CN101067129A - 一种利用宇佐美曲霉产业化生产木聚糖酶的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用宇佐美曲霉产业化生产木聚糖酶的方法，属于酶工程技术领域。本发明以蔗渣或玉米芯、麸皮和豆饼粉等农作物废弃物为发酵基料，并添加适量的无机盐、表面活性剂和自来水等，采用30M³固态发酵罐，利用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株固态发酵产业化生产木聚糖酶，本发明提供了发酵培养基配方和发酵条件，成熟发酵曲料经45～50℃热风烘干(干曲含水量8％左右)，木聚糖酶活性达到7783～9616IU/g干曲，高于目前国内水平。

Description

一种利用宇佐美曲霉产业化生产木聚糖酶的方法

技术领域

本发明涉及一种以蔗渣或玉米芯、麸皮和豆饼粉等农作物废弃物为基料，利用宇佐美曲霉E001菌株固态发酵产业化生产木聚糖酶的方法，属酶工程技术领域。

技术背景

木聚糖(xylans)是由多个吡喃木糖残基通过β-1，4-木糖苷键连接成主链，并在其侧链上连有多种不同取代基的不均一聚糖，是植物半纤维素的主要组分，后者在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可再生资源。

木聚糖酶(xylanases)是一类在木聚糖降解过程中起协同作用的多组分酶系，属于半纤维素酶类，通常是指β-1，4-D-木聚糖内切酶(β-1，4-D-endoxylanase，EC3.1.2.8)，能从木聚糖主链的内部随机切割木糖苷键，将其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖。木聚糖酶广泛存在于真核、原核微生物及某些动植物中。近年来，随着对自然界半纤维素资源的开发利用，尤其是低聚木糖优越的生理功能和饲料中抗营养因子的去除，人们对不同来源和不同特性的木聚糖酶进行了深入地研究，木聚糖酶的应用领域不断地被拓展，其在造纸、食品、饲料、纺织、酿酒、医药、环境和能源等工业领域均有较广泛的应用。目前，研究最为深入、应用最为广泛的是来源于曲霉、青霉和木霉等真菌所产的酸性或中性木聚糖酶；近年来，从某些极端生态环境中筛选到一些耐热或(/和)耐碱菌株，其所产耐热性或(/和)耐碱性木聚糖酶已引起人们广泛的关注；同时，某些人工构建的木聚糖酶基因工程菌株，由于其产木聚糖酶活性高、酶系纯、酶学特性符合人们设定的应用要求，也已得到了广泛应用。

木聚糖酶按其最适作用pH值可分为碱性、中性和酸性木聚糖酶，各自有其不同的酶学特性和应用领域。

碱性木聚糖酶(最适作用pH值8～10)：来源于某些耐碱菌以及由其作为木聚糖酶基因供体所构建的基因工程菌所产生的，目前主要应用于造纸工业纸浆的预漂白工艺中。一方面可以改善纸浆化学漂白的效果，得到比单纯用碱提取、氯漂白处理更好的纸浆特性；另一方面可以减少碱和氯的用量，从而降低废水中有毒、致癌和致畸有机氯化物的含量，减少了对环境的污染。

中性木聚糖酶(最适作用pH值6～8)：一般来源于某些细菌产生的，目前主要用于降解玉米芯、棉子壳和甘蔗渣中的木聚糖制备功能性低聚木糖，后者有利于人和动物肠道内以双歧杆菌、乳酸菌等为代表的有益菌群的增殖，以增强人和动物体内非免疫防御系统。此外，该类木聚糖酶还可用于纺织原料苎麻的脱胶、低温油井的破胶等。

酸性木聚糖酶(最适作用pH值3～5)：一般来源于真菌产生的，在饲料工业中有着广阔的应用前景。酸性木聚糖酶单独使用或与其它半纤维素酶或纤维素酶复配，可有效地去除饲料中的抗营养因子，从而提高各种类型饲料的能量值和利用率，减少畜禽肠道疾病，提高成活率，减少粘粪等。此外，在功能性低聚木糖的制备、酒类和果蔬汁的澄清、食品的加工和贮藏等领域中也有广泛的应用。

