CN101368163A - 表达嗜热子囊菌光孢变种基因Mn-sod的毕赤酵母工程菌株 - Google Patents

表达嗜热子囊菌光孢变种基因Mn-sod的毕赤酵母工程菌株 Download PDF

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本发明是一种表达嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)热稳定锰超氧化物歧化酶(Mn－SOD)基因Mn－sod的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris MS18。通过RT－PCR方法从嗜热子囊菌光孢变种获得锰超氧化物歧化酶基因Mn－sod，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，然后将得到的锰超氧化物歧化酶基因Mn－sod表达载体pPIC9K/Mn－sod导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一种表达锰超氧化物歧化酶的酵母工程菌MS18。该工程菌经诱导培养6d后，酶表达量为0.92mg/mL，酶活为2324U/mL，分子量为86.0kDa，酶在50、60℃下活性稳定，80℃保温40min后酶活仍剩余50％，在 90℃处理60min仍具有20％的活性，具热稳定性，可用于热稳定锰超氧化物歧化酶的生产菌株，有重要的经济价值和社会价值。

Description

表达嗜热子囊菌光孢变种基因Mn-sod的毕赤酵母工程菌株
(一)技术领域：
本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)热稳定锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因Mn-sod的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris MS18。
(二)背景技术：
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)(EC.1.15.1.1)系一类金属酶，广泛存在于生物体中。它能够催化超氧阴离子发生歧化反应，从而清除超氧阴离子。在生物体防御氧化损伤的过程中，发挥着重要作用。目前SOD主要用于炎症、肿瘤辐照病人、自身免疫系统疾病、某些心血管疾病等方面的治疗。据报道SOD在防衰老、防细胞损伤以及防止癌发生方面也起到了重要的作用。在治疗肾细胞癌方面，Mn-SOD可以有效的降低癌瘤带来的损害，在治愈胰腺癌方面，Mn-SOD的超表达可以抑制胰腺癌的发展。Mn-SOD在抑制视网膜病及糖尿病心肌病致病机理方面发挥着重要作用。
嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)是一种分布广泛、生长上限温度较高的真菌。它能够产生热稳定的具有重要价值的SOD酶，但是野生菌用于大规模的工业生产SOD酶，还存在一些尚未解决的问题。如嗜热菌培养条件比较苛刻，嗜热酶的大规模发酵生产需要特殊设备，而且产酶效率低，从而造成产品成本增加，因此限制了它的应用。解决这一问题的有效途径是应用分子生物学手段，将热稳定SOD酶基因导入中温型微生物酵母中高效表达，利用酵母生长快、易于培养等特点，使SOD酶基因在常温和短时间内快速、大量表达，期望达到降低能耗和提高经济效益的目的。
(三)发明内容：
本发明从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)获得SOD酶基因的全长cDNA，命名为Mn-sod(EF428323)，并将Mn-sod构建到表达载体pPIC9K上，转化毕赤酵母GS115菌株，获得毕赤酵母工程菌株MS18。
利用获得的嗜热子囊菌光孢变种Mn-sod基因，构建重组表达质粒载体pPIC9K/Mn-sod，利用电转仪提供的优化参数进行电击转化Pichia pastorisGS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行诱导表达。获得一重组子MS18。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在30℃ 250rpm/min摇床培养7d后，酶表达量为0.92mg/mL，酶活为2324U/mL，分子量为86.0kDa，酶在50，60℃下活性稳定，80℃保温40min后酶活仍剩余50％，在90℃处理60min仍具有20％的活性。
该工程菌株MS18能够高效表达(0.92mg/mL，2324U/mL)嗜热子囊菌光孢变种Mn-SOD酶基因Mn-sod，分泌的Mn-SOD酶具高的热稳定性，用于热稳定Mn-SOD酶的生产菌株，有重要的经济价值和社会价值。
(四)附图说明：
图1表达嗜热子囊菌光孢变种基因Mn-sod的毕赤酵母工程菌株程序图
Figure A200810140293D00041
是嗜热子囊菌光孢变种的分离鉴定
Figure A200810140293D00042
是嗜热子囊菌光孢变种Mn-SOD酶基因Mn-sod的克隆
Figure A200810140293D00043
是基因Mn-sod表达载体的构建
Figure A200810140293D00044
是表达基因Mn-sod的酵母工程菌株的构建及筛选
Figure A200810140293D00045
是毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测
是表达嗜热子囊菌光孢变种基因Mn-sod毕赤酵母工程菌株MS18的保藏
图2Mn-sod基因PCR产物电泳图谱
泳道1：Marker-DL2000
泳道2：全长cDNA(分子量878bp)
图3Mn-SOD酶的SDS-PAGE分析
a)泳道M：低分子量蛋白标准
泳道1：对照
泳道2-7：酵母工程菌Pichia pastoris MS18的诱导2-7天
b)泳道M：低分子量蛋白标准
泳道1：纯化的重组Mn-SOD酶(分子量21.7kDa)
(五)具体实施方式
