CN102787108A - 来源于里氏木霉的一个蛋白质及其基因的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了里氏木霉的一个蛋白质及其基因的用途。该用途为Trfog1在调控里氏木霉（Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量中的应用；所述Trfog1是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。本发明为构建胞外蛋白分泌量增加的里氏木霉宿主菌和工程菌提供了技术基础。

Description

来源于里氏木霉的一个蛋白质及其基因的用途

技术领域

本发明涉及来源于里氏木霉的一个蛋白质及其基因的用途，特别涉及来源于里氏木霉的Trfog1在调控里氏木霉的胞外蛋白的分泌量中的应用。

背景技术

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei)是一种嗜温的腐生真菌，被广泛应用于生产食品、饲料、纺织、制浆和造纸等行业用纤维素和半纤维素酶。目前已成为研究纤维素降解的重要模式菌株。里氏木霉是FDA认证的安全生产菌株，具有强大的蛋白分泌能力，并且具有与高等哺乳动物相似的糖基化系统，因此里氏木霉也是一种非常理想的重组蛋白表达宿主。为了进一步提高里氏木霉的纤维素酶半纤维素酶产量，同时提高其表达异源蛋白的分泌量，近年来，如何提高里氏木霉的胞外蛋白合成分泌量成为研究热点。

目前研究表明里氏木霉纤维素酶基因的表达调控是在转录水平进行的，受到转录激活因子的促进和碳代谢抑制蛋白的阻遏，在以往的研究中，人们采用基因克隆、酵母杂交等传统方法分离、仅仅鉴定了3个转录激活因子（Ace2、Hap2/3/5、Xyr1）和2个阻遏蛋白（CreⅠ、AceⅠ）。同时也有研究表明阻遏蛋白的缺失可以显著提高里氏木霉外分泌蛋白的表达水平。基于里氏木霉纤维素酶表达调控的复杂性，在其转录调控过程中应该还有许多关键的调控因子仍然没被发现。通过对一些具有转录因子典型结构的蛋白进行功能分析，研究其在纤维素酶半纤维素酶生物合成中的作用有望从机制本身进一步提高里氏木霉合成和分泌蛋白的能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供来源于里氏木霉的Trfog1蛋白的用途。

本发明所提供的一个用途是Trfog1在调控里氏木霉（Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量中的应用；所述Trfog1是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。

其中，序列表中序列2由363个氨基酸残基组成。Trfog1的理论分子量为40.8kDa，等电点为9.231。

所述胞外蛋白包括里氏木霉（Trichoderma reesei)的内源蛋白，如纤维素酶和/或半纤维素酶，还可包括导入里氏木霉（Trichoderma reesei)的外源蛋白。

其中，在不包含外源蛋白的里氏木霉菌株中，所述调控里氏木霉（Trichodermareesei)胞外蛋白分泌量可体现为调控纤维素酶和/或半纤维素酶的分泌量。

本申请的实验证明，将里氏木霉出发菌株中的Trfog1基因敲除后得到了胞外蛋白分泌量明显增加，特别是纤维素酶分泌量明显增加的Trfog1基因敲除株，说明Trfog1是与里氏木霉（Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量相关的一个蛋白。

本发明还提供了构建Trfog1基因敲除株（一种重组里氏木霉菌）的具体方法。

本发明所提供的制备重组里氏木霉菌的方法，包括敲除里氏木霉（Trichodermareesei)中的Trfog1基因得到所述重组里氏木霉菌的步骤，所述Trfog1是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。

所述Trfog1基因可为基因组基因也可为cDNA基因，序列表中的序列1为Trfog1的cDNA基因，共有1092bp；序列表中序列5的第2501-3660为Trfog1的基因组基因，共有1160bp。

