CN101717782B - 一种提高灵芝生物产量和多糖含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高灵芝生物产量和多糖含量的方法。将来自水稻的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(OsUgp2)连接到过量表达载体中，通过农杆菌介导法将尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因转入灵芝中，获得的转基因灵芝菌株中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表达增强，紫芝的生物量、胞内多糖和胞外多糖的含量均得到明显的提高。本发明能有效提高灵芝等食用和药用真菌中生物产量和多糖含量，为提高食用和药用真菌多糖含量提供了一条新的途径，具有良好的应用和开发前景。

Description

一种提高灵芝生物产量和多糖含量的方法

技术领域

本发明属于转基因食用真菌技术领域。具体涉及一种通过转基因技术将尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因转入食用真菌灵芝中过量表达，从而提高灵芝生物产量和多糖含量的方法。

背景技术

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase，EC 2.7.7.9)是生物体内的一种重要酶类，与糖类代谢过程密切相关。UGPase可催化一依赖镁的可逆反应，反应式如下：UTP+G-1-P←→UDPG+PPi。尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是葡萄糖的主要活化形式，可作为葡萄糖基的供体，参与蔗糖、淀粉、纤维素、半纤维素、果胶质以及糖脂、糖蛋白、糖原、β-葡聚糖等多种碳水化合物的合成代谢(Kleczkowski，1994)。

至今有关UGPase过量表达的研究不多，有研究表明提高黄芪毛状根中UGPase的活性，可提高黄芪多糖的含量。黄芪总多糖积累量和UGPase活性之间呈正相关，两者的相关系数达到0.928，可溶性多糖与UGPase活性的相关系数则达到0.957(吴晓俊，刘涤，胡之璧.黄芪毛状根中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性与多糖含量关系的研究，上海中医药大学学报，2000，14(2)：53-55)；UGPase在烟草、杨树中的过量表达显示：相应的转基因生物可溶性糖含量增加，木质素、纤维素含量及整体生物量有不同程度的增加(Coleman HD，Ellis DD，Gilbert M，et al.Up-regulation ofsucrose synthase and UDP-glucose pyrophosphorylase impacts plant growthand metabolism.Plant Biotechnology Journal，2006，4：87-101)；UGPase在水稻中的过量表达可以使水稻结实粒数和单株粒重等产量性状得到明显改善(公开号CN 1614023A的发明专利申请)；也有报道：在大肠杆菌中过量表达低聚糖合成途径中两个关键的酶UGPase和葡萄糖磷酸变位酶基因，使UDPG的合成量提高，从而提高了低聚糖的含量(Mao Z.Shin HDand Chen RR.Engineering the E.coli UDP-glucose synthesis pathway foroligosaccharide synthesis.Biotechnology Progress，2006，22(2)：369-74)。

但是，UGPase在真菌中的过量表达未见相关技术报道。因真菌生长和菌丝结构的特殊性，上述现有的UGPase过量表达技术在真菌中没有更多的可复制和参比性。

灵芝是重要的药用真菌，灵芝多糖含量是灵芝的主要药用成分之一，灵芝多糖作为灵芝中最主要的药用成分，药理活性广泛，具有提高机体免疫功能、抗肿瘤、消除机体内自由基延缓衰老、抗辐射、提高肝脏解毒功能等作用，是决定灵芝品质的重要因素。而目前国内外在提高灵芝多糖产量方面的研究大多集中在菌种诱变选育和发酵条件的优化方面(李刚，杨凡，李瑞雪等.原生质体紫外诱变选育灵芝新菌种的研究.微生物学报，2001，41(2)：229-233；孙金旭，朱会霞.生长因子对灵芝生长及多糖产量的影响.中国酿造，2008，24：69-71)，这些方法也都在一定的程度上提高了灵芝多糖的含量。

目前为止，根据代谢工程的原理，利用基因工程来改造菌株，从而提高多糖含量的方法尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，通过转基因技术将多糖合成相关功能基因转入灵芝真菌中，获得灵芝多糖含量稳定提高的转基因灵芝菌株。

