CN103865814B - 一种灵芝多糖高产工程菌株Rmust及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种灵芝多糖高产工程菌株Rmust及其构建方法，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC？NO.8258，本发明提供的灵芝工程菌，是通过选用灵芝强启动子P-<i>gpd</i>过表达编码PGM-葡萄糖磷酸变位酶（PGM）基因，得到高产灵芝多糖灵芝工程菌Rmust；通过摇瓶发酵实验表明，该菌在其细胞生长不受影响的情况下，转化子菌株产灵芝多糖的含量是野生型菌株（WT菌株）含量的提1.6倍，其中1g干菌丝体产灵芝多糖的量(mg/g)由145.9±1.65mg/g提高到236.95±1.28mg/g，因此，本高产菌株可以作为生产灵芝多糖的工程菌株，具有广泛的应用前景。

Description

一种灵芝多糖高产工程菌株Rmust及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程和代谢工程领域的，具体涉及一种通过基因工程对灵芝代谢途径中有关灵芝多糖合成的PGM（葡萄糖磷酸变位酶）基因过表达的方法，构建了一个灵芝多糖的高产工程菌株。

背景技术

灵芝(Ganodermalucidum)是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌。灵芝真菌在我国有20多种，包括赤芝，黄芝，紫芝，黑芝，薄盖灵芝，树舌等。我国应用灵芝作为药物已有两千多年的历史。灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效。由于其特殊的要用价值，灵芝的有效成分分析和药理学研究已经引起了国际上的广泛关注，尤其在日本，美国，韩国等国家。目前，灵芝的研究已经深入到了分子水平，一些专著相继出版，从不同的角度介绍了灵芝的生物学特性、栽培技术、药理学作用及临床应用等情况。

灵芝多糖是从灵芝中提取的一种新内源活性物质，其所含的化学成分能够显著提高吞噬细胞的吞噬能力，增强体液免疫和细胞免疫功能，还能提高红细胞中超氧化物歧化酶活性，对人体具有多种功能。

PGM（葡萄糖磷酸变位酶）基因是灵芝多糖合成途径中的一个较为关键的基因，它能使糖原分子的葡萄糖残基形成的葡萄糖-6-磷酸转变为葡萄糖-1-磷酸。葡萄糖-6-磷酸是糖酵解或糖原合成的主流中间代谢产物，在细胞中的代谢比较快，但是只有葡萄糖-1-磷酸才能够合成多糖，因此PGM对糖原的合成具有重要的作用。灵芝多糖的合成途径如下所示：

随着人们生活水平的提高，各种癌症等疾病的发生率也逐年递增。于是，人们对健康的关注也越来越来广泛。灵芝作为一种良好的中药对提高人体免疫力，抗氧化等方面具有重要的地位，尤其是在治疗癌症方面表现尤为突出。

虽然灵芝在治疗癌症方面具有不可替代的作用，尤其是野生灵芝效果更佳，但是野生灵芝资源有限。随着对灵芝的需求不断增加，如何提高灵芝的产量和增加灵芝的有效成分越来越引起人们的关注。液体深层发酵技术是进行快速工业化生产的重要手段。现在市售的灵芝多糖主要从灵芝子实体和液体深层发酵得到的菌丝体中获得。但是液体深层发酵方法投资大，干燥费用高，产品得率低。灵芝多糖在灵芝细胞中的含量低，分离纯化也较难，这限制了灵芝多糖的活性及作用机理的研究及广泛应用。近年来，基因工程与代谢工程迅速发展，成为了现代分子育种的重要手段。通过分子克隆和基因拼接等分子生物学方法来改造菌株的基因组，从而提高活性成分的含量越来越受学者们的青睐。如何从分子水平上提高灵芝多糖的产量是目前急需解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是解决野生型灵芝菌株自身产灵芝多糖较低的问题，提供一种灵芝多糖高产菌株，该菌株为高产灵芝多糖的灵芝（Ganodermalucidum）工程菌Rmust，已于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.8258。

本发明灵芝多糖高产工程菌株的构建方法如下：

以PMD19-T为起始载体并使用灵芝本身的强启动子P-gpd、终止子T-sdhB、cbx基因，cbx基因（具有carboxin抗性）是来自灵芝本身的琥珀酸脱氢酶基因进行定点突变后获得的抗性基因，其特点是在蘑菇类担子菌的转化体系中同源标记基因的转化效率更高，能够稳定遗传，抗性强；

