CN105462865A - 一种灵芝酸高产工程菌株Kmust-LS - Google Patents

一种灵芝酸高产工程菌株Kmust-LS Download PDF

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CN105462865A CN201610001941.6A CN201610001941A CN105462865A CN 105462865 A CN105462865 A CN 105462865A CN 201610001941 A CN201610001941 A CN 201610001941A CN 105462865 A CN105462865 A CN 105462865A
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徐军伟
张德怀
李焕军
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    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99007—Lanosterol synthase (5.4.99.7), i.e. oxidosqualene-lanosterol cyclase

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Abstract

本发明公开一种灵芝酸高产工程菌株Kmust-LS，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC？NO.11603，本发明提供的灵芝工程菌，是通过选用灵芝强启动子P-<i>gpd</i>过表达编码羊毛甾醇合酶LS基因，得到高产灵芝酸灵芝工程菌Kmust-LS；通过摇瓶发酵实验表明，该菌在其细胞生长不受影响的情况下，单体灵芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S分别是WT菌株的2.1，1.6，2.35，1.3倍，因此，本高产菌株可以作为生产灵芝酸的工程菌株，具有广泛的应用前景。

Description

一种灵芝酸高产工程菌株Kmust-LS
技术领域
本发明属于基因工程和代谢工程领域，通过基因工程对灵芝酸代谢途径中的羊毛甾醇合酶(LS)基因过表达的方法，构建了一个灵芝酸的高产工程菌株。
背景技术
灵芝(Ganodermalucidum)是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌。灵芝真菌在我国有20多种，包括赤芝，黄芝，紫芝，黑芝，薄盖灵芝，树舌等。我国应用灵芝作为药物已有两千多年的历史。灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效。由于其特殊的要用价值，灵芝的有效成分分析和药理学研究已经引起了国际上的广泛关注，尤其在日本，美国，韩国等国家。目前，灵芝的研究已经深入到了分子水平，一些专著相继出版，从不同的角度介绍了灵芝的生物学特性、栽培技术、药理学作用及临床应用等情况。
灵芝酸是一类分子结构中含有羧基的三萜类物质，从结构来看它属于高度氧化的羊毛甾烷衍生物。自1982年KubotaT等人首次分离得到灵芝酸以来，目前已有130多种灵芝酸被分离出来。它们多为四环三萜类化合物，含有30个碳原子，结构中一般都有羟基，在红外光谱中有较强的羟基吸收峰。在紫外光谱中也呈现多个波长的特征吸收，多数是在250nm、237nm、365nm处有吸收峰。灵芝酸具有许多重要的药理活性如：抗癌，抑制小鼠肝肉瘤(HTC)细胞的增殖；护肝，灵芝中的灵芝酸提取物能加强其解毒作用；抗HIV；降血压；抗氧化；抑制血小板凝集，抑制组胺释放，镇痛，抑制真核细胞DNA多聚酶活性，抑制法尼基蛋白转移酶活性和促进体液免疫功能等作用。
羊毛甾醇合酶(LS)基因是灵芝酸合成途径中的一个较为重要的基因。它主要催化鲨烯2,3-氧化物转化为羊毛甾醇，进而合成灵芝酸。灵芝酸是通过甲羟戊酸途径合成的。这条途径普遍存在于动物，植物，真菌。首先是由乙酰辅酶A(AcetylCoA)在硫解酶(AcetoacetylCoAthiolase)催化下缩合形成乙酰乙酰辅酶A(AcetoacetylCoA)，乙酰乙酰辅酶A经HMG-CoA合成酶(HMG-CoAsynthase)催化与另一分子乙酰CoA缩合生成3-羟基-3甲基-戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)，然后HMG-CoA还原酶(HMG-CoAreductase,HMGR)催化HMG-CoA转化为甲羟戊酸。甲羟戊酸经甲羟戊酸激酶(MVK)、甲羟戊酸5-磷酸激酶(PMK)和MDD三步酶促反应转化为IPP。IPP进一步转化成法呢酯焦磷酸FPP。FPP在鲨烯合酶(SQS)的催化下合成鲨烯SQS后经过鲨烯单加氧酶的作用产生鲨烯2,3-氧化物，再经过羊毛甾醇合酶lanosterolsynthasee(LS)的作用产生羊毛甾醇。最后通过不同酶的修饰作用产生不同结构的灵芝三萜。灵芝酸的合成途径如下所示：
