CN103232949A

CN103232949A - 表达61家族糖苷水解酶基因的毕赤酵母工程菌株

Info

Publication number: CN103232949A
Application number: CN2012105563831A
Authority: CN
Inventors: 李多川; 李安娜; 韩华; 郭洁
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2013-08-07

Abstract

本发明是一种表达嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus热稳定热稳定61家族糖苷水解酶基因61f的毕赤酵母工程菌Pichiapastoris GS-TA-61。通过RT-PCR及RACE方法从嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus获得糖苷水解酶基因61f，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，然后将得到的糖苷水解酶基因61f表达载体pPIC9K/61f导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基因61f的酵母工程菌GS-TA-61。该工程菌表达的糖苷水解酶61F对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用，混合酶比原始内切酶N24的降解纤维素的活性提高3.89倍。不同金属离子对61F和61F+N24混合酶活性具有促进或抑制作用。61F具有良好的热稳定性和提高纤维素酶活力的能力，可广泛用于纤维废料及其它工业领域，具有重大经济价值和社会价值。

Description

表达61家族糖苷水解酶基因的毕赤酵母工程菌株

（一）技术领域

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达具体地说是以嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus 61家族糖苷水解酶基因61f的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-TA-61。

（二）背景技术

糖苷水解酶（英语：Glycoside hydrolases，又称糖苷酶）是一种专门水解配糖键（glycosidic bond），并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。

嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶和61家族糖苷水解酶。

嗜热子囊菌光孢变种产生的61家族糖苷水解酶61F具有微弱的纤维素酶活性，但对该菌株产生的内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用,可使其活性提高3.89倍。在不同金属离子如Mn²⁺的作用下，61F和61F+N24的活性可分别提高20倍和1.2倍。

（三）发明内容

本发明从嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus获得内切β-1,4-葡聚糖酶基因的全长cDNA序列，命名为61f，61f基因cDNA全长1325bp，包括起始密码子和多聚A尾，具有一个747bp的开放阅读框，编码249个氨基酸。具有信号肽序列（1-21aa MSFSKIIATAGVLASASLVAG）及一个潜在的N糖基化位点（NNS）。

将61f编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第61家族，其中3个基序GNYV-RHE，GAQNYPQC和Y-IPGP具保守性。与丝状真菌亚西岛篮状菌Talaromyces stipitatus、马尔尼菲青霉菌penicilliummarneffei的内切葡聚糖酶的同源性较高，分别达到74%和75%。

构建重组表达质粒载体pPIC9K/61f，利用电转仪进行电击转化pichiapastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-TA-61。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28℃200 rpm/min摇床培养6d后，61家族糖苷水解酶的表达量为3.22mg/ml，分子量为29KDa，酶活力为0.0667U/ml，61F在65℃下是稳定的，处理60min后仍有95%以上的酶活性；70℃处理60min后仍保持67%的活性；75℃的半衰期为40min；80℃处理10min后保持40%的活性；90℃处理50min活性几乎完全丧失。

61家族糖苷水解酶61F对嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.Levisporus内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，混合酶比原始酶N24的降解纤维素的能力提高3.89倍。不同金属离子对61F和61F+N24混合酶活性具有促进或抑制作用，其中在Mn²⁺条件下，61F和61+N24的纤维素酶活性可分别提高20倍和1.2倍。

（四）附图说明：

图161家族糖苷水解酶61F的SDS-PAGE分析

泳道1：低分子量蛋白标准

泳道2：纯化的61家族糖苷水解酶61F

图261家族糖苷水解酶61F对内切纤维素酶N24活性的促进作用

图3不同金属离子对61F纤维素酶活性的影响

图4不同金属离子对混合酶的作用

（五）具体实施方式

实施例1：嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus的分离鉴定

（1）标本采集：从堆肥中采集。

（2）分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。

（3）鉴定:参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。

实施例2：糖苷水解酶基因61g的克隆

（1）嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus总RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明。

（2）cDNA第一条链的合成：按照Takara公司的TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0试剂盒说明书进行：取1~2μg总RNA，加RNase Free ddH₂O至9.5μL，将RNA样品在75℃变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分：10mmol/L dNTP Mixture 2μL，10×RTBuffer(Mg²⁺)2μL，25mmol/L MgCl₂4μL，Oligo d(T)-Adaptor Primer 1μL，RNaseInhibiter 0.5μL，AMV Reverse Transcriptase 1μL（Final Volume 20μL），将反应液混合后，室温下放10min，然后42℃温育60min，再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180μL DEPC处理的ddH₂O，稀释至200μL，混匀，稍微离心，保存于-20℃，备用。

