JP5048651B2 - ペニシリウム・フニクロサムのabfB−1遺伝子 - Google Patents
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Description
− SEQ ID No.2のポリペプチド、
− その配列が、SEQ ID No.2の位置28から位置507の間の配列であるポリペプチド、
− α−L−アラビノフラノシダーゼ B活性を有するSEQ ID No.2のポリペプチドの断片、
− α−L−アラビノフラノシダーゼ B活性を有しおよびSEQ ID No.2のポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有するポリペプチド。
− その配列が、SEQ ID No.1の位置845から位置2368の間の配列であるポリヌクレオチド、
− その配列が、SEQ ID No.1の位置927から位置2368の間の配列であるポリヌクレオチド、
− 上記にように定義したポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
− 宿主生物において機能的であるプロモーター;
− 本発明によるポリヌクレオチド;および
− 同じ宿主生物において機能的であるターミネーター配列。
本発明は、従って、α−L−アラビノフラノシダーゼ B活性を有するABFBポリペプチドに関する。好ましくは、これらのポリペプチドは、ペニシリウム・フニクロサムから単離される。
本発明はまた、α−L−アラビノフラノシダーゼ B活性をコードするポリヌクレオチドに関する。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、ペニシリウム・フニクロサムのα−L−アラビノフラノシダーゼ Bをコードする。
本発明による一実施態様によると、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当業者に周知のクローン技術を使用して、発現カセットに挿入される。この発現カセットは、本発明によるポリペプチドをコードする配列の転写および翻訳に必要な要素を含む。
− 宿主生物で機能的であるプロモーター;
− 本発明によるポリヌクレオチド;
− 同宿主生物にて機能的であるターミネーター配列。
従って、本発明はまた、本発明による少なくとも1つのポリヌクレオチドまたは1つの発現カセットを含む、宿主生物を形質転換するための複製または発現ベクターに関する。このベクターは、特に、本発明によるポリヌクレオチドまたは発現カセットが挿入されたプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスに相当してよい。これらのベクターを構築するための、およびこれらのベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入するための技術は、当業者に周知である。一般に、特にポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を誘導するために、宿主細胞において自己を維持し、自己複製しまたは増殖可能な何れかのベクターを使用することが可能である。当業者は、形質転換する宿主生物に依存して、および使用する形質転換技術に依存して、適切なベクターを選択するだろう。
− 宿主生物を、本発明による発現カセットを含む発現ベクターでおよび/または本発明によるポリヌクレオチドで形質転換する、
− 宿主生物によって生産されるポリペプチドを単離する。
本発明の対象はまた、本発明による少なくとも1つのポリヌクレオチドもしくは発現カセットまたはベクターを宿主生物に組み込むことによる、宿主生物を形質転換する方法である。ポリヌクレオチドは、宿主生物のゲノムに組み込んでよく、または宿主生物において安定に複製させてよい。宿主生物を形質転換する方法は、当業者に周知であり、および文献に十分記載されている。
本発明は、従って、α−L−アラビノフラノシダーゼ B活性を提供する食品添加物に関する。この種の酵素活性の摂取は、食品の消化を増強し、およびその栄養価の増加を可能にする。
a)ABFBの発現を誘導する条件の下、ペニシリウム・フニクロサム株または本発明による形質転換された宿主生物を培養する、
b)ABFB酵素を含む培養上清を分離する。
L−アラビノフラノシダーゼ活性は、40時間後に、0.15%provasoyおよび0.3%セルロースから成る混合添加物を使用して、M2培地のP.フニクロサム培養液から評価した。サンプルを、48時間および72時間の培養液から採取した。培養は、200ml容三角フラスコを用いて、有効量を50mlとして行った。活性は、50 mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)中で、5mMパラ−ニトロフェニル−(L−アラビノフラノシド(PNPAF)を加水分解することで決定した。50μlの培養上清を、50℃で15分間予熱した250μlの基質とともにインキュベートした。反応は、500μlの0.5M NaOHを添加することで停止した。p−ニトロフェニル(PNP)の放出は、17000M−1.cm−1のモル吸光係数で、405nmで評価する。酵素ユニットは、上記の条件において1分当り1μmolのPNPAFを加水分解する酵素の量として定義される。P.フニクロサムの培養において、培養の48時間後に20mU.ml−1および72時間後に112mU.ml−1であった。これらの結果は、文献と一致しており、アスペルギルス・ニガーにおいて、100〜600 mU.ml−1のオーダーの活性が、培養に使用される誘導物質によって観察された。
P.フニクロサム由来のゲノムDNAから開始し、一組のプライマー(HindIII abfB/XbaI abfB)を用いて、94℃ 30秒;62℃ 30秒;72℃ 1分30秒の条件で30サイクルによるPCRにより、abfB遺伝子を増幅した。PCR産物は、市販のベクターpGEM−T(tm)easyにクローン化した。
