CN103255072A

CN103255072A - 表达热稳定纤维素酶基因融合体61f-eg1的毕赤酵母工程菌株

Info

Publication number: CN103255072A
Application number: CN2013102052006A
Authority: CN
Inventors: 李多川; 李安娜; 宁晓东; 田洪平
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2013-08-21

Abstract

本发明是一种融合表达嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus61家族糖苷水解酶61f和内切葡聚糖酶eg1融合基因的毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GS-61eg1-134。通过RT-PCR及融合PCR方法从嗜热子囊菌光孢变种T.aurantiacus var.levisporus获得糖苷水解酶基因61f和内切葡聚糖酶eg1，将其通过融合PCR得到融合基因61f-eg1，构建酵母表达载体pPIC9K/61f-eg1，导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一株高效表达融合蛋白的酵母工程菌GS-61eg1-134。该工程菌表达的酶的融合体相对于61f、eg1单独表达时的酶的活性得到明显的提高，达到10.89U/mL，比活力较内切纤维素酶EG1提高2.7倍。同时，融合蛋白表达量大，具有良好的热稳定性，可广泛用于纤维废料及其它工业领域，具有重大经济价值和社会价值。

Description

表达热稳定纤维素酶基因融合体61F-EG1的毕赤酵母工程菌株

（一）技术领域

本发明涉及生物工程，具体地说是从嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus克隆出61家族糖苷水解酶基因61f和内切葡聚糖酶eg1通过融合PCR构建的毕赤酵母工程菌株GS-61eg1-134。

(二）背景技术

嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶和61家族糖苷水解酶。

嗜热子囊菌光孢变种产生的61家族糖苷水解酶61F具有微弱的纤维素酶活性，通过使用接头序列将61f和eg1融合表达后，其内切纤维素酶活性明显提高，为EG1活性的2.7倍。

（三）发明内容

本发明从嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus获得的61家族糖苷水解酶基因61f和内切葡聚糖酶基因eg1，通过融合PCR得到61f-eg1基因，该基因cDNA全长1638bp，编码545个氨基酸。

构建重组表达质粒载体pPIC9K/61f-eg1，利用电转仪进行电击转化Pichia pastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-61EG1-134。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28℃200rpm/min摇床培养6d，纯化后融合蛋白的表达量为4.32mg/ml，分子量为58.8KDa，酶活力为13.6U/ml，重组蛋白61F-EG1在60℃下是稳定的；70℃处理60min后仍保持90.34% 的活性；80℃处理60min后保持75.65%的活性；90℃下半衰期为50min。

（四）附图说明：

图1融合蛋白61F-EG1的SDS-PAGE分析

泳道1：纯化的融合蛋白61F-EG1

泳道2：低分子量蛋白标准（自上至下依次为116kDa，66.2kDa,45KDa,35kDa）

图2融合蛋白61F-EG1与61F、EG1单独表达时的酶活比较

图3融合蛋白61F-EG1最适反应温度

图4融合蛋白61F-EG1热稳定性

图5融合蛋白61F-EG1最适反应PH

（五）具体实施方式

实施方式1：嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus的分离鉴定

（1）标本采集：从堆肥中采集。

（2）分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。

（3）鉴定:参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。

实施方式2：糖苷水解酶基因61f和内切葡聚糖酶eg1的基因融合

（1）嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus总RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明。

（2）cDNA第一条链的合成：按照Takara公司的TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0试剂盒说明书进行：取1～2μg总RNA，加RNase Free ddH₂O至9.5μL，将RNA样品在75℃变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分：10mmol/L dNTP Mixture2μL，10×RT Buffer(Mg²⁺)2μL，25mmol/L MgCl₂4μL，Oligo d(T)-Adaptor Primer1μL，RNase Inhibiter0.5μL，AMV Reverse Transcriptase1μL（Final Volume20μL），将反应液混合后，室温下放10min，然后42℃温育60min，再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180μL DEPC处理的ddH₂O，稀释至200μL，混匀，稍微离心，保存于-20℃，备用。

（3）61f和eg1基因的分离：根据已知的61f和eg1的序列设计特异引物，在61f上游引物加入SnaBⅠ酶切位点，eg1下游引物加入NotⅠ酶切位点，在61f下游引物和eg1上游引物添加linker，引物序列如下;

61f-1:CC TACGTA CATGGCTTCGTTCAGAACA

61f-2:ACCACCAGAACCACCACCAGAACCACCACCAGTATACAGAGG AGGA

eg1-1:TCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGCGAAAGTATTCC AATGGT

eg1-2:TT GCGGCCGC TCAAAGATAC GGAGTCAAA

（4）基因克隆：取0.5μl PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂有X－gal和IPTG的含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