（3）中间片段的分离：根据嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacusvar.levisporus纯化纤维素酶N端测序结果和61家族纤维素酶同源保守序列设计兼并引物。上游引物为：5’-GTCCARAAYATYGTYATYGATGG-3’，下游引物为：5’-GTTGANGCAYTGDGGRTAGTT-3’

（4）3′和5′序列的分离：按照TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0使用说明进行。蛋白酶基因3’-RACE所用引物为61-3.2、61-3.3、Oligo dT-Adaptor primer和M13 Primer M4，其序列为：

61-3.2：5’-CGCCTGGTCTACTACGGCAACTGAT-3’

61-3.3：5’-AGACAATCTGATAGCAGCCAACAACA-3’

M13Primer M4：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

Oligo dT-Adaptor primer：包含dT区域及M13 Primer M4序列。

蛋白酶基因5’端序列克隆，使用Tail-PCR的方法，以基因组DNA为模版，所用引物为3个向外的特异巢式引物P5-1、P5-2、P5-3，以及上游公共兼并引物AD₁、AD₂、AD₃、AD₄、AD₅，其序列为：

61-5.1：5’-ATCCAGTACCGTCCACAAATCCAAGA-3’

61-5.2：5’-CAGTTGCCGTAGTAGACCAGGCGATGA-3’

61-5.3：5’-GCTGTTGCCGCTTATGTGCGTCTTG-3’

AD₁：5’-NTCGASTWTSGWGTT-3’

AD₂：5’-NGTCGASWGANAWGAA-3’

AD₃：5’-WGTGNAGWANCANAGA-3’

AD₄：5’-TGWGNAGSANCASAGA-3’

AD₅：5’-AGWGNAGWANCAWAGG-3’

（5）基因克隆：取0.5μl PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂有X-gal和IPTG的含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

（6）质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。

（7）序列测定：DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行。序列引物为M13启动子引物。嗜热子囊菌光孢变种61f基因cDNA全长1325bp，包括起始密码子和多聚A尾，具有一个747bp的开放阅读框，编码249个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第61家族，其中3个基序GNYV-RHE，GAQNYPQC和Y-IPGP具保守性。该序列如下：

(A)SEQ ID NO 1的信息

（a）序列特征：*长度：1325碱基对；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性

（b）分子类型：cDNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：嗜热子囊菌光孢变种（Thermoascus aurantiacus var.levisporus）