1、将灵芝启动子P-gpd与终止子T-sdhB与PMD19-T连接，将灵芝cbx抗性基因插入到PstI酶切位点，从而构建成pJW-EXP载体；其具有灵芝的强启动子和终止子，并具有灵芝本身的抗性；

其中扩增灵芝强启动子P-gpd的引物序列为：

P-gpd-F：5’-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC-3’，

P-gpd-R：5’-GCTAGCGTTGAGAGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG-3’；

扩增灵芝sdhB基因终止子的引物序列为：

T-sdhB-F:5’-ATGAGCGGGTCAGAGAGT-3’，

T-sdhB-R:5’-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT-3’；

扩增灵芝cbx抗性基因的引物为：

cbx-F：5’-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3’，

cbx-R：5’-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3’；

2、灵芝多糖合成途径中关键酶PGM-葡萄糖磷酸变位酶（PGM）从灵芝基因组中克隆（所用的引物为PGM-Nhe-F和PGM-Sma-R），并插入到pJW-EXP载体中，得到pJW-EXP-tPGM载体；引物为PGM-Nhe-F：5’-GCTAGCATGTCGTACCAGGTCAAGGAG-3’和PGM-Sma-R：5’-GGGCCCCTACGTGATGACGGTCGGC-3’；PGM基因核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；

3、通过PEG介导原生质体融合的方法，将pJW-EXP-tPGM转化到野生型灵芝细胞中，以carboxin作为抗性来筛选灵芝转化子，在含有carboxin抗性的CYM平板上筛选出转化子；

4、将转化子在carboxin抗性的CYM平板中进行传代培养；

5、灵芝细胞的液体培养：

PDA培养基(g/L)：葡萄糖10，琼脂20，硫酸镁1.5，磷酸二氢钾3，维生素B10.05和制备好的土豆汁。

土豆汁的制备方法：将200克去皮新鲜土豆切成小块，加入去离子水1.0L煮沸30分钟，用八层纱布过滤，取滤液，用于PDA培养基的配制。

种子培养基(g/L)：葡萄糖35，蛋白胨5，酵母膏2.5，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5和维生素B10.05。

发酵培养基(g/L)：蛋白胨5、酵母膏5、磷酸二氢钾1.0、硫酸镁0.5、维生素B10.05，乳糖35，起始pH5.5。

CYM培养基(g/L)：葡萄糖20，麦芽糖10，酵母粉2，蛋白胨2，MgSO₄0.5，KH₂PO₄4.6，琼脂10。

斜面培养：接种菌丝于土豆汁-葡萄糖-琼脂（PDA）斜面中28℃培养5-7天。

一级种子培养：在250ml摇瓶中添加40ml培养基和10ml菌丝体悬液（从一支斜面中获得），并在30℃，120rpm下培养5天。

二级种子培养：在250ml摇瓶中加入45ml培养基和5ml一级种子培养液（大约500mgDW/L，一级培养物用玻璃珠打碎后接种），在30℃，120rpm下培养2天。

发酵培养：在250ml摇瓶中加入45ml发酵培养基和5ml二级种子发酵液（大约500~600mgDW/L，二级培养物用玻璃珠打碎后接种），在30℃，120rpm下培养。

6、多糖的分离提取：称取干细胞粉末100mg，加入1M氢氧化钠3ml，60℃水解1h后，用浓硫酸—苯酚法测定胞内多糖含量。

本发明的优点和技术效果：

通过药瓶发酵实验表明，该灵芝多糖高产工程菌株在其发酵性能不受影响的情况下（培养温度、培养基组成、接种量和培养方式相同的条件下），转化子菌株产灵芝多糖的含量是野生型菌株（WT菌株）的1.6倍，其中1g干菌丝体产灵芝多糖的量(mg/g)由145.9±1.65mg/g提高到236.95±1.28mg/g。在本发明构建的灵芝工程菌株中，多糖合成基因编码的葡萄糖磷酸变位酶得到了过量表达，灵芝多糖的产量得到提高，在同等情况下，使用本发明构建的工程菌株可以节约劳动力，缩短生产周期，降低成产成本。因此，本高产菌株可以作为生产灵芝多糖的工程菌株，适用于工业化生产，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明灵芝基因组；图中：M为核酸标准品，G为灵芝基因组；