；
由于野生灵芝生长周期长，受环境因素影响大且野生灵芝资源有限，灵芝菌丝培养成为生产活性物质的重要方法。随着对灵芝活性物质需求的不断增加，如何提高灵芝酸的产量和增加灵芝的有效成分越来越引起人们的关注。液体深层发酵技术是进行快速工业化生产的重要手段。现在市售的灵芝酸主要是从灵芝子实体和液体深层发酵得到的菌丝体中获得。由于野生灵芝液体深层发酵时灵芝酸在灵芝细胞中的含量较低，分离纯化也较难，限制了对灵芝酸的活性、作用机理的研究及其广泛应用。近年来，基因工程与代谢工程迅速发展，成为了现代分子育种的重要手段。通过分子克隆和基因拼接等分子生物学方法来改造菌株的基因组，从而提高活性成分的含量越来越受学者们的青睐。如何从分子水平上提高灵芝酸的产量是目前急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是解决野生型灵芝菌株自身产灵芝酸较低的问题，提供一种灵芝酸高产菌株，该菌株为高产灵芝酸的灵芝(Ganodermalucidum)工程菌Kmust-LS，已于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.11603。
本发明灵芝酸高产工程菌株的构建方法如下：
以PMD19-T为起始载体并使用灵芝本身的强启动子P-gpd、终止子T-sdhB、cbx基因，cbx基因(具有carboxin抗性)是来自灵芝本身的抗性基因，其特点是在蘑菇类担子菌的转化体系中同源标记基因的转化效率更高，能够稳定遗传，抗性强。
1、将灵芝启动子P-gpd与终止子T-sdhB与PMD19-T连接，将灵芝cbx抗性基因插入到PstI酶切位点，从而构建成pJW-EXP载体；其具有灵芝的强启动子和终止子，并具有灵芝本身的抗性。
其中扩增灵芝强启动子P-gpd的引物序列为：
P-gpd-F：5’-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC-3’，
P-gpd-R：5’-GCTAGCGTTGAGAGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG-3’；
扩增灵芝sdhB基因终止子的引物序列为：
T-sdhB-F:5’-ATGAGCGGGTCAGAGAGT-3’，
T-sdhB-R:5’-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT-3’；
扩增灵芝cbx抗性基因的引物为：
cbx-F：5’-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3’，
cbx-R：5’-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3’；
2、灵芝酸合成途径中关键酶羊毛甾醇合酶(LS)从灵芝基因组中克隆(所用的引物为LS-Nhe-F和LS-Sma-R)，并插入到pJW-EXP载体中，得到pJW-EXP-tLS载体；引物序列为：
LS-Nhe-F：5’-GCTAGCATGGCAGCGTACGCCCCG-3’
LS-Sma-R：5’-CCCGGGCTACTTCTTGGCGTGCAACTCCTTG-3’；
LS基因核苷酸序列在GenBank上，其登录号为KJ155729。
3、通过PEG介导原生质体融合的方法，将pJW-EXP-LS转化到野生型灵芝细胞中，以carboxin作为抗性来筛选灵芝转化子，在含有carboxin抗性的CYM平板上筛选出转化子。
4、将转化子在carboxin抗性的CYM平板中进行传代培养。
5、灵芝细胞的液体培养：
PDA培养基(g/L)：葡萄糖10，琼脂20，硫酸镁1.5，磷酸二氢钾3，维生素B10.05和制备好的土豆汁。
土豆汁的制备方法：将200g去皮新鲜土豆切成小块，加入去离子水1.0L煮沸30min，用八层纱布过滤，取滤液，用于PDA培养基的配制。
种子培养基(g/L)：葡萄糖35、蛋白胨5、酵母膏2.5、磷酸二氢钾1、硫酸镁0.5和维生素B10.05。
发酵培养基(g/L)：蛋白胨5、酵母膏5、磷酸二氢钾1.0、硫酸镁0.5、维生素B10.05，乳糖35，起始pH5.5。