（5）质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。

（6）序列测定：在上海博尚生物工程有限公司进行。

（7）基因融合：融合PCR体系为61f PCR产物1μL、eg1PCR产物1μL、10ｘBuffer（Mg2+）2.5μL、10mmol/LdNTP2μL、0.5μL(2.5U)Taq DNA聚合酶、61f上游引物和eg1下游引物各1μL、ddH2O16μL。融合PCR反应程序为95℃4min；95℃1min，45℃1min，72℃2min，共32个循环；72℃延伸10min；10℃保温。

（8）序列测定：在上海博尚生物工程有限公司进行。融合基因61f-eg1cDNA全长1638bp，编码545个氨基酸，包括linkerGGSGGGSGGGSG。

该序列如下：

(A)SEQ ID NO1的信息

（a）序列特征：*长度：1638碱基对；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性

（b）分子类型：cDNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)

（f）序列描述：

1 CATGGCTTCG TTCAGAACAT CGTGATTGAT GGTAAAAAGT ATGTCATTGC AAGACGCAAC

61 CAGTATCCAT ACATGTCCAA TCCTCCAGAG GTCATCGCCT GGTCTACTAC GGCAACTGAT

121 CTTGGATTTG TGGACGGTAC TGGATACCAA ACCCCAGATA TCATCTGCCA TAGGGGCGCC

181 AAGCCTGGAG CCCTGACTGC TCCAGTCTCT CCAGGAGGAA CTGTTGAGCT TCAATGGACT

241 CCATGGCCTG ATTCTCACCA TGGCCCAGTT ATCAACTACC TTGCTCCGTG CAATGGTGAT

301 TGTTCCACTG TGGATAAGAC CCAATTAGAA TTCTTCAAAA TTGCCGAGAG CGGTCTCATC

361 AATGATGACA ATCCTCCTGG GATCTGGGCT TCAGACAATC TGATAGCAGC CAACAACAGC

421 TGGACTGTCA CCATTCCAAC CACAATTGCA CCTGGAAACT ATGTTCTGAG GCATGAGATT

481 ATTGCTCTTC ACTCAGCTCA GAACCAGGAT GGTGCCCAGA ACTATCCCCA GTGCATCAAT

541 CTGCAGGTCA CTGGAGGTGG TTCTGATAAC CCTGCTGGAA CTCTTGGAAC GGCACTCTAC

601 CACGATACCG ATCCTGGAAC TCTGATCAAC ATCTATCAGA AACTTTCCAG CTATATCATC

661 CCTGGTCCTC CTCTGTATAC TGGTGGTGGT TCTGGTGGTG GTTCTGGTGG TGGTTCTGGT

721 GCGAAAGTAT TCCAATGGTT CGGTTCGAAC GAGTCCGGTG CTGAATTCGG AAGCCAGAAC

781 CTTCCAGGAG TCGAGGGAAA GGATTATATA TGGCCTGATC CCAACACCAT TGACACATTG

841 ATCAGCAAGG GGATGAATAT CTTTCGTGTC CCCTTTATGA TGGAGAGATT GGTTCCCAAC

901 TCAATGACCG GCTCTCCGGA TCCGAACTAC CTGGCAGATC TCATAGCGAC TGTAAATGCA

961 ATCACCCAGA AAGGTGCCTA CGCCGTCGTC GATCCTCATA ACTACGGCAG ATACTACAAT

1021 TCTATAATCT CGAGCCCTTC CGATTTCCAG ACCTTCTGGA AAACGGTCGC CTCACAGTTT

1081 GCTTCGAATC CACTGGTCAT CTTCGACACT AATAACGAAT ACCACGATAT GGACCAGACC

1141 TTAGTCCTCA ATCTCAACCA GGCCGCTATC GACGGCATCC GTTCCGCCGG AGCCACTTCC

1201 CAGTACATCT TTGTCGAGGG CAATTCGTGG ACCGGGGCAT GGACCTGGAC GAACGTGAAC

1261 GATAACATGA AAAGCCTGAC CGACCCATCT GACAAGATCA TATACGAGAT GCACCAGTAC

1321 CTGGACTCTG ACGGATCCGG GACATCAGCG ACCTGCGTAT CTTCGACCAT CGGTCAAGAG

1381 CGAATCACCA GCGCAACGCA GTGGCTCAGG GCCAACGGGA AGAAGGGCAT CATCGGCGAG

1441 TTTGCGGGCG GAGCCAACGA CGTCTGCGAG ACGGCCATCA CGGGCATGCT GGACTACATG

1501 GCCCAGAACA CAGACGTCTG GACTGGCGCC ATCTGGTGGG CGGCCGGGCC GTGGTGGGGA

1561 GACTACATAT TCTCCATGGA GCCGGACAAT GGCATCGCGT ATCAGCAGAT ACTTCCTATT

1621 TTGACTCCGT ATCTTTGA

（B）SEQ ID NO1的信息

（a）序列特征：*长度：545氨基酸；*类型：氨基酸；*链型：单链；*拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）序列描述：

