CN106701605A - 一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母sf4 - Google Patents

一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母sf4 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母SF4，涉及酿酒酵母技术领域。酿酒酵母SF4是通过寡肽链[‑(G4S1)3‑]链接的2个木糖利用酶即木糖还原酶XYL1和木糖醇氧化酶XYL2构成的融合蛋白基因；XYL1的基因序列如SEQ ID NO：1，XYL2的基因序列如SEQ ID NO：2，融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：3。将转基因工程酿酒酵母SF4应用于秸秆水解产物的乙醇发酵中。本发明的SF4菌株生长量比对照提高1.5倍；葡萄糖和木糖共发酵的发酵时，SF4菌株木糖利用率达到53.8%；芒草材料水解液的乙醇发酵中，乙醇产量菌株SF4提高4.5倍左右。

Description

一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母SF4
技术领域
本发明涉及酿酒酵母技术领域，尤其涉及一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母SF4。
背景技术
木糖是秸秆水解产物中含量最丰富的一种五碳糖，但是却不能被传统的酿酒酵母所利用。充分将木糖转化成乙醇是秸秆资源合理有效利用的关键性环节。应用基因工程构建重组酵母菌株，提高其木糖发酵能力在理论上完全可行，故近三十年来，国内外已有大量的转基因工程技术手段应用于改良酿酒酵母的报道，旨在获得和提高酿酒酵母发酵木糖的能力。虽已取得一定的进展，但相关转基因酵母仍然存在以下问题：1、乙醇产率较低；2、乙醇及发酵抑制物的耐受性不高；3、重组菌株稳定性不好；4、高浓度糖的耐受性不高。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母SF4。
本发明的目的是这样实现的：
一、转基因工程酿酒酵母SF4（简称酿酒酵母SF4）
酿酒酵母SF4是通过寡肽链[-(G4S1)3-]链接的2个木糖利用酶即木糖还原酶XYL1和木糖醇氧化酶XYL2构成的融合蛋白基因；
XYL1的基因序列如SEQ ID NO：1，XYL2的基因序列如SEQ ID NO：2，融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：3；
酿酒酵母SF4于2016年10月17日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国 武汉 武汉大学 邮编：430072），保藏编号为CCTCC NO：M 2016563。
该融合蛋白基因被证实不仅能够使天然不能利用木糖的酿酒酵母获得利用木糖的能力，能以木糖作为唯一碳源转化成为乙醇，还能够在以单一木糖、木糖+葡萄糖或稻草等秸秆水解液的发酵中，进行高效乙醇发酵。
二、酿酒酵母SF4的获得方法
将木糖代谢途径中关键酶基因木糖还原酶基因xyl1和木糖醇氧化酶基因xyl2通过寡肽-（G4S1）3-DNA序列连接，然后与木酮糖激酶基因 xks1一道构建到整合型表达载体pAUR101上，并转化到高温酿酒酵母SF7中。
对得到的酿酒酵母转化子进行生长曲线测定，转录水平测定，蛋白表达含量测定，酶活测定，木糖唯一碳源发酵产物含量测定，木糖葡萄糖共发酵产物含量测定，芒草秸秆材料稀硫酸预处理酶解后发酵产物含量测定实验。
三、转基因工程酿酒酵母SF4的应用
秸秆是最丰富的资源之一，我国每年未被利用的农作物秸秆资源达5亿吨之多；农作物秸秆的基本成分是半纤维素、纤维素和木质素，这三者大约各占30%的比例；传统的酿酒酵母只能利用其中的纤维素分解产物，这是以秸秆酿造乙醇未能产业化的重要瓶颈之一。
将转基因工程酿酒酵母SF4应用于秸秆水解产物的乙醇发酵中；
除了具备传统的酿酒酵母生产菌株对该产物中纤维素分解后的6碳糖高效利用以外，还能够高效发酵利用该产物中半纤维素分解后的5碳糖，大大提高对原料资源的利用率。
本发明具有下列优点和积极效果：
1、RT-PCR结果表明：融合表达基因xyl1-（G4S1）3-xyl2 的SF4菌株中xyl1基因表达比对照明显增强，SF4菌株xyl2基因表达明显增强，xks1基因表达中SF4与对照相比无明显差异；
2、SDS-PAGE结果表明：xyl1-(G4S1)3-xyl2表达的融合蛋白有较强表达；
3、酶活测定结果表明：XYL1酶活菌株SF4比对照提高0.3倍，XYL2酶活菌株SF4比对照提高17.3倍；
