CN103509727A

CN103509727A - 表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌株

Info

Publication number: CN103509727A
Application number: CN201310423137.3A
Authority: CN
Inventors: 李多川; 韩超
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2014-01-15

Abstract

本发明是一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum热稳定热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GS-CT-9C。通过RT-PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得糖苷水解酶基因CtAA9c，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，然后将得到的糖苷水解酶基因CtAA9c表达载体pPIC9K/CtAA9c导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基因CtAA9c的酵母工程菌GS-CT-9C。该工程菌表达的糖苷水解酶CtAA9C对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用，混合酶比原始内切酶N24的降解纤维素的活性提高1.4倍。在Mn²⁺条件下，CtAA9C和CtAA9C+N24的纤维素酶活性可分别提高15倍和3.5倍。CtAA9C具有良好的热稳定性和提高纤维素酶活力的能力，可广泛用于纤维废料及其它工业领域，具有重大经济价值和社会价值。

Description

表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌株

（一）技术领域

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达具体地说是以嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-CT-9C。

（二）背景技术

糖苷水解酶（英语：Glycoside hydrolases，又称糖苷酶）是一种专门水解配糖键（glycosidic bond），并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。

嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶和9家族糖苷水解酶。

嗜热毛壳菌产生的9家族糖苷水解酶CtAA9C具有微弱的纤维素酶活性，但对该菌株产生的内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用,可使其活性提高1.4倍。在不同金属离子如Mn²⁺的作用下，CtAA9C和CtAA9C+N24的活性可分别提高15倍和3.5倍。

（三）发明内容

本发明从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得内切β-1,4-葡聚糖酶基因的cDNA序列全长，命名为CtAA9c，CtAA9c基因DNA全长1020bp，包括信号肽序列，起始密码子和终止密码子，无内含子，编码313个氨基酸，具有信号肽序列（1-26aa MPPSTSSLLSILLTLSSTLIPDPVFA）。将CtAA9c编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。

构建重组表达质粒载体pPIC9K/CtAA9c，利用电转仪进行电击转化Pichia pastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-CT-9C。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28℃200rpm/min摇床培养6d后，糖苷水解酶的表达量为3.24mg/ml，分子量为65KDa，酶活力为0.0483U/ml，CtAA9C在65℃下是稳定的，处理60min后仍有95%以上的酶活性；70℃处理30min后仍保持74.4%的活性；80℃处理30min后保持24.8%的活性；90℃处理30min活性几乎完全丧失。

9家族糖苷水解酶CtAA9C对嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，混合酶比原始酶N24的降解纤维素的能力提高1.4倍。不同金属离子对CtAA9C和CtAA9C+N24混合酶活性具有促进或抑制作用，其中在Mn²⁺条件下，CtAA9C和CtAA9C+N24的纤维素酶活性可分别提高35倍和3.5倍。

（四）附图说明：

图1 9家族糖苷水解酶CtAA9C的SDS-PAGE分析

泳道1：低分子量蛋白标准

泳道2：纯化的9家族糖苷水解酶CtAA9C

图2 A:9家族糖苷水解酶CtAA9C的最适温度

B:9家族糖苷水解酶CtAA9C的热稳定性测定

图3 9家族糖苷水解酶CtAA9C对内切纤维素酶N24活性的促进作用

图4 金属离子Mn²⁺对CtAA9C纤维素酶及混合酶活性的影响

（五）具体实施方式

实施例1：嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum的分离鉴定

（1）标本采集：从堆肥中采集。

（2）分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。

（3）鉴定:参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。

实施例2：糖苷水解酶基因CtAA9c的克隆

（1）嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum总RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明。

（2）cDNA第一条链的合成：按照Takara公司的TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0试剂盒说明书进行：取1～2μg总RNA，加RNase Free ddH₂O至9.5μL，将RNA样品在75℃变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分：10mmol/L dNTP Mixture 2μL，10×RT Buffer(Mg²⁺)2μL，25mmol/L MgCl₂4μL，Oligo d(T)-Adaptor Primer 1μL，RNase Inhibiter 0.5μL，AMV Reverse Transcriptase 1μL（Final Volume 20μL），将反应液混合后，室温下放10min，然后42℃温育60min，再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180μL DEPC处理的ddH₂O，稀释至200μL，混匀，稍微离心，保存于-20℃，备用。

（3）PCR反应（25μL）：cDNA 2μL,10×Buffer 2.5μL,10mmol/L dNTP 2μL,25mmol/LMgCl2 2μL，上、下游引物各2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL),ddH2O12μL。反应条件为94℃ 5min预变性；94℃ 40s，54℃ 40s，72℃ 1min,共32个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

上游引物：5’-ATGCCTCCTTCAACGAGTTCAC-3’

下游引物：5’-TTAACCCCTAAGATGATAC-3’

（4）基因克隆：取0.5μl PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂有氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

