CN1676605A - 细菌性木聚糖酶的生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种细菌性木聚糖酶的生产方法，其特征在于采用耐高温枯草杆菌为生产菌种，通过液体深层发酵方法生产细菌性木聚糖酶。本发明的桔草杆菌生产出的细菌性木聚糖酶水解效率高，能高效降解底物，且即可生产出低分子量的碱性木聚糖酶，又可生产出高分子量的酸性木聚糖酶，具有更广泛的活性pH值范围，可更加有效地在不同动物的胃肠中发挥作用。本发明采用深层液体发酵生产细菌性木聚糖酶，其酶性好，其生产工艺易于控制，生产周期短，产品质量稳定，且适宜于工业化生产，自动化程度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种木聚糖酶的生产工艺，具体地是一种细菌性木聚糖酶的生产工艺。
背景技术
阿拉伯木聚糖(Arabinoxylan，AX)是广泛存在于我国常用植物性饲料原料(玉米、小麦、菜籽和棉粕)中的非淀粉多糖(Non-starch polysaccharides，NSP)，是限制营养物质有效利用的主要抗营养因子。因此，消除阿拉伯木聚糖的抗营养作用对进一步提高饲料资源的利用率、拓宽饲料资源和提高养殖经济效益有重要意义。国内外大量研究表明通过在饲料中添加外源木聚糖酶及其复合酶制剂可以提高饲料营养物质利用率，改善动物生产性能。
通过对木聚糖酶的酶解作用模式进行的研究表明，内切木聚糖酶可以随机攻击木聚糖的1-4-β糖苷键，并优先攻击非取代基团。木聚糖酶主要来源于细菌和真菌，大多数细菌性木聚糖酶为内木聚糖酶，其作为饲料具有下述独特的优点：
1、热稳定性及贮存稳定性：稳定性是影响酶制剂使用效果的关键因素，使用结果表明在80℃的造粒温度下，细菌性木聚糖酶的活性保留值为80％，而真菌性木聚糖酶仅保留5％左右。
2、较高的内切木聚糖酶糖比例，酶解效率高：细菌性木聚糖酶主要由内切性木聚糖酶组成，分解木聚糖酶的效率高；细菌性木聚糖酶大多属于10族内切酶，水解异型聚糖(取代木聚糖)和同型木聚糖的能力更强。
3、彻底降解木聚糖。细菌性木聚糖酶不但可以作用于可溶性木聚糖，而且可作用于不溶性木聚糖，进一步释放细胞壁中包裹的营养物质。在各种植物原料中都存在不溶性木聚糖(占木聚糖总量的80％)，它们和纤维素相互作用包裹营养物质形成营养屏障，影响营养吸收。使用细菌性木聚糖酶可显著提高日粮的代谢能、消化能及其营养物质的消化率，可广泛应用于豆粕、玉米、小麦、饼粕等植物原料为主的饲料中。
4、对酶的抑制剂不敏感：植物饲料原料中存在着对真菌性木聚糖酶的抑制剂，但对细菌性木聚糖酶不敏感，细菌性木聚糖酶在使用中不受酶抑制剂的影响，保持较高酶活。
5、PH适应范围广：细菌性木聚糖酶相对具有更广泛的活性PH值范围，可更加有效地在不同动物的胃肠道中发挥作用。在胃部其稳定性很好，进入肠道后呈现更高的酶活(肠道是消化道中最长的部位)，使食糜在动物肠道内更好地被降解消化吸收。
上世纪50-70年代，开始研究外源酶在动物中的应用，但因价格昂贵而限制了其应用。80年代后，生物技术的发展促进了饲用酶制剂的研究和商品化生产和应用。我国饲用酶制剂的应用起于80年代后期。目前，酶制剂特别是以木聚糖酶为主的复合酶制剂以其可有效降解玉米、小麦和杂粕等饲料原料中的阿拉伯木聚糖，消除阿拉伯木聚糖对动物的抗营养作用，提高营养物质利用率和动物的生长性能而成为一种在养殖业中广泛应用的酶制剂。特别是细菌性木聚糖酶以其稳定性好，降解效率高等特点引起了人们的广泛关注。
我国大部分肉鸡饲料和部分猪饲料均采用制粒工艺，很多饲料厂温度超过75℃，甚至到90℃以上。因此，酶制剂产品的耐温性是影响其使用效果的关键，也是衡量酶制剂性能的主要指标。
目前国际上仅有比利时NUTREX公司开发出耐热性的细菌性的内切木聚糖酶，其生产工艺不详，且其售价高。
