CN103060202A - 生产高效降解饲料底物的木聚糖酶的米曲霉及生产木聚糖酶的方法 - Google Patents
生产高效降解饲料底物的木聚糖酶的米曲霉及生产木聚糖酶的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及发酵领域，具体地，涉及能生产高效降解饲料底物的木聚糖酶的米曲霉及生产木聚糖酶的方法。根据本发明的能够高效降解饲料的木聚糖酶的菌株米曲霉（Aspergillus oryzae）Y-1其保藏编号为CGMCC No.6842。发明所提供的由米曲霉（Aspergillus oryzae）Y-1产生的木聚糖酶具有高效降解饲料，显著提高动物生产性能的能力，生产过程不产生废水废渣，无二次环境污染，设备简单，生产成本低，可作为禽、畜、水产养殖动物的饲料添加剂，使用范围广。
Description
技术领域
本发明涉及发酵领域，具体地，涉及能生产高效降解饲料底物的木聚糖酶的米曲霉及生产木聚糖酶的方法。
背景技术
我国饲料资源中玉米供应日趋紧张，使用麦类饲料作为能量饲料越来越受到重视。在小麦、大麦、高粱等植物性饲料原料中存在着大量的非淀粉多糖(NSPS)，特别是阿拉伯木聚糖，对动物消化吸收存在一定的抗营养作用，使饲料营养成分尤其是脂肪和蛋白质不能被充分消化吸收，最终导致营养物质的消化吸收率下降。此外，食糜在小肠的滞留会引起微生物的异常繁殖，使动物生长受阻，表观代谢能（AME）受到抑制。木聚糖酶（xylanase）是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，主要包括外切β-1,4-木聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶和β-木聚糖酶。它可以将饲料中的非淀粉多糖（NSPS）分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改善饲料性能，消除或降低非淀粉多糖在动物肠胃中因粘度较大而引起的抗营养作用；同时它可以破坏植物细胞壁的结构，提高内源性消化酶的活性，提高饲料养分的利用表观代谢能（AME）；另外还可以减少微生物的定植、维持肠道正常结构，取得了良好的社会效益和经济效益。
目前饲用酶制剂的生产主要有液态和固态发酵方式。固态发酵是高效生产酶制剂的方法之一，存在着很多优点，如单位体积的培养基的生产能力大大高于液态培养基；对工厂、机械设备和能源等的要求不高，操作成本低；培养基含水量小，不易污染杂菌等。目前，在木聚糖酶生产成本中培养基的成本占总成本的30%～40%，因此，利用廉价的培养基成分（特别是碳源）是降低木聚糖酶生产成本的关键。而农业废弃物如玉米芯、秸杆、蔗渣、麸皮等既是碳源，又是固态发酵生产木聚糖酶的良好载体。
随着研究的深入，固态发酵生产木聚糖酶的水平也得到了较大的提高。Lakshmi等（2009）报道了Aspergillus terreus MTCC 8661固态发酵木聚糖酶活力可达到115000IU/g干物质，这是迄今为止木聚糖酶活力最高的报道。邬敏辰等人（2007）报道了Aspergillus usamii利用麸皮、豆粕粉等农作物废弃物为发酵基质，在28-32℃发酵64-72h后，木聚糖酶活力达7783-9616IU/g，为目前国内报道的最高水平。然而，很多研究主要涉及木聚糖酶活力的提高，而没有涉及木聚糖酶的实际应用功效，及木聚糖酶实际降解饲料的酶解效果。王前广等人（2005）利用体外酶解法快速评定不同酶制剂在小麦型日粮中的应用效果，结果表明酶活高的木聚糖酶其体外应用效果并不一定好。这与本实验室得到的试验结果相一致。因此，仅仅通过提高木聚糖酶活力是不能评判饲用木聚糖酶的作用效果。这个问题阻碍了木聚糖酶在饲料工业中的生产与在养殖业中的规模使用。许多研究表明，体外模拟法是评价酶制剂品质的有效方法之一，体外法能够在一定程度上反映酶制剂的作用效果，并与动物试验结果有较强的一致性。动物试验是准确评价酶制剂使用效果的方法。因此，饲用木聚糖酶的品质不仅仅是提高木聚糖酶活力，而且还要结合体外法对饲料底物的降解效果以及动物试验的验证。
发明内容
本发明是针对目前固态发酵木聚糖酶的研究只侧重酶活的提高，而没有涉及木聚糖酶的实际应用效果而提出并完成的。
首先，本发明的目的是提供一种能够高效降解饲料的木聚糖酶的菌株。
本发明的再一目的是提供一种生产高效降解饲料的木聚糖酶的方法。
根据本发明的能够高效降解饲料的木聚糖酶的菌株米曲霉（Aspergillus oryzae）Y-1其保藏编号为CGMCC No.6842。米曲霉（Aspergillus oryzae）Y-1自广东珠海市饲料厂麸皮堆放处周围土壤中分离得到。首先将土样用马铃薯琼脂培养基培养，然后用含有0.5%木聚糖的马铃薯琼脂培养基进行初筛，最后固态发酵木聚糖酶进行复筛，最终得到米曲霉Y-1。米曲霉Y-1质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色，背面无色。分生孢子头放射状，层球形或近球形。
根据本发明的生产高效降解饲料的木聚糖酶的方法包括通过发酵上述米曲霉（Aspergillus oryzae）Y-1得到木聚糖酶的步骤。
根据本发明的生产高效降解饲料的木聚糖酶的方法，其中，米曲霉（Aspegillusoryzae）Y-1在固态培养基上发酵。所述固态培养基为麸皮70%，玉米芯30%，硫酸铵3%，磷酸二氢钾1.5%（m/m），料水比1：1-1.2（m/m）的发酵培养基。
根据本发明的生产高效降解饲料的木聚糖酶的方法，其中，发酵工艺为：采用曲房多层固态发酵方法，将孢子悬浮液喷洒至固态发酵培养基中，搅拌均匀，调节空气温度在30-32℃，控制相对湿度80%-95%的条件下培养72-84h，然后于45-50℃下低温干燥。
本发明所提供的木聚糖酶，具有高效降解饲料的能力，即在相同条件下应用于体外酶解饲料原料，较其它市售商品木聚糖酶具有显著的酶解效果（以净还原糖为指标）。
本发明所提供的木聚糖酶，具有显著提高动物的生产性能，即动物试验显示小麦型日粮添加本发明的木聚糖酶后，动物的生产性能得到了显著的提高。
本发明所提供的由米曲霉（Aspergillus oryzae）Y-1产生的木聚糖酶具有高效降解饲料，显著提高动物生产性能的能力，生产过程不产生废水废渣，无二次环境污染，设备简单，生产成本低，可作为禽、畜、水产养殖动物的饲料添加剂，使用范围广。
米曲霉（Aspergillus oryzae）Y-1于2012年11月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101），其保藏编号是：CGMCC No.6842。
具体实施方式
实施例1、菌种的分离、筛选
1、分离、筛选所用的培养基
分离培养基：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15-20g/L，pH自然，121℃灭菌20min。
初筛培养基：在分离培养基中添加0.5%（m/v）的桦木木聚糖（SigmaX4252-100G），121℃灭菌20min。
复筛固体发酵培养基：麸皮70%，玉米芯30%，硫酸铵3%，磷酸二氢钾1.5%，（m/m），料水比1：1-1.2（m/m）。121℃灭菌30min。
2、分离、筛选的方法及步骤
将1g从广东珠海市饲料厂麸皮堆放处周围土壤与9mL无菌水充分混匀，静置30min后取1mL上层液作为微生物样品。取1mL微生物样品，梯度稀释到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，各取50μl均匀涂布于分离培养基（PDA）上，30℃倒置培养72h，再通过稀释涂板，菌落划线等方法得到单一纯化菌种。吸5μL菌液滴在初筛培养基的中央，各重复一次。30℃，培养48h后用0.4%的刚果红给平板染色10min，然后用1M氯化钠褪色1h。测定各菌落的透明圈直径/菌落直径（D/d），依据（D/d）大小来选择产酶菌株。选取（D/d）比值大的菌株进行复筛，固态发酵完成后测定木聚糖酶的活力。最终得到产木聚糖酶活力最高为1856U/g干曲的菌株米曲霉Y-1。
米曲霉Y-1质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色，背面无色。分生孢子头放射状，层球形或近球形。
以下实施例中：
一、发酵菌种的制备
菌种为发明人筛选保藏，本发明经筛选所用菌种为米曲霉（Aspergillus oryzae）Y-1；菌种的制备分一级菌种和二级菌种制备。
一级菌种的制备：将保藏菌种米曲霉Y-1划线接种于麦芽汁斜面培养基上，30-32℃恒温培养箱中培养84-96h，用无菌水将斜面孢子冲洗干净，转移至装有无菌玻璃珠的三角瓶中，震荡打散，制备成孢子悬浮液。
二级菌种的制备：麸皮70%，玉米芯30%，硫酸铵3%，磷酸二氢钾1.5%（m/m），每500mL三角瓶装干料20g，料水比1：1-1.2（m/m），加水混匀，121℃灭菌30min，冷却，分别接一级菌种1.0mL，搅拌均匀，30-32℃恒温培养箱中培养72-84h，用无菌水洗下孢子，制备成孢子悬浮液备用。
二、发酵生产
1、发酵方式：采用曲房多层固态发酵方法，控温、控湿、保持通气。
2、固态发酵培养基配制：先将70%麸皮与30%玉米芯混合均匀，然后将固体基质与含有3%硫酸铵和1.5%磷酸二氢钾的营养盐溶液按固体基质重量1：1-1.2的比例搅拌均匀，装入布袋中，经121℃灭菌35min。
3、发酵培养：待灭菌后的固态发酵培养基冷却至常温后，接固态培养基重量的10%-15%的二级菌种于固体发酵培养基中，搅拌均匀后进行发酵。曲料厚度为3-4cm，曲盘水平放置，垂直间隔距离为0.2m，均匀分布在整个曲房托架上。发酵进行到20-24h，用无菌棒划线翻曲。调节空气温度在30-32℃，控制相对湿度80%-95%的条件下培养72-84h。
4、干燥：将发酵结束的固体基质，在45-50℃下低温气流干燥，粉碎得到本发明的木聚糖酶。
实施例2
将实施例1分离的米曲霉Y-1接种于新鲜的麦芽汁斜面上，置于恒温培养箱中30℃培养84-96h，待斜面长满孢子后，加入适量的无菌水洗下孢子，制成一级种孢子悬液。在500mL的三角瓶中装入麸皮14g，玉米芯6g，硫酸铵0.6g，磷酸二氢钾0.3g，水20ml，121℃灭菌30min。冷却后，接米曲霉Y1孢子悬液1.0mL，搅拌均匀，置于恒温培养箱中30℃培养72-84h，待发酵培养基表面长满孢子，用无菌水洗下孢子，制成二级种米曲霉孢子悬液。
配制50kg干料发酵培养基（麸皮35kg，玉米芯15kg，硫酸铵1.5kg，磷酸二氢钾0.5kg），加自来水50kg，混合机搅拌均匀，121℃灭菌35min。冷却后，接米曲霉Y1孢子悬液5L均匀喷洒于发酵培养基中，搅拌均匀。采用多层曲盘发酵，曲料厚度为3-4cm，曲盘水平放置，垂直间隔距离为0.2m，均匀分布在整个曲房托架上。调节空气温度在30-32℃，控制相对湿度80%-95%。发酵进行到20-24h，用无菌棒划线翻曲，整个过程保持温度和相对湿度，继续培养48h后发酵结束。将发酵料于45-50℃下气流干燥至含水量8-10%，送入粉碎机粉碎，检验合格后，装1kg锡纸袋包装成成品。
经测定，所得产品的木聚糖酶活力为2326U/g。
实施例3
将米曲霉Y1接种于新鲜的麦芽汁斜面上，置于恒温培养箱中30℃培养84-96h，待斜面长满孢子后，加入适量的无菌水将孢子洗下，制成一级种孢子悬液。在500mL的三角瓶中装入麸皮14g，玉米芯6g，硫酸铵0.6g，磷酸二氢钾0.3g，水20ml，121℃灭菌30min。冷却后，接米曲霉Y1孢子悬液1.0mL，搅拌均匀，置于恒温培养箱中30℃培养72-84h，待发酵培养基表面长满孢子，用无菌水洗下孢子，制成二级种黑曲霉孢子悬液。
配制50kg干料发酵培养基（麸皮35kg，玉米芯15kg，硫酸铵1.5kg，磷酸二氢钾0.5kg），加自来水55kg，混合机搅拌均匀，121℃灭菌35min。冷却后，接米曲霉Y1孢子悬液6L均匀喷洒于发酵培养基中，搅拌均匀。采用多层曲盘发酵，曲料厚度为3-4cm，曲盘水平放置，垂直间隔距离为0.2m，均匀分布在整个曲房托架上。调节空气温度在30-32℃，控制相对湿度80%-95%。发酵进行到20h-24h，用无菌棒划线翻曲，整个过程保持温度和相对湿度，继续培养48h后发酵结束。将发酵料于45-50℃下气流干燥至含水量8-10%，送入粉碎机粉碎，检验合格后，装1kg锡纸袋包装成成品。
经测定，所得产品的木聚糖酶活力为2434U/g。
实施例4
将米曲霉Y1接种于新鲜的麦芽汁斜面上，置于恒温培养箱中30℃培养84-96h，待斜面长满孢子后，加入适量的无菌水将孢子洗下，制成一级种孢子悬液。在500mL的三角瓶中装入麸皮14g，玉米芯6g，硫酸铵0.6g，磷酸二氢钾0.3g，水20mL，121℃灭菌30min。冷却后，接米曲霉Y1孢子悬液1.0mL，搅拌均匀，置于恒温培养箱中30℃培养72-84h，待发酵培养基表面长满孢子，用无菌水洗下孢子，制成二级种黑曲霉孢子悬液。
配制50kg干料发酵培养基（麸皮35kg，玉米芯15kg，硫酸铵1.5kg，磷酸二氢钾0.5kg），加自来水60kg，混合机搅拌均匀，121℃灭菌35min。冷却后，接米曲霉孢子悬液7L均匀喷洒于发酵培养基中，搅拌均匀。采用多层曲盘发酵，曲料厚度为3-4cm，曲盘水平放置，垂直间隔距离为0.2m，均匀分布在整个曲房托架上。调节空气温度在30-32℃，控制相对湿度80%-95%。发酵进行到20h-24h，用无菌棒划线翻曲，整个过程保持温度和相对湿度，继续培养48h后发酵结束。将发酵料于45-50℃下气流干燥至含水量8-10%，送入粉碎机粉碎，检验合格后，装1kg锡纸袋包装成成品。
经测定，所得产品的木聚糖酶活力为2385U/g。
实施例5本发明的木聚糖酶与其它市售商品木聚糖酶对饲料体外酶解比较
通过发酵本发明的米曲霉Y1制备的木聚糖酶，具有高效降解饲料的能力。体外酶处理饲料及其原料方法：称饲料或饲料原料10g于300ml三角瓶中，按料水比1：10加入0.1M pH5.5的乙酸乙酸钠缓冲液100ml，加酶量为50U/g饲料，于40℃恒温振荡酶解5h。反应结束后加入5ml 10%三氯乙酸处理10min，酶解液于4000r/min离心10min，收集上清液，DNS法测定还原糖含量。结果见表1。
表1本发明的木聚糖酶与其它市售商品木聚糖酶对饲料体外酶解比较
注：饲料来源于珠海盈盛饲料有限公司。饲料1为水产料，生产货号：312，生产日期20120615；饲料2为畜（猪）料，生产货号：503，生产日期：20120712；饲料3为禽（鸡）料，生产货号：882，生产日期：20120804。
实施例2、3、4木聚糖酶为实施例2、3、4获得的本发明木聚糖酶。
木聚糖酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ为其它市售商品木聚糖酶。
从表1中我们可以看出，实施例2、3、4获得的木聚糖酶对相同饲料原料体外酶解效果基本一致。其中对饲料2的降解效果最好，依次为饲料3和饲料1，本发明的木聚糖酶产品质量稳定。另外，对相同饲料原料体外酶解效果而言，本发明的木聚糖酶较其它市售商品木聚糖酶具有显著的酶解效果。本发明的木聚糖酶对饲料1、2、3的酶解率显著高于其它市售商品木聚糖酶，酶解率分别高出19.8%-53.0%、175.8%-207.2%、124.7%-154.4%。
实施例6本发明的木聚糖酶的动物试验
本发明所提供的木聚糖酶，具有显著提高动物的生产性能，即动物试验显示小麦型日粮添加本发明的木聚糖酶后，动物的生产性能得到了显著的提高。
480羽1日龄罗斯308白羽肉鸡，随机分为3个处理，每个处理4个重复，每重复30羽鸡。每重复栏和每组间的均只重差异均不显著。试验分为前后两期，前期1-21日龄，后期22-42日龄。试验设计分组见附表2。试验结果见附表3、4、5。动物试验显示小麦型日粮添加本发明的木聚糖酶后，小鸡阶段、大鸡阶段、全期阶段动物的生产性能均得到了显著的提高。
表2动物试验分组
表3小鸡阶段（1-21日龄）生产性能
| 试验组 | 饲料 | 加酶量 | 初重（g) | 末重（g) | 日增重 | 采食量 | 料肉比 | 成活率（%） |
| 1 | 玉米豆粕型 | - | 47.0±0.9 | 918.6±24.8A | 41.5±1.8A | 63.1±2.1A | 1.52±0.06A | 100 |
| 2 | 30%小麦 | - | 47.2±0.7 | 734.4±40.7B | 32.7±1.9B | 53.6±2.8B | 1.64±0.01B | 96.3±3.7 |
| 3 | 30%小麦 | 500 | 47.2±1.1 | 912.7±33.9A | 41.2±1.0A | 63.4±2.8A | 1.54±0.07A | 100 |
| 4 | 30%小麦 | 1000 | 47.3±0.9 | 935.3±28.5A | 42.3±1.4A | 63.9±2.6A | 1.51±0.05A | 99.2±2.7 |
注：表中同列数据肩标字母相同或无字母则表示差不显著（P>0.05），小写字母不同者表示差异显著（P<0.05），大写字母不同者表示差异极显著（P<0.01）。
表4中大鸡阶段（22-42日龄）生产性能
| 试验组 | 饲料 | 加酶量 | 初重（g) | 末重（g) | 日增重 | 采食量 | 料肉比 | 成活率（%） |
| 1 | 玉米豆粕型 | - | 47.0±0.9 | 2399.6±196.9A | 70.5±8.2A | 142.4±3.1A | 2.02±0.20A | 99.2±3.46 |
| 2 | 60%小麦 | - | 47.2±0.7 | 2013.9±169.5B | 60.9±9.7B | 135.0±1.3B | 2.22±0.37B | 94.4±2.26 |
| 3 | 60%小麦 | 500 | 47.2±1.1 | 2411.4±222.5A | 71.4±9.4A | 141.3±11.2A | 1.98±0.20A | 97.4±5.24 |
| 4 | 60%小麦 | 1000 | 47.3±0.9 | 2450.5±124.3A | 72.2±4.9A | 142.8±7.5B | 1.98±0.08A | 98.3±6.34 |
注：表中同列数据肩标字母相同或无字母则表示差不显著（P>0.05），小写字母不同者表示差异显著（P<0.05），大写字母不同者表示差异极显著（P<0.01）。
表5全期（1-42日龄）生产性能
| 试验组 | 饲料 | 加酶量 | 初重（g) | 末重（g) | 日增重 | 采食量 | 料肉比 | 成活率（%） |
| 1 | 玉米豆粕型 | - | 47.0±0.9 | 2399.6±196.9A | 56.0±8.2A | 102.8±3.1a | 1.84±0.20A | 99.2±3.46a |
| 2 | 小麦型 | - | 47.2±0.7 | 2013.9±169.5B | 46.8±9.7B | 94.3±1.1b | 2.01±0.20B | 90.9±2.26b |
| 3 | 小麦型 | 500 | 47.2±1.1 | 2411.4±222.5A | 56.3±9.4A | 102.4±11.2a | 1.82±0.20A | 97.4±5.24ab |
| 4 | 小麦型 | 1000 | 47.3±0.9 | 2450.5±124.3A | 57.2±4.9A | 103.4±7.5a | 1.81±0.08A | 97.5±6.34ab |
注：表中同列数据肩标字母相同或无字母则表示差不显著（P>0.05），小写字母不同者表示差异显著（P<0.05），大写字母不同者表示差异极显著（P<0.01）。
Claims (4)
1.高效降解饲料的米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株Y-1，其保藏编号为CGMCCNo.6842。
2.一种生产高效降解饲料的木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括通过发酵权利要求1所述米曲霉（Aspegillus oryzae）Y-1得到木聚糖酶的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述米曲霉（Aspergillus oryzae）Y-1在固态培养基上发酵，所述固态培养基为麸皮70%，玉米芯30%，硫酸铵3%，磷酸二氢钾1.5%（m/m），料水比1：1-1.2（m/m）的发酵培养基。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，采用固态发酵方法，将孢子悬浮液喷洒至固态发酵培养基中，搅拌均匀，调节空气温度在30-32℃，控制相对湿度80%-95%的条件下培养72-84h，然后于45-50℃下低温干燥。
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2012
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|---|---|
| CN103060202B (zh) | 2014-12-10 |
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