由于木聚糖酶在工业领域中有着越来越多的应用，而木聚糖酶的生产主要是利用微生物的液体发酵或固态发酵，所以除了需加大木聚糖酶的基础理论研究之外，还需选育高产菌株和优化发酵工艺条件。目前国外研究所涉及的微生物主要有霉菌、放线菌、细菌等，并利用各种耐酸/或碱、耐高温细菌以及由其作为木聚糖酶基因供体的基因工程菌来发展耐酸/或碱以及耐高温的木聚糖酶，拓宽木聚糖酶的应用范围。

在国内，木聚糖酶研究主要以霉菌为主。朱静、周世宁、陈一平等人分别从土壤中筛选了产木聚糖酶的曲霉属菌株，但发酵产木聚糖酶活性均较低(采用液体发酵法，酶活性不超过15IU/mL)；陈惠忠等利用黑曲霉(Aspergillusniger)An-76菌株，液体发酵产木聚糖酶活性达353.6IU/mL；杨瑞金等筛选到了一株青霉菌，在添加玉米芯木聚糖作为诱导剂的培养基中进行液体发酵，酶活性达289.3IU/mL；刘月英等利用棒曲霉UA-2菌株，固态发酵产木聚糖酶活性为2696U/g；符丹丹等利用宇佐美曲霉E001菌株，固态发酵产木聚糖酶活性为7442U/g。

目前，无论是液体发酵法还是固态发酵法，微生物产木聚糖酶活性均较低，导致了木聚糖酶的生产和应用成本高，从而限制了该酶的广泛应用，尤其是在饲料工业和低聚木糖生产等领域中的应用；而且未见有利用宇佐美曲霉固态发酵产业化生产木聚糖酶的文献或专利报道。微生物固态发酵具有设备简单、投资少、见效快、生产成本低以及对环境友好等优势。本发明的木聚糖酶发酵酶活性高于目前国内水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用农作物废弃物，经生物转化产业化生产木聚糖酶的方法。

本发明的技术方案：以蔗渣或玉米芯、麸皮和豆饼粉为发酵培养基的基料，并添加适量的无机盐、表面活性剂和自来水，在30M³固态发酵罐内，利用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株固态发酵产业化生产木聚糖酶。

菌株：宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001，由江南大学医学院分子生物学研究室筛选和保藏，该菌株巳在《食品与发酵工业》2005Vol.31No.4p50公开。

斜面种子培养基及培养条件：去皮马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH；121℃灭菌20min，放置斜面；冷却后接种E001菌株，置28℃培养96h。此斜面培养基用于菌种活化、保藏和试管斜面种子等。

三角瓶麸曲种子的制备：250mL三角瓶中装10g基料(麸皮8.0g+玉米芯2.0g)，(NH₄)₂SO₄ 100mg，自来水13mL，pH 6.0。于121℃灭菌40min，冷却后接种试管斜面种子，28℃培养96h，期间分别于24h和40h各翻曲1次。

曲盘麸曲种子的制备：称取3.0kg基料(麸皮2.4kg+玉米芯0.6kg)，(NH₄)₂SO₄ 30g，自来水3.9L，pH 6.0，混匀，装入8层纱布袋中。于121℃灭菌40min，冷却后置于曲盘(100cm×50cm×10cm)中，接种1只三角瓶(250mL)麸曲种子，于28℃曲房中培养96h，期间分别于24h和40h各翻曲1次，并同时各补加无菌水390mL。

固态发酵产业化生产木聚糖酶：

接种物：E001曲盘麸曲种子。

发酵培养基配方：1000kg基料(蔗渣或玉米芯350～450kg+麸皮350～450kg+豆饼粉100～200kg)，并添加(NH₄)₂SO₄ 15～20kg，KH₂PO₄ 3.0～5.0kg，CaCl₂0.5～1.0kg，MgSO₄ 0.5～1.0kg，CoCl₂ 0.05kg，FeSO₄·7H₂O 0.05kg，ZnCl₂ 0.05kg，Tween-80 4.0kg，自来水1600～1800kg，pH 5.5～6.5。

固态发酵条件：将上述发酵培养基加入6M³高压蒸煮锅，用蒸汽加热至121℃，保温灭菌40min，冷却至36～38℃后，接种3kg E001曲盘麸曲种子，混匀，置于30M³固态发酵罐(4.5m×2.0m)内，于28～32℃间断通风培养64～72h，期间分别于20～22h和36～38h各翻曲1次，并同时各补加无菌水160～180kg。

分析方法：

木聚糖酶活性测定：于25mL具塞试管A、B中，各加入用pH 4.6、乙酸-乙酸钠缓冲液配置的质量浓度为0.5％的木聚糖溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应15min；立即分别加入2.5mL 3’，5’-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A、B管各煮沸7min；冷却后各加水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶单位。酶活性定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖的酶量定义为1个木聚糖酶活性单位(IU)。

还原糖测定：采用DNS法，以木糖为标准。

水分测定：称取一定量的麸曲，105℃烘干至恒重。

本发明的有益效果：本发明利用宇佐美曲霉E001菌株，在固态发酵实验室小试的基础上，采用30M³固态发酵罐，实施了木聚糖酶的固态发酵产业化生产。成熟发酵曲料经45～50℃热风烘干(干曲含水量8％左右)，木聚糖酶活性达到7783～9616IU/g干曲。可直接应用于造纸、饲料、纺织、酿酒、环境和能源等工业领域；将发酵曲料用水浸提和精制，可用于食品和医药领域。

本发明突出的优点有：(1)采用本发明优化的培养基配方和发酵条件，充分挖掘了宇佐美曲霉E001产木聚糖酶的潜力；(2)采用蔗渣或玉米芯、麸皮和豆饼粉等农作物废弃物作为固态发酵主原料，充分地利用了自然界的可再生资源；(3)固态发酵法对环境友好，是一种绿色环保的生产方法；(4)与利用微生物液体深层发酵法相比较，固态发酵法生产木聚糖酶具有设备简单、投资少、生产成本低等优势。

具体实施方式

以下是采用蔗渣或玉米芯、麸皮和豆饼粉等农作物废弃物为主原料，并添加适量的无机盐、表面活性剂和自来水等，利用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株固态发酵产业化生产木聚糖酶的实施例，但本发明并不限于所列出的几个实施例。

实施例1

菌株：宇佐美曲霉E001。

固态发酵设备：30M³固态发酵罐，带自动控温鼓风装置、机械翻曲装置、机械补水装置和机械出料装置等。罐体直径4.5m，罐体高度2.0m，实装1000kg基料(以干物料计)，发酵培养基堆积厚度30cm。

固态发酵培养基：1000kg固态发酵基料(蔗渣450kg+麸皮450kg+豆饼粉100kg)，(NH₄)₂SO₄ 20kg，KH₂PO₄ 5kg，CaCl₂ 0.5kg，MgSO₄ 0.5kg，CoCl₂0.05kg，FeSO₄·7H₂O 0.05kg，ZnCl₂ 0.05kg，Tween-80 4.0kg，自来水1800kg，pH 6.0。

固态发酵条件：将发酵培养基加入6M³高压蒸煮锅，用蒸汽加热至121℃，保温40min，冷却至36～38℃后，接种3kg E001曲盘麸曲种子，混匀后，置于30M³固态发酵罐内，采用间断通风将温度控制在28℃，恒温培养72h，期间分别于22h和38h各翻曲1次，并同时各补加无菌水180kg。

重复3批次的上述产业化生产试验结果表明，成熟发酵曲料经45～50℃热风烘干(干曲含水量8％左右)，木聚糖酶平均酶活性达到7924IU/g干曲。

实施例2

在实施例1的基础上，为了有利于菌体的生长，达到缩短发酵周期和控制杂菌污染的目的，本实施例采用固态发酵温度前高后低的变温控制模式。

实施例1发酵培养基经灭菌、冷却、接种后，置于30M³固态发酵罐内。(1)发酵前期(0～20h)：0～8h将进风口和出风口全部关闭，温控仪设置在32℃；8～12h将进风口和出风口开启1/3，随后12～20h逐渐开大进风口和出风口，直至全部开启，温度仍控制在32℃。(2)发酵中期(20～48h)：20h翻曲一次并同时补加无菌水180kg，并将设定温度调低至31℃；36h再翻曲一次并同时补加无菌水180kg，将设置温度调低至30℃；36～48h将温度逐渐调低至28℃。(3)发酵后期(48～64h)：将28℃一直保持到64h发酵结束。

重复3批次的上述产业化生产试验结果表明，成熟发酵曲料经45～50℃热风烘干(干曲含水量8％左右)，木聚糖酶平均酶活性达到8479IU/g干曲。

实施例3

改变固态发酵基料中蔗渣与豆饼粉的比例，其余配方同实施例2。

1000kg基料(蔗渣350kg+麸皮450kg+豆饼粉200kg)，(NH₄)₂SO₄ 20kg，KH₂PO₄ 5kg，CaCl₂ 0.5kg，MgSO₄ 0.5kg，CoCl₂ 0.05kg，FeSO₄·7H₂O 0.05kg，ZnCl₂ 0.05kg，Tween-80 4.0kg，自来水1800kg，pH 6.0。发酵培养基经灭菌、冷却、接种后，置于30M³固态发酵罐内，发酵条件同实施例2。

重复3批次的上述产业化生产试验结果表明，成熟发酵曲料经45～50℃热风烘干(干曲含水量8％左右)，木聚糖酶平均酶活性达到9616IU/g干曲。

实施例4

用玉米芯完全替代固态发酵基料中的蔗渣，其余配方同实施例3。

1000kg基料(玉米芯350kg+麸皮450kg+豆饼粉200kg)，(NH₄)₂SO₄ 20kg，KH₂PO₄ 5kg，CaCl₂ 0.5kg，MgSO₄ 0.5kg，CoCl₂ 0.05kg，FeSO₄·7H₂O 0.05kg，ZnCl₂ 0.05kg，Tween-80 4.0kg，自来水1800kg，pH 6.0。发酵培养基经灭菌、冷却、接种后，置于30M³固态发酵罐内，发酵条件同实施例3。

重复3批次的上述产业化生产试验结果表明，成熟发酵曲料经45～50℃热风烘干(干曲含水量8％左右)，木聚糖酶平均酶活性达到8034IU/g干曲。

Claims (1)

1、一种固态发酵产业化生产木聚糖酶的方法，其特征是以蔗渣或玉米芯、麸皮和豆饼粉为发酵培养基的基料，并添加适量的无机盐、表面活性剂和自来水，在30M³固态发酵罐内，利用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株固态发酵产业化生产木聚糖酶；

固态发酵培养基配方：1000kg基料中的组分为：蔗渣或玉米芯350～450kg，麸皮350～450kg和豆饼粉100～200kg，并添加(NH₄)₂SO₄ 15～20kg，KH₂PO₄3.0～5.0kg，CaCl₂ 0.5～1.0kg，MgSO₄ 0.5～1.0kg，CoCl₂ 0.05kg，FeSO₄·7H₂O 0.05kg，ZnCl₂ 0.05kg，Tween-80 4.0kg，自来水1600～1800kg，pH 5.5～6.5；

固态发酵条件：固态发酵培养基121℃灭菌40min，冷却至36～38℃，接种3kgE001曲盘麸曲种子，混匀，置于30M³固态发酵罐内，于28～32℃间断通风培养64～72h，期间分别于20～22h和36～38h各翻曲1次，并同时各补加无菌水160～180kg。