本发明的技术方案是：通过大量实验筛选对比研究，将从水稻中克隆的与多糖代谢相关的关键酶基因-尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(Oryza sativa UDP-glucose pyrophosphorylase 2，OsUgp2，GenBank登录号为AF249880)与构巢曲霉(Aspergillus nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，gpd)的启动子连接，构建了过量表达载体，命名为OsU-gpd。所述载体具有完整的左右边界序列，选择标记基因为潮霉素抗性基因，适合农杆菌介导法转化灵芝。

本发明进一步通过农杆菌介导法将表达载体OsU-gpd转入灵芝，得到具有潮霉素抗性的转化菌株。并对转化菌株进行了PCR(聚合酶链反应)、Southern杂交分析、RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)、表达产物UGPase酶活性检测等的一系列鉴定，证明获得的转化菌株外源基因OsUgp2成功插入受体灵芝基因组中，并成功表达，有效提高灵芝的生物产量和多糖含量。

本发明的有益效果是：

本发明通过转基因技术将多糖合成相关功能UGPase基因转到紫芝菌株中去，获得多糖含量明显提高的转基因灵芝，为提高灵芝多糖含量，培养灵芝新菌株开辟一条新的途径。采用苯酚-硫酸法分别测定发酵第7天的紫芝菌丝体的胞内多糖含量、胞外多糖含量及菌丝体干重。实验结果表明：第一代转化菌株的多糖平均含量为9.56mg/g菌粉，比野生型对照菌株提高了12.3％；胞外多糖含量为82.52mg/L与对照野生型菌株相比提高了22.96％。此外，转化菌株的生物量也得到增加，第一代转化菌株的菌丝体干重平均达到6.45g/L，比对照菌株提高了7.7％。采用SPSS13.0数据统计分析软件分析了UGPase酶活力与多糖含量之间的相关性，结果表明紫芝菌丝体的总糖含量，胞内多糖含量和胞外多糖含量与UGPase的酶活力都显示了较强的相关性，其相关系数分别为0.826，0.980和0.815。其中胞内多糖含量与UGPase酶活力的相关性最高达0.98，说明了UGPase主要参与了胞内多糖的合成。本发明得到的转OsUgp2的转基因紫芝菌株，紫芝的多糖含量和生物量均得到明显提高，为提高食用和药用真菌多糖含量提供了新的实用技术和趋势，具有良好的应用和开发前景。

附图说明

图1 OsUgp2过量表达载体OsU-gpd T-DNA区示意图

图2转化紫芝菌丝体在含有20μg/mL潮霉素(Hyg)的MYG培养基平板上生长1周的情况

图3转基因紫芝的PCR鉴定

图4转基因紫芝的Southern杂交分析

图5 RT-PCR分析转基因菌株外源基因OsUgp2的表达

具体实施方式

本发明方法适用于赤芝(G.lucidunz)、紫芝(G.sinense)、松杉灵芝(G.tsugae)或树舌(G.applenatum)等灵芝，实验步骤大致相同。下面以紫芝为例，结合附图和具体实施过程进一步详细说明本发明，其它种类的灵芝不一一在实施例中赘述，但并不因此限定本发明范围。

实施例1：农杆菌介导法转化紫芝

(1)农杆菌介导的灵芝过量表达载体OsU-gdp的构建

本实施例转化载体可选用通过农杆菌介导的常规二元表达载体，在T-DNA两边界间，插入真菌中表达的启动子(本实施例中为gpd启动子)，再加上本发明所述的目的基因(尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因)，及选择性标记基因(本例为潮霉素抗性基因)即可得到农杆菌介导的灵芝转化载体。

本实施例中表达载体OsU-gdp，是采用上述常规方法，在由Ubi启动子驱动的OsUgp2过量表达，用于农杆菌介导转化水稻的表达载体(命名为OsU-ubi，载体结构见附图1)基础上构建的。

以含gpd启动子的pAN7-1质粒为模板，设计引物扩增gpd启动子片段。所述pAN7-1质粒资料可参考Punt P.J.et al；Transformation ofAspergillus based on the hygromycin B resistance marker fromEscherichia coli.Gene，1987，56(1)：117-124，市面可购买得到。本实施例使用的pAN7-1质粒为中山大学李刚老师惠赠，李刚等人(2004)构建了真菌表达质粒pAN7-1(6.7kb)，携带有构巢曲霉gpd(3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因的启动子。