CYM培养基(g/L)：葡萄糖20、麦芽糖10、酵母粉2、蛋白胨2、MgSO40.5、KH2PO44.6、琼脂10。
斜面培养：接种菌丝于土豆汁-葡萄糖-琼脂(PDA)斜面中28℃培养5-7天。
一级种子培养：在250mL摇瓶中添加40mL培养基和10mL菌丝体悬液(从一支斜面中获得)，并在30℃，120rpm下培养5天。
二级种子培养：在250mL摇瓶中加入45mL培养基和5mL一级种子培养液(大约500mgDW/L，一级培养物用玻璃珠打碎后接种)，在30℃，120rpm下培养2天。
发酵培养：在250mL摇瓶中加入45mL发酵培养基和5mL二级种子发酵液(大约500~600mgDW/L，二级培养物用玻璃珠打碎后接种)，在30℃，120rpm下培养。
6、单体灵芝酸的分离和提取
准确称取干细胞粉末100mg，加入3mL70%（v/v）乙醇浸泡过夜，超声处理3次，每次30min。10000rpm离心5min后获得上清液。在50℃烘箱中烘干。用200μL色谱级甲醇彻底溶解，用0.22μm滤膜过滤。用HPLC检测灵芝酸单体。HPLC检测条件为：HPLC色谱柱为C18柱（Agilent1200series，5μmAgilentZorbaxSB-C18column，250×4.6mm）；进样量20μL；流速1mL/min；流动相A为甲醇/乙酸（100:0.5（v/v）），流动相B为超纯水，0-20min：A相为80%-100%等梯度洗脱；20min-30min：A相为100%洗脱；30min-35min：A相为80%洗脱；紫外检测波长为245nm；洗脱时间35min。记录相应的峰面积和出峰时间。按照标准曲线计算出各个灵芝酸单体的浓度和含量。
本发明的优点和技术效果：通过摇瓶发酵实验表明，LS转化子菌株产单体灵芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S的含量分别是WT菌株的2.1，1.6，2.35，1.3倍。在同等情况下，使用本发明构建的工程菌株可以节约劳动力，缩短生产周期，降低成产成本。因此，本高产菌株可以作为生产灵芝酸的工程菌株，适用于工业化生产，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明中灵芝基因组，图中：G为灵芝基因组，M为DNAMarker；
图2为本发明中pJW-EXP载体结构示意图；
图3为本发明中扩增LS基因的电泳图；图中：M为500bpDNALadder(DyePlus)的核酸标准品(Takara)；L为LS基因；
图4为本发明中pJW-EXP-LS载体结构示意图；
图5为本发明中验证LS阳性转化子的电泳图；图中：M为500bpDNALadder(DyePlus)的核酸标准品(Takara)，P为阳性对照，L为转LS基因的阳性转化子，WT为野生型菌株，N为阴性对照。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1：pJW-EXP载体的构建
1、灵芝基因组DNA的提取
称取约0.2g冻干野生型灵芝(CCGMC5.0616)的菌丝体在液氮中研磨成粉末，将粉末转入1.5mL经65℃预热的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)抽取缓冲液中，65℃保温30min，然后在4℃下，10000g离心20min，取上清液加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)的混合物，轻轻摇匀30min以上，4℃下、10000g离心20min；将上清液移入1.5mL离心管后，加入2/3体积经-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，用玻璃棒捞出DNA后，用75%的乙醇洗涤2-3次，室温凉干后，溶于适量含20μg/mLRNase的TE，37℃消化RNA30min后即可到灵芝基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳结果显示：灵芝的基因组为单一条带，且大小在10000bp以上(见图1)。
2、灵芝强启动子的克隆
以灵芝基因组DNA为模板，用P-gpd-F、P-gpd-R作为引物进行PCR扩增，扩增得到灵芝的启动子P-gpd，引物序列如下：
P-gpd-F：5’-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC-3’，
P-gpd-R：5’-GCTAGCGTTGAGAGGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG-3’；