1、嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)的分离鉴定
(1)标本采集：从堆肥中采集，地点北京。
(2)分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。
(3)鉴定：参考Cooney and Emerson(1964)文献。
2、嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)Mn-SOD酶基因Mn-sod的克隆
(1)嗜热子囊菌光孢变种总RNA的提取:参照Trizol试剂盒说明。
(2)cDNA第一条链的合成：按照Promega公司的Reverse TranscriptionReaction试剂盒说明书进行，以Oligo(dT)20为引物合成cDNA第一链。反应条件为：42℃ 1小时；85℃ 10分钟。
(3)PCR反应：上游引物5’-ATGGCCGCTTCCCTCGTT-3’，下游引物5’-TTAAGCGGCGAAGCGCTT-3’。聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为：
10X反应缓冲液     2.5μl
25mM MgCl2        2μl
10mM dNTP             2μl
上游引物(10μM)        1μl
下游引物(10μM)        1μl
模板cDNA              2μl
Taq DNA聚合酶         0.5μl
灭菌双蒸水            14μl
总体积                25μl
PCR反应条件为：95℃预变性4min；94℃变性1min；59℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min。
(4)基因克隆：取2μl PCR产物与pGEM-T easy载体进行连接，操作步骤按照Promega公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
(5)质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。
(6)序列测定：DNA双脱氧法测定核苷酸序列，序列测定由上海生物工程有限公司完成，序列引物为M13启动子引物。嗜热子囊菌光孢变种Mn-sod全长的cDNA序列为878bp，它的最大开放阅读框ORF有696bp，编码231个氨基酸。
3、基因Mn-sod表达载体的构建
(1)根据分离出的Mn-sod基因的核苷酸序列设计表达引物，在引物的5’端分别引入EcoR I和Not I酶切位点：
上游引物：5’-CCGAATTCAAGGCGACTCTCCCTGAC-3’(EcoR I)
下游引物：5’-GGGCGGCCGCTTAAGCGGCGAAGCGCTT-3’(Not I)
(2)嗜热子囊菌光孢变种总RNA的提取：利用Trizol试剂提取。
(3)反转录合成cDNA第一条链：取2μg总RNA，加入5×反应缓冲液4μL，10mM dNTP 2μL，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/μL)0.5μL，引物oligodT(1μg/μL)1μL，反转录酶(10u/μL)2μL，42℃反应60min，然后85℃10min终止反应，稀释至200μL。
(4)PCR反应(25μL)：cDNA2μL，10×Buffer 2.5μL，10mmol/L dNTP2μL，25mmo l/LMgCl2 2μL，上、下游引物各2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL)，ddH2O12μL。反应条件为94℃ 3min预变性；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
(5)基因克隆：取2μL PCR产物与pGEM-T载体进行连接，获得重组质粒pGEMT/1n操作步骤按Promega公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α，在涂有X-gal和IPTG的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
(6)质粒DNA提取：碱法提取质粒DNA。
(7)用SnaB I和Avr II对重组质粒pGEMT/Mn-sod产物进行双酶切，同时用EcoR I和Not I双酶切酵母表达质粒pPIC9K，DNA胶回收试剂盒回收纯化Mn-sod基因及载体pPIC9K片断。然后进行体外连接，获得重组质粒pPIC9K/Mn-sod，重组质粒转化大肠杆菌JM109，在含Amp的LB转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定，测序确认重组质粒的读码框正确。
4、表达嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)Mn-SOD酶基因Mn-sod的酵母工程菌株的构建及筛选
(1)重组表达质粒的线性化：将重组表达质粒pPIC9K/Mn-sod用限制性内切酶Sac I线性化。
(2)转化：电击转化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，转化方法参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。
(3)筛选：用灭菌牙签挑取转化子对应点种在MM和MD平板上，30℃培养2-4d，挑取在MD/MM平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于250μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mLG418的YPD平板上筛选多拷贝转化子。
5、毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测