引物序列为：P-F：5’-AGCTCTAGAGAATTCCCTTGTATCTCTAC；

P-R1：5’-CTCACTAGTGTTCTTGGATGGGAAGATG。

在上游引物的5’端设计Xba I酶切位点，在下游引物的5’端设计Spe I酶切位点。进行PCR扩增，扩增条件为(1)预变性94℃1分钟；(2)94℃30秒，52℃ 30秒，72℃ 2分6秒，进行5个循环；(3)94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 2分6秒，进行25个循环；(4)72℃延伸5分钟。对PCR扩增产物进行Xba I与Spe I双酶切处理，并将其连接入经XbaI与Spe I双酶切处理的OsU-ubi中，使得OsU-ubi原有的Ubi启动子被gpd启动子所取代，获得OsU-gpd表达载体，OsUgp2过量表达载体OsU-gpdT-DNA区示意图见附图1。该表达载体经测序鉴定序列正确后，导入农杆菌LBA4404，于-70℃中保存菌种。

(2)农杆菌介导的紫芝转化及转基因紫芝菌株的筛选

(A)紫芝菌丝体的培养

用灭过菌的离心管量取5mL活化好的紫芝菌丝体接种于装有玻璃珠的50mL的CYM液体培养基(10g/L麦芽糖，20g/L葡萄糖，2g/L酵母提取物，2g/L胰蛋白胨，0.5g/L MgSO₄.7H₂O，4.6g/L KH₂PO₄)中，28℃、120rpm/min，培养7天后可用于转化。

紫芝菌丝体活化的过程：将常规的紫芝菌种(Ganoderma sinense)斜面从4℃冰箱中取出，取斜面上约0.5cm²大小的紫芝菌丝体1块，接种至固体PDA培养基(马铃薯去皮切碎，煮成汁，4层纱布过滤，20g/L葡萄糖，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L Mgcl₂，0.01g/L VB₁，15g/L琼脂条)平板上，置于28℃培养箱中培养7天。用0.5cm²大小的接种环挑取该平皿边缘的菌丝体6块，用无菌接种刀切碎后将其接种到无菌的液体PDA培养基(马铃薯去皮切碎，煮成汁，4层纱布过滤，20g/L葡萄糖，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L Mgcl₂，0.01g/L VB₁)中，28℃、150rpm/min，培养7天，得到活化好的菌丝体。本实施例采用的紫芝菌种(Ganoderma sinense)从广东省微生物研究所购买。

(B)农杆菌的活化

取出于-70℃中保存、含有重组质粒OsU-gpd的农杆菌菌种LBA4404，在含有卡那霉素(kan)和利福平(Rif)的YEB培养基(5g/L Nacl，10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨)上进行划线培养，28℃黑暗培养2天后挑取单菌落接种到2ml(含卡那霉素)100μg/mL，利福平50μg/mL)YEB液体培养基中，于28℃，200rpm/min振荡培养过夜，第二天加入乙酰丁香酮(AS)至终浓度200μmol/L，继续振荡培养至OD₅₅₀为0.5左右，再于28℃、150rpm/min振荡培养，每5分钟测一次OD值，至OD值为0.6～0.8左右，即可用于侵染。

(C)农杆菌介导的紫芝菌丝体转化

在超净台中用100目网筛过滤培养好的紫芝菌丝体，并用无菌水冲洗3～4次，用1mL无菌水悬浮。取100μL悬浮的灵芝菌丝体与上述100μL活化好的农杆菌混匀，涂布在CYM固体培养基(10g/L麦芽糖，20g/L葡萄糖，2g/L酵母提取物，2g/L胰蛋白胨，0.5g/L MgSO₄.7H₂O，4.6g/LKH₂PO₄，15g/L琼脂条)上，于培养箱中28℃黑暗共培养2天后，在平板上倒入10mL筛选培养基(CYM固体培养基+潮霉素(Hyg)20μg/mL+头孢唑林钠(Cefo)500μg/mL)，于28℃继续培养3天，筛选转化菌株，肉眼可见白色的再生菌落。继续培养5天，将新长出的转化菌株转接到筛选培养基上筛选，每天转接一次，转接2～3次，直到没有农杆菌的生长，待菌丝体长大为直径约5cm时，则保存菌种，用于下一步的检测分析。