所述方法中可通过同源重组、随机插入突变或RNAi敲除里氏木霉（Trichodermareesei)中的Trfog1基因。

其中，用于发生同源重组的组件（敲除组件）由Trfog1基因上下游同源臂及在所述Trfog1基因上下游同源臂之间插入的便于筛选转化子的筛选标记基因组成。

本发明序列表中的序列5给出了里氏木霉Trfog1基因及其上下游各2500bp的基因组DNA序列，序列表中的序列5的第1-2500位为所述Trfog1基因上游2500bp序列，序列表中的序列5的第3601-6160位为所述Trfog1基因下游2500bp序列，所述Trfog1基因及其上下游序列可见如下网站：http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/dispGeneModel?db=Trire2&tid=108357。

其中，所述同源重组中采用的上游同源臂可选自Trfog1基因及其上游序列，长度至少1000bp，所述同源重组中采用的下游同源臂可选自Trfog1基因及其下游序列，长度至少1000bp。在本发明的实施例中，上游同源臂选自Trfog1基因上游序列，下游同源臂选自Trfog1基因下游序列。所述同源臂具体可为序列表中序列4的第10-1405位（序列5的第787-2182位），所述同源重组中采用的下游同源臂的核苷酸序列可为序列表中序列4的第3336-4920位（序列5的第4077-5661位）。

在本发明的实施例中，所述同源重组通过将序列表中序列4所示的DNA片段（敲除组件）导入所述里氏木霉（Trichoderma reesei)实现。

序列表中的序列4的第10-1405位为Trfog1的上游同源臂，第3336-4920位为Trfog1的下游同源臂，第1406-3342位为pyr4表达盒。其中，pyr4为筛选标记基因，是营养选择性标记基因乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶的基因。

由上述任一种方法得到的重组里氏木霉菌（Trfog1基因敲除株）也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的另一个用途是用于敲除里氏木霉（Trichoderma reesei)的Trfog1基因的物质在提高里氏木霉（Trichoderma reesei)中胞外蛋白分泌量中的应用，所述Trfog1是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。

其中，所述用于敲除里氏木霉（Trichoderma reesef)的Trfog1基因的物质可为下述任一种生物材料：

1）用于敲除里氏木霉（Trichoderma reesei)的Trfog1基因的DNA片段，所述DNA片段含有Trfog1基因上游同源臂和Trfog1基因下游同源臂，所述Trfog1基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列4的第10-1405位，所述Trfog1基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列4的第3336-4920位；所述DNA片段具体可为序列表中序列4所示的双链DNA。

2）含有步骤1）的DNA片段的重组载体；该重组载体用于保存敲除组件。

3）含有步骤1）的DNA片段的重组细胞，该重组细胞用于保存敲除组件。

其中，步骤3）中的重组细胞可为非人的动物细胞、微生物细胞或植物细胞。

本发明为构建胞外蛋白分泌量增加的里氏木霉宿主菌和工程菌提供了技术基础。

附图说明

图1为Trfog1敲除菌株的PCR鉴定图谱。

图2为Trfog1敲除菌株和出发菌株发酵上清液的SDS-PAGE分析

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂，质粒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所有引物均由上海生工合成。

菌株：

里氏木霉菌株TU6△tku70为尿嘧啶营养缺陷菌株，由奥地利维也纳大学MonikaSchmoll实验室馈赠，TU6△tku70即为如下文献中的KU70.4转化子（将红褐肉座菌(Hypocrea jecorina,即Trichoderma reesei的有性型)TU-6菌株中的tku70缺失得到的转化子）：Gene targeting in a nonhomologous end joining deficient Hypocreajecorina.Zhang Guangtaoa,et al.Journal of Biotechnology 139(2009)146–151。公众可从中国科学院微生物研究所获得该菌株。

培养基、试剂

1)土豆培养基PDA（100ml）：20g去皮马铃薯，切碎，加入90mL水，煮沸30min，双层纱布过滤，加入2g葡萄糖和1.8g琼脂粉，用水定容至100mL,115℃高压蒸气灭菌。

2)基本培养基（Minimal medium，MM）组成：溶剂为水，每升培养基中溶质及其质量为：0.05g（NH₄）₂SO₄，0.15g KH₂PO₄，0.006g MgSO₄，0.006g CaCl₂，0.00005g FeSO₄·7H₂O，0.000016g MnSO₄·H₂O，0.000014g ZnSO₄·7H₂O，0.00002g CoCl₂。

