−１遺伝子を、Ｓ．セレビジエにクローン化した。いくつかの形質転換体でアラビノフラノシダーゼＢ活性の有無について調べた後、形質転換体を選択し、２４時間の増殖の後、ＡＢＦＢ活性を培養上清にて試験した。培養は、２００ｍｌ容三角フラスコ（液量５０ｍｌ）で行った。活性は、５ｍＭｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド（ＰＮＰＡＦ）を含むＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液系列（ｐＨ２．２〜８．０）にて測定した。８０μｌの培養上清を、４０℃で１０分間予熱した３２０μｌの基質とともにインキュベートした。１ｍｌの１ＭＮａ_２ＣＯ_３を添加することによって反応を止めた。ｐ−ニトロフェニルの放出は、４０５ｎｍ^−１で評価する。１酵素ユニットは、上に定義した条件において、１分当りに１μｍｏｌのＰＮＰＡＦを加水分解する酵素の量として定義される。活性曲線を図１に示す。ＡＢＦＢ−１では、活性の最適条件はｐＨ３．４であり、酵素は、ｐＨ５において６５％活性を保存する。

最適温度の決定
同じプロトコールを使用して、ＡＢＦＢ−１の活性のための至適温度を決定した。酵素を、ｐＨ３．４のＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液中で、各々の温度で１０分間インキュベートした。活性曲線は図２に示される。Ｐ．フニクロサムＡＢＦＢ−１は、６０℃が活性最適条件である。ＡＢＦＢ−１は、従って、文献によるＡＢＦＢより高い温度最適条件を有する。ＡＢＦＢ−１酵素の最適ｐＨおよび温度を選択した場合（ｐＨ３．４および６０℃）、ＡＢＦＢ−１の活性は、ｐＨ５および４０℃の酢酸塩緩衝液で決定される活性よりも４倍高い（４２４ｍＵ対１０２ｍＵ）ことがわかる。

ＫｍおよびＶｍの決定
ＡＢＦＢ−１の動力学的定数（ＫｍおよびＶｍ）は、上記の通り決定した最適条件の下、時間とともにＰＮＰＡＦの加水分解を測定することによって決定した。

基質（ＰＮＰＡＦ）濃度の範囲は、ｐＨ３．４の緩衝液において、０．５から５ｍＭの間とした。加水分解の動力学を、６０℃において１０分間モニタした。結果は、二重逆数法（ｄｏｕｂｌｅｉｎｖｅｒｓｅｍｅｔｈｏｄ）（ＬｉｎｅｗｅａｒｋａｎｄＢｕｒｋ）により処理し、図３に示した。

Ｋｍ値は、ＡＢＦＢ−１では１ｍＭである。比較すると、文献によると、この種の酵素のＫｍ値は、研究する属および菌種によって０．０５から１．２ｍＭまで変化する。ＡＢＦＢ−１は、上述した条件において、５２１ｍｏｌＰＮＰＡＦ／酵素ｍｏｌ数／分の加水分解の最大速度（Ｖｍ）を有する。

ＡＢＦＢ−１酵素の分子量の決定
ＡＢＦＢ−１酵素の分子量を決定するため、最小培地における変異株（Ｓ．セレビジエ）の増殖培地由来の培養上清を２００倍濃縮し、１００℃で５分間沸騰することで変性させ、その後ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで沈澱（ｄｅｐｏｓｉｔ）させた。

細胞外タンパク質の量は、野生型株で非常に低いことが認められる。変異体では、ＡＢＦＢ−１酵素は培養上清に分泌される。それは、Ｓ．セレビジエの細胞外タンパク質の基礎レベルを圧倒する。

分子量の決定は、サイズマーカーＳｅｅＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。結果を表１に示す。

我々は、アルゴリズムＶｅｃｔｏｒＮＴｉによって予測された分子量と、変性ＳＤＳＰＡＧＥゲルによる電気泳動の移動によって得られた重量とを比較した。我々は、ＳＤＳＰＡＧＥゲルでは酵素の分子量が過剰に見積もられることを発見した。実際は、電気泳動のバンドの拡散がゲル上に見られたことから、酵素に高度に糖鎖形成（ＯおよびＮ糖鎖形成）が生じていることが示唆される。糖鎖形成は、発現する生物におけるタンパク質のプロセッシングの際に生じる。

ペニシリウム・フニクロサムにおけるａｂｆＢ−１遺伝子の発現プロファイルの分析
ペニシリウム・フニクロサムは、２つのＢ α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼをコード化する遺伝子を有している：ａｂｆＢ−１およびａｂｆＢ−２遺伝子。様々なＰ．フニクロサム培養条件の下、これらの遺伝子の発現プロファイルを比較した。

Ｐ．フニクロサムを、セルロース分解性およびヘミセルロース分解性酵素を誘導する条件（Ｍ２型産業用増殖培地）、および非産生性の条件（最小限のグルコース培地Ｍ０）で培養した。４０時間の増殖の後、培養を停止し、菌糸を回収し、および全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの量および品質は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで吸光度を測定することによって評価した（２６０／２８０の比率は、＞１．８）。Ｂ型アラビノフラノシダーゼ（ＡＢＦＢ−１およびＡＢＦＢ−２）活性をコード化する転写物のレベルは、リアルタイム定量ＰＣＲにより、２つの条件（Ｍ０およびＭ２）でそれぞれ定量した。