得到的转化菌株在不含潮霉素抗生素的MYG培养基(10g/L麦芽糖，4g/L葡萄糖，4g/L酵母提取物，1g/L胰蛋白胨，15g/L琼脂条)上继代培养5代后，再在添加有潮霉素(Hyg)的MYG培养基上培养，筛选得到潮霉素抗性的紫芝转化菌株，转化紫芝菌丝体在含有20μg/mL潮霉素的MYG平板上生长1周的情况见附图2，其中，CK为野生型菌株；1～3为转化菌株。

实施例2转基因紫芝的PCR鉴定和Southern鉴定

(1)转基因紫芝总DNA的制备(CTAB法)

称取0.2g左右真空抽干的菌丝体于研钵中，加液氮研磨成粉末，转移到2mL的离心管中，加CTAB抽提液[10mmol/L Tris-HCL，2.0％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，20mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1.4mol/LNaCl，pH8.0]1mL和CTAB沉淀液(50mmol/L Tris-HCL，1.0％CTAB，10mmol/L EDTA，pH 8.0)100μL后混合，于65℃静置1小时后以12000rpm离心10分钟，取上清，加上清液的1/10体积的CTAB/NaCl溶液(1.0％CTAB，0.7mol/L NaCl)，混匀，然后再加入等体积的24∶1的氯仿∶异戊醇溶液，混匀，抽提，摇动几分钟，4℃、8000rpm条件离心10分钟后取上清，再加入等体积氯仿，摇动5分钟，8000rpm离心10分钟，取上清，加入等体积的CTAB沉淀液，混匀，65℃下静置30分钟产生沉淀，于4℃、6000rpm离心10分钟，倒去上清，用70％酒精洗涤2次，风干，溶于50μL 0.5×TE(5mmol/L Tris-HCL，0.5mmol/L EDTA，pH8.0)，-20℃保存备用。

(2)转基因紫芝的PCR鉴定

取适量的转基因紫芝总DNA进行Hpt(潮霉素基因)和OsUgp2(目的基因)部分序列的PCR扩增，转基因紫芝的PCR鉴定结果见附图3所示，其中，a为Hpt基因扩增结果b为OsUgp2基因扩增结果，M为DL2000；CK为野生型菌株；阳性对照为农杆菌质粒；1～3为转化菌株号。

以含有目的基因的质粒为正对照，反应体系为25μl，在200μl的无菌PCR专用管中依次加入：

引物：                0.3μmol/L

dNTP：                100μmol/L

10×Buffer：          2.5μL

Taq聚合酶：           1U

基因组DNA(20ng/μL)： 1μL

ddH₂O：               补齐25μL。

PCR扩增反应程序为：(1)预变性94℃ 5min；(2)94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 60s，共30个循环；(3)72℃延伸10min；(4)16℃，5min。

用于检测Hpt引物序列：

Hpt F：5’-GGACGCAACGCCTACGACTGGAC；

HptR：5’TCATCGCAAGACCGGCAACAGGA3’。

用于检测OsUgp2的引物序列：

OsUF：5’GTCAGTACTATGGCGGACGAGAAGC；

OsUR：5’ACAGGATCCTTCGCTCAAAGGTCCTC3’。

(3)转基因紫芝菌株的Southern blot分析

取紫芝菌丝(约0.5g)，采用上述CTAB法抽提总基因组DNA，选用Hind III限制性内切酶酶切菌丝总基因组DNA(约1～2μg)，酶切12小时左右。先取少量进行预电泳检测酶切效果，然后用0.8％的琼脂糖凝胶进行反转电泳。电泳16小时后将大于8kb大片段的凝胶部分用紫外灯照射15分钟左右，再用0.4mol/L NaOH进行碱转移8～12小时，将胶上的DNA转移到Hybond-N+尼龙膜上。转移结束后，将尼龙膜放入一干净盒子，先用少量的2×SSC溶液简单漂洗后，再将煮沸的0.5×SSC/0.5％SDS溶液倒入，摇动数分钟。将尼龙膜取出，室温晾干，之后用保鲜纸把膜包好，4℃下保存备用。