图2为本发明pJW-EXP载体；

图3为本发明中pJW-EXP-tPGM载体；

图4为本发明中扩增PGM基因的电泳图；图中：M为DL2000的核酸标准品（Takara）；

图5为本发明中验证PGM阳性转化子的电泳图；图中：M为DL2000的核酸标准品（Takara），T为转PGM的阳性转化子，P为阳性对照，WT为野生型菌株，N为阴性对照。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：pJW-EXP载体的构建

1、灵芝基因组DNA的提取

称取约0.2g冻干野生型灵芝（CCGMC5.616）的菌丝体在液氮中研磨成粉末，将粉末转入1.5mL经65℃预热的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）抽取缓冲液中，65℃保温30min，然后在4℃下，10000g离心20min，取上清液加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)的混合物，轻轻摇匀30min以上，4℃下、10000g离心20min；将上清液移入1.5mL离心管后，加入2/3体积经-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，用玻璃棒捞出DNA后，用75%的乙醇洗涤2-3次，室温凉干后，溶于适量含20μg/mLRNase的TE，37℃消化RNA30min后即可到灵芝基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳结果显示：灵芝的基因组为单一条带，且大小在10000bp以上（见图1）。

2、灵芝强启动子的克隆

以灵芝基因组DNA为模板，用P-gpd-F、P-gpd-R作为引物进行PCR扩增，扩增得到灵芝的启动子P-gpd，引物序列如下：

P-gpd-F：5’-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC-3’，

P-gpd-R：5’-GCTAGCGTTGAGAGGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG-3’；

PCR条件如下：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃90s，72℃10min。

3、启动子P-gpd与PMD19-T连接

将克隆后的启动子P-gpd进行胶回收，将回收产物与PMD19-T用T4连接酶在16℃进行连接，得到PMD19-T-P中间载体；

4、灵芝终止子的克隆

以灵芝基因组DNA为模板，用引物T-sdhB-F：5’-ATGAGCGGGTCAGAGAGT-3’和T-sdhB-R：5’-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT-3’进行扩增，得到440bp的序列；PCR条件为：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，72℃10min；

5、终止子T-sdhB与PMD19-T-P连接

将克隆后的终止子T-sdhB胶回收，把PMD19-T-P中间载体用SacⅠ单酶切，PCR回收酶切产物，再用T4聚合酶补平酶切位点，然后再用T4连接酶在16℃进行平末端连接，得到PMD19-T-P-T中间载体；

6、cbx基因的克隆

以灵芝基因组DNA为模板，用引物cbx-F：5’-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3’和cbx-R：5’-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3’进行PCR得到灵芝的sdhB基因；PCR条件为：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃90s，72℃10min；再设计一对定点突变引物sdhB-MR：5'-GAAGATCGTGAGGCAGCGGTATAGGC-3'(其中A为突变位点)和sdhB-MF：5'-GCCTATACCGCTGCCTCACGATCTTC-3'(其中T为突变位点)。第一轮PCR用引物cbx-F和sdhB-MR进行扩增，PCR条件为：95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃2min20s，72℃10min，得到片段sdhB1；第二轮PCR用引物cbx-R和sdhB-MF进行扩增，PCR条件为：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃1min20s，72℃10min，得到片段sdhB2；获得相应片段后，采用重叠PCR的方法把两个片段连接。第三轮重叠PCR的引物为cbx-F和cbx-R，扩增条件为：94℃变性10min，66℃退火30s，72℃延伸4min，共35个循环，最后72℃延伸10min。最终获得了3171bp突变的灵芝sdhB基因序列（定点突变后对carboxin抗生素产生抗性，我们把定点突变后的sdhB基因定义为cbx）。经序列测定后确认相应位点已经突变。

7、将突变的cbx基因插入到PMD19-T-P-T的PstI酶切位点

将PMD19-T-P-T载体用PstI酶在37℃下，单酶切2h，回收酶切后的片段，用T4聚合酶补平酶切位点，再用T4连接酶在16℃下把cbx基因与回收后的片段进行连接，即得到pJW-EXP载体（见图2）。

