CN106929530B - 一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵技术领域，公开了一种提高酵母细胞对复合抑制剂的方法以及获得酵母菌株。本发明所述提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法通过基因工程技术构建包含表达异源全局调控因子PprI或PprI突变体的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的异源全局调控因子PprI或PprI突变体，使得酵母细胞内多个基因的转录水平同时发生改变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控，从而有利于获得理想的耐受性状，提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受性。本发明所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416‑HXT7p‑PprI/PprI突变体‑TEF1t的酵母菌株。实验结果表明本发明所述酵母菌株耐受性能显著增强。

Description

一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株，尤其是利用异源全局调控因子PprI提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株。
背景技术
人类社会对化石能源的依赖延伸到生活的方方面面。然而，由于化石燃料的不可再生性，石油逐渐成为困扰世界各国经济和社会发展的重大问题。为了应对日益严重的能源危机，以木质纤维素如农作物秸秆、城市固体垃圾等为原料，通过微生物发酵生产新的可替代能源-燃料乙醇成为各国研究者关注的热点。然而木质纤维素原料预处理过程中的高温高压条件会导致一系列对微生物细胞有毒的物质产生，主要包括呋喃类、弱酸类和酚类等，其中糠醛、乙酸和苯酚是三类抑制剂的典型代表。
酿酒酵母作为生产乙醇的传统菌株，广泛应用于工业生产中。天然的酿酒酵母对预处理过程中产生的大量抑制剂具有较低的耐受能力，影响后续的发酵效率和乙醇得率。而传统的脱毒步骤增加操作成本，降低纤维素乙醇的价格竞争优势。因此提高酵母菌株对抑制剂耐受性，尤其是对三种代表复合抑制剂的耐受能力，对推进纤维素乙醇的工业化生产具有重要意义。
研究表明酿酒酵母对复合抑制剂的耐受是一个受多基因调控的复杂性状。目前文献已报到的耐受菌株大都针对某一个单一的抑制剂，已报道的可直接调控菌株对抑制剂耐受性的靶基因较少，尤其是对复合抑制剂耐受相关的基因。通过定向改造某一个目标基因，很难实现酵母细胞耐受性能的增强。而对复合抑制剂耐受相关基因的解析是个繁琐和耗时的过程，从而限制了利用定向改造策略提高菌株耐受性。其次，不同抑制剂之间存在明显的协同和拮抗作用，且抑制剂的耐受性是一个多基因调控的复杂性状，因此定向的改造某一个代谢途径或功能基因很难提高酵母菌株对复合抑制剂的耐受能力，或者细胞获得的耐受能力难以达到自己预期的水平。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法，构建含有异源全局调控因子PprI或PprI突变体的重组质粒，转化酵母细胞。
在一些实施方案中，所述重组质粒为pRS416-HXT7p-PprI/PprI突变体-TEF1t。
其中，所述异源全局调控因子PprI具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明所述方法中所述PprI突变体具有SEQ ID NO:2-4之一所示的氨基酸序列。
本发明提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法中所述转化酵母细胞为酿酒酵母宿主菌。
在一些实施方案中，酿酒酵母宿主菌为酿酒酵母宿主菌BY4742。
本发明还提供了耐受复合抑制剂的酵母菌株，包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t的酵母菌株或包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI突变体-TEF1t的酵母菌株。
在一些实施方案中，所述酵母菌株为酿酒酵母宿主菌BY4742。
优选的，所述PprI突变体具有SEQ ID NO:2-4之一所示的氨基酸序列。
实验表明，本发明所述酵母菌株能明显增强对复合抑制剂的耐受性。因此，本发明还提供所述耐受复合抑制剂的酵母菌株在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇中的应用。
本发明还提供一种在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇的方法，将本发明所述耐受复合抑制剂的酵母菌株接种纤维素水解液发酵。
