CN101307295A - 表达嗜热毛壳菌基因cbh3的毕赤酵母工程菌株 - Google Patents

Abstract

本发明是一种表达嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)热稳定外切－β－1，4－葡聚糖酶基因cbh3的毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GS－CBH3－27。通过RT－PCR及RACE方法从嗜热毛壳菌获得外切－β－1，4－葡聚糖酶基因cbh3，然后将得到的外切－β－1，4－葡聚糖酶基因cbh3表达载体pPIC9K/cbh3导入到毕赤酵母GS115中，从中筛选出了表达外切－β－1，4－葡聚糖酶的酵母工程菌GS－CBH3－27。该工程菌外切－β－1，4－葡聚糖酶表达量高达1.7mg/mL，酶在60℃是稳定的，在70℃保温60min，仍有60％的活性，80℃的半衰期为10min，具热稳定性，用于转化植物纤维素的生物降解，具有较高经济价值和社会价值。

Description

表达嗜热毛壳菌基因cbh3的毕赤酵母工程菌株

(一)技术领域：

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)热稳定外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-CBH3-27。

(二)背景技术：

纤维素在自然界储量极其丰富，是第一大可再生资源。纤维素的生物降解是通过纤维素酶实现的。纤维素酶是一个复合酶系，包括内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(EG)、β-1，4-纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(CBH)及β-1，4-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)(BG)。这三种酶协同作用，彻底切割β-1，4-糖苷键，使纤维素最终降解为葡萄糖。其中内切-β-1，4-葡聚糖酶是纤维素酶系最主要的成分，它首先作用纤维素，水解纤维素链非结晶区的β-1，4-糖苷键将纤维素链打开，它对整个纤维素的降解起重要的作用。

纤维素酶广泛应用于轻工、医药、环保、食品加工、饮料工业、纺织工业、可再生资源的综合利用等方面，被认为是最有应用潜力的酶制剂之一。目前国内外纤维素酶主要由嗜温真菌曲霉和木霉生产，但存在菌种产酶量低、活力低、酶稳定性差及成本高等问题，使其纤维素酶的生产和应用受到很大限制。由于热稳定纤维素酶在高温条件下的热稳定，因此具重要应用前景和商业价值。

嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶，但要使之用于规模化工业生产，还存在一些尚未解决的问题。如嗜热毛壳菌培养条件比较苛刻，高温发酵需要特殊设备，产酶效率低，造成成本增加，因此限制了它的应用。解决这一问题的有效途径是应用分子生物学手段，将嗜热毛壳菌热稳定纤维素酶基因导入酵母中高效表达，利用酵母生长快、易于培养等特点，使热稳定纤维素酶基因在常温和短时间内快速、大量表达，期望达到降低能耗和提高经济效益的目的。

(三)发明内容：

本发明的目的是从嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)获得外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3的全长cDNA，命名为cbh3(DQ085790)，嗜热毛壳菌cbh3全长的cDNA为1607bp，包括起始密码子和多聚A尾。开放阅读框(ORF)部分为1356bp，编码451个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于第7家族糖苷酶，其中6个基序DANWRW、FDVDVS、DLWEEV、GYCDSAQC、MVLVMS和MLWLDS具保守性。

利用获得的嗜热毛壳菌cbh3基因，构建重组表达质粒载体pPIC9K/cbh3，利用电转仪进行电击转化Pichia pastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得表达外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3的毕赤酵母工程菌株GS-CBH3-27。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在30℃250rpm/min摇床培养6d后，外切-β-1，4-葡聚糖酶表达量为1.7mg/mL，分子量为48kDa，酶在60℃保温60min，仍有97％的活性，在70℃保温60min，仍有60％的活性，80℃的半衰期为10min。

该工程菌株GS-CBH3-27能够高效表达(1.7mg/mL)嗜热毛壳菌外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3，分泌的外切-β-1，4-葡聚糖酶具较高的热稳定性，能用于植物纤维素的生物降解，有重要的经济价值和社会价值。