PCRプライマー対の配列
XbaI−abfB−1: >5’−TCTAGAATGTTTCCAAGAATAAAACCAG−3’<
HindIII−abfB−1: >5’−AAGCTTTCATGCAAAGGCAGTCT−3’<。
P.フニクロサム由来のアラビノフラノシダーゼB活性をコードするabfB−1遺伝子を、S.セレビジエにクローン化した。いくつかの形質転換体でアラビノフラノシダーゼB活性の有無について調べた後、形質転換体を選択し、24時間の増殖の後、ABFB活性を培養上清にて試験した。培養は、200ml容三角フラスコ(液量50ml)で行った。活性は、5mM p−ニトロフェニル−α−L−アラビノフラノシド(PNPAF)を含むMcIlvaine緩衝液系列(pH2.2〜8.0)にて測定した。80μlの培養上清を、40℃で10分間予熱した320μlの基質とともにインキュベートした。1mlの1M Na2CO3を添加することによって反応を止めた。p−ニトロフェニルの放出は、405nm−1で評価する。1酵素ユニットは、上に定義した条件において、1分当りに1μmolのPNPAFを加水分解する酵素の量として定義される。活性曲線を図1に示す。ABFB−1では、活性の最適条件はpH3.4であり、酵素は、pH5において65%活性を保存する。
同じプロトコールを使用して、ABFB−1の活性のための至適温度を決定した。酵素を、pH3.4のMcIlvaine緩衝液中で、各々の温度で10分間インキュベートした。活性曲線は図2に示される。P.フニクロサムABFB−1は、60℃が活性最適条件である。ABFB−1は、従って、文献によるABFBより高い温度最適条件を有する。ABFB−1酵素の最適pHおよび温度を選択した場合(pH3.4および60℃)、ABFB−1の活性は、pH5および40℃の酢酸塩緩衝液で決定される活性よりも4倍高い(424mU対102mU)ことがわかる。
ABFB−1の動力学的定数(KmおよびVm)は、上記の通り決定した最適条件の下、時間とともにPNPAFの加水分解を測定することによって決定した。
ABFB−1酵素の分子量を決定するため、最小培地における変異株(S.セレビジエ)の増殖培地由来の培養上清を200倍濃縮し、100℃で5分間沸騰することで変性させ、その後SDS−ポリアクリルアミドゲルで沈澱(deposit)させた。
ペニシリウム・フニクロサムは、2つのB α−L−アラビノフラノシダーゼをコード化する遺伝子を有している:abfB−1およびabfB−2遺伝子。様々なP.フニクロサム培養条件の下、これらの遺伝子の発現プロファイルを比較した。
Claims (14)
- 以下のポリペプチドから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする、動物栄養における使用に適したポリペプチド:
− SEQ ID No.2のポリペプチド;
− 配列が、SEQ ID No.2の位置28から位置507の間の配列であるポリペプチド。 - 以下のポリヌクレオチドから選択されることを特徴とする、α−L−アラビノフラノシダーゼB活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
− 配列が、SEQ ID No.1の位置845から位置2368の間の配列であるポリヌクレオチド;
− 配列が、SEQ ID No.1の位置926から位置2368の間の配列であるポリヌクレオチド;
− 請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - SEQ ID No.1の配列またはSEQ ID No.1に相補的な配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
- 以下を含むことを特徴とする、転写の調節における、発現カセット:
− 宿主生物で機能的であるプロモーター;
− 請求項2に記載のポリヌクレオチド;および
− 前記宿主生物にて機能的であるターミネーター配列。 - 請求項2から3の何れか1項に記載のポリヌクレオチドおよび/または請求項4に記載の発現カセットを含むベクター。
- 請求項2から3の何れか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項4に記載の発現カセットおよび/または請求項5に記載のベクターで形質転換された宿主生物。
- 前記宿主生物が、酵母および糸状菌から選択されることを特徴とする、請求項6に記載の宿主生物。
- ペニシリウム・フニクロサム株であることを特徴とする、請求項7に記載の宿主生物。
- 請求項1に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、動物のための栄養添加物。
- 請求項6から8の何れか1項に記載の宿主生物および/または請求項6から8の何れか1項に記載の宿主生物の発酵ブロスを含むことを特徴とする、動物のための栄養添加物。
- 液体の形態または粉末の形態であることを特徴とする、請求項9から10の何れか1項に記載の動物のための栄養添加物。
- 動物のための栄養基礎剤および請求項9から11の何れか1項に記載の動物のための栄養添加物を含むことを特徴とする、飼料。
- 動物のための栄養添加物または飼料の製造のための、請求項1に記載のポリペプチドまたは請求項6から8の何れか1項に記載の宿主生物の使用。
- アラビノフラノシル−オリゴ糖化合物のα−L−アラビノフラノシル結合を加水分解するための、請求項1に記載のポリペプチドまたは請求項6から8の何れか1項に記載の宿主生物の使用。
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