用随机引物标记试剂盒(TakaRa公司)进行探针标记。参照说明书在1.5mL离心管加入Hpt的DNA探针50ng，□/Hind III探针10ng，随机引物2μL，加水体积至14μL。95℃变性3分钟，冰浴5分钟。再在离心管中加入10×反应缓冲液，dNTP混合物各2.5μL，1μLDNA聚合酶Klenow片段，5μL[□-³²P]dCTP，37℃反应20分钟。加入等体积0.8mol/LNaOH变性后用于杂交。

将上述转移后的尼龙膜放入杂交管贴于管壁，按0.1mL杂交液/cm²膜面积的量加入杂交液，65℃预杂交3小时后，再将上述标记好的探针加入杂交管中，65℃杂交16～20小时。倒出杂交液，少量的洗膜液(0.2×SSC/0.1％SDS)简单冲洗一次后，再换洗膜液在65℃杂交炉中洗膜两次，每次30分钟。取出尼龙膜，用保鲜膜包好，用GM计数器测量膜上同位素的计数后，压上分子磷屏两天。然后用FX分子磷屏成像系统进行扫描分析杂交结果，分析结果见附图4，其中M为λ/Hind III marker；CK为野生型菌株；1～3为转化菌株号。

PCR鉴定结果和Southern blot的结果(附图3和图4)显示外源基因OsUgp2已成功转入紫芝受体菌丝体中，得到的1#，2#和3#三个独立的转化菌株中，1#和2#各有一个拷贝的插入，3#菌株有两个拷贝的插入。

实施例3转基因紫芝多糖含量和生物量的测定

(1)紫芝菌株胞内和胞外多糖的提取含量测定

采用热水浸提法提取胞内多糖：取灵芝菌粉0.2g，用85％乙醇15mL于60℃浸提30分钟，重复2次，以去除单糖、双糖、低聚糖等干扰性成分。预处理后的菌粉于沸水浴中提取1小时，过滤定容至50mL，用于测定多糖含量。

采用乙醇沉淀法提取胞外多糖：取发酵液500μL，加入1.5mL的95％乙醇，于4℃静置过夜，约18小时后离心，去上清，沉淀用无水乙醇洗涤2次，晾干后再溶于1mLddH₂O，用于测定多糖含量。

(2)紫芝菌株多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量：

a.标准曲线的制备：精确称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，置100mL容量瓶中，用ddH₂O定容，制成1μg/μL的标准溶液。分别准确吸取标准溶液20、40、60、80、100、120μL，分置于试管中，并用蒸馏水定容至2.0mL，再各加5％苯酚1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0mL，摇匀后于适当温度下显色25分钟。于490nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，并计算其标准曲线回归方程。另取蒸馏水2mL，作为空白对照，同上操作加苯酚和硫酸进行显色反应。

b.多糖含量的测定：准确吸取上述(1)中提取的胞内多糖样品溶液0.5mL或胞外多糖样品溶液200μL，用蒸馏水定容至2.0mL，再各加5％的苯酚1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0ml，摇匀后于适当温度下显色25分钟，于490nm波长处测定吸光度，记录读数。根据回归方程求出样品溶液中葡萄糖含量。

每g菌粉胞内多糖含量的计算：多糖含量(μg/g)＝c×d/w

式中c为计算出来的样品溶液所对应的葡萄糖含量；d为供试样品溶液的稀释因子；w为所称取的菌粉的重量。

每L发酵液中胞外多糖的含量计算：多糖含量(μg/L)＝c×d×1000/v

式中c为计算出来的样品溶液所对应的葡萄糖含量；d为供试样品溶液的稀释因子；V为发酵液的体积。计算结果见表1，表中1#、2#、3#代表随机选取的三株紫芝转化菌株。

表1转基因紫芝菌株菌丝干重和多糖含量测定结果(x±s)