PCR条件如下：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃90s，72℃10min。
3、启动子P-gpd与PMD19-T连接
将克隆后的启动子P-gpd进行胶回收，将回收产物与PMD19-T用T4连接酶在16℃进行连接，得到PMD19-T-P中间载体。
4、灵芝终止子的克隆
以灵芝基因组DNA为模板，用引物
T-sdhB-F：5’-ATGAGCGGGTCAGAGAGT-3’
T-sdhB-R：5’-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT-3’
进行扩增，得到440bp的序列；PCR条件为：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，72℃10min。
5、终止子T-sdhB与PMD19-T-P连接
将克隆后的终止子T-sdhB胶回收，把PMD19-T-P中间载体用SacI单酶切，PCR回收酶切产物，再用T4聚合酶补平酶切位点，然后再用T4连接酶在16℃进行平末端连接，得到PMD19-T-P-T中间载体。
6、cbx基因的克隆
以灵芝基因组DNA为模板，用引物
cbx-F：5’-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3’
cbx-R：5’-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3’进行PCR得到灵芝的sdhB基因；PCR条件为：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃90s，72℃10min；再设计一对定点突变引物：
sdhB-MR：5'-GAAGATCGTGAGGCAGCGGTATAGGC-3'(其中A为突变位点)
sdhB-MF：5'-GCCTATACCGCTGCCTCACGATCTTC-3'(其中T为突变位点)。
第一轮PCR用引物cbx-F和sdhB-MR进行扩增，PCR条件为：95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃2min20s，72℃10min，得到片段sdhB1；第二轮PCR用引物cbx-R和sdhB-MF进行扩增，PCR条件为：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃1min20s，72℃10min，得到片段sdhB2；获得相应片段后，采用重叠PCR的方法把两个片段连接。第三轮重叠PCR的引物为cbx-F和cbx-R，扩增条件为：94℃变性10min，66℃退火30s，72℃延伸4min，共35个循环，最后72℃延伸10min。最终获得了3171bp突变的灵芝sdhB基因序列(定点突变后对carboxin抗生素产生抗性，我们把定点突变后的sdhB基因定义为cbx)。经序列测定后确认相应位点已经突变。
7、将突变的cbx基因插入到PMD19-T-P-T的PstI酶切位点
将PMD19-T-P-T载体用PstI酶在37℃下，单酶切2h，回收酶切后的片段，用T4聚合酶补平酶切位点，再用T4连接酶在16℃下把cbx基因与回收后的片段进行连接，即得到pJW-EXP载体(见图2)。
实施例2：pJW-EXP-LS载体的构建
1、LS基因的克隆
以灵芝基因组DNA为模板，用引物
LS-Nhe-F：5’-GCTAGCATGGCAGCGTACGCCCCG-3’
LS-Sma-R：5’-CCCGGGCTACTTCTTGGCGTGCAACTCCTTG-3’；
进行PCR得到LS基因；PCR条件为：95℃10min，95℃30s，61℃30s，72℃4min10s，72℃10min(见图3)。
2、将LS基因插入到pJW-EXP载体
将pJW-EXP载体用SmaI和NheI双酶切，回收酶切后的片段，用T4连接酶在16℃下，将LS基因插入到pJW-EXP载体的NheI和SmaI之间即得到pJW-EXP-LS载体(见图4)。
实施例3：通过PEG介导原生质体融合的方法，将pJW-EXP-LS转化到野生型灵芝细胞中
1、灵芝原生质体的制备及转化
先用溶壁酶将野生型灵芝菌丝制备成原生质体，然后将灵芝原生质体悬浮在100μL的STC(0.55M的山梨醇，10mM的CaCl2，10mM的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5)中，再加入1μg的质粒DNA和PTC缓冲液(60%的PEG4000(W/V)，10mM的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5，50mM的CaCl2)；在冰上培养10min，再加入1mL的PTC缓冲液混合均匀并在室温培养20min；用10mL融化的CYM固体培养基与转化后的原生质体混合倒平板并加入carboxin使carboxin的终浓度为2mg/L；在30℃下培养10天后可长出若干单菌落。