4、发酵生长曲线测定结果表明：重组菌株可以在木糖唯一碳源培养基上生长，其中SF4菌株生长量比对照提高1.5倍；
5、木糖唯一碳源发酵时，SF4利用率可达95%，但其乙醇产量只有4.6%，为理论产量的10%；葡萄糖和木糖共发酵的发酵时，SF4菌株木糖利用率达到53.8%；
6、芒草材料水解（稀硫酸+酶解）液的乙醇发酵中，与对照菌株相比，菌株SF4五碳糖利用率提高0.8～0.6倍；乙醇产量菌株SF4提高4.5倍左右。
附图说明
图1是pYPGE15XYL1-(G4S1)1-XYL2和pYPGE15XYL1-(G4S1)3-XYL2载体鉴定，
1：pYPGE15，
2：pYPGE15XYL1，
3：pYPGE15XYL2，
4：pYPGE15XYL1-(G4S1)1-XYL2，
5：ddH2O，6: pYPGE15，
7：pYPGE15XYL1，
8：pYPGE15XYL2，
9：pYPGE15XYL1-(G4S1)3-XYL2，
10：ddH2O，
M：2k plus；
图2是pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2菌落PCR鉴定；
图3是pAUR101-XYL1、pAUR101-XYL2、pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2 载体质粒酶切检测，
1：pAUR101-XYL1，
2：pAUR101-XYL1 Sac I和Apa I双酶切，
3：pAUR101-XYL2，
4：pAUR101-XYL2 Sac I和Apa I双酶切，
5：pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2，
6：pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2 Sac I和Sal I双酶切，
7：Trans 2K Plus DNA Marker；
图4是pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2-XKS1菌落PCR和双酶切鉴定，
A中，1-3：XKS1a/W3F，4、8：ddH2O；
B中，xyl2a/W2F；
图5是SF7酵母转化子鉴定，
A中，1-2：SF-CK，3：pAUR101，4：SF7，5：SF1，6：ddH2O；
B中，1-2：SF71，3：pA101-XYL1，4-5：SF72，6：pA101-XYL2，
7-8：SF73，9：pA101-XKS1，10：SF7，11：ddH2O；
图6是SF7酵母转化子鉴定，
A中，1-2：SF4，3：pA-XYL1-(G4S1)3-XYL2XKS1，4：SF7，5：ddH2O；
B中，1-4：SF5，5：pA1-XYL2XYL1XKS1，6：SF7，7：ddH2O；
图7是XYL1、XYL2和XKS1基因表达RT-PCR分析；
图8是XYL1、XYL2和XKS1共表达鉴定；
图9是XYL1、XYL2和XKS1整合型表达鉴定；
图10是转基因酵母与对照菌株在20g/L木糖唯一碳源发酵37℃时生长曲线；
图11是20g/L木糖唯一碳源限氧发酵木糖含量测定。
酿酒酵母SF4于2016年10月17日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国 武汉 武汉大学 邮编：430072），保藏编号为CCTCC NO：M 2016563。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明：
一、酿酒酵母SF4的应用步骤
SF4→甘油管保存菌种→YPD培养基（2%葡萄糖、1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.03 g腺嘌呤、固体添加2%琼脂）斜面活化→YPD培养基液体三角瓶种子→按照0.1～0.5%量接入秸秆水解液或木糖溶液中→静止发酵48～72小时→发酵液80～100℃蒸馏→冷却得到乙醇。
二、重组菌株构建、验证的方法与技术路线
序列表显示的是SF4中包含有xyl1-(G4S1)3-xyl2基因的核苷酸序列（序列5）。
1、SF4的构建及其功能的验证
1）pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建
由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽（序列4），因此设计了如下引物：
FP1-1Fi：5’-CCGGAATTCATGTCTACTACTCCTACTATTCCTAC-3’（序列6）；
FP1-1Ri：5’-CGGGGTACCACCACCAACAAAGATTGGAATGTTGTC-3’（序列7）；
FP2-1Fi：5’-CGGGGTACCGGTGGTTCTATGACTGCAAACCCATCCTTAG-3’（序列8）；