采用苯酚-硫酸法分别测定发酵第7天的紫芝菌丝体的胞内多糖含量、胞外多糖含量及菌丝体干重。实验结果表明：第一代转化菌株的多糖平均含量为9.56mg/g菌粉，比野生型对照菌株提高了12.3％；胞外多糖含量为82.52mg/L与对照野生型菌株相比提高了22.96％。此外，转化菌株的生物量也得到增加，第一代转化菌株的菌丝体干重平均达到6.45g/L，比对照菌株提高了7.7％。

(3)紫芝菌丝体生物量的测定

根据紫芝菌丝体多糖含量变化的测定结果，对上述经PCR检测和Southern杂交验证的3株转基因紫芝菌株和野生型对照菌株，分别测定它们培养第7天的干重，实验重复3次。将发酵到第7天的紫芝菌液用网筛过滤，分离得到菌丝体，用蒸馏水冲洗多次，至洗下的液体无色为止。随后将菌丝体置于60℃烘箱中烘干至恒重，称取菌丝体的重量。实验结果表明：第一代转化菌株的菌丝体干重较野生型对照菌株提高了7.68％，见表1。

实施例5 OsUgp2基因在转化菌株中的表达分析

采用半定量RT-PCR对转基因灵芝进行了OsUgp2表达量的分析。用Trizol法，从灵芝菌丝体中提取总RNA，以oligo(dT)为引物，反转录成cDNA，再以cDNA为模板扩增灵芝免疫蛋白基因Lz8(内参基因)和目的基因OsUgp2，RT-PCR分析转基因菌株外源基因OsUgp2的表达见附图5，图中a为OsUgp2基因扩增；b为Lz8基因的扩增；CK为野生型菌株；1～3为转化菌株株号。由附图5可以看出OsUgp2基因在野生型菌株没有表达，而转基因菌株均有表达出来。1#菌株表达量最高，2#与1#相对差异不大，3#表达量最低。

实施例4菌株的UGPase酶活性测定

将培养好的菌丝体过滤，蒸馏水洗涤3次后用布什漏斗抽干，准确称取0.5g菌丝体，研磨至粉碎，加入预冷的离心管中，加入1mL的抽提缓冲液[2mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，10mmol/L MgCl₂，1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，100mmol/L Tris-HCl，pH 7.5]，4℃、12000rpm下离心20分钟后取上清，即为菌丝体粗酶液。

UGPase催化反应：

UDPG+ppi→UTP+G-1-P

加入尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和焦磷酸(ppi)在尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)的作用下，反应从左向右进行形成1-磷酸葡萄糖(G-1-P)以及尿苷三磷酸(UTP)；在过量的磷酸葡萄糖变位酶作用下，G-1-P变为G-6-P(6-磷酸葡萄糖)；在过量的6-磷酸葡萄糖去氢酶作用下，G-6-P被NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)氧化，用分光光度计在340nm处测定形成的NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸)。

取960μL新鲜配制的UGPase酶反应缓冲液[5mmol/L MgCl₂，0.8mmol/L UDPG，0.8mmol/L NADP，2U磷酸葡萄糖变位酶，1U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，20μmol/L Glucose-1，6-bisphosphate potassium salt(葡萄糖-1，6-二磷酸盐)，10mmol/L Tris-HCL)，pH7.5]，加到光路为1cm的石英杯中，再加入粗酶液30μL，最后加入100mmol/L的焦磷酸钾盐10μL，迅速混匀，反应即开始。在340nm处记录光密度读数，6分钟内每30秒记录1次。酶活性定义为在30℃下每分钟形成1μmol的1-磷酸葡萄糖为一个酶活力单位(U)。

酶活力＝OD值×上清液体积×1÷6.22消光系数÷测定体积(注：NADPH的消光系数为6.22mM^-1cm^-1)

比活力＝酶活力÷上清液中所含蛋白总量。上清液中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法(Bradford，1976)。