3)发酵培养基：在MM培养基中加入下列碳源（如1%纤维素、3%乳糖、1%木聚糖、2%葡萄糖、2%甘油，终浓度）之一，pH 5.2±0.1。

A1、含1.0M 山梨醇但不含尿苷的MM培养基平板：在MM中加入山梨醇至终浓度为1.0M，再加入琼脂制成固体培养基。

A2、MM+0.1%Triton X100的平板：在含有2%葡萄糖的MM中加入Triton X100至体积终浓度为0.1%，再加入琼脂制成固体培养基。

A3、含2%葡萄糖的MM液体培养基：在MM中加入葡萄糖至终浓度为2%（质量百分浓度）得到的液体培养基。

A4、MM+1%微晶纤维素液体培养基：在MM中加入微晶纤维素至终浓度为1%（质量百分浓度）得到的液体培养基。

4）LB培养基：溶剂是水，每升培养基中溶质及其质量百分含量为：1%蛋白胨，1%氯化钠，0.5%酵母提取物。

5）里氏木霉染色体DNA提取缓冲液：

6）原生质体制备及转化相关试剂

0.2M磷酸缓冲液pH7.4(每100mL)

0.2M Na₂HPO₄            81mL

0.2M NaH₂PO₄            19mL

1.2mol/L的MgSO₄溶液

MgSO₄                   1.2M

磷酸缓冲液pH7.4         10mM

0.6M的山梨醇溶液

山梨醇                  0.6M

Tris.Cl pH 7.0          0.01M

1.0M的山梨醇溶液

山梨醇                  1.0M

CaCl₂                   0.01M

Tris.Cl pH 7.5          0.01M

PEG溶液

PEG4000                 50%

CaCl₂                   0.05M

Tris.Cl pH7.5           0.01M

实施例1、敲除里氏木霉Trfog1基因构建胞外蛋白分泌量增加的重组里氏木霉菌

本实施例中，通过将序列表中序列4所示的DNA片段（敲除组件）导入里氏木霉出发菌株-里氏木霉菌株TU6△tku70中通过同源重组将Trfog1基因敲除得到了胞外蛋白分泌量明显增加，特别是纤维素酶分泌量明显增加的Trfog1基因敲除株（重组里氏木霉菌）。

1、Trfog1基因(含两侧同源臂)及pyr4基因表达盒的PCR扩增

以里氏木霉（Trichoderma reesei)菌株QM9414(ATCC 26921)基因组DNA为模板，引物Fog1-F,Fog1-R扩增包含Trfogl两侧同源臂的Trfog1基因片段（上游同源臂1395bp、Trfog1基因1160bp、下游同源臂1589bp）。扩增程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延2min，30个循环；最后72℃扩展延伸10min。将所得PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收目的条带，连接至pEASY-Blunt simple载体，形成重组载体pFog1,转化大肠杆菌DH5α。挑取转化子进行鉴定并抽提质粒pFog1，进行测序，结果表明Fog1-F和Fog1-R得到的PCR产物的序列如序列表中序列3所示，序列3的第10-1723位为Trfog1基因上游同源臂，第1724-2883位为Trfog1的基因组基因，第2884-4884位为Trfog1基因下游同源臂，第3294-3299位为SalI的识别位点GTCGAC，第1406-1411位为EcoRI的识别位点GAATTC。Trfog1的cDNA基因如序列表中的序列1所示，由1092bp组成，编码序列表中序列2的蛋白质。序列表中的序列2由363个氨基酸残基组成。

利用引物F1pyr-F,F1pyr-R以里氏木霉（Trichoderma reesei)菌株QM9414(ATCC26921)基因组DNA为模板扩增营养选择性标记基因乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶的pyr4基因表达盒片段，扩增程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延1min，30个循环；最后72℃扩展延伸10min。将所得PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收目的条带，连接至pEASY-Blunt simple载体，形成重组载体pF1pyr4，转化大肠杆菌DH5α。挑取转化子进行鉴定并抽提质粒pF1pyr4，进行测序，结果表明F1pyr-F和F1pyr-R得到的PCR产物的序列如序列表中序列4的第1406-3335位所示。