FP2-1Ri：5’-CGGGGTACCCTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’（序列9）；
FP1-1上游引物引入EcoR I酶切位点，下游引物引入Kpn I酶切位点；
FP2-1上游和下游引物均引入Kpn I酶切位点。
以热带假丝酵母基因组DNA为模板，采用FP1-1引物，用KOD Plus高保真酶扩增XYL1基因（序列1），Tm=56℃，延伸1.5 min，回收此PCR产物，同时提取载体pYPGE15质粒，将扩增片段和载体分别用EcoR I和Kpn I双酶切4h，琼脂糖凝胶电泳分离目的条带并回收，16℃连接过夜，转化DH5α，采用P15a和P15s引物检测阳性转化子pYPGE15XYL1（FP1-1）。
XYL2基因（序列2）克隆以热带假丝酵母基因组DNA为模板，采用FP2-1引物，用KODPlus高保真酶进行PCR扩增，Tm=53℃，延伸1.5 min，回收此扩增产物，同时提取pYPGE15XYL1（FP1-1）转化子质粒，将基因和该转化子用Kpn I单酶切2 h，再将单酶切的转化子去磷酸化以防止其自连，琼脂糖凝胶电泳分离目的条带并回收，16℃连接过夜，转化DH5α，采用P15a和P15s引物检测阳性转化子pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2 (见图1)。
2）pYPGE15XYL1-（G4S1）3-XYL2载体构建
此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入（G4S1）3片段作为连接肽，连接肽引物如下：
FP1-3Fi：5’-CCGGAATTCATGTCTACTACTCCTACTATTCCTAC-3’（序列10）
FP1-3Ri：5’-CGGGGTACCACCACCAGAACCACCACCACCAACAAAGATTG
GAATGTGTC-3’（序列11）
FP2-3Fi：5’-CGGGGTACCGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGACTGCA
ACCCATCCTTAG-3’（序列12）
FP2-3Ri: 5’-CGGGGTACCCTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’（序列13）
此载体与pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2的构建方法一样，但基因XYL1和基因XYL2的克隆分别采用FP1-3和FP2-3引物（见图2）。
3）pAUR101-XYL1-（G4S1）3-XYL2载体构建
首先采用pYPGE15-132s/XYL2a引物从pYPGE15XYL1-（G4S1）3-XYL2载体构建载体上克隆PGK- XYL1-(G4S1)3-XYL2-CYC1（2757bp）片段（序列5），上游引入SalI，回收KOD Plus PCR产物，同时提取空载体pAUR101质粒，将基因片段和载体分别用SacI和SalI双酶切4 h，琼脂糖凝胶电泳后用切口刀片切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，再用DNA回收试剂盒回收目的片段，加入DNA连接酶后16℃过夜连接，转化DH5α；采用pA-F和pA-R引物检测阳性转化子，如图2所示，目的片段大小3089bp；同时，用Sac I和Apa I双酶切分别双酶切pAUR101-XYL1和pAUR101-XYL2，用Sac I和Sal I双酶切pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2，如图3所示，结果与预期大小一致。
4）pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2-XKS1的大肠杆菌转化子的获得
提取载体pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2和pAUR101-XKS1质粒，同时用Sse8387 I和SphI双酶切4 h，琼脂糖凝胶电泳后用切口刀片切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，再用DNA回收试剂盒回收目的片段，加入DNA连接酶后16℃过夜连接，转化DH5α；采用xyl2a/W2F和XKS1a/W3F引物检测阳性转化子结果如图4A所示，目的片段大小分别为1780 bp和2796 bp，与预期的结果一致。同时提取pAUR101-XYL1-(G4S1)3-XYL2-XKS1质粒，采用XKS1a/W3F引物质粒PCR，结果如图4B所示，目的片段大小1848 bp（序列3），与预期的结果一致。