实施例2：pJW-EXP-tPGM载体的构建

1、PGM基因的克隆

以灵芝基因组DNA为模板，用引物PGM-Nhe-F：5’-GCTAGCATGTCGTACCAGGTCAAGGAG-3’和PGM-Sma-R：5’-GGGCCCCTACGTGATGACGGTCGGC-3’进行PCR得到PGM基因；PCR条件为：95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃2min，72℃10min（见图3）。

2、将PGM基因插入到pJW-EXP载体

将pJW-EXP载体用SmaⅠ和NheⅠ双酶切，回收酶切后的片段，用T4连接酶在16℃下，将PGM基因插入到pJW-EXP载体的NheⅠ和SmaⅠ之间即得到pJW-EXP-tPGM载体（见图4）。

实施例3：通过PEG介导原生质体融合的方法，将pJW-EXP-tPGM转化到野生型灵芝细胞中

1、灵芝原生质体的制备及转化

先用溶壁酶将野生型灵芝（CCGMC5.616）菌丝制备成原生质体，然后将灵芝原生质体悬浮在100μL的STC（0.55M的山梨醇，10mM的CaCl₂，10mM的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5）中，再加入1μg的质粒DNA和PTC缓冲液（60%的PEG4000（W/V），10mM的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5，50mM的CaCl₂）；在冰上培养10min，再加入1mL的PTC缓冲液混合均匀并在室温培养20min；用10mL融化的CYM固体培养基与转化后的原生质体混合倒平板并加入carboxin使carboxin的终浓度为2μg/L；在30℃下培养10天后可长出若干单菌落。

2、在含有carboxin抗性的平板上传代培养

把单菌落转移到含有2μg/L的carboxin的CYM平板中，在30℃下传代培养约7天；经过3次在抗性平板上传代可获得稳定的转化子，用CTAB法提取转化后的灵芝基因组，具体操作步骤见实施例1步骤1。分别以转化后的灵芝基因组、pJW-EXP-tPGM质粒（阳性对照）、野生型（WT）灵芝基因组、水（阴性对照）为模板，用PGM-gpd-F：5’-GGGCCCCTACGTGATGACGGTCGGC-3’和PGM-gpd-R：5’-GGGCCCCTACGTGATGACGGTCGGC-3’作为验证引物进行PCR，PCR条件为：95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃2min，72℃10min（见图5）。由于P-gpd和PGM基因在真菌表达载体pJW-EXP-tPGM中连接在一起，以PGM-gpd-F（位于灵芝gpd基因的启动子上）和PGM-gpd-R（位于灵芝PGM基因上）为引物和基因组DNA为模板进行PCR，能够扩增出约1300bp条带的菌株即可认为是导入了PGM基因的转基因灵芝。如图4所示，从转基因菌株和阳性对照上能够扩增出约1300bp的条带，而野生型中没有出现此条带，只出现了一些非特异性条带。结果表明：PGM基因确实整合到了灵芝基因组上。

3、斜面培养

将阳性转化子转移到固体PDA培养基中（含有2μg/L的carboxin），在28℃下培养5-7天。

4、一级种子培养

在250mL摇瓶中添加40mL种子培养基和10mL菌丝体悬液（从一支斜面中获得），并在28℃，120rpm下培养5天。

5、二级种子培养

在250mL摇瓶中加入45mL种子培养基和5mL一级种子培养液（大约500mgDW/L，一级培养物用玻璃珠打碎后接种），在28℃，120rpm下培养2天。

6、发酵培养

在250mL摇瓶中加入45mL发酵培养基和5mL二级种子发酵液（大约500~600mgDW/L，二级培养物用玻璃珠打碎后接种），在28℃，120rpm下培养。

7、灵芝多糖的分离和提取

称取干细胞粉末100mg，加入1M氢氧化钠3mL，60℃水解1h后，用浓硫酸—苯酚法测定胞内多糖含量。

通过野生型和PGM菌株灵芝多糖的含量的测定，结果表明：通过药瓶发酵实验表明，该菌在其发酵性能不受影响的情况下，转化子菌株产灵芝多糖的含量是野生型菌株（WT菌株）含量的提1.6倍，其中1g干菌丝体产灵芝多糖的量(mg/g)由145.9±1.65mg/g提高到236.95±1.28mg/g，因此，本高产菌株可以作为生产灵芝多糖的工程菌株，具有广泛的应用前景。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>一种灵芝多糖高产工程菌株Rmust及其构建方法