所用到的引物序列如下：

Fog1-F：CCGCTCGAGGACTTTGCCTGTGCTCCATGATCAG

Fog1-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTGTATAGTTAGTTTCTTGCCTCTC

F1pyr-F:CCGGAATTCCA ACTGCATCCA A ACCATCCT

F1pyr-R:ACGCGTCGACCTCACCCCCAAAGTCGCAATAT

2、里氏木霉Trfogl敲除载体的构建及敲除组件的获得

分别用限制性内切酶SalI和EcoRI消化质粒pFog1和pF1pyr4，回收pFog1消化产生的5.9kb的片段和pF1pyr4消化产生的1.9kb的片段，将这两个片段进行连接，转化大肠杆菌，挑取转化子进行测序鉴定，即得到Trfogl基因的敲除载体pBF1pyr4。

以质粒pBF1pyr4为模板，引物Fog1-F，Fog1-R进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延2min，30个循环；最后72℃扩展延伸10min。PCR扩增所得的产物即为包含Trfogl基因上下游同源臂以及pyr4基因表达框的敲除组件片段，其序列如序列表中的序列4，序列4的第1-34位为Fog1-F，第4896-4935位为Fog1-R的反向互补序列，第10-1405位为Trfogl的上游同源臂，第3336-4920位为Trfogl的下游同源臂，第1406-3335位为pyr4表达盒。

3、里氏木霉菌株Tu6△tku70的原生质体制备

A．取新鲜培养的斜面或平板（培养基是PDA）上的里氏木霉菌株Tu6△tku70孢子，用适量无菌水洗涤孢子制成孢子悬液，200目筛子过滤除去残余的菌丝。将过滤的孢子悬液接种至装有100mL MM培养基的500mL三角瓶中，28℃培养13h-14h，至菌丝伸展。

B．将培养液经200目筛子过滤，收集菌体，无菌水洗涤2-3次，最后用1.2M的MgSO4溶液洗涤一次，让溶液自然流尽。

C．将筛子上的菌体冲洗到装有15mL裂解液的三角瓶中（裂解液是含有150mg的裂解酶和15mg纤维素酶的1.2M MgSO₄溶液），30℃反应1.5h，显微镜下观察原生质体产生的情况，1h后每隔10min取样观察一次。

D．当原生质体大量产生并且仍有大量菌丝存在时，加等体积0.6M的山梨醇溶液终止反应，200目筛子过滤除去残余的菌丝，室温3000rpm离心10min收集原生质体沉淀。

E．沿着沉淀一侧倒去上清，原生质体沉淀用1.0M山梨醇溶液重悬，室温3000rpm离心10min。

F．重复步骤E，弃上清将原生质体悬浮于200μL 1.0M 山梨醇溶液中，得到里氏木霉菌株Tu6△tku70的原生质体，血球板计数器观察并计数。

4、Trfog1敲除组件转化里氏木霉菌株Tu6△tku70原生质体

A．将步骤2用引物Fog1-F和Fog1-R进行PCR扩增获得的敲除组件（其序列如序列表中的序列4）进行回收并用2倍体积的无水乙醇及1/10体积的3.0M醋酸钠(pH5.2)过夜沉淀，用70%乙醇洗涤2次，用灭菌ddH₂O溶解，使敲除组件的浓度达每微升微克级。

B．将一定量（体积不超过20μL）制备好的敲除组件加入到步骤3）制备的里氏木霉菌株Tu6△tku70原生质体中，轻轻混匀，再往其中加入50μLPEG4000，再次混匀，冰上放置30min；设对照，对照用等体积的无菌水代替DNA。