目前我国市场上销售的绝大部分木聚糖酶均为真菌性木聚糖酶。是用真菌和固体发酵技术生产木聚糖酶，终产物为多酶复合体，发酵参数变异加大，难于控制，产品质量不稳定，添加量大，生产成本高。特别是对热处理抵抗能力低，饲料制粒过程中酶活损失大，储存期短，实际应用安全问题较多。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种能实现生产的大型化、机械化、自动化和连续化，提高产品的耐高温性及水解性能，降低生产成本，提高产品质量的饲用细菌性木聚糖酶的生产方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：一种细菌性木聚糖酶的生产方法，其特征在于采用耐高温枯草杆菌为生产菌种，通过液体深层发酵方法生产细菌性木聚糖酶。
本发明生产方法的具体步骤是：
第一，菌种活化：将保藏菌种接种于斜面培养基(复壮培养基)上，于33-39℃，培养40-52小时；第二，瓶培养：将经活化并扩大培养的种子接摇瓶进行培养，500ml摇瓶中装50ml培养液，转速160-200rpm，培养温33-39℃，时间24-48小时；第三，种子罐培养：种子罐培养：将摇瓶中培养的菌体液移至种子罐，接种量为0.4-0.8％，转速220-280rpm，恒温33-39℃，培养24-48小时；121℃保温20min；第四，发酵培养：将种子罐培养的菌体液移至发罐酵，接种量0.5-1％，发酵温度33-39℃，PH7.2，转速130rpm，通气比1∶0.7，发酵周期48-72小时，发酵液的酶活单位达10000U/ml。转速为130rpm，培养时间约70h，第五，后处理：发酵液经过滤、沉淀、浓缩、吸附干燥工序制备成所需细菌性木聚糖酶；
其中，
斜面培养基为：牛肉膏2-4g，蛋白胨8-12g，氯化钠(NaCl)4-6g，琼脂18-22g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2；
摇瓶中培养液为：牛肉膏2-4g，蛋白胨8-12g，氯化钠(NaCl)4-6g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2；
种子罐中的培养液为：葡萄糖1-2％，CaCl2.2H2O(二水氯化钙)0.01-0.05％，NH4H2PO4(磷酸二氢铵)0.3-0.7％，FeSO4.7H2O(七水硫酸亚铁)0.01-0.05％，柠檬酸钠0.05-0.1％，PH7.2；
发酵罐中的培养液为：酵母膏0.1-0.3％，葡萄糖1-2％，FeSO4.7H2O(七水硫酸亚铁)0.01-0.05％，MnSO4.H2O(二水硫酸锰)0.03-0.08％，CaCl2.2H2O(二水氯化钙)0.01-0.05％，柠檬酸钠0.03-0.08％，PH7.2，
本发明的桔草杆菌生产出的细菌性木聚糖酶水解效率高，能高效降解底物，且即可生产出低分子量的碱性木聚糖酶，又可生产出高分子量的酸性木聚糖酶，具有更广泛的活性PH值范围，可更加有效地在不同动物的胃肠中发挥作用。
本发明采用深层液体发酵生产细菌性木聚糖酶，其酶性好，其生产工艺易于控制，生产周期短，产品质量稳定，且适宜于工业化生产，自动化程度高。
具体实施方式
实施例1：
1、菌种冷冻保藏：制备枯草芽孢杆菌体悬浮液，经冷冻干燥处理，将冷冻后菌体装于充氮的密封安培瓶中，保藏于-80℃低温冰箱，保存期限为8-10年。
2、冷冻后的菌种的复壮及筛选：将菌体粉溶解于无菌生理盐水中，接种于复壮培养基上，于37℃培养48h，筛选菌落较大，表面光滑、湿润的单菌体。其中，斜面培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠(NaCl)5g，琼脂20g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2，在121℃下灭菌20min，将灭菌斜面培养基放入37℃的温室中培养24-48h，以检查灭菌是否彻底。
3、母瓶培养：将经活化并扩大培养的种子接摇瓶进行培养，500ml摇瓶(三角瓶)中装50ml培养液，转速160rpm，培养温33℃，时间48h；摇瓶培养液为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