酶活力和比活力的测定结果见表2，表中1#、2#、3#为随机选取的三株紫芝转化菌株。

表2转化菌株UGPase酶活性测定结果(x±s)

实施例5过量表达UGPase与灵芝多糖含量间的相关性分析

采用SPSS 13.0统计软件中的相关性分析程序对多糖含量与酶活力进行了相关性分析。分析结果显示：总糖含量与酶活力的直线相关系数r＝0.826，胞内多糖与酶活力的直线相关系数r＝0.980，胞外多糖含量与酶活力的直线相关系数为r＝0.815。通常当|r|＞0.95时，两个变量存在显著性相关；当0.8＜|r|＜0.95时，两个变量存在高度相关，上述分析结果表明转化菌株多糖含量与UGPase酶活力之间都显示出了较高的正相关性。其中胞内多糖与酶活力的直线相关系数最高达0.98。

Claims (7)

1.一种提高灵芝生物产量和多糖含量的方法，其特征在于采用构巢曲霉(Aspergillus nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子gpd驱动GenBank登录号为AF249880的水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在灵芝中过量表达，提高灵芝生物产量、胞内和胞外多糖含量。

2.根据权利要求1所述提高灵芝多糖含量的方法，其特征在于是将从水稻中克隆的与多糖代谢相关的关键酶基因OsUgp2与构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子连接，构建过量表达载体OsU-gpd；选择标记基因为潮霉素抗性基因，采用农杆菌介导法将表达载体OsU-gpd转入灵芝，得到具有潮霉素抗性的转化菌株，提高灵芝生物产量、胞内和胞外多糖含量。

3.根据权利要求1所述提高灵芝多糖含量的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)以含gpd启动子的pAN7-1质粒为模板，设计引物扩增gpd启动子片段获得PCR扩增产物，连接农杆菌介导转化水稻的表达载体OsU-ubi，并使OsU-ubi原有的ubi启动子被gpd启动子所取代，构建灵芝过量表达载体OsU-gpd，将表达载体OsU-gpd导入农杆菌LBA4404；

(2)将步骤(1)导入了表达载体的农杆菌LBA4404活化后介导转化灵芝菌丝体，筛选转基因灵芝菌株；

(3)转基因灵芝的PCR鉴定和Southern鉴定，测定多糖含量和生物量。

4.根据权利要求3所述提高灵芝多糖含量的方法，其特征在于步骤(1)所述引物序列为：

P-F：5’-AGCTCTAGAGAATTCCCTTGTATCTCTAC；

P-R 1：5’-CTCACTAGTGTTCTTGGATGGGAAGATG。

5.根据权利要求3所述提高灵芝多糖含量的方法，其特征在于步骤(2)所述农杆菌活化至OD值为0.6～0.8。

6.根据权利要求3所述提高灵芝多糖含量的方法，其特征在于步骤(2)所述灵芝菌丝体转化是取灵芝菌丝体与活化好的农杆菌混匀，涂布在CYM固体培养基上，于培养箱中28℃黑暗共培养2天后，在平板上倒入筛选培养基于28℃继续培养3天，肉眼可见白色的再生菌落后继续培养5天，将新长出的转化菌株转接到筛选培养基上筛选；

所述筛选培养基为CYM固体培养基+潮霉素(Hyg)20μg/mL+头孢唑林钠(Cefo)500μg/mL。

7.根据权利要求3所述提高灵芝多糖含量的方法，其特征在于步骤(2)所述筛选是将新长出的转化菌株转接到筛选培养基上筛选，每天转接一次，转接2～3次至没有农杆菌的生长，得到的转化菌株在不含潮霉素抗生素的MYG培养基上继代培养5代后，再在含潮霉素抗生素20μg/mL的MYG培养基上培养，筛选得到潮霉素抗性的灵芝转化菌株；

所述筛选培养基为含潮霉素20μg/mL和头孢唑林钠500μg/mL的CYM固体培养基；所述MYG培养基含10g/L麦芽糖，4g/L葡萄糖，4g/L酵母提取物，1g/L胰蛋白胨，15g/L琼脂条。

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