<160>12

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>2038

<212>DNA

<213>灵芝菌株CCGMC5.616

<400>1

atgtcgtaccaggtcaaggaggtcccgacgaagcccttcgatggccaaaagcctggcact60

tcgggcctgaggaagaggtgagcgcccatccatctatatctgttcaatcggtacccgcat120

atatgcgcacattggtcccaacaccttgagcggacaccttgggaaatgcattcgcgttac180

tcgacgcctcgcaacatcgaaggattgggacgatatgagaatgctgacttgcgctcaggg240

tgaaggtcttccagcaggaggtgcgtgccgtaatccatctcttcactacccgttgctgat300

ggtgtccataaaagcattataccgagaacttcatccaagccatcttcgattccattgaac360

cttctggcaagaccatcgtcattgggggcgatggtcgctacttctcccccgaaaccgtcc420

agaccatcctcaagatcggttccgccaatggcgttgccaagttcatcatcggtcaggacg480

ccatcctctctacccccgccgcgtccaatatcatccgcaagtacaaggcggatggtggta540

tcctcctcaccgcctcccacaaccccggtggaccgaatgccgacttcggtatcaagtaca600

acatgtccaacggcggtcccgctccggagggcgtcaccaacaccatctacgagaagacaa660

agacgatctccacatacagggtcatcgaactagcccccatcgatctctccaagaagggct720

tcttcacgtatggtccgacgaacgtggagatcatcgactccgtatcggactacgtccagc780

tcctgcagtccatcttcgacttcccgctgatcaagaacttcctgcaatcacacgccaacg840

acttcaaaggtcctcttcgacggcatgcacggcgtcaccggcccgtacggtcgcgccatt900

ctcgtcgacgccctcggcctcccagcatcctcagtggcagaaacgcggattcccacctcc960

ccgactttggcgggaggacaccccgacccaaaccctcacctacgcacacgaccctcgtcg1020

cgcgcgtcgaaaaaggagaaacatcccaggttcggcgctgctccgacggtgacggcgaca1080

ggaacatgatctacggcaagggcgcattcgtcactccatccgacagtgtcgcgattatcg1140

cggactgggcggcggaggcgatcccatacttcaagaagggcggtgtcaagggtctcgcgc1200

ggagcatgccgacgagtgcgcagatcgattatgtcgccaagaagaagggtctcgagtgcc1260

atgtcgtcccgactggtgagaacgacgatcttcgcgatactggtatggaagcgctgacgc1320

tacatctccaggctggaagttcttcggaaacctcatggatgcgggccgtctgtccatctg1380

cggtgaggagtcgttcggtactggctcggaccacatccgagagaaggacggtgtctgggc1440

tgtcgtcggtgaatatcttcatgtgccccttgctgcgtgcatgttacttatccttcttcc1500

agcatggctgaacatcctcgcatacgcgaaccagcagacaccgaacgagctcgtcggcat1560

caaggagctcctctcgaagcactacgccgtctacggccgctccttcttctcgcgctacga1620

ctacgaggaggtctcgtccgagggcgcgcagaagctcgtcgacgcgctcaaccagcacat1680

cgccgcgggctcgctcgccaagaccacacacaagtccaagagcaccggacaggagttctc1740

catctccggcgtgtcgaacttcgactacacggacccgatcgaccactcggtgagcaagaa1800

ccaagggcagattatcagcttcgcggacggctcgcgcgtcgtgttccgcctgtccggcac1860

cgggtcgcagggcgcgacggtgcgcctgtacgtcgagcgctacgtgagcgcggacaaggg1920

cgccgcggagctcaataaggacacgcaggaggggttgaagggactcattgaggtcgcgct1980

ggagattagtaggctgcgcgagttcttggaccgcgagaagccgaccgtcatcacgtag2038

<210>2

<211>571

<212>PRT

<213>灵芝菌株CCGMC5.616

<400>2

MetSerTyrGlnValLysGluValProThrLysProPheAspGly

110

GlnLysProGlyThrSerGlyLeuArgLysArgValLysValPhe

2030

GlnGlnGluHisTyrThrGluAsnPheIleGlnAlaIlePheAsp

40

SerIleGluProSerGlyLysThrIleValIleGlyGlyAspGly

5060

ArgTyrPheSerProGluThrValGlnThrIleLeuLysIleGly

70

SerAlaAsnGlyValAlaLysPheIleIleGlyGlnAspAlaIle

8090

LeuSerThrProAlaAlaSerAsnIleIleArgLysTyrLysAla

100

AspGlyGlyIleLeuLeuThrAlaSerHisAsnProGlyGlyPro