由上述技术方案可知，本发明提供了提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株。本发明所述提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法通过基因工程技术构建包含表达异源全局调控因子PprI或PprI突变体的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的异源全局调控因子PprI或PprI突变体，使得酵母细胞内多个基因的转录水平同时发生改变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控，从而有利于获得理想的耐受性状，提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受性。本发明所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t的酵母菌株或包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI突变体-TEF1t的酵母菌株，尤其是酵母菌株BY4742/PprI(SyBE_Sc0150024)、BY4742/I12(SyBE_Sc0150025)、BY4742/I24(SyBE_Sc0150027)和BY4742/I37(SyBE_Sc0150036)。实验结果表明本发明所述酵母菌株耐受性能显著增强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1所述pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t质粒谱图；
图2示实施例1所述PprI在酿酒酵母中的表达对其在复合抑制剂环境下生长能力的影响图；
图3示实施例3所述PprI突变体I12在酿酒酵母中的表达对其在复合抑制剂环境下发酵能力的影响图；
图4示实施例3所述PprI突变体I24在酿酒酵母中的表达对其在复合抑制剂环境下发酵能力的影响图；
图5示实施例3所述PprI突变体I37在酿酒酵母中的表达对其在复合抑制剂环境下发酵能力的影响图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法，构建含有异源全局调控因子PprI或PprI突变体的重组质粒，转化酵母细胞。
全局转录调控因子可以同时修饰细胞内多个基因的转录水平，更有利于实现细胞表型的强化。PprI是来源于耐辐射球菌的一个全局调控因子，辐射条件下可以调节DNA损伤修复，同时影响细胞内的转录调控、压力响应和能量代谢等路径。PprI蛋白的表达可以提高大肠杆菌对糠醛、5-羟甲基糠醛和香草醛的耐受性以及对乙醇、丁醇和乙酸的耐受能力，同时使得运动发酵单胞菌在乙酸和乙醇压力条件下的生长能力和乙醇生产能力得到增强。而大肠杆菌、运动发酵单胞菌同耐辐射球菌均为原核生物，同源性比较近，能较容易实现PprI的异源表达和调控。
本发明通过基因工程技术构建包含表达异源全局调控因子PprI的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的异源全局调控因子PprI，使得酵母细胞内多个基因的转录水平同时发生改变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控。
在一些实施方案中，所述重组质粒为pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t。
其中，所述异源全局调控因子PprI具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本领域技术人员可以按照公知的方法构建本发明所述重组质粒。
在一些实施方案中，本发明所述方法分别扩增启动子HXT7p和终止子TEF1t，酶切后依次将启动子HXT7p和终止子TEF1t连入质粒pRS416中得到质粒pRS416-HXT7p-TEF1t；然后扩增基因PprI，酶切后插入到质粒pRS416-HXT7p-TEF1t中启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t，质粒谱图如图1所示。
在一些实施方案中，本发明通过构建包含表达异源全局调控因子PprI突变体的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的异源全局调控因子PprI突变体，同样可以使得酵母细胞内多个基因的转录水平同时发生改变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控。所述PprI突变体为异源全局调控因子PprI的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列。所述重组质粒为pRS416-HXT7p-PprI突变体-TEF1t。
所述的氨基酸取代、缺失或添加，可以在氨基酸序列的任意位点进行，只要具有改造后的氨基酸序列的整合到酵母细胞中能够使得酵母细胞内多个基因的转录水平同时发生改变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控即可。
类似的，所取代、缺失或添加的氨基酸的数目也是任意的，只要具有改造后的氨基酸序列的整合到酵母细胞中能够使得酵母细胞内多个基因的转录水平同时发生改变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控即可。
在一些实施方案中，所述PprI突变体的突变位点为M74T、I103T、S133R、P162S、V204A、V299A、A300V。即异源全局调控因子PprI氨基酸序列中74位M突变为T、103位I突变为T、133位S突变为R、162位P突变为S、204位V突变为A、299位V突变为A、300位A突变为V。所述PprI突变体命名为PprI突变体I12，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述PprI突变体的突变位点为A52E、E119V、L160F、R244G。即氨基酸序列中52位A突变为E、119位E突变为V、160位L突变为F、244位R突变为G。所述PprI突变体命名为PprI突变体I24，具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述PprI突变体的突变位点为A52E、L57P、L65P、E119V、L160F、M169V、R244G、E271K，且第825位碱基缺失。即异源全局调控因子PprI氨基酸序列中74位M突变为T、103位I突变为T、133位S突变为R、162位P突变为S、204位V突变为A、299位V突变为A、300位A突变为V。所述PprI突变体命名为PprI突变体I37，具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
本领域技术人员可以按照上述方法构建本发明所述重组质粒pRS416-HXT7p-PprI突变体-TEF1t。扩增PprI突变体，酶切后插入到质粒pRS416-HXT7p-TEF1t中启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS416-HXT7p-PprI突变体-TEF1t。
本发明提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法中所述转化酵母细胞为酿酒酵母宿主菌。
在一些实施方案中，酿酒酵母宿主菌为酿酒酵母宿主菌BY4742。
本发明也提供了耐受复合抑制剂的酵母菌株。
在一些实施方案中，所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t的酵母菌株。
在另一些实施方案中，所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI突变体-TEF1t的酵母菌株。
优选的，所述酵母菌株为酿酒酵母宿主菌BY4742。
在一些具体实施例中，所述耐受复合抑制剂的酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t的酿酒酵母宿主菌BY4742，命名为BY4742/PprI(SyBE_Sc0150024)。
在一些具体实施例中，所述耐受复合抑制剂的酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI突变体I12-TEF1t的酿酒酵母宿主菌BY4742，命名为BY4742/I12(SyBE_Sc0150025)。
在一些具体实施例中，所述耐受复合抑制剂的酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI突变体I24-TEF1t的酿酒酵母宿主菌BY4742，命名为BY4742/I24(SyBE_Sc0150027)。
在一些具体实施例中，所述耐受复合抑制剂的酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI突变体I37-TEF1t的酿酒酵母宿主菌BY4742，命名为BY4742/I37(SyBE_Sc0150036)。
实验表明，本发明所述酵母菌株能明显增强对复合抑制剂的耐受性。因此，本发明还提供所述耐受复合抑制剂的酵母菌株在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇中的应用。
其中，所述复合抑制剂为糠醛、乙酸和苯酚。
本发明还提供一种在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇的方法，将本发明所述耐受复合抑制剂的酵母菌株接种纤维素水解液发酵。
由上述技术方案可知，本发明提供了提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受能力的方法以及获得酵母菌株。本发明所述提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法通过基因工程技术构建包含表达异源全局调控因子PprI或PprI突变体的重组质粒，转化酵母细胞，通过酵母菌株中的异源全局调控因子PprI或PprI突变体，使得酵母细胞内多个基因的转录水平同时发生改变，实现对酵母细胞耐受纤维素水解抑制物能力的调控，从而有利于获得理想的耐受性状，提高酵母细胞对复合抑制剂糠醛、乙酸和苯酚耐受性。本发明所述酵母菌株为包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t的酵母菌株或包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI突变体-TEF1t的酵母菌株，尤其是酵母菌株BY4742/PprI(SyBE_Sc0150024)、BY4742/I12(SyBE_Sc0150025)、BY4742/I24(SyBE_Sc0150027)和BY4742/I37(SyBE_Sc0150036)。实验结果表明本发明所述酵母菌株耐受性能显著增强。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：PprI的表达增强酵母细胞在复合抑制剂条件中的生长能力
1、培养基的配制
SC-Ura液体培养基：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，氨基酸缺省混合物2g/L，20mg/L组氨酸，20mg/L亮氨酸，20mg/L色氨酸，115℃灭菌15min。
SC-Ura固体培养基：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，氨基酸缺省混合物2g/L，20mg/L组氨酸，20mg/L亮氨酸，20mg/L色氨酸，20g/L琼脂粉，115℃灭菌15min。
发酵培养基：SC-Ura液体培养基，在接种前加入纤维素水解液抑制剂糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量为0.78g/L，乙酸的含量为3.18g/L，苯酚的含量为0.3g/L。
2、质粒构建与酵母转化
2.1、质粒构建
以酿酒酵母S288C的基因组为模版，以表1中的HXT7p_F为上游引物，HXT7p_R为下游引物，扩增启动子HXT7p；以表1中的TEF1t_F为上游引物，TEF1t_R为下游引物，扩增终止子TEF1t。使用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切启动子HXT7p片段，利用连接体系1将片段HXT7p连入质粒pRS416，形成质粒pRS416-HXT7p。使用限制性内切酶SalI和XhoI酶切终止子TEF1t片段和质粒pRS416-HXT7p，利用连接体系2将片段TEF1t同时连入质粒pRS416-HXT7p中，得到质粒pRS416-HXT7p-TEF1t。
表1引物序列
基因PprI经密码子优化后，由基因公司合成，连接到质粒pUC19上。以PprI_F为上游引物，PprI_R为下游引物，以质粒pUC19为模版，扩增基因PprI。之后使用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切片段PprI和质粒pRS416-HXT7p-TEF1t，利用连接体系3将基因PprI插入到启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，得到质粒pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t，质粒谱图如图1所示。
其中PCR扩增体系为100μL：64.5μL ddH2O，20μL 5×Buffer，1μL DNA聚合酶，2.5μL 10mM dNTP，4μL基因组模板，4μL上游引物，4μL下游引物。
PCR反应条件为：95℃5min进行1轮；95℃30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30-60s，进行30轮；72℃延伸10min进行1轮。柱回收PCR产物，50μL洗脱液溶解DNA样品。酶切反应体系50μL：40μL DNA片段，5μL 10×Buffer，2.5μL酶1，2.5μL酶2；37℃酶切反应30min-50min，之后柱回收酶切产物，30μL洗脱液溶解DNA片段。
连接体系1为10μL：HXT7p片段7μL，载体1.5μL，10×Buffer 1μL，连接酶1μL。连接体系2为10μL：TEF1t片段7μL，载体1.5μL，10×Buffer 1μL，连接酶1μL。连接体系3为10μL：PprI片段7μL，载体1.5μL，10×Buffer 1μL，连接酶1μL。反应条件：22℃，30min。每次的连接产物都需转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，获得平板转化子，利用M13F与M13R这两个引物进行菌落PCR，筛选阳性转化子。将阳性转化子接到LB-Amp液体培养基中，培养12小时，保存一份菌液，取少量样品送交公司进行DNA测序，将测序正确的质粒用于酵母转化。
2.2、酵母转化
将质粒pRS416，S416-HXT7p-PprI-TEF1t转化酵母菌株BY4742。酵母转化采用传统的醋酸锂法：菌株BY4742在液体YPD培养基中30℃培养过夜，以初始OD600＝0.1接种于5mL液体YPD中培养5～7h，1.5mL离心管5000rpm收集细胞，水洗一遍，离心弃水，之后向细胞中加入1mL 0.1mol/L的LiAc，离心弃废液，重复两遍，第二次尽量吸除LiAc，向残余细胞中分别加入40μL、10μL粒DNA、240mL PEG(50％m/V)、36μL1.0mol/L LiAc、25μL ssDNA，剧烈震荡直至细胞完全混匀，30℃培养箱保温30min，42℃水浴中热激25min，4000rpm离心2min，弃上清，加入1mL无菌水，用小枪吹匀细胞后，4000rpm离心2min，弃上清，将细胞在无菌水中悬浮涂在SC-Ura平板上，30℃培养箱上培养。酵母转化子在SC-Ura培养基上筛选，获得质粒pRS416表达的菌株BY4742/pRS416(SyBE_Sc0150011)和质粒pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t表达的菌株BY4742/PprI(SyBE_Sc0150024)。
3、发酵
将菌株BY4742/pRS416(SyBE_Sc0150)，BY4742/PprI(SyBE_Sc0150024)在含有SC-Ura固体培养基上活化，后挑去单菌落接种于5mL的SC-Ura液体培养基中，在30℃、150rpm条件下培养12h。将一级种子接种于100mL种子液体培养基中，在30℃、150rpm条件下培养16h-20h。然后以OD600＝0.2的初始菌体浓度接种于100mL发酵培养基中，于30℃、150rpm条件下培养，测定培养过程中菌体的生长曲线。结果如图2所示。
图2结果显示，在抑制剂培养条件下，原始菌株BY4742/pRS416约在153h进入生长稳定期，而质粒pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t的表达，使得菌株BY4742/PprI的发酵时间缩短到115h。表明在酿酒酵母细胞中表达异源全局调控因子PprI能增强酵母菌株对复合抑制剂糠醛、苯酚和乙酸的耐受性。
实施例2：PprI定向进化突变体
1、培养基的配制