(四)附图说明：

图1表达嗜热毛壳菌基因cbh3的毕赤酵母工程菌程序图

图中：

是嗜热毛壳菌的分离鉴定

是嗜热毛壳菌外切-1，4-β-葡聚糖酶基因cbh3的克隆

是基因cbh3表达载体的构建

是表达基因cbh3的酵母工程菌株的构建及筛选

是毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测

是表达嗜热毛壳菌基因cbh3毕赤酵母工程菌株GS-CBH3-27的保藏

图2外切-1，4-β-葡聚糖酶基因cbh3PCR产物电泳图谱

泳道1：Marker-DL2000

泳道2：cDNA(ORF)(分子量1356bp)

图3外切-1，4-β-葡聚糖酶CBH3的SDS-PAGE分析

泳道1和8：低分子量蛋白标准

泳道2-7：酵母工程菌Pichia pastoris GS-CBH3-27的诱导2-6天的表达情况

泳道9：纯化的重组外切-1，4-β-葡聚糖酶CBH3(分子量48kDa)

(五)具体实施方式

1、嗜热毛壳菌的分离鉴定

(1)标本采集：从堆肥中采集。

(2)分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。

(3)鉴定：参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。

2、嗜热毛壳菌外切-1，4-β-葡聚糖酶基因cbh3的克隆

(1)嗜热毛壳菌总RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明。

(2)cDNA第一条链的合成：按照Promega公司的Reverse TranscriptionReaction试剂盒说明书进行，以Oligo(dT)20为引物合成cDNA第一链。反应条件为：42℃1小时；85℃10分钟。

(3)3′和5′序列的分离：按照5’/3’RACE Kit，2nd Genneration(RocheApplied Science)使用说明进行。3′RACE的上游引物序列为：5’-ATGCTNTGGCTNGAYTC-3’，下游引物为oligo dT。5′RACE引物根据3′RACE获得的序列设计。

(4)基因克隆：取2μl PCR产物与pGEM-T easy载体进行连接，操作步骤按照Promega公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

(5)质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。

(6)序列测定：DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行。序列引物为M13启动子引物。嗜热毛壳菌cbh3全长的cDNA为1607bp，包括起始密码子和多聚A尾。开放阅读框部分为1356bp，编码451个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于第7家族糖苷酶，其中6个基序DANWRW、FDVDVS、DLWEEV、GYCDSAQC、MVLVMS和MLWLDS具保守性。

3、cbh3基因表达载体的构建

(1)根据分离出的cbh3基因的核苷酸序列设计表达引物，在引物的5’端分别引入EcoRI和NotI酶切位点：

上游引物：5’-CCGAATTCCAGCGGGCCGGCACTCAG-3’(EcoR I)

下游引物：5’-GGGCGGCCGCCTAGACCTGGTAAGTCGAGC-3’(Not I)

(2)嗜热毛壳菌总RNA的提取：利用Trizol试剂提取。

(3)反转录合成cDNA第一条链：取2μg总RNA，加入5×反应缓冲液4μL，10mM dNTP 2μL，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/μL)0.5μL，引物oligodT(1μg/μL)1μL，反转录酶(10u/μL)2μL，42℃反应60min，然后85℃10min终止反应，稀释至200μL。

(4)PCR反应(25μL)：cDNA 2μL，10×Buffer 2.5μL，10mmol/L dNTP2μL，25mmol/LMgCl₂2μL，上、下游引物各2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL)，ddH₂O 12μL。反应条件为94℃3min预变性；94℃1min，60℃1min，72℃1.5min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

(5)基因克隆：取2μL PCR产物与pGEM-T载体进行连接，获得重组质粒pGEMT/cbh3操作步骤按Promega公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α，在涂有X-gal和IPTG的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