110120

AsnAlaAspPheGlyIleLysTyrAsnMetSerAsnGlyGlyPro

130

AlaProGluGlyValThrAsnThrIleTyrGluLysThrLysThr

140150

IleSerThrTyrArgValIleGluLeuAlaProIleAspLeuSer

160

LysLysGlyPhePheThrTyrGlyProThrAsnValGluIleIle

170180

AspSerValSerAspTyrValGlnLeuLeuGlnSerIlePheAsp

190

PheProLeuIleLysAsnPheLeuGlnSerHisAlaAsnAspPhe

200210

LysGlyProLeuArgArgHisAlaArgArgHisArgProValArg

220

SerArgHisSerArgArgArgProArgProProSerIleLeuSer

230240

GlyArgAsnAlaAspSerHisLeuProAspPheGlyGlyArgThr

250

ProArgProLysProSerProThrHisThrThrLeuValAlaArg

260270

ValGluLysGlyGluThrSerGlnValArgArgCysSerAspGly

280

AspGlyAspArgAsnMetIleTyrGlyLysGlyAlaPheValThr

290300

ProSerAspSerValAlaIleIleAlaAspTrpAlaAlaGluAla

310

IleProTyrPheLysLysGlyGlyValLysGlyLeuAlaArgSer

320330

MetProThrSerAlaGlnIleAspTyrValAlaLysLysLysGly

340

LeuGluCysHisValValProThrGlyTrpLysPhePheGlyAsn

350360

LeuMetAspAlaGlyArgLeuSerIleCysGlyGluGluSerPhe

370

GlyThrGlySerAspHisIleArgGluLysAspGlyValTrpAla

380390

ValValAlaTrpLeuAsnIleLeuAlaTyrAlaAsnGlnGlnThr

400

ProAsnGluLeuValGlyIleLysGluLeuLeuSerLysHisTyr

410420

AlaValTyrGlyArgSerPhePheSerArgTyrAspTyrGluGlu

430

ValSerSerGluGlyAlaGlnLysLeuValAspAlaLeuAsnGln

440450

HisIleAlaAlaGlySerLeuAlaLysThrThrHisLysSerLys

460

SerThrGlyGlnGluPheSerIleSerGlyValSerAsnPheAsp

470480

TyrThrAspProIleAspHisSerValSerLysAsnGlnGlyGln

490

IleIleSerPheAlaAspGlySerArgValValPheArgLeuSer

500510

GlyThrGlySerGlnGlyAlaThrValArgLeuTyrValGluArg

520

TyrValSerAlaAspLysGlyAlaAlaGluLeuAsnLysAspThr

530540

GlnGluGlyLeuLysGlyLeuIleGluValAlaLeuGluIleSer

550

ArgLeuArgGluPheLeuAspArgGluLysProThrValIleThr

560570

End

571

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tccaaagccgctctcatggcatggcac27

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gctagcgttgagagggggatgaagagtgagtaagaag37

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atgagcgggtcagagagt18

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tgctctatgtcttgccttgt20

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tctgctcttcccgattgctgcatttgt27

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ctatgtcttgccttgtctcgcgtcaacc28

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gaagatcgtgaggcagcggtataggc26

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gcctataccgctgcctcacgatcttc26

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gctagcatgtcgtaccaggtcaaggag27

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

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Claims (2)

1.一种灵芝多糖高产工程菌株Rmust，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO.8258。

2.权利要求1所述灵芝多糖高产工程菌株Rmust的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

将目的片段与表达载体相连得到重组表达质粒，然后将重组表达质粒通过PEG介导的原生质体融合的方法将重组表达质粒转化进灵芝中，从而得到高产灵芝多糖的工程菌株；

其中所述的目的片段为葡萄糖磷酸变位酶PGM基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。