（f）序列描述：

1 CTCGGACACC GTTTCTTGAA GTTGCTTTAT ATTATTAGCT TTGGTCCATC GCGATCGAAT

61 TGGCACATCC TATTTGAAAG ATGTCCTTTT CCAAGATAAT TGCTACTGCC GGCGTTCTTG

121 CCTCTGCTTC TCTAGTGGCT GGCCATGGCT TCGTTCAGAA CATCGTGATT GATGGTAAAA

181 AGTATGTCAT TGCAAGACGC AACCAGTATC CATACATGTC CAATCCTCCA GAGGTCATCG

241 CCTGGTCTAC TACGGCAACT GATCTTGGAT TTGTGGACGG TACTGGATAC CAAACCCCAG

301 ATATCATCTG CCATAGGGGC GCCAAGCCTG GAGCCCTGAC TGCTCCAGTC TCTCCAGGAG

361 GAACTGTTGA GCTTCAATGG ACTCCATGGC CTGATTCTCA CCATGGCCCA GTTATCAACT

421 ACCTTGCTCC GTGCAATGGT GATTGTTCCA CTGTGGATAA GACCCAATTA GAATTCTTCA

481 AAATTGCCGA GAGCGGTCTC ATCAATGATG ACAATCCTCC TGGGATCTGG GCTTCAGACA

541 ATCTGATAGC AGCCAACAAC AGCTGGACTG TCACCATTCC AACCACAATT GCACCTGGAA

601 ACTATGTTCT GAGGCATGAG ATTATTGCTC TTCACTCAGC TCAGAACCAG GATGGTGCCC

661 AGAACTATCC CCAGTGCATC AATCTGCAGG TCACTGGAGG TGGTTCTGAT AACCCTGCTG

721 GAACTCTTGG AACGGCACTC TACCACGATA CCGATCCTGG AACTCTGATC AACATCTATC

781 AGAAACTTTC CAGCTATATC ATCCCTGGTC CTCCTCTGTA TACTGGTTAG AGGAACGTCC

841 GGCGGTCAGA ATTGGTGCTG GTATTGTGAG AAGGGTCAGC GGTAGAGGTC TCGTTCGGAG

901 GGTTGCAAAA ACATGACGCT AGGTGGTTTT GTGCGATTCT TCCCATCTCG CCTCTTCCAC

961 TTCTGCCAAA TCCGGTTCTG CGATTGCTAT TTCGCCGTGA CCGGCTGTTA CTTTCGAACC

1021 TGTCTCTACC AGGAACAACA CCATTTCGTT CTCCATTCTG TGGTCCCCCA GGGCCTCTAC

1081 TAGTCTACCG GGAATTTCTC AACAGCGTCC GTGAATTCCA CGAGGCTAAA TGAAAGCAAC

1141 CCTGTGGCTC CTCAGGTTTG AACGAGGGAG GGGACATATC TTTTTGGAAA CACATGTGTG

1201 ACCTCCAACT TCTACGTTCT TTTCTACCTT GATTGTTTGT ATCAAGTACT TTGACTTGAC

1261 TGTCTTAGTG TGGATACAAA TCGTTACATC AATCCATGTA TTCTCATTGC GACAAAAAAA

1321 AAAAA

（B）SEQ ID NO 2的信息

（a）序列特征：*长度：249氨基酸；*类型：氨基酸；*链型：单链；*拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）序列描述：

1 MSFSKIIATA GVLASASLVA GHGFVQNIVI DGKKYVIARR NQYPYMSNPP EVIAWSTTAT

61 DLGFVDGTGY QTPDIICHRG AKPGALTAPV SPGGTVELQW TPWPDSHHGP VINYLAPCNG

121 DCSTVDKTQL EFFKIAESGLINDDNPPGIW ASDNLIAANN SWTVTIPTTIAPGNYVLRHE

181 IIALHSAQNQ DGAQNYPQCI NLQVTGGGSD NPAGTLGTAL YHDTDPGTLI NIYQKLSSYI

241 IPGPPLYTG

实施方式3：表达载体的构建

（1）根据分离出的61f基因的核苷酸序列设计表达引物，在引物的5’端分别引入SnaB I和NotⅠ酶切位点：

上游引物：5’-GGCTACGTACATGGCTTCGTTCAGAACAT’(SnaB I)

下游引物：5’-GGGCGGCCGCCTAACCAGTATACAGAGGA-3’(NotⅠ)

(2)嗜热子囊菌总RNA的提取:利用Trizol试剂提取。

（3）反转录合成cDNA第一条链：取2μg总RNA，加入5×反应缓冲液4μL，10mM dNTP 2μL，核糖核酸酶抑制剂(40－200u/μL）0.5μL，引物o1igodT(1μg/μL)1μL，反转录酶（10u/μL）2μL，42℃反应60min，然后85℃10min终止反应，稀释至200μL。

（4）PCR反应（25μL）：cDNA 2μL,10×Buffer 2.5μL,10mmol/L dNTP2μL,25mmol/LMgCl₂2μL，上、下游引物各2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL),ddH₂O 12μL。反应条件为94℃ 3min预变性；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1.5min,共32个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

（5）基因克隆：取2μL PCR产物与pMD18－T载体进行连接，获得重组质粒pMD18T/61f操作步骤按TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α，在涂有X－gal和IPTG的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

（6）质粒DNA提取：碱法提取质粒DNA。

（7）用SnaB I和NotⅠ对重组质粒pMD18-T/61f产物进行双酶切，同时用SnaB I和NotⅠ双酶切酵母表达质粒pPIC9K，DNA胶回收试剂盒回收纯化61f基因及载体pPIC9K片断。然后进行体外连接，获得重组质粒pPIC9K/61f，重组质粒转化大肠杆菌JM109，在含Amp的LB转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定，测序确认重组质粒的读码框正确。