C．再往上述管中各加入1mL PEG4000，混匀，室温放置20min。

D．加入1mL 1.0M山梨醇溶液，混匀后分四次与四支4ml融化的MM培养基（58℃以下）混和，立即铺于含1.0M 山梨醇但不含尿苷的MM培养基平板上，30℃培养4~7天。在不含尿苷的MM培养基中，只有转入pyr4的菌株才能生长。

5、转化子的筛选及分子鉴定

待转化子长出后，将其转移至PDA平板上，28℃培养3-5天有孢子生成后，将平板上的孢子用无菌水将孢子洗下来制备成孢子悬液，做梯度稀释后，将其涂布在MM+0.1%Triton X100的平板上分单孢。待菌丝长出后，抽提基因组DNA，PCR鉴定阳性转化子，所用鉴定引物如下：

F1Vup-F:ACTGCCGATTAGAGTGGAGTGGTT

F1Vup-R:GGAAGGTTCATATATGGTCCTGAC

F1down-F:GCGAGGGAGTTGCTTTAATGTCGG

F1down-R:CACCCATGTCGAACCGGTGAGAGC。

序列表中的序列5是Trfog1及其上下游2500bp的片段。F1Vup-F对应于序列5的第567-590位，F1down-R对应于序列5的5703位。F1down-F对应于序列4的第3178-3201位，F1Vup-R对应于序列4的1532-1555位。序列5的第787位对应于序列4的第10位，为Trfog1的上游同源臂第1位；序列5的第5661位对应于序列4的4920位，为Trfog1的下游同源臂的最后1位。

其中，F1Vup-F，F1down-R引物分别结合于敲除组件中同源臂的外侧序列，F1Vup-R，F1down-F分别与pyr4表达盒的上下游结合，如果trfog1敲除组件定点整合在trfog1位点，则F1Vup-F，F1Vup-R引物对理论上应该扩增出1769bp的片段，F1down-F，F1down-R引物对应该扩增出1812bp的片段。而原始菌株里氏木霉菌株Tu6△tku70不会扩增出相关的条带。用F1Vup-F和F1Vup-R扩增出1769bp的PCR产物，且用F1down-F和F1down-R扩增出1812bp的PCR产物的菌株即为Trfog1敲除菌株,其PCR鉴定结果如图1。图1中，泳道1：里氏木霉菌株Tu6△tku70DNA为模板，引物F1Vup-F，F1Vup-R的PCR扩增产物；泳道2：Trfog1敲除菌株DNA为模板，引物F1Vup-F，F1Vup-R的PCR扩增产物；泳道3：里氏木霉菌株Tu6△tku70DNA为模板，引物F1down-F，F1down-R的PCR扩增产物；泳道4：Trfog1敲除菌株DNA为模板，引物F1down-F，F1down-R的PCR扩增产物。

6、对照株、敲除菌株发酵液蛋白表达分泌差异分析

得到遗传稳定的转化株后，将对照株里氏木霉菌株Tu6△tku70与Trfogl敲除菌株转至PDA平板上产孢，然后用无菌水洗涤孢子制备成浓度为10⁸个/mL的孢子悬液，取1mL孢子悬液接种于250mL三角瓶中的50mL含2%葡萄糖的MM液体培养基中，28℃，200rpm预培养48h，四层纱布过滤菌体，分别称取1.8克菌体于50mL MM+1%微晶纤维素液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养168h，期间，从48h开始，每隔24h取发酵上清液（胞外发酵液），进行SDS-PAGE电泳分析。里氏木霉菌株Tu6△tku70和Trfog1敲除菌株的培养条件及接种量完全相同。每次取样的里氏木霉菌株Tu6△tku70和Trfogl敲除菌株的发酵上清液体积相同。每次取样，里氏木霉菌株Tu6△tku70和Trfogl敲除菌株各取三瓶。结果表明，发酵48h，72h，96h，120h，144h，168h，Trfogl敲除菌株均比里氏木霉菌株Tu6△tku70胞外蛋白分泌量明显提高（图2）。图2中，Tu6ku70为里氏木霉菌株Tu6△tku70，△Trfog1为rfogl敲除菌株。

并对120h发酵上清液的总蛋白浓度和滤纸酶活进行了测定。具体测定方法如下：

1）考马斯亮兰法（Bradford法）测发酵液的蛋白浓度

a.Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m 195%乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml。

b.标准曲线蛋白质样本的准备：用牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml的标准蛋白质溶液，并用去离子水稀释成一系列梯度的蛋白质溶液。

c.按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。

d.每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度，并绘制标准曲线。

e.用同样的反应体系对120h的发酵液上清进行反应，并根据标准曲线计算出发酵液上清的总蛋白浓度。

结果表明Trfog1敲除菌株的120h发酵上清液的总蛋白浓度为4.42±0.29mg/ml，明显高于其出发株里氏木霉菌株Tu6△tku70的总蛋白浓度，里氏木霉菌株Tu6△tku70的120h发酵上清液的总蛋白浓度为3.14±0.23mg/ml。

2）滤纸酶酶活测定

采用Whatman 1号滤纸，参照IUPAC标准方法进行测定。取发酵上清液100μl，加入到10mL含0.05%苯甲酸钠的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液（0.05M、pH 4.8）中，得到稀释101倍的酶液。将Whatman 1号滤纸制成6cm长、1cm宽的形状（50mg左右），折成4折，成M型。将滤纸条置于试管底部，加入含0.05%苯甲酸钠的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液（0.05M、pH 4.8）1.5mL，50℃水浴平衡后，加入已经稀释的酶液0.5mL（空白先不加），混合均匀，使管内溶液浸没滤纸。50℃水浴保温1小时，迅速冷却。向各试管中加入3mL DNS试剂，再向空白中加酶液0.5mL，混合均匀。在沸水中煮10min，迅速冷却，用蒸馏水定容至25mL。以0号管为参比，测定540nm的吸光度。1mL液体酶，在50℃、pH 4.8的条件下，每分钟水解滤纸底物，产生1umol还原糖（以葡萄糖计）所需要的酶量定义为一个国际单位滤纸酶活（FPU/ml）。

结果表明Trfog1敲除菌株的120h发酵上清液的纤维素酶滤纸酶活为0.41±0.03FPU/ml，明显高于其出发株里氏木霉菌株Tu6△tku70的纤维素酶滤纸酶活（里氏木霉菌株Tu6△tku70的120h发酵上清液的纤维素酶滤纸酶活为0.29±0.02FPU/ml）。

Claims (10)

1.Trfog1在调控里氏木霉（Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量中的应用；

所述Trfog1是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控里氏木霉（Trichodermareesei)胞外蛋白分泌量为调控纤维素酶分泌量。

3.制备重组里氏木霉菌的方法，包括敲除里氏木霉（Trichoderma reesei)中的Trfog1基因得到所述重组里氏木霉菌的步骤，所述Trfog1是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法中通过同源重组、随机插入突变或RNAi敲除里氏木霉（Trichoderma reesei)中的Trfog1基因。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述同源重组中采用的上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列4的第10-1405位，所述同源重组中采用的下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列4的第3336-4920位。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述同源重组通过将序列表中序列4所示的DNA片段导入所述里氏木霉（Trichoderma reesei)实现。

7.由权利要求3-6中任一所述方法得到的重组里氏木霉菌。

8.用于敲除里氏木霉（Trichoderma reesei)的Trfog1基因的物质在提高里氏木霉（Trichoderma reesei)中胞外蛋白分泌量中的应用，所述Trfog1是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述用于敲除里氏木霉（Trichodermareesei)的Trfog1基因的物质为权利要求10所述的生物材料。

10.下述任一种生物材料：

1）用于敲除里氏木霉（Trichoderma reesei)的Trfog1基因的DNA片段，含有Trfog1基因上游同源臂和Trfog1基因下游同源臂，所述Trfog1基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列4的第10-1405位，所述Trfog1基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列4的第3336-4920位；所述DNA片段具体为序列表中序列4所示的双链DNA；

2）含有步骤1）的DNA片段的重组载体；

3）含有步骤1）的DNA片段的重组细胞。

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