5、酵母转化及鉴定
将构建好的整合型表达载体转化高温酿酒酵母SF7，用AbA筛选到阳性转化子后再提取酵母基因组DNA进行PCR鉴定。
5.1、中间载体转化子鉴定（载体引物pAF/pAR）
采用载体引物pAF/pAR 对空载体菌株SF7-CK基因组DNA进行PCR鉴定，结果如图5A所示，目的片段大小436 bp，与预期的结果一致。采用载体引物pAF/pAR 分别对中间载体SF1、SF2、SF3菌株基因组DNA进行PCR鉴定，结果如图5B所示，目的片段大小分别为1978 bp、2084bp、2834 bp，与预期的结果一致。
5.2、终载体转化子鉴定（基因-载体交叉引物）
分别采用RHP13F/pAR、W2F/pAR、XKS1a/W4F对终载体菌株SF4基因组DNA进行PCR鉴定，结果如图6A所示，目的片段大小分别为1649 bp、2418 bp、1427 bp，结果与预期的一致。分别采用XYL1a/W1F、W2F/pAR、XKS1a/W4F，结果如图6B所示，目的片段大小分别为849 bp、1572 bp、1427 bp，结果与预期的一致。
6、RT-PCR检测目的基因的表达
采用液氮研磨法破碎酵母细胞壁后，再利用Tranzol试剂提取酵母总RNA，反转录为cDNA，以酵母内源组成型表达的Actin基因作为内参基因，分别对XYL1、XYL2、XKS1进行RT-PCR分析。
结果与分析：如图7所示，SF4菌株中XYL1基因表达比对照明显增强，而SF5则无变化，SF4、SF5号菌株XYL2基因表达明显增强，XKS1基因表达中SF4号比对照稍弱，SF5号比对照稍强，分析可能原因是SF4号菌株中加入融合蛋白，导致XKS1基因表达量降低，上述结果与蛋白表达结果（SDS-PAGE）一致。
7、SDS-PAGE检测目的蛋白
提取酵母总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，制备蛋白质浓度为1.0 mg/mL的蛋白样品。制备12%分离胶，5%浓缩胶，总蛋白上样量20 μg。
结果与分析：如图8和图9所示，与对照菌株SF7-CK相比，单个基因及多基因串联表达（XYL1、XYL2、XKS1）的载体菌株的蛋白表达量均没有明显变化，而融合表达载体菌株XYL1-(G4S1)3-XYL2有较强的蛋白表达。分析可能原因是整合性表达拷贝数太低，导致单位时间内的蛋白表达量较弱。
8、XR（木糖还原酶）和XDH（木酮糖氧化酶）酶活测定
8.1、XR 酶活测定
XR酶活测定结果表明，重组菌株SF4的XR酶活达到0.0078 U/mg，比对照SF-CK（0.006U/mg）提高了0.3倍。
8.2 XDH 酶活测定
XDH酶活测定结果表明，重组菌株SF4的XDH酶活达到0.11 U/mg，比对照菌株（SF-CK，XDH酶活为0.006U/mg）提高了17.3倍。
9、YPX限氧发酵
9.1、生长曲线
以20 g/L木糖为唯一碳源限氧发酵时，菌株在60 h时进入对数期(图10)，120 h进入稳定期，OD值趋于稳定，其中对照菌株SF-CK OD值为0.96，SF4号菌株为2.4，比对照提高1.5倍。
9.2、20 g/L木糖唯一碳源限氧发酵过程中木糖含量（图11）
发酵144 h后，对照菌株木糖残留浓度为17.4 g/L，木糖利用率仅为13%，SF4木糖残留浓度仅为0.8 g/L，木糖利用率为96%，比对照提高6.4倍。
10、YPX-YPDX厌氧发酵
以45 g/L木糖为唯一碳源以及45 g/L木糖和45 g/L葡萄糖共发酵，在37℃厌氧条件下发酵5天，蒸馏出乙醇后，采用比色法测定残留五碳糖，重铬酸钾法测定乙醇含量。
10.1、发酵后残留木糖含量
1）45 g/L木糖唯一碳源厌氧发酵后，对照菌株SF-CK木糖残留浓度为39.0 g/L，SF4号菌株为2.2 g/L，SF4残留的五碳糖含量与对照菌株SF-CK相比有显著性提高。
2）45 g/L木糖和45 g/L葡萄糖厌氧共发酵后，对照菌株SF-CK木糖残留量为36.8g/L，SF4号菌株为20.8 g/L。重组菌株SF4与对照菌株SF-CK相比均有显著性的提高。
10.2、木糖利用率
1）45 g/L木糖唯一碳源发酵后，对照菌株SF-CK木糖利用率为13.3%，重组菌株SF4为95.1%，比对照菌株提高了6.2倍。
2）45 g/L木糖和45 g/L葡萄糖厌氧共发酵后，对照菌株SF-CK木糖利用率为18.3%，重组菌株SF4为53.8%，比对照提高1.9倍。
11、乙醇产率
11.1、45 g/L木糖唯一碳源发酵后，对照菌株SF-CK乙醇产率为1.2%，重组菌株SF4为4.6%，比对照菌株提高2.8 倍。
11.2 45 g/L木糖和45 g/L葡萄糖厌氧共发酵后，对照菌株SF-CK乙醇产率为15.6%,重组菌株SF4为21.8%，比对照提高0.4倍。
三、转基因酿酒酵母的发酵、培养和检测