Ｐ．フニクロサムのチューブリンをコード化する遺伝子（ｔｕｂ１）を、２つの条件の下、対照として使用した。この遺伝子は、細胞の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に不可欠な構造蛋白質をコード化する。使用される培養条件に関わらず、一定の発現レベルを示す（遍在性）ため、この遺伝子は一般に、基準遺伝子（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｅ）として使用される。

定量ＰＣＲのための特異的なプライマーを、それぞれの遺伝子（ａｂｆＢ−１、ａｂｆＢ−２およびｔｕｂ−１）に設計した。両方の増殖条件（Ｍ０およびＭ２）において、全ＲＮＡ２μｇを逆転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）した。目標遺伝子の増幅のための最適条件（定量的ＰＣＲ方法の制約およびこれらの一組のプライマーの効率のための条件）を決定するために、逆転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）に由来する相補ＤＮＡの一連の希釈を行った。

標準化した結果を表２および図４に示す。

セルロース分解およびヘミセルロース分解活性をコード化する遺伝子の転写調節は記述されている。これらの遺伝子の発現は、微生物の培養における炭素源および窒素源の性質および／または複雑性に非常に影響を受ける。これらの遺伝子の転写の高い抑制は、グルコースが存在する場合に生じることが報告されている。この調節は、異化抑制（ｃａｔａｂｏｌｉｃｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）タンパク質ＣｒｅＡによって行われ、このタンパク質は、これらの遺伝子のプロモーターと特に結合し、およびそれらの転写を遮断する。ＰＣＲによって、ａｂｆＢ−１およびａｂｆＢ−２メッセンジャーを定量する我々の実験において、グルコース（Ｍ０）条件下では、これらの２つの遺伝子の発現のレベルは非常に低い。このことは文献と一致する。というのは、これらの遺伝子は、好適でない条件（セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性基質の欠如）の下でさえ、基礎レベルの発現を示すことがわかっていたためである。Ｍ０条件で得られる結果は、文献と一致する。ａｂｆＢ−１遺伝子の発現に関して、誘導率は、Ｍ０条件で得られる基礎レベルの１０７倍高いことがわかり、一方でａｂｆＢ−１遺伝子は過剰発現されない。

図１は、５ｍＭＰＮＰＡＦの存在下、４０℃のＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液系列（ｐＨ２．２〜８）における、ＡＢＦＢ−１酵素の最適ｐＨの決定を示す図である。図２は、５ｍＭＰＮＰＡＦの存在下、最適ｐＨにおける、ＡＢＦＢ−１酵素の至適温度の決定を示す図である。図３は、動力学的定数ＫｍおよびＶｍの決定（ｐＨ３．４および６０℃において、ＰＮＰＡＦが０．５ｍＭからの５ｍＭの範囲で、ＡＢＦＢ−１の１／Ｖｉ＝ｆ（１／Ｓ））を示す図である。図４は、Ｐ．フニクロサムの増殖条件による、ａｂｆＢ−１およびａｂｆＢ−２遺伝子の発現の相対的な定量的差の値を示す図である。

Claims

以下のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする、動物栄養における使用に適したポリペプチド：
− ＳＥＱＩＤＮｏ．２のポリペプチド；
− 配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．２の位置２８から位置５０７の間の配列であるポリペプチド。
以下のポリヌクレオチドから選択されることを特徴とする、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
− 配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置８４５から位置２３６８の間の配列であるポリヌクレオチド；
− 配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の位置９２６から位置２３６８の間の配列であるポリヌクレオチド；
− 請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
ＳＥＱＩＤＮｏ．１の配列またはＳＥＱＩＤＮｏ．１に相補的な配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
以下を含むことを特徴とする、転写の調節における、発現カセット：
− 宿主生物で機能的であるプロモーター；
− 請求項２に記載のポリヌクレオチド；および
− 前記宿主生物にて機能的であるターミネーター配列。
請求項２から３の何れか１項に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項４に記載の発現カセットを含むベクター。
請求項２から３の何れか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の発現カセットおよび／または請求項５に記載のベクターで形質転換された宿主生物。
前記宿主生物が、酵母および糸状菌から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の宿主生物。
ペニシリウム・フニクロサム株であることを特徴とする、請求項７に記載の宿主生物。
請求項１に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、動物のための栄養添加物。
請求項６から８の何れか１項に記載の宿主生物および／または請求項６から８の何れか１項に記載の宿主生物の発酵ブロスを含むことを特徴とする、動物のための栄養添加物。
液体の形態または粉末の形態であることを特徴とする、請求項９から１０の何れか１項に記載の動物のための栄養添加物。
動物のための栄養基礎剤および請求項９から１１の何れか１項に記載の動物のための栄養添加物を含むことを特徴とする、飼料。
動物のための栄養添加物または飼料の製造のための、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項６から８の何れか１項に記載の宿主生物の使用。
アラビノフラノシル−オリゴ糖化合物のα−Ｌ−アラビノフラノシル結合を加水分解するための、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項６から８の何れか１項に記載の宿主生物の使用。