SC-Ura液体培养基：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，氨基酸缺省混合物2g/L，20mg/L组氨酸，20mg/L亮氨酸，20mg/L色氨酸，115℃灭菌15min。
SC-Ura固体培养基：葡萄糖20g/L，YNB 6.7g/L，氨基酸缺省混合物2g/L，20mg/L组氨酸，20mg/L亮氨酸，20mg/L色氨酸，20g/L琼脂粉，115℃灭菌15min。
发酵培养基：SC-Ura液体培养基，在接种前加入纤维素水解液抑制剂糠醛、苯酚和乙酸，使得糠醛的含量为0.78g/L，乙酸的含量为3.18g/L，苯酚的含量为0.3g/L。
2、PprI突变库的构建以及突变体的筛选
以表1中的PprI_F为上游引物，PprI_R为下游引物，以质粒pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t为模版，利用PCR体系1扩增PprI片段，得到含有不同突变位点的PprI片段。之后使用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切PprI片段和质粒pRS416-HXT7p-TEF1t，利用连接体系1将片段PprI插入到启动子HXT7p和终止子TEF1t中间，转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，获得平板转化子。之后用无菌水清洗平板上的转化子，混合离心，提取质粒，得到含有不同PprI突变体的混合质粒，即为所构建的PprI突变库，用于酵母转化。
其中PCR扩增体系1为100μL：33μL ddH2O，10μL 10×Taq Buffer，1μL Taq酶，10μL10×dNTP(2mM dATP,2mM dGTP，5mM dGTP,5mM dCTP),4μL质粒模板，4μL上游引物PprI_F，4μL下游引物PprI_R，28μL 25mM Mg2+，7μL 50mM MnCl2。PCR反应条件为：95℃5min进行1轮；95℃30s，50-60℃退火30s，72℃延伸45s，进行30轮；72℃延伸10min进行1轮。柱回收PCR产物，50μL洗脱液溶解DNA样品。酶切反应体系50μL：40μL DNA片段，10μL10×Buffer，2.5μL酶EcoRI，2.5μL酶SalI；37℃酶切反应30min-50min，之后柱回收酶切产物，30μL洗脱液溶解DNA片段。连接体系为10μL：PprI片段7μL，载体1.5μL，10×Buffer 1μL，连接酶1μL。反应条件：22℃，30min。
3、酵母转化
将PprI突变质粒库转化酵母菌株BY4742。酵母转化采用传统的醋酸锂法：菌株BY4742在液体YPD培养基中30℃培养过夜，以初始OD600＝0.1接种于5mL液体YPD中培养5h～7h，1.5mL离心管5000rpm收集细胞，水洗一遍，离心弃水，之后向细胞中加入1mL 0.1mol/L的LiAc离心弃废液，重复两遍，第二次尽量吸除LiAc，向残余细胞中分别加入40μL水、10μL质粒DNA、240mL PEG(50％m/V)、36μL1.0mol/L LiAc、25μL ssDNA，剧烈震荡直至细胞完全混匀，30℃培养箱保温30min，42℃水浴中热激25min，4000rpm离心2min，弃上清，加入1mL无菌水，用小枪吹匀细胞后，4000rpm离心2min，弃上清，将细胞在无菌水中悬浮涂在SC-Ura平板上，30℃培养箱上培养，得到含有转化子的平板。挑取1000-2000个单克隆，在含有发酵培养基的96孔板中培养24h，测量细胞生长密度，挑取其中60个细胞密度较大的菌株在含有发酵培养基的试管中进一步培养筛选，进而选取性状较强的菌株(较高生长密度)在含有发酵培养基的摇瓶中培养，从而筛选得到三个耐受性能增强的突变菌株BY472/I12(SyBE_Sc0150025)、BY472/I24(SyBE_Sc0150027)和BY472/I37(SyBE_Sc0150036)。
其中，突变菌株BY472/I12(SyBE_Sc0150025)中PprI的突变位点为M74T、I103T、S133R、P162S、V204A、V299A、A300V。即氨基酸序列中74位M突变为T、103位I突变为T、133位S突变为R、162位P突变为S、204位V突变为A、299位V突变为A、300位A突变为V；所述PprI突变体命名为PprI突变体I12，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
突变菌株BY472/I24(SyBE_Sc0150027)中PprI的突变位点为A52E、E119V、L160F、R244G。即氨基酸序列中52位A突变为E、119位E突变为V、160位L突变为F、244位R突变为G；所述PprI突变体命名为PprI突变体I24，具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
突变菌株BY472/I37(SyBE_Sc0150036)中PprI的突变位点为A52E、L57P、L65P、E119V、L160F、M169V、R244G、E271K，且第825位碱基缺失。即氨基酸序列中52位A突变为E、57位L突变为P、65位L突变为P、119位E突变为V、160位L突变为F、169位M突变为V、244位R突变为G、270位E突变为K，且第825位碱基缺失，从第276位氨基酸开始发生移码突变；所述PprI突变体命名为PprI突变体I37，具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
实施例3：PprI定向进化突变体的表达对酵母细胞在复合抑制剂中的发酵能力的影响
1、PprI定向进化所得突变体I12的表达对酵母细胞在复合抑制剂中的发酵能力的影响
将菌株BY4742/pRS416(SyBE_Sc0150011)，BY4742/I12(SyBE_Sc0150025)在含有SC-Ura固体培养基上活化，后挑取单菌落接种于5mL的SC-Ura液体培养基中，在30℃、150rpm条件下培养12h。将一级种子接种于100mL种子液体培养基中，在30℃、150rpm条件下培养16h–20h。然后以OD600＝0.2的初始菌体浓度接种于100mL发酵培养基中，于30℃、150rpm条件下培养，测定培养过程中菌体的生长曲线，糖耗曲线以及乙醇生产曲线。结果见图3。
图3结果显示，在抑制剂培养条件下，PprI突变体I12的表达使得菌株BY4742/I12在48h左右完成发酵，而此时原始菌株BY4742/pRS416仍处于延滞期，直到153h左右进入生长稳定期。菌株BY4742/I12的葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率同原始菌株相比提高了约3倍。表明在酿酒酵母细胞中改造的异源全局调控因子PprI能增强酵母菌株对复合抑制剂的耐受性。
2、PprI定向进化所得突变体I24的表达增强酵母细胞对复合抑制剂中的发酵能力的影响
将菌株BY4742/pRS416(SyBE_Sc0150011)，BY4742/I24(SyBE_Sc0150027)在含有SC-Ura固体培养基上活化，后挑取单菌落接种于5mL的SC-Ura液体培养基中，在30℃、150rpm条件下培养12h。将一级种子接种于100mL种子液体培养基中，在30℃、150rpm条件下培养16h–20h。然后以OD600＝0.2的初始菌体浓度接种于100mL发酵培养基中，于30℃、150rpm条件下培养，测定培养过程中菌体的生长曲线，糖耗曲线以及乙醇生产曲线。结果见图4。
图4结果显示，在抑制剂培养条件下，PprI突变体I12的表达使得菌株BY4742/I24在42h左右完成发酵，而此时原始菌株BY4742/pRS416仍处于延滞期，直到153h左右进入生长稳定期。菌株BY4742/I24的葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率同原始菌株相比提高了约4倍。结果表明在酿酒酵母细胞中改造的异源全局调控因子PprI能增强酵母菌株对复合抑制剂的耐受性。
3、PprI定向进化所得突变体I37的表达增强酵母细胞对复合抑制剂中的发酵能力的影响
将菌株BY4742/pRS416(SyBE_Sc0150011)，BY4742/I37(SyBE_Sc0150036)在含有SC-Ura固体培养基上活化，后挑取单菌落接种于5mL的SC-Ura液体培养基中，在30℃、150rpm条件下培养12h。将一级种子接种于100mL种子液体培养基中，在30℃、150rpm条件下培养16h-20h。然后以OD600＝0.2的初始菌体浓度接种于100mL发酵培养基中，于30℃、150rpm条件下培养，测定培养过程中菌体的生长曲线，糖耗曲线以及乙醇生产曲线。结果见图5。
图5结果显示，在抑制剂培养条件下，PprI突变体I37的表达使得菌株BY4742/I37在33h左右完成发酵，而此时原始菌株BY4742/pRS416仍处于延滞期，直到153h左右进入生长稳定期。菌株BY4742/I37的葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率同原始菌株相比提高了约5倍。结果表明在酿酒酵母细胞中改造的异源全局调控因子PprI能增强酵母菌株对复合抑制剂的耐受性。

Claims (8)

1.一种提高酵母细胞对复合抑制剂耐受能力的方法，其特征在于，构建含有表达异源全局调控因子PprI或PprI突变体的重组质粒，转化酵母细胞；所述复合抑制剂为糠醛、乙酸和苯酚；所述异源全局调控因子PprI氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述PprI突变体氨基酸序列如SEQ ID NO:2-4之一所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组质粒为pRS416-HXT7p-PprI/PprI突变体-TEF1t。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酵母细胞为酿酒酵母宿主菌BY4742。
4.一种酵母菌株，其特征在于，包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI-TEF1t的酵母菌株或包含重组质粒pRS416-HXT7p-PprI突变体-TEF1t的酵母菌株；所述PprI氨基酸序列如SEQID NO:1所示；所述PprI突变体氨基酸序列如SEQ ID NO:2-4之一所示。
5.根据权利要求4所述酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母宿主菌BY4742。
6.根据权利要求4或5所述酵母菌株，其特征在于，所述PprI突变体氨基酸序列如SEQID NO:2-4之一所示。
7.权利要求4-6任意一项所述酵母菌株在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇中的应用。
8.一种在复合抑制剂存在下发酵生产纤维素乙醇的方法，其特征在于，权利要求4-6任意一项所述酵母菌株接种纤维素水解液发酵。
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