4、种子罐培养：将摇瓶中培养24h后的菌体液移至种子罐，接种量为0.4％，转速220rpm，恒温37℃培养24h。培养基：葡萄糖1％，CaCl2.2H2O 0.01％，NH4H2PO4 0.5％，FeSO4.7H2O0.01％，柠檬酸钠0.05％，PH7.2，121℃保温20min。
5、发酵培养：接种量0.5％，发酵温度37℃，PH7.2，转速130rpm，通气比1∶0.7，发酵周期70h，发酵液的酶活单位达10000U/ml。培养基：酵母膏0.1％，葡萄糖1％，FeSO4.7H2O 0.01％，MnSO4.H2O0.05％，CaCl2.2H2O 0.01％，柠檬酸钠0.05％，PH7.2，121℃保温20min。
6、发酵液预处理：发酵液添加絮凝剂后，静置30min，经离心过滤，除去菌体，收集上清液，调节清液酸度，PH为5.0，静置1h，过滤除去大部分沉淀，收集清液。
7、浓缩：采用多效减压薄膜蒸发法，真空度约为0.07Mpa，蒸发温度70℃，料液瞬间受热时间约20S。
8、干燥：用淀粉和玉米芯(1∶2)载体吸附经浓缩的酶液，于鼓风干燥箱中干燥，温度50℃，时间约2H，待物料含水量为10％时，经粉碎和调配即可。
实施例2：
1、菌种活化扩大：将冷冻保藏的枯草芽孢杆菌菌体粉溶解于无菌生理盐水中，接种于复壮培养基上，于33℃培养52h，筛选菌落较大，表面光滑、湿润的单菌体。其中，斜面培养基为：牛肉膏2g，蛋白胨8g，氯化钠(NaCl)4g，琼脂18g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2，在121℃下灭菌20min，将灭菌斜面培养基放入37℃的温室中培养24-48h，以检查灭菌是否彻底。
2、瓶培养：将经活化并扩大培养的种子接摇瓶进行培养，500ml摇瓶(三角瓶)中装50ml培养液，转速180rpm，培养温37℃，时间24h；摇瓶培养液为：牛肉膏2g，蛋白胨8g，NaCl4g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
3、种子罐培养：将摇瓶中培养24h后的菌体液移至种子罐，接种量为0.5％，转速250rpm，恒温33℃培养48h。培养基：葡萄糖1％，CaCl2.2H2O 0.01％，NH4H2PO4 0.5％，FeSO4.7H2O0.01％，柠檬酸钠0.05％，PH7.2，121℃保温20min。
4、发酵培养：接种量0.5％，发酵温度37℃，PH7.2，转速130rpm，通气比1∶0.7，发酵周期70h，发酵液的酶活单位达10000U/ml。培养基：酵母膏0.1％，葡萄糖1％，FeSO4.7H2O 0.01％，MnSO4.H2O0.05％，CaCl2.2H2O 0.01％，柠檬酸钠0.05％，PH7.2，121℃保温20min。
5、发酵液预处理：发酵液添加絮凝剂后，静置30min，经离心过滤，除去菌体，收集上清液，调节清液酸度，PH为5.0，静置1h，过滤除去大部分沉淀，收集清液。
6、浓缩：采用多效减压薄膜蒸发法，真空度约为0.07Mpa，蒸发温度70℃，料液瞬间受热时间约20S。
7、干燥：用淀粉和玉米芯(1∶2)载体吸附经浓缩的酶液，于鼓风干燥箱中干燥，温度50℃，时间约2H，待物料含水量为10％时，经粉碎和调配即可。
实施例3：
1、菌种活化扩大：将冷冻保藏的枯草芽孢杆菌菌体粉溶解于无菌生理盐水中，接种于复壮培养基上，于39℃培养40h，筛选菌落较大，表面光滑、湿润的单菌体。其中，斜面培养基为：牛肉膏5g，蛋白胨12g，氯化钠(NaCl)6g，琼脂22g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2，在121℃下灭菌20min，将灭菌斜面培养基放入37℃的温室中培养24-48h，以检查灭菌是否彻底。
2、瓶培养：将经活化并扩大培养的种子接摇瓶进行培养，500ml摇瓶(三角瓶)中装50ml培养液，转速200rpm，培养温39℃，时间24h；摇瓶培养液为：牛肉膏5g，蛋白胨12g，NaCl6g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
3、种子罐培养：将摇瓶中培养24h后的菌体液移至种子罐，接种量为0.5％，转速250rpm，恒温33℃培养48h。培养基：葡萄糖1％，CaCl2.2H2O 0.01％，NH4H2PO4 0.5％，FeSO4.7H2O0.01％，柠檬酸钠0.05％，PH7.2，121℃保温20min。
4、发酵培养：接种量0.5％，发酵温度37℃，PH7.2，转速130rpm，通气比1∶0.7，发酵周期70h，发酵液的酶活单位达10000U/ml。培养基：酵母膏0.1％，葡萄糖1％，FeSO4.7H2O 0.01％，MnSO4.H2O0.05％，CaCl2.2H2O 0.01％，柠檬酸钠0.05％，PH7.2，121℃保温20min。
5、发酵液预处理：发酵液添加絮凝剂后，静置30min，经离心过滤，除去菌体，收集上清液，调节清液酸度，PH为5.0，静置1h，过滤除去大部分沉淀，收集清液。
6、浓缩：采用多效减压薄膜蒸发法，真空度约为0.07Mpa，蒸发温度70℃，料液瞬间受热时间约20S。
7、干燥：用淀粉和玉米芯(1∶2)载体吸附经浓缩的酶液，于鼓风干燥箱中干燥，温度50℃，时间约2H，待物料含水量为10％时，经粉碎和调配即可。
试验与结果：
细菌木聚糖酶耐热稳定性：称取15份木聚糖酶(单位为15000U/g)，每份约10g，均匀平摊于100cm2的玻璃板上，放置于恒湿恒温的试验箱中进行耐热试验，相对湿度稳定于90％，处理温度分别为85℃、80℃、75℃，恒温时间分别为2min、4min、6min、8min、10min，然后检测各样品的酶活，结果如下：
结果说明，细菌木聚糖酶在饲料生产加工中具有较高稳定性，能保持高的酶力，有效降解抗营养因子，是一种理想的绿色饲料添加剂。
Claims (2)
1、一种细菌性木聚糖酶的生产方法，其特征在于采用耐高温枯草杆菌为生产菌种，通过液体深层发酵方法生产细菌性木聚糖酶。
2、如权利要求1所述的生产方法，其特征在于其具体生产步骤如下：
第一，菌种活化：将保藏菌种接种于斜面培养基上，于33-39℃，培养40-52小时；第二，瓶培养：将经活化并扩大培养的种子接摇瓶进行培养，500ml摇瓶中装50ml培养液，转速160-200rpm，培养温33-39℃，时间24-48小时；第三，种子罐培养：种子罐培养：将摇瓶中培养的菌体液移至种子罐，接种量为0.4-0.8％，转速220-280rpm，恒温33-39℃，培养24-48小时；121℃保温20min；第四，发酵培养：将种子罐培养的菌体液移至发罐酵，接种量0.5-1％，发酵温度33-39℃，PH7.2，转速130rpm，通气比1∶0.7，发酵周期48-72小时，发酵液的酶活单位达10000U/ml，转速为130rpm，培养时间约70h；第五，后处理：发酵液经过滤、沉淀、浓缩、吸附干燥工序制备成所需细菌性木聚糖酶；
其中：
斜面培养基为：牛肉膏2-4g，蛋白胨8-12g，氯化钠4-6g，琼脂18-22g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2；
摇瓶中培养液为：牛肉膏2-4g，蛋白胨8-12g，氯化钠4-6g，加水定容至1000ml，PH7.0-7.2；
种子罐中的培养液为：葡萄糖1-2％，二水氯化钙0.01-0.05％，磷酸二氢铵0.3-0.7％，七水硫酸亚铁0.01-0.05％，柠檬酸钠0.05-0.1％，PH7.2；
发酵罐中的培养液为：酵母膏0.1-0.3％，葡萄糖1-2％，七水硫酸亚铁0.01-0.05％，二水硫酸锰0.03-0.08％，二水氯化钙0.01-0.05％，柠檬酸钠0.03-0.08％，PH7.2。
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|---|---|---|---|---|
| CN101525607B (zh) * | 2009-04-13 | 2010-12-08 | 云南大学 | 高温木聚糖酶的制备方法 |
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