(6)质粒DNA提取：碱法提取质粒DNA。

(7)用EcoR I和Not I对重组质粒pGEMT/cbh3产物进行双酶切，同时用EcoRI和Not I双酶切酵母表达质粒pPIC9K，DNA胶回收试剂盒回收纯化cbh3基因及载体pPIC9K片断。然后进行体外连接，获得重组质粒pPIC9K/cbh3，重组质粒转化大肠杆菌JM109，在含Amp的LB转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定，测序确认重组质粒的读码框正确。

4、表达基因cbh3的酵母工程菌株的构建及筛选

(1)重组表达质粒的线性化：将重组表达质粒pPIC9K/cbh3用限制性内切酶Sac I线性化。

(2)转化：电击转化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，转化方法参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。

(3)筛选：用灭菌牙签挑取转化子对应点种在MM和MD平板上，30℃培养2-4d，挑取在MD/MM平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于250μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mLG418的YPD平板上筛选多拷贝转化子。

5、毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测

(1)将阳性转化子接种于含25mL BMGY培养基中，30℃250rpm/min摇床培养24h(OD₆₀₀达2-6)，离心收集菌体，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD₆₀₀值为1.0，30℃250rpm/min继续培养，每24h补充甲醇至终浓度为0.5％，每24h取样，室温10,000g离心5min，取上清进行SDS-PAGE分析。

(2)阳性转化子酶活性检测与工程菌确定：酶活性测定采用pNPC法，蛋白含量测定采用Bradford法。阳性转化子中酶活性最高(2.5U/ml发酵液)的确定为酵母工程菌株GS-CBH3-27。

(3)重组外切葡聚糖酶CBH3的最适反应温度、pH及热稳定性：酵母工程菌株GS-CBH3-27经诱导表达的重组外切葡聚糖酶经过DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析，获得电泳均一的纯化蛋白，用纯化的重组外切葡聚糖酶测定其性质。在不同温度和pH条件下分别测定重组外切葡聚糖酶的酶活力，将最高的酶活力定义为100％，分别计算不同温度条件下外切葡聚糖酶的相对酶活性；将重组外切葡聚糖酶在不同的温度下保温60min，检测剩余酶活力。

6、表达嗜热毛壳菌基因cbh3的毕赤酵母工程菌株GS-CBH3-27的保藏

表达嗜热毛壳菌基因cbh3的毕赤酵母工程菌株GS-CBH3-27的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2008年5月29日；酵母工程菌株编号为：CGMCC No.2530；毕赤酵母工程菌株的分类命名为：巴氏毕赤酵母Pichia pastoris。

嗜热毛壳菌基因cbh3序列表

核苷酸序列：

1     GCGAGCACAC CAGGCACACA CGGTCGGTTT GTCTAGAGTC TCACGGTTCA TCTTCTGGTC

61    TCACATCCCT CTCACTCAAA ATGCAGATCA AGCAGTACCT CCAGTACCTG GCGGCGGCTC

121   TGCCGCTCGT CAACATGGCT GCTGCCCAGC GGGCCGGCAC TCAGCAGACC GAGACTCATC

181   CCCGTTTGAG CTGGAAGCGC TGCTCGTCAG GCGGCAACTG CCAAACAGTC AACGCCGAGA

241   TCGTCATCGA CGCTAACTGG CGCTGGCTGC ACGACTCCAA CTACCAGAAC TGCTATGACG

301   GCAACCGCTG GACCAGCGCG TGCAGCTCGG CGACCGACTG CGCGCAGAAG TGCTACCTGG

361   AGGGCGCCAA CTACGGCAGC ACGTACGGTG TCTCGACCAG CGGCGATGCC TTGACGCTCA

421   AGTTCGTCAC CAAGCACGAG TACGGAACCA ACATCGGCTC GCGTGTGTAC CTCATGAATG

481   GCTCGGACAA GTATCAGATG TTCACGCTGA TGAACAACGA GTTCGCCTTC GACGTCGACC

541   TGAGCAAGGT CGAGTGCGGT CTCAACAGCG CCCTGTACTT TGTCGCCATG GAGGAGGACG

601   GCGGCATGCG CAGTTACTCG TCCAACAAGG CCGGCGCCAA GTACGGCACA GGCTACTGTG

661   ATGCCCAATG CGCTCGTGAC CTCAAGTTCG TGGGCGGCAA GGCCAACATC GAGGGCTGGC

721   GCCCGTCGAC CAACGATGCT AACGCCGGTG TTGGTCCGTA CGGCGCCTGC TGCGCTGAGA

781   TCGACGTCTG GGAGTCAAAC GCCTATGCCT TCGCCTTCAC CCCCCACGGT TGCCTCAACA

841   ACAACTACCA CGTTTGCGAA ACCTCCAACT GCGGTGGTAC ATATTCGGAG GACCGCTTCG

901   GCGGCCTCTG CGACGCAAAC GGCTGCGACT ACAACCCGTA CCGCATGGGC AACAAGGACT

961   TCTACGGCAA GGGCAAGACG GTCGACACCA GCCGCAAGTT TACTGTCGTC ACGCGCTTCG

1021  AGGAGAACAA GCTCACGCAG TTCTTCATCC AAGACGGCCG CAAGATCGAC ATCCCGCCGC

1081  CGACCTGGCC CGGCCTGCCC AACAGCAGCG CCATCACCCC CGAGCTGTGC ACCAACCTCT

1141  CCAAGGTCTT CGACGACCGC GACCGCTACG AGGAGACGGG CGGCTTCCGC ACCATCAACG

1201  AGGCCCTGCG CATCCCCATG GTCCTGGTCA TGTCCATCTG GGACGGCCAT TACGCCAGCA

1261  TGCTCTGGCT CGACTCGGTC TACCCACCCG AGAAGGCTGG CCAGCCCGGC GCCGAGCGTG

1321  GTCCTTGCGC TCCTACTTCT GGCGTCCCTG CCGAGGTCGA AGCCCAATTC CCTAATGCCC

1381  AGGTCATCTG GTCCAACATC CGCTTCGGCC CCATCGGCTC GACTTACCAG GTCTAGGCAT

1441  CCAGTTAATG ACGCGTCTCG CATGGCCAAG AGCAGGAGGT TGGGTGCATT TTCTTATCGG

1501  ACATATTCGC TTCTTTTTTT TGTTGTGTAT AGCCAGATCC GTACCATAGC AAAGCCGTAG

1561  AAAGTCAATC AAGCTTTAAG CATTGATCTA GAAAAAAAAA AAAAAAA

氨基酸序列：

1    MQIKQYLQYL AAALPLVNMA AAQRAGTQQT ETHPRLSWKR CSSGGNCQTV NAEIVIDANW

61   RWLHDSNYQN CYDGNRWTSA CSSATDCAQK CYLEGANYGS TYGVSTSGDA LTLKFVTKHE

121  YGTNIGSRVY LMNGSDKYQM FTLMNNEFAF DVDLSKVECG LNSALYFVAM EEDGGMRSYS

181  SNKAGAKYGT GYCDAQCARD LKFVGGKANI EGWRPSTNDA NAGVGPYGAC CAEIDVWESN

241  AYAFAFTPHG CLNNNYHVCE TSNCGGTYSE DRFGGLCDAN GCDYNPYRMG NKDFYGKGKT

301  VDTSRKFTVV TRFEENKLTQ FFIQDGRKID IPPPTWPGLP NSSAITPELC TNLSKVFDDR

361  DRYEETGGFR TINEALRIPM VLVMSIWDGH YASMLWLDSV YPPEKAGQPG AERGPCAPTS

421  GVPAEVEAQF PNAQVIWSNI RFGPIGSTYQ V

Claims (1)

1、一种表达嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)热稳定外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3的酵母工程菌株GS-CBH3-27，其特征在于，通过RT-PCR及RACE方法从嗜热毛壳菌获得热稳定外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3，将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，获得表达重组质粒pPIC9K/cbh3，转化毕赤酵母GS115，从中筛选出表达热稳定外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3的毕赤酵母工程菌株GS-CBH3-27，该菌用于植物纤维素的生物降解。

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