2、在含有carboxin抗性的平板上传代培养
把单菌落转移到含有2mg/L的carboxin的CYM平板中，在30℃下传代培养约7天；经过3次在抗性平板上传代可获得稳定的转化子，用CTAB法提取转化后的灵芝基因组，具体操作步骤见实施例1步骤1。分别以转化后的灵芝基因组、pJW-EXP-LS质粒(阳性对照)、野生型(WT)灵芝基因组、水(阴性对照)为模板，用
LS-gpd-F：5’-AACAATCACGATGGTCCCG-3’
LS-gpd-R：5’-GAACGAGCGATGTAGTCAGG-3’
作为验证引物进行PCR，PCR条件为：95℃10min，95℃30s，55℃30s，72℃2min，72℃10min(见图5)。由于P-gpd和LS基因在真菌表达载体pJW-EXP-LS中连接在一起，以LS-gpd-F(位于灵芝gpd基因的启动子上)和LS-gpd-R(位于灵芝LS基因上)为引物和基因组DNA为模板进行PCR，能够扩增出约3500bp条带的菌株即可认为是导入了LS基因的转基因灵芝。如图5所示，从转基因菌株和阳性对照上能够扩增出约3500bp的条带，而野生型中没有出现此条带，只出现了一些非特异性条带。结果表明：LS基因确实整合到了灵芝基因组上。
3、斜面培养
将阳性转化子转移到固体PDA培养基中(含有2mg/L的carboxin)，在28℃下培养5-7天。
4、一级种子培养
在250mL摇瓶中添加40mL种子培养基和10mL菌丝体悬液(从一支斜面中获得)，并在28℃，120rpm下培养5天。
5、二级种子培养
在250mL摇瓶中加入45mL种子培养基和5mL一级种子培养液(大约500mgDW/L，一级培养物用玻璃珠打碎后接种)，在28℃，120rpm下培养2天。
6、发酵培养
在250mL摇瓶中加入45mL发酵培养基和5mL二级种子发酵液(大约500~600mgDW/L，二级培养物用玻璃珠打碎后接种)，在28℃，120rpm下培养。
7、单体灵芝酸的分离和提取
准确称取干细胞粉末100mg，加入3mL70%（v/v）乙醇浸泡过夜，超声处理3次，每次30min。10000rpm离心5min后获得上清液。在50℃烘箱中烘干。用200μL色谱级甲醇彻底溶解，用0.22μm滤膜过滤。用HPLC检测灵芝酸单体。HPLC检测条件为：HPLC色谱柱为C18柱（Agilent1200series，5μmAgilentZorbaxSB-C18column，250×4.6mm）；进样量20μL；流速1mL/min；流动相A为甲醇/乙酸（100:0.5（v/v）），流动相B为超纯水，0-20min：A相为80%-100%等梯度洗脱；20min-30min：A相为100%洗脱；30min-35min：A相为80%洗脱；紫外检测波长为245nm；洗脱时间35min。记录相应的峰面积和出峰时间。按照标准曲线计算出各个灵芝酸单体的浓度和含量。
通过摇瓶发酵实验表明，LS转化子菌株产单体灵芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S的含量分别是WT菌株的2.1，1.6，2.35，1.3倍。在同等情况下，使用本发明构建的工程菌株可以节约劳动力，缩短生产周期，降低成产成本。因此，本高产菌株可以作为生产灵芝酸的工程菌株，适用于工业化生产，具有广泛的应用前景。
序列表
<110>昆明理工大学
<120>一种灵芝酸高产工程菌株Kmust-LS
<160>14
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>2983
<212>DNA
<213>灵芝菌株CCGMC5.0616
<400>1
atggcagcgtacgccccgctcgacctccccgcctccggtgcgctccccttcacggactac60
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Claims (1)

1.一种灵芝酸高产工程菌株Kmust-LS，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO.11603。
CN201610001941.6A 2016-01-06 2016-01-06 一种灵芝酸高产工程菌株Kmust-LS Pending CN105462865A (zh)

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