1、YPX-YPDX发酵实验
1）45 g/L YPX-YPDX培养基的配制
A、45 g/L YPX:18 mL 2% YP（2% Yeast extract，1% Tryptone），加5 M Hcl调节pH至4.8，过滤灭菌的2 mL 45 g/100 mL xylose。
B、45 g/L YPDX:16 mL 2% YP（2% Yeast extract，1% Tryptone）加5 M HCl调节pH至4.8，过滤灭菌的2 mL 45 g/100 mL xylose和2 mL 45g/100 mL glucose。
2）接种于发酵
收集适量YPD培养的酵母，蒸馏水洗涤三次接种至上述培养基中，初始OD 600=15（稀释50倍后为0.3）， 37℃,100 r,发酵4d。
2、芒草秸秆分解（稀硫酸预处理-酶解）液的乙醇发酵
1）预处理
A、称取已烘干至恒重的芒草秸秆粉末1.00 g于15 mL离心管中，平行三份。（本实验18份）。
B、向离心管中加入1 %硫酸（v/v）8.0 mL，充分摇匀后放入高压锅中灭菌，120℃反应20 min。冷却后取出，再放入50℃摇床，150 r摇2 h。
C、取出冷却至室温，3000 g离心5 min，取上清100 uL于1.5 mL离心管（直接稀释10倍），4℃保存。
2）中和-灭菌
A、向15mL离心管中加入8 %氢氧化钠（v/v），调节pH至4.8，混匀（预实验确定NaOH用量，大约1 mL）。
B、将混合液转入已称重的50 mL三角瓶，用pH 4.8的磷酸缓冲液润洗至总重量增加19.0 g。
C、将三角瓶放入高压灭菌锅中，120℃反应20 min，冷却后取出。
3）酶解
A.在超净工作台中向三角瓶中加入1.0 mL，40 g/L的纤维素复合酶溶液（终浓度2 g/L，灭菌磷酸Buffer配制），放入摇床，150 r，50℃酶解48 h。
B.酶解完成后取出，取上清150 uL，3000 g离心5 min，取上清100 uL,（直接稀释10倍），4℃保存。
4）发酵
A、将YPD培养36 h的3种酵母菌株分别接种，接种量为OD 600=15.0， 37℃发酵4 d。
B、取发酵液1 mL，3000 g离心5 min，取上清100 uL，稀释10倍，4℃保存。
5）蒸馏
发酵完成后，加入30 mL单蒸水，蒸馏，取蒸馏液10 mL，比色法测定乙醇含量。
3、发酵产物测定
发酵过程中的葡萄糖采用硫酸-蒽酮法测定，木糖采用苔黑酚法测定，乙醇采用重铬酸钾法测定。
1）葡萄糖含量测定
分别取1.00 mg/mL葡萄糖标准溶液2.0，4.0，6.0，8.0 mL，10. 0mL定容至100 mL，再分别取上述各溶液1.0 mL于10 mL具塞玻璃试管中，加入2.0 mL硫酸蒽酮试剂（0.2 g蒽酮溶于100 mL浓硫酸）快速摇匀，沸水中加热5 min, 自来水冷却至室温，620 nm比色。1 mL的蒸馏水作空白样品。
2）木糖含量测定
取1.00 mg/mL木糖标准溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL于100 mL容量瓶中，加水定容，再分别取上述各溶液1.0 mL于10 mL具塞玻璃试管中，先加入134 μL A试剂（A=6 g苔黑酚溶于100 mL无水乙醇中），再加入2 mL B试剂（B=0.1 g FeCl3溶于100 mL 37% 浓盐酸中），混匀后，沸水中加热20 min，自来水冷却至室温，660 nm比色，1 mL的蒸馏水作空白样品。
3）乙醇产率的测定
取1 mL乙醇样品，向其中加入2 mL 5% K2Cr2O7后混匀，沸水浴10 min后自来水冷却至室温，再加入7 mL单蒸水至总体积为10 mL，600 nm比色，1 mL蒸馏水做空白样品。定义乙醇的产率为发酵后产生乙醇的质量和发酵底物中葡萄糖（木糖）的质量的比值。
四、应用
1、转基因酵母菌株以芒草材料的发酵
从本实验大量芒草材料中挑取一对纤维素和木质素含量相近，半纤维素含量差异较大两种材料，分别命名高材料（H）和低材料（L），用1%稀硫酸预处理后加入纤维素酶酶解48 h,再接种酵母，37℃厌氧发酵5天，比色法测定木糖含量，重铬酸钾法测定乙醇浓度。
1.1、芒草材料原样成分
本研究根据芒草材料原样成分分析结果，选取了一对芒草材料，如表1所示，这一对材料的总纤维素和总木质素含量近似相同，但是半纤维素含量差异较大，稀硫酸预处理酶解后五碳糖（主要是木糖）含量差异也较大。
表1 芒草材料原样成分分析
品名 编号 总半纤维素 总纤维素 总木质素
低材料（L） 芒 60 26 29.18 25.20
高材料（H） 南荻 130 34.36 28.47 25.66
1.2、芒草材料发酵后残留五碳糖
无论高材料是还是低材料， 重组菌株SF4发酵后五碳糖含量残留最少，分别只有1.7mg/mL和1.8 mg/mL，而对照菌株则分别为5.4 mg/mL和7.1 mg/mL。