1 HGFVQNIVID GKKYVIARRN QYPYMSNPPE VIAWSTTATD LGFVDGTGYQ TPDIICHRGA

61 KPGALTAPVS PGGTVELQWT PWPDSHHGPV INYLAPCNGD CSTVDKTQLE FFKIAESGLI

121 NDDNPPGIWA SDNLIAANNS WTVTIPTTIA PGNYVLRHEI IALHSAQNQD GAQNYPQCIN

181 LQVTGGGSDN PAGTLGTALY HDTDPGTLIN IYQKLSSYII PGPPLYTGGG SGGGSGGGSG

241 AKVFQWFGSN ESGAEFGSQN LPGVEGKDYI WPDPNTIDTL ISKGMNIFRV PFMMERLVPN

301 SMTGSPDPNY LADLIATVNA ITQKGAYAVV DPHNYGRYYN SIISSPSDFQ TFWKTVASQF

361 ASNPLVIFDT NNEYHDMDQT LVLNLNQAAI DGIRSAGATS QYIFVEGNSW TGAWTWTNVN

421 DNMKSLTDPS DKIIYEMHQY LDSDGSGTSA TCVSSTIGQE RITSATQWLR ANGKKGIIGE

481 FAGGANDVCE TAITGMLDYM AQNTDVWTGA IWWAAGPWWG DYIFSMEPDN GIAYQQILPI

541 LTPYL

实施方式3：表达载体的构建

用SnaB I和NotⅠ对实施方式2第（8）步所获重组质粒pMD18-T/61f-eg1进行双酶切，同时用SnaB I和NotⅠ双酶切酵母表达载体pPIC9K，分别回收后，进行体外连接，转化大肠杆菌JM109，在含Amp的LB平板上挑选单菌落，提取质粒DNA，获得融合表达载体pPIC9K/61f-eg1，经PCR、酶切鉴定及序列测定，确认重组质粒。实施例4.表达融合基因61f-eg1的酵母工程菌株的构建及筛选

（1）重组表达质粒的线性化:将重组表达质粒pPIC9K/61f-eg1用限制性内切酶SacⅠ线性化。

（2）转化：电击转化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，转化方法参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。

（3）筛选：用灭菌牙签挑取转化子对应点种在MM和MD平板上，30℃培养2－4d,挑取在MD/MM平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mLG418的YPD平板上筛选多拷贝转化子。

实施方式5：毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测

（1）将阳性转化子接种于含25mLBMGY培养基中，30℃250rpm/min摇床培养24h（OD₆₀₀达2－6），离心收集菌体，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD₆₀₀值为1.0，30℃250rpm/min继续培养，每24h补充甲醇至终浓度为1%，每24h取样，室温10，000g离心5min，取上清进行SDS-PAGE分析。

（2）酶活性检测：酶活性测定采用DNS法，反应体系及反应条件为100μL的酶液，加入200μL的1%羧甲基纤维素钠，100μL的醋酸缓冲液（0.4mol/L、pH5.0）60℃反应30min，加入400μL DNS试剂，煮沸10min，在540nm波长下测定光吸收值。在最适条件下，1分钟内能转化1微摩尔底物所需的酶量定义为1个活力单位（U）。蛋白含量测定采用Bradford法。

（3）融合体61F-EG1的最适反应温度、pH及热稳定性测定：融合蛋白经过DEAE阴离子交换层析，获得电泳均一的纯化蛋白。在不同温度和pH条件下分别测定融合蛋白的对纤维素的酶活力，将最高的酶活力定义为100％，分别计算不同温度下的相对酶活性；将融合蛋白在不同的温度下保温10-60min，检测剩余酶活力。重复三次，取平均值。

实施方式6：表达61f-eg1基因的毕赤酵母工程菌株GS-61eg1-134的保藏

表达61f-eg1基因的毕赤酵母工程菌株GS-61eg1-134的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年4月23日；酵母工程菌株编号为：CGMCC No.7496；毕赤酵母工程菌株的分类命名为：巴氏毕赤酵母Pichia pastoris。

序列表

Claims

1.一种表达嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus61家族糖苷水解酶与与内切纤维素酶融合体的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT-PCR及融合PCR方法从嗜热子囊菌光孢变种Thermoascusaurantiacus var.levisporus获得融合基因,将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,获得表达重组质粒pPIC9K/61f-eg1,转化毕赤酵母GS115,从中筛出具有高纤维素酶活性的毕赤酵母工程菌株GS-61eg1-134，该融合蛋白纤维素酶的活性是原始酶EG的2.7倍。