(1)将阳性转化子接种于含25mL BMGY培养基中，30℃ 250rpm/min摇床培养24h(OD600达2-6)，离心收集菌体，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD600值为1.0，30℃ 250rpm/min继续培养，每24h补充甲醇至终浓度为1％，每24h取样，室温10,000g离心5min，取上清进行SDS-PAGE分析。
(2)阳性转化子酶活性检测与工程菌确定：酶的活性测定根据Stewart和Bewley(1980)的方法，利用SOD可抑制氮蓝四唑(NBT)的光化还原的原理进行进行酶活力的确定。蛋白质含量测定采用Bradford法。阳性转化子中酶活性最高(2324/ml发酵液)的确定为酵母工程菌株MS18。
(3)重组Mn-SOD酶的最适反应温度、pH及热稳定性：工程菌株MS18经诱导表达的重组Mn-SOD酶经过DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析，获得电泳均一的纯化蛋白，用纯化的重组SOD酶测定其性质。在不同温度和pH条件下分别测定重组SOD酶的酶活力，将最高的酶活力定义为100％，分别计算不同温度条件下SOD酶的相对酶活性；将重组SOD酶在不同的温度下保温60min，检测剩余酶活力。
6、嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)Mn-SOD酶基因Mn-sod的毕赤酵母工程菌株MS18的保藏
表达嗜热子囊菌光孢变种Mn-SOD酶基因Mn-sod的毕赤酵母工程菌株MS18的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2008年9月15日；酵母工程菌株编号为：CGMCC No.2665；毕赤酵母工程菌株的分类命名为：巴氏毕赤酵母Pichia pastoris。
嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)Mn-sod序列图
核苷酸序列：
1   GTCCCGGATC AGTCCTCCGG TCTCGATCGC TGTCCATTCC CCCCAGTCTA AGACAGTCGA 60
61  GCAAGCCGTT TCCCATCCAC CATGGCCGCT TCCCTCGTTC ATCCCTCTGC CGCCCGCGCC 120
121 GCCCTGCGTG CCGGAGCTTC GGCTACTCGT ACTGCTGGAC TYGCCGGCAC CAGCTTCGTC 180
181 CGCGGCAAGG CGACTCTCCC TGACCTGGCC TACGACTACG GCGCCCTCGA GCCCGCCATC 220
241 TCGGGCAAGA TCATGGAGCT GCACCACAAG AACCACCACA ACACCTACGT GACCAACTAC 300
301 AACGCCGCGC TCGAGAAGCT GCACGAGGCG CAGGCCAAGA ACGACGTGGC GGCCCAGATC 360
361 GCCCTGAAAC CCGCCATCAA CTTCAACGGC GGCGGGCACA TCAACCACAC CCTCTTCTGG 420
421 GAGAACCTGG CGCCCAAGAG CGCCGGCGGC GGTGACCCCC CCTCGGGCGC GCTGGCCAAG 480
481 GCTATCGACG ACGCCTACGG CGGCTACGAC AAGTTCAAGG AGAAGTTCAA CGCCGCCCTG 540
541 GCCGGCATCC AGGGCAGCGG GTGGGCGTGG CTCGTCAAGG ACAAGGAGAC GGGCCAGATC 600
601 AGCATCCGGA CTTACGCGAA CAGGACCCTG TCGTGGGGCA GTACATTCCC CTGCTGGGT  660
661 ATCGATGCCT GGGAGCACGC ATACTACCTC CAGTACCAGA ACCGCAAGGC CGAGTACTTC 720
721 AAGGCCGTCT GGGAGGTCGT CAACTGGAAG GCCGCTGAGA AGCGCTTCGC CGCTTAAACG 780
781 GCCTTTGGCC TAGGATTTTA TGTATTGTAT GCTGTCTATC TCTAGGATAG TATCTAATCG 840
841 GGAATCTACT GAATGATTCA AGCTAAAAAA AAAAAAAA
氨基酸序列：
1   MAASLVHPSA ARAALRAGAS ATRTAGLAGT SFVRGKATLP DLAYDYGALE PAISGKIMEL 60
61  HHKNHHNTYV TNYNAALEKL HEAQAKNDVA AQIALKPAIN FNGGGHINHT LFWENLAPKS 120
121 AGGGDPPSGA LAKAIDDAYG GYDKFKEKFN AALAGIQGSG WAWLVKCKET GQISIRTCAN 180
181 QDPVVGQYIP LLGIDAWEHA YYLQYQNRKA EYFKAVWEVV NWKAAEKRFA A

Claims (1)

1.一种表达嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascusaur antiacus var.levisporus)热稳定锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因Mn-sod的毕赤酵母工程菌株Pichiapastoris MS18，其特征在于，通过RT-PCR方法从嗜热子囊菌光孢变种获得热稳定锰超氧化物歧化酶基因Mn-sod，将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，获得表达重组质粒pPIC9K/Mn-sod，转化毕赤酵母GS115，从中筛选出表达嗜热子囊菌光孢变种热稳定锰超氧化物歧化酶基因Mn-sod的毕赤酵母工程菌株MS18，该菌株可作为热稳定锰超氧化物歧化酶的生产菌株。
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