1.3、芒草材料发酵后的五碳糖利用率
重组菌株SF4五碳糖利用率高低材料分别为87%和85%，分别比对照提高0.8倍和0.6倍。
1.4、芒草材料发酵后的乙醇产率
重组菌株SF4最终乙醇产率高低材料分别为8.8%和8.0%，分别比对照菌株提高4.5倍和0.6倍。
1.5、小结与分析：由以上结果可知，菌株SF4可以利用预处理酶解后的芒草材料发酵生成乙醇，五碳糖利用率最高可达87%。
序列表
<110>华中农业大学
<120>一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母SF4
<140>
<141>
<160>13
<210>1
<211>975
<212>DNA-基因xyl1的核苷酸序列
<400>
Atgtctactactcctactattcctaccattaaattaaactctggttatgaaatgccattagttggtttcggatgttggaaagtcaataatgaaactgctgctgaccaaatctacaatgctatcaaaactggttacagattatttgatggtgctgaagattacggtaatgaaaaagaagttggtgaaggtattaacagagccattaaagaaggattagttaaaagagaagaattattcatcacttctaaattatggaacaatttccatgatccaaagaatgttgaaactgctttaaacaaaactttaagtgacttgaacttggactatgttgatttattcttgattcattttccaattgcttttaaatttgttccaattgaagaaaaatacccacctggtttctactgtggtgatggtgataacttccactatgaagatgttccattattagatacttggaaagctttggaaaaattggttgaagctggtaagatcaaatctattggtatttccaattttactggtgctttgatttacgatttgatcagaggtgctactatcaaaccagctgttttacaaattgaacatcacccatacttgcaacaaccaaaattgattgaatatgttcaaaaagctggtattgccattactggttactcttcatttggtccacaatcattcttggaattggaatccaagagagctttgaacaccccaactttatttgaacatgaaactattaaatcaattgctgataaacatggtaaatccccagctcaagttttattaagatgggctactcaaagaaatattgctgttattccaaaatcaaacaatccagaaagattagctcaaaacttgtctgttgttgactttgacttgactaaggatgatttggacaatattgctaaattggacattggtttgagattcaatgatccatgggactgggacaacattccaatctttgtttaa；
<210>2
<211>1095
<212>DNA-基因xyl2的核苷酸序列
<400>
Atgactgcaaacccatccttagttcttaacaaagttgacgatatttcctttgaagaatacgaagctccaaaactcgaatcaccaagagatgtcattgttgaagttaagaaaactggtatctgtggatcagatatccattactatgcccatggttcaattggtccatttattttaagaaaaccaatggttttaggtcacgaatcagcaggtgttgtttctgctgtcggaagtgaagttaccaacttgaaggttggtgatagagttgccattgaacctggtgtaccttcaagatttagtgatgagaccaaatctggtcattatcatttgtgcccacatatgtcttttgccgccaccccaccagttaacccagatgaaccaaatcctcaaggtactttatgtaaatactacagagtcccatgtgactttttattcaaattaccagatcatgtttctttggagttgggtgctatggttgaaccattaactgttggtgtccacggttgtaaattggctgatttgaaatttggtgaagacgttgttgtttttggtgccggtccagttggtttgttgaccgctgccgttgctagaacaattggtgctaaaagagtcatggttgttgatatttttgacaacaaattgaagatggcaaaagatatgggtgctgccactcatattttcaactcaaaaaccggtggtgattatcaagatttgatcaagagttttgatggtgttcaaccttcagttgttttggaatgtagtggtgctcaaccatgtatctatatgggtgttaaaatcttgaaagctggtggtagatttgttcaaattggtaatgccggtggtgatgtcaatttcccaattgctgatttctcaaccagagaattggcattatatggttctttcagatatggttacggtgactaccaaacttcaattgatattttagacagaaactacgtcaatggtaaagacaaagcaccaattaatttcgaattgttgattactcacagattcaagtttaaagatgccatcaaagcctatgatttggtcagagcaggaaatggtgctgtcaaatgtttgattgacggtccagaatag；
<210>3
<211>1803
<212>DNA-基因xks1的核苷酸序列
<400>
atgttgtgttcagtaattcagagacagacaagagaggtttccaacacaatgtctttagactcatactatcttgggtttgatctttcgacccaacaactgaaatgtctcgccattaaccaggacctaaaaattgtccattcagaaacagtggaatttgaaaaggatcttccgcattatcacacaaagaagggtgtctatatacacggcgacactatcgaatgtcccgtagccatgtggttagaggctctagatctggttctctcgaaatatcgcgaggctaaatttccattgaacaaagttatggccgtctcagggtcctgccagcagcacgggtctgtctactggtcctcccaagccgaatctctgttagagcaattgaataagaaaccggaaaaagatttattgcactacgtgagctctgtagcatttgcaaggcaaaccgcccccaattggcaagaccacagtactgcaaagcaatgtcaagagtttgaagagtgcataggtgggcctgaaaaaatggctcaattaacagggtccagagcccattttagatttactggtcctcaaattctgaaaattgcacaattagaaccagaagcttacgaaaaaacaaagaccatttctttagtgtctaattttttgacttctatcttagtgggccatcttgttgaattagaggaggcagatgcctgtggtatgaacctttatgatatacgtgaaagaaaattcagtgatgagctactacatctaattgatagttcttctaaggataaaactatcagacaaaaattaatgagagcacccatgaaaaatttgatagcgggtaccatctgtaaatattttattgagaagtacggtttcaatacaaactgcaaggtctctcccatgactggggataatttagccactatatgttctttacccctgcggaagaatgacgttctcgtttccctaggaacaagtactacagttcttctggtcaccgataagtatcacccctctccgaactatcatcttttcattcatccaactctgccaaaccattatatgggtatgatttgttattgtaatggttctttggcaagggagaggataagagacgagttaaacaaagaacgggaaaataattatgagaagactaacgattggactctttttaatcaagctgtgctagatgactcagaaagtagtgaaaatgaattaggtgtatattttcctctgggggagatcgttcctagcgtaaaagccataaacaaaagggttatcttcaatccaaaaacgggtatgattgaaagagaggtggccaagttcaaagacaagaggcacgatgccaaaaatattgtagaatcacaggctttaagttgcagggtaagaatatctcccctgctttcggattcaaacgcaagctcacaacagagactgaacgaagatacaatcgtgaagtttgattacgatgaatctccgctgcgggactacctaaataaaaggccagaaaggactttttttgtaggtggggcttctaaaaacgatgctattgtgaagaagtttgctcaagtcattggtgctacaaagggtaattttaggctagaaacaccaaactcatgtgcccttggtggttgttataaggccatgtggtcattgttatatgactctaataaaattgcagttccttttgataaatttctgaatgacaattttccatggcatgtaatggaaagcatatccgatgtggataatgaaaattgggatcgctataattccaagattgtccccttaagcgaactggaaaagactctcatctaa；
<210>4
<211>45
<212>DNA-融合蛋白联接肽-(G4S1)3-的核酸序列
<400>
Ggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttct；
<210>5
<211>2109
<212>DNA-融合蛋白XYL1-(G4S1)3-XYL2的DNA序列
<400>
atgtctactactcctactattcctaccattaaattaaactctggttatgaaatgccattagttggtttcggatgttggaaagtcaataatgaaactgctgctgaccaaatctacaatgctatcaaaactggttacagattatttgatggtgctgaagattacggtaatgaaaaagaagttggtgaaggtattaacagagccattaaagaaggattagttaaaagagaagaattattcatcacttctaaattatggaacaatttccatgatccaaagaatgttgaaactgctttaaacaaaactttaagtgacttgaacttggactatgttgatttattcttgattcattttccaattgcttttaaatttgttccaattgaagaaaaatacccacctggtttctactgtggtgatggtgataacttccactatgaagatgttccattattagatacttggaaagctttggaaaaattggttgaagctggtaagatcaaatctattggtatttccaattttactggtgctttgatttacgatttgatcagaggtgctactatcaaaccagctgttttacaaattgaacatcacccatacttgcaacaaccaaaattgattgaatatgttcaaaaagctggtattgccattactggttactcttcatttggtccacaatcattcttggaattggaatccaagagagctttgaacaccccaactttatttgaacatgaaactattaaatcaattgctgataaacatggtaaatccccagctcaagttttattaagatgggctactcaaagaaatattgctgttattccaaaatcaaacaatccagaaagattagctcaaaacttgtctgttgttgactttgacttgactaaggatgatttggacaatattgctaaattggacattggtttgagattcaatgatccatgggactgggacaacattccaatctttgtTggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttcTactgcaaacccatccttagttcttaacaaagttgacgatatttcctttgaagaatacgaagctccaaaactcgaatcaccaagagatgtcattgttgaagttaagaaaactggtatctgtggatcagatatccattactatgcccatggttcaattggtccatttattttaagaaaaccaatggttttaggtcacgaatcagcaggtgttgtttctgctgtcggaagtgaagttaccaacttgaaggttggtgatagagttgccattgaacctggtgtaccttcaagatttagtgatgagaccaaatctggtcattatcatttgtgcccacatatgtcttttgccgccaccccaccagttaacccagatgaaccaaatcctcaaggtactttatgtaaatactacagagtcccatgtgactttttattcaaattaccagatcatgtttctttggagttgggtgctatggttgaaccattaactgttggtgtccacggttgtaaattggctgatttgaaatttggtgaagacgttgttgtttttggtgccggtccagttggtttgttgaccgctgccgttgctagaacaattggtgctaaaagagtcatggttgttgatatttttgacaacaaattgaagatggcaaaagatatgggtgctgccactcatattttcaactcaaaaaccggtggtgattatcaagatttgatcaagagttttgatggtgttcaaