CN103525791B - 一种耐高温中性纤维素酶Cel61P8及其基因和应用 - Google Patents

一种耐高温中性纤维素酶Cel61P8及其基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温中性纤维素酶Cel61P8及其基因。本发明提供了一种来源于腐质霉属Humicola？sp.P8的纤维素酶Cel61P8，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，且本发明提供了编码上述中性纤维素酶的编码基因cel61P8。本发明的纤维素酶具有以下性质：最适pH7.5，在pH4.0～11.0保持50%以上的酶活，最适温度65℃，在65℃具有良好的热稳定性。与纤维二糖水解酶协同作用，可以有效提高微晶纤维素的水解效率。作为一种新型的酶制剂，可广泛用于纺织印染、能源工业等。

Description

一种耐高温中性纤维素酶Cel61P8及其基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温中性纤维素酶Cel61P8及其基因和应用。
背景技术
生物质的再生和降解是自然界中一个非常重要的环节，自然界中每年有15%的总碳通过植物被固定，其中50%的固定碳形成了结构多糖和木质素，通常将这一部分称为木质纤维素（Sandgrenetal.ProgBiophysMolBio,2005,89:246-291.）。植物通过光和作用每年可产生约400亿吨木质纤维素，木质纤维素主要由纤维素、木质素和半纤维组成，还含有少量的灰分、蛋白质和果胶（Dashtbanetal.IntJBiolSci,2009,5:578-595.）。纤维素的降解需要纤维素酶，纤维二糖水解酶，葡萄糖苷酶将纤维寡糖，二糖水解得到葡萄糖。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中按纤维素酶催化反应的最适pH值,可将其分为酸性纤维素酶(最适pH值为3-5)、中性纤维素酶(最适pH值为6-8)和碱性纤维素酶(最适pH值为8-11)（ZhangYHP,etal.BiotechnolAdv2006,24:62-481.）。
纤维素酶在造纸，酿造，纺织，饲料，生物能源等领域均具有广泛的应用前景（WongKK,etal.MicrobiolRev1988,52:305-317.）。但是，不同的工业应用需求不同性质的纤维素酶，例如，饲料工业需要嗜酸的纤维素酶，纺织工业需要中性耐碱的纤维素酶。目前工业上广泛应用的木霉所产纤维素酶最适pH在5.0左右，最适温度在50-60度之间，不能满足棉织品水洗整理工业的工业要求。由于棉纤维耐碱不耐酸，强酸性处理后易损坏（许爱国等，中性纤维素酶在棉织物整理中的应用，印染，2006，21，11-12）。
目前，国内纺织工业主要依赖进口，且价格昂贵。因此，获得新型具有耐碱高温的中性纤维素酶的研究具有重大意义。克隆和分离具有中性、热稳定性好的纤维素酶可以更好的应用于纺织、能源等领域。本发明中来源于腐质霉属Humicolasp.P8的纤维素酶Cel61P8具有以下性质：最适pH7.5，并在pH5.0～9.0范围内具有40%以上的酶活力，具有很好的pH稳定性，37℃下作用2h后，在pH4.0–11.0之间,剩余酶活性均在50%以上。最适温度65℃，80℃都有较好的稳定性，保温60min后仍保持60%以上的酶活。中性和碱性范围内具有较高酶活力，良好的pH和热稳定性等特性，并且与纤维二糖水解酶协同作用，在复合纤维素酶中添加可以有效提高微晶纤维素的水解效率，使其在纺织、能源工业应用上具有很大的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的耐高温中性纤维素酶。
本发明的再一目的是提供编码上述耐高温中性纤维素酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述耐高温中性纤维素酶的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述耐高温中性纤维素酶的应用。
本发明从腐质霉(Humicolasp.P8)中分离得到一种新的耐高温中性纤维素酶Cel61P8。
本发明提供了一种纤维素酶Cel61P8，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
SEQIDNO.1：
MPRFTKSIVSALAGASLVAAHGHVTHIVINGVLYPNFDPTSHPYMQNPPTVVGWT
AANTDNGFVAPDQFASGDIICHNQATNAGGHAVVAAGDKIWIQWDQWPESHHGP
VLDYLASCGSSGCESVNKLDLEFFKIGEKGLIDGSSAPGRWASDELIANNAGWLV
QIPADIAPGHYVLRHEIIALHAAGQPNGAQNYPQCFNLLVTGSGTARPQGVKGTAL
YTPNDKGILAGIYNAPVSYEIPGPALYSGAARNLQQSSSQATSTATALTGDAVPVPT
QAPVTTTSSSSADAATATSTTVQPPQQTTLTTAIATSTAAAAPTTTAGSGNGGNRPF
PTRCPGLAGLGFDKRRRQLRAEEGVQVVA
其中，该酶基因编码363个氨基酸，N端20个氨基酸为其信号肽序列“mprftksivsalagaslvaa”(SEQIDNO.3)。
因此，成熟的中性纤维素酶Cel61P8的理论分子量为35.5kDa，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：
HGHVTHIVINGVLYPNFDPTSHPYMQNPPTVVGWTAANTDNGFVAPDQFASGDIICHNQATNA
GGHAVVAAGDKIWIQWDQWPESHHGPVLDYLASCGSSGCESVNKLDLEFFKIGEKGLIDGSSA
PGRWASDELIANNAGWLVQIPADIAPGHYVLRHEIIALHAAGQPNGAQNYPQCFNLLVTGSGT
ARPQGVKGTALYTPNDKGILAGIYNAPVSYEIPGPALYSGAARNLQQSSSQATSTATALTGDAVP
VPTQAPVTTTSSSSADAATATSTTVQPPQQTTLTTAIATSTAAAAPTTTAGSGNGGNRPFPTRCP
GLAGLGFDKRRRQLRAEEGVQVVA
本发明的中性纤维素酶Cel61P8同时具有好的热稳定性而且在中性和碱性的范围内均具有高活性等特性。本发明筛选到的纤维素酶，其最适pH值为7.5，并在pH4.0～11.0范围内具有50%以上的酶活力；最适温度为65℃，在80℃处理60min后仍具有60％左右的酶活力。
本发明提供了编码上述耐高温中性纤维素酶的基因Cel61P8。具体地，该基因的序列如SEQIDNO.4所示：
atgcctcgcttcaccaagtccattgtctcggccctggccggcgcttccctggtcgcagcccacggccatgtcacccacatcgtcat
caacggcgtgctgtacccgaacttcgaccctacatcccacccttacatgcagaacccgccgaccgttgtgggctggaccgccgc
caacaccgacaacggcttcgttgctcccgaccagttcgcctcgggcgatatcatctgccacaaccaggccaccaacgcgggcg
gccacgccgtggtcgcggccggcgacaagatttggatccagtgggaccagtggcctgagagccaccacggccccgtcctcga
ctacctcgcctcctgcggcagctcgggctgcgagtcggtcaacaagctcgacctcgagttcttcaagatcggcgaaaagggcct
gatcgacggctcctccgcgccgggccggtgggcgtcggacgagctgatcgccaacaacgccggctggctggtccagattccc
gccgacattgcgcccggccactacgtcctgcgccacgaaatcatcgccctccacgccgccggccagcccaacggcgcccaga
actacccgcagtgcttcaacctcctcgtcacgggctccggcaccgcgcggccgcagggcgtcaagggaacagcgctgtacacc
cccaacgacaagggcatcttggcgggcatctacaatgcccccgtctcgtacgagattcccggccccgcgctctactccggcgcc
gccaggaacttgcagcagagctcgtcccaggccacgtcgactgccacggctttgactggggacgcggtgcctgttccgaccca
agcccccgtcactaccacttcctcttcttcggccgatgccgccaccgccacctccaccaccgtccagccgccccagcaaaccac
cctcacgaccgccatcgccacgtcgaccgctgctgctgccccgacgaccaccgccggcagcggaaacggtggcaaccggcc
cttcccaacccgctgccctggcctggctgggctcgggtttgacaagcgccgtcgccagctccgcgctgaggagggtgtgcaggt
ggttgcttga
本发明通过PCR的方法分离克隆了耐高温中性纤维素酶基因Cel61P8，DNA全序列分析结果表明，中性纤维素酶Cel61P8的基因全长1092bp。成熟蛋白理论分子量为35.5kDa，将纤维素酶基因cel61P8序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，确定Cel61P8是一种新的纤维素酶。
成熟的中性纤维素酶Cel61P8的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示