实施例4.表达糖苷水解酶基因61f的酵母工程菌株的构建及筛选

（1）重组表达质粒的线性化:将重组表达质粒pPIC9K/61f用限制性内切酶SacⅠ线性化。

（2）转化：电击转化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，转化方法参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。

（3）筛选：用灭菌牙签挑取转化子对应点种在MM和MD平板上，30℃培养2－4d,挑取在MD/MM平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于250μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mLG418的YPD平板上筛选多拷贝转化子。

实施方式5：毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测

（1）将阳性转化子接种于含25mL BMGY培养基中，30℃ 250rpm/min摇床培养24h（OD₆₀₀达2－6），离心收集菌体，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD₆₀₀值为1.0，30℃250rpm/min继续培养，每24h补充甲醇至终浓度为0.5%，每24h取样，室温10，000g离心5min，取上清进行SDS-PAGE分析。

（2）酶活性检测：酶活性测定采用DNS法，反应体系及反应条件为100μL的酶液，加入200μL的0.5%微晶纤维素，100μL的醋酸缓冲液（0.4mol/L、pH 5.0）65℃反应30min，加入400μL DNS试剂，煮沸10min，在540nm波长下测定光吸收值。对照组用失活的酶液做对照。以失活酶液的活性定义为100%，测定糖苷水解酶61F的相对酶活性。重复三次，取平均值。蛋白含量测定采用Bradford法。

（3）重组糖苷水解酶61f的最适反应温度、pH及热稳定性：诱导表达的重组糖苷水解酶经过DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析，获得电泳均一的纯化蛋白，用纯化的重组糖苷水解酶测定其性质。在不同温度和pH条件下分别测定重组糖苷水解酶的对纤维素的酶活力，将最高的酶活力定义为100％，分别计算不同温度条件下糖苷水解酶的相对酶活性；将重组糖苷水解酶在不同的温度下保温60min，检测剩余酶活力。重复三次，取平均值。

实施方式6：61家族糖苷水解酶对内切纤维素酶N24活性的促进作用及不同金属离子对其活性的影响

（1）糖苷水解酶对内切纤维素酶N24活性的促进作用

采用DNS法，分别测定61F、N24及混合酶在N24最适反应条件下的内切纤维素酶活性，混合酶为61F和N24等体积混合，反应体系为：61F 50μL，N24 50μL，200μL的0.5% CMC-Na，100μL的醋酸缓冲液（0.4mol/L、pH 5.0）50℃反应30min，加入400μL DNS试剂，煮沸10min，在540nm波长下测定光吸收值。以不加糖苷水解酶61F的反应体系中的酶活性定义为100%，分别计算糖苷水解酶61F、内切纤维素酶N24以及混合酶的相对酶活性。重复三次，取平均值。

（2）不同金属离子对糖苷水解酶61F纤维素酶活性的影响

在反应体系中加入不同的金属离子，使其终浓度为50mmol/L，在糖苷水解酶61F最适反应条件下测定其内切纤维素酶活性，不加金属离子反应体系中的酶活性定义为100%，计算不同金属离子条件下糖苷水解酶61F的相对酶活性。重复三次，取平均值。

（3）不同金属离子对混合酶活性的影响

在反应体系中加入不同的金属离子，使其终浓度为50mmol/L，在内切纤维素酶N24最适反应条件下测定混合酶的内切纤维素酶活性，不加金属离子反应体系中的酶活性定义为100%，计算不同金属离子条件下混合酶的相对酶活性。重复三次，取平均值。

实施方式7：表达61f基因的毕赤酵母工程菌株GS-TA-61的保藏

表达61f基因的毕赤酵母工程菌株GS-TA-61的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年11月22日；酵母工程菌株编号为：CGMCC No.6861；毕赤酵母工程菌株的分类命名为：巴氏毕赤酵母pichiapastoris。

Claims

1.一种表达嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus 61家族糖苷水解酶61f基因的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT-PCR及RACE方法从嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus获得热稳定61家族糖苷水解酶基因61f，将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,获得表达重组质粒pPIC9K/61f,转化毕赤酵母GS115,从中筛选出表达热稳定糖苷水解酶基因61f的毕赤酵母工程菌株GS-TA-61，该糖苷水解酶61F对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用。