（5）质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。

（6）序列测定：DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行。序列引物为M13启动子引物。嗜热毛壳菌CtAA9c基因cDNA全长1020bp，包含起始密码子和终止密码子，无内含子，编码313个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。该序列如下：

(A)SEQ ID NO1的信息

（a）序列特征：*长度：1020碱基对；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum

（f）序列描述：

1 ATGCCTCCTT CAACGAGTTC ACTTCTTTCA ATCCTGCTTA CTCTCAGCTC CACACTCATC

61 CCTGACCCGG TATTCGCCCA CTCTCATCTC TCCCACATCG TCGTCAACGG GGCTCTCTAC

121 CACGGCTATG ACCCGCGAAG CCCCGTTAAG AACCCTGATA GCAACAAAAC ATACAACAAT

181 CCCAGACCCA ACCATCCTGG TAGTGTTGCT TGGTCATATG CCGCTTTCGA CGATGGCTTC

241 GTCGCCCCAG AAAATTACTC ACATCCGGAT ATAATTTGTC ACATCGGTGC TACCAGCCCC

301 AAAGCCCATG CTCCCGTTCG CCCAGGCGAT CTAATCCACA TTCAATGGAA CGGTTGGCCT

361 GTGGGGCACG TCGGTCCTAT CCTGACATAC ATCGCTCCCT GCAAAAGCCA GTCCGGGTGT

421 GCAGGTGTGG ATAAGACGAC CCTGAGATGG ACAAAAATTG ATGAGTCTCG TCCCGTACTA

481 GAGATTCTCC CGAACAATGA GAATCGCTGG GATGTGGAAC ACGGCCGGGC TGGCATAGTA

541 GGAAAGAGGT GGGCCACAGA TGTGATGGTT GCTGCCAACA ACAGCTGGCA GGTAGAGGTG

601 CCAAGGGGTT TGGCGCGCGG GGCGTATGTG ATGAGACATG AGATTATTGC ATTGCATTTT

661 GCGGCGAAGA GGGGAGGGGC GCAAAATTAC CCTGTGTGCT TTAATCTGTG GATTGAGGGA

721 GAGAAAGAGG GGAGCGTGAC GCTAGATGGG TATGATGCTA GGGAGTTTTA TCGGGATGAT

781 CATATTGGCG TGTGGGTAAA TGTCACAGCT CCAGCGCTGG CGAGTTACAT CATTCCGGGG

841 CCAACGATAG CCAGCTGGGC TATGCCAGTC CCGTATGCGC AGCAGACCTC GATGTTACTG

901 AGATCAGAGG GAACTCCCGT TGTTGTGACG AGGAGTACAG AGACCGTACT GTGGACTGCA

961 GAGGTGACAC CTACACCTAC CGGCCAAGCT GTTCGACACA GGTATCATCT TAGGGGTTAA

（B）SEQ ID NO2的信息

（a）序列特征：*长度：313氨基酸；*类型：氨基酸；*链型：单链；*拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）序列描述：

1 HSHLSHIVVN GALYHGYDPR SPVKNPDSNK TYNNPRPNHP GSVAWSYAAF DDGFVAPENY

61 SHPDIICHIG ATSPKAHAPV RPGDLIHIQW NGWPVGHVGP ILTYIAPCKS QSGCAGVDKT

121 TLRWTKIDES RPVLEILPNN ENRWDVEHGR AGIVGKRWAT DVMVAANNSW QVEVPRGLAR

181 GAYVMRHEII ALHFAAKRGG AQNYPVCFNL WIEGEKEGSV TLDGYDAREF YRDDHIGVWV

241 NVTAPALASY IIPGPTIASW AMPVPYAQQT SMLLRSEGTP VVVTRSTETV LWTAEVTPTP

301 TGQAVRHRYH LRG

实施方式3：表达载体的构建

（1）根据分离出的CtAA9c基因的核苷酸序列设计表达引物，在引物的5’端分别引入Ecor I和NotⅠ酶切位点,下游引物引入6个组氨酸序列，作为纯化标签：上游引物：5’-CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACCA CTCTCATCTC TCC-3(Ecor I)；下游引物：5’-TTGCGGCCGCTTAACCCCTA AGAT-3’(NotⅠ)（组氨酸序列）

(2)嗜热毛壳菌总RNA的提取:利用Trizol试剂提取。

（3）反转录合成cDNA第一条链：取2μg总RNA，加入5×反应缓冲液4μL，10mM dNTP2μL，核糖核酸酶抑制剂（40－200u/μL）0.5μL，引物 oligodT(1μg/μL)1μL，反转录酶（10u/μL）2μL，42℃反应60min，然后85℃10min终止反应，稀释至200μL。

（4）PCR反应（25μL）：cDNA2μL,10×Buffer2.5μL,10mmol/L dNTP2μL,25mmol/LMgCl₂2μL，上、下游引物各2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL),ddH₂O12μL。反应条件为94℃5min预变性；94℃40s，54℃40s，72℃1min,共32个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

（5）基因克隆：取2μL PCR产物与pMD18－T载体进行连接，获得重组质粒pMD18T/CtAA9c操作步骤按TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α，在涂有AMP的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

（6）质粒DNA提取：碱法提取质粒DNA。

（7）用Ecor I和NotⅠ对重组质粒pMD18-T/CtAA9c产物进行双酶切，同时用Ecor I和NotⅠ双酶切酵母表达质粒pPIC9K，DNA胶回收试剂盒回收纯化9a基因及载体pPIC9K片断。然后进行体外连接，获得重组质粒pPIC9K/CtAA9c,重组质粒转化大肠杆菌JM109，在含Amp的LB转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定，测序确认重组质粒的读码框正确。

实施例4.表达糖苷水解酶基因CtAA9c的酵母工程菌株的构建及筛选

（1）重组表达质粒的线性化:将重组表达质粒pPIC9K/CtAA9c用限制性内切酶SacⅠ线性化。

（2）转化：电击转化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，转化方法参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。

（3）筛选：用灭菌牙签挑取转化子对应点种在MM和MD平板上，30℃培养2－4d,挑取在MD/MM平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于250μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mLG418的YPD平板上筛选多拷贝转化子。

实施方式5：毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测

（1）将阳性转化子接种于含25mL BMGY培养基中，30℃250rpm/min摇床培养24h（OD₆₀₀达2－6），离心收集菌体，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD₆₀₀值为1.0，30℃250rpm/min继续培养，每24h补充甲醇至终浓度为0.5%，每24h取样，室温10，000g离心5min，取上清进行SDS-PAGE分析。

（2）酶活性检测：酶活性测定采用DNS法，反应体系及反应条件为100μL的酶液，加入200μL的0.5%微晶纤维素，100μL的醋酸缓冲液（0.4mol/L、pH5.0）60℃反应30min，加入400μL DNS试剂，煮沸10min，在540nm波长下测定光吸收值。对照组用失活的酶液做对照。以失活酶液的活性定义为100%，测定糖苷水解酶CtAA9C的相对酶活性。重复三次，取平均值。蛋白含量测定采用Bradford法。

（3）重组糖苷水解酶CtAA9C的最适反应温度、pH及热稳定性：诱导表达的重组糖苷水解酶经过GE公司的HisTrap FF crude金属配体亲和层析柱纯化带有组氨酸标记的重组蛋白质，获得电泳均一的纯化蛋白，用纯化的重组糖苷水解酶测定其性质。在不同温度和pH条件下分别测定重组糖苷水解酶的对纤维素的酶活力，将最高的酶活力定义为100％，分别计算不同温度条件下糖苷水解酶的相对酶活性；将重组糖苷水解酶在不同的温度下保温30min，检测剩余酶活力。重复三次，取平均值。

实施方式6：9家族糖苷水解酶对内切纤维素酶N24活性的促进作用及不同金属离子对其活性的影响

（1）糖苷水解酶对内切纤维素酶N24活性的促进作用

采用DNS法，分别测定CtAA9C、N24及混合酶在N24最适反应条件下的内切纤维素酶活性，混合酶为CtAA9C和N24等体积混合，反应体系为：CtAA9C50μL，N2450μL，200μL的0.5%CMC-Na，100μL的醋酸缓冲液（0.4mol/L、pH5.0）50℃反应30min，加入400μL DNS试剂，煮沸10min，在540nm波长下测定光吸收值。以不加糖苷水解酶CtAA9C的反应体系中的酶活性定义为100%，分别计算糖苷水解酶CtAA9C、内切纤维素酶N24以及混合酶的相对酶活性。重复三次，取平均值。

（2）金属离子Mn²⁺对糖苷水解酶CtAA9C纤维素酶活性的影响

在反应体系中加入不同的金属离子，使其终浓度为1mmol/L，在糖苷水解酶CtAA9C最适反应条件下测定其内切纤维素酶活性，不加金属离子反应体系中的酶活性定义为100%，计算不同金属离子条件下糖苷水解酶CtAA9C的相对酶活性。重复三次，取平均值。

（3）金属离子Mn²⁺对混合酶活性的影响

在反应体系中加入不同的金属离子，使其终浓度为1mmol/L，在内切纤维素酶N24最适反应条件下测定混合酶的内切纤维素酶活性，不加金属离子反应体系中的酶活性定义为100%，计算不同金属离子条件下混合酶的相对酶活性。重复三次，取平均值。

实施方式7：表达CtAA9c基因的毕赤酵母工程菌株GS-CT9C的保藏

表达CtAA9c基因的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9C的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年7月19日；酵母工程菌株编号为：CGMCC No.7944；毕赤酵母工程菌株的分类命名为：巴氏毕赤酵母Pichia pastoris。

Claims

1.一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT-PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9c,将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,获得表达重组质粒pPIC9K/CtAA9c,转化毕赤酵母GS115,从中筛选出表达热稳定糖苷水解酶基因CtAA9c的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9C，该糖苷水解酶CtAA9C对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用。