cacggccatgtcacccacatcgtcatcaacggcgtgctgtacccgaacttcgaccctacatcccacccttacatgcagaacccgc
cgaccgttgtgggctggaccgccgccaacaccgacaacggcttcgttgctcccgaccagttcgcctcgggcgatatcatctgcca
caaccaggccaccaacgcgggcggccacgccgtggtcgcggccggcgacaagatttggatccagtgggaccagtggcctga
gagccaccacggccccgtcctcgactacctcgcctcctgcggcagctcgggctgcgagtcggtcaacaagctcgacctcgagtt
cttcaagatcggcgaaaagggcctgatcgacggctcctccgcgccgggccggtgggcgtcggacgagctgatcgccaacaac
gccggctggctggtccagattcccgccgacattgcgcccggccactacgtcctgcgccacgaaatcatcgccctccacgccgcc
ggccagcccaacggcgcccagaactacccgcagtgcttcaacctcctcgtcacgggctccggcaccgcgcggccgcagggc
gtcaagggaacagcgctgtacacccccaacgacaagggcatcttggcgggcatctacaatgcccccgtctcgtacgagattccc
ggccccgcgctctactccggcgccgccaggaacttgcagcagagctcgtcccaggccacgtcgactgccacggctttgactgg
ggacgcggtgcctgttccgacccaagcccccgtcactaccacttcctcttcttcggccgatgccgccaccgccacctccaccacc
gtccagccgccccagcaaaccaccctcacgaccgccatcgccacgtcgaccgctgctgctgccccgacgaccaccgccggca
gcggaaacggtggcaaccggcccttcccaacccgctgccctggcctggctgggctcgggtttgacaagcgccgtcgccagctc
cgcgctgaggagggtgtgcaggtggttgcttga
本发明还提供了包含上述耐高温中性纤维素酶基因cel61P8的重组载体，命名为pPIC-cel61P8。将本发明的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的纤维素酶成熟蛋白基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和AvrII限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Cel61P8。
本发明还提供了包含上述耐高温中性纤维素酶基因cel61P8的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/cel61P8。
本发明还提供了一种制备耐高温中性纤维素酶Cel61P8的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；
3)回收并纯化所表达的纤维素酶Cel61P8。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichiapastoris)GS115，得到重组菌株GS115/cel61P8。
本发明还提供了上述耐高温中性纤维素酶Cel61P8的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有酸性纤维素酶在纺织工业上应用的不足，提供一种性质优良的、适合于在中碱性pH环境下应用新的中性纤维素酶。本发明的纤维素酶最适pH为7.5，在pH5.0～8.0都有较高的酶活性。其耐高温特性，可使其在需求耐高温环境的工业生产上应用。本纤维素酶可应用于纺织、能源工业。
附图说明
图1重组纤维素酶的最适pH。
图2重组纤维素酶的pH稳定性。
图3重组纤维素酶的最适温度。
图4重组纤维素酶的热稳定性。
图5重组纤维素酶Cel61P8与纤维素酶系（CelluclastPlus）降解微晶纤维素的协同作用。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：1、菌株及载体：1、菌株及载体：本发明从腐质霉(Humicolasp.P8)中分离得到一种新的中性纤维素酶Cel61P8。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
（1）LB培养基：1%NaCl，0.5%酵母提取物，1%蛋白胨
（2）YPD培养基：2%葡萄糖，1%酵母提取物，2%蛋白胨
（3）MM固体培养基：琼脂粉1.7%（w/v），YNB1.34%（w/v），生物素4×10-5%（w/v），甲醇0.5%（v/v）
（4）MD固体培养基：以2%（w/v）的葡萄糖代替甲醇，其余同MM固体培养基
（5）BMGY培养基：酵母提取物1%（w/v），蛋白胨2%（w/v），甘油1%（v/v），生物素4×10-5%（w/v），YNB1.34%（w/v）
（6）BMMY培养基：以0.5%甲醇代替甘油，其余同BMGY培养基
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1腐质霉Humicolasp.P8纤维素酶编码基因Cel61P8的克隆
腐质霉Humicolasp.P8分离于河北张家口森林土壤。
提取腐质霉Humicolasp.P8基因组DNA：
采用CTAB法提取真菌基因组，参见（Grahametal.,1994），有所修改：
①离心取真菌培养物约2g，尽量除去培养基，在液氮中充分研磨几次；
②加入15-20mL预热的CTAB裂解液（一般0.5-1g加3mL），混匀后于65℃温育2h，中间每15min混匀一次；
③加入等体积的Tris饱和酚和氯仿的等体积混合物，混匀后，12,000g4℃离心15min，然后将上清液转移到新的离心管中（视蛋白残留的程度重复一次）；
④上清液中加入等体积的氯仿，混匀后，12,000g4℃离心15min，将上清液转移到新的离心管中；
⑤在上清液中加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，-20℃静置30min以上，离心弃上清；
⑥沉淀用70%乙醇漂洗两次，然后真空抽干，重悬于500μLl蒸馏水；
⑦加入10μLRNase（10mg/mL），37℃处理30min以上；
⑧采用DNA纯化试剂盒进行纯化，以提高DNA的浓度和纯度。
根据第61家族纤维素酶基因的保守(VAAHGH和GHYVLRH)序列设计合成了简并引物P1，P2
P1:5'-GTCGCNGCNCAYGGNCA-3'；
P2:5'-RTGNCKNARNACRTARTTNCC-3')。
以Humicolasp.P8总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，40℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约486bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送博迈德公司测序。
根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为Cel61P8up1、Cel61P8up2、Cel61P8up3(上游特异性引物)、Cel61P8dp1、Cel61P8dp2、Cel61P8dp3(下游特异性引物)见表1。
表1.纤维素酶Cel61P8TAIL-PCR特异性引物
通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送博迈德公司测序。拼接后Cel61P8纤维素酶基因全长1092bp，编码363个氨基酸和一个终止密码子。去除信号肽后预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为35.5kDa。
实施例2重组纤维素酶的制备
设计去除信号肽的成熟蛋白表达引物（Cel61P8-expF:GGGGAATTCCACGGCCATGTCACCCACATCGTCATC和Cel61P8-expR:GGGGCGGCCGCTCAAGCAACCACCTGCACACCCTCCTC），然后通过RT-PCR进行扩增到成熟蛋白基因。将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+AvrII)，同时将编码纤维素酶的成熟基因Cel61P8双酶切(EcoRI+AvrII)，切出编码成熟纤维素酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Humicolasp.P8纤维素酶成熟蛋白基因的重组质粒pPIC-cel61P8并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/cel61P8。将包含信号肽序列的Cel61P8纤维素酶全长基因以同样的方法构建表达载体，并获得重组毕赤酵母菌株。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mLBMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mLBMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定纤维素酶的活力。重组纤维素酶的表达量为0.56U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组纤维素酶在毕赤酵母中得到了表达。重组纤维素酶的比活为25.1U/mg。
实施例3重组纤维素酶的活性分析
DNS法：具体方法如下：在pH7.0，65℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物(CMC-Na)，反应30min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。
实施例4重组纤维素酶Cel61P8的性质测定
1、重组纤维素酶Cel61P8的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
纯化后的酶液在不同的pH（1.0-12.0）条件下进行酶促反应，所使用的缓冲液如下：0.2M甘氨酸-盐酸pH1.0-3.0；0.2M磷酸氢二钠-柠檬酸pH2.5-8.0；0.2MTris-盐酸缓冲液，pH7.0-9.0；0.2M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH9.0-12.0，65℃反应30min。将酶液用不同pH缓冲液稀释，在不同pH，37℃2h，然后用最适pH缓冲液稀释并在最适温度下测其剩余酶活。结果(图1)表明，重组酶Cel61P8的最适pH为7.5，在pH5.0～9.0有40%以上的相对酶活性。pH稳定性结果（图2）表明纤维素酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH7.0缓冲液体系中65℃下测定酶活性，发现在pH4.0–11.0之间较稳定,剩余酶活性均在50%以上。
2、纤维素酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
纤维素酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为65℃。耐温性测定为纤维素酶在不同温度下处理不同时间，再在65℃下进行酶活性测定。酶的热稳定性性试验表明(图4)，Cel61P8有良好的热稳定性，70℃和80℃都有比较好的稳定性，保温60min后仍保持60%以上的酶活，在90℃处理10min，还能剩余40%的酶活。
4、不同金属离子化学试剂对Cel61P8酶活的影响测定如下：
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为10mmol/L。在65℃、pH7.0条件下测定酶活性。结果表明（表1），Co2+、Cr3+、SDS对酶活有部分抑制作用，Ag+完全抑制酶活，而Cu2+、Fe3+、Ni2+和巯基乙醇对酶活都有一定的促进作用，其它金属离子和化学试剂对酶活的影响不大。
表1各种化学试剂及离子的对Cel61P8的影响如表所示
5、重组纤维素酶Cel61P8与纤维素酶系的协同作用
纤维素转化分析体系为25g/L微晶纤维素（Avicel）或玉米秸秆溶解到50mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.5)中，50℃下反应6天。其中加入每g纤维素中加入50mgCel61P8,20mg纤维二糖水解酶（HiCDH,Novozymes），60mg混合纤维酶CelMix（CelluclastPlus，Novozymes）。水解产物利用HPLC进行分析。结果发现（图5），单独添加Cel61P8和HiCDH并不能对微晶纤维素进行高效水解，但添加少量Cel61P8和HiCDH，在与复合纤维素酶系协同作用，能有效提高纤维素酶降解微晶纤维素和玉米秸秆能力，并且随着时间的延长其水解效果更明显。说明该酶能是纤维素酶系中一个具有重要增效作用的新一类纤维素酶。

Claims (9)

1.一种耐高温中性纤维素酶Cel61P8，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。
2.一种耐高温中性纤维素酶基因cel61P8，其特征在于，编码权利要求1所述的耐高温中性纤维素酶Cel61P8。
3.如权利要求2所述的耐高温中性纤维素酶基因cel61P8，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。
4.包含权利要求2所述耐高温中性纤维素酶基因cel61P8的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为载体pPIC-Cel61P8，其中，将权利要求2所述耐高温中性纤维素酶基因cel61P8插入到质粒pPIC9上的EcoRI和AvrII限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Cel61P8。
6.包含权利要求2所述耐高温中性纤维素酶基因cel61P8的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
8.一种制备权利要求1所述耐高温中性纤维素酶cel61P8的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；
3)回收并纯化所表达的纤维素酶Cel61P8。
9.权利要求1所述耐高温中性纤维素酶Cel61P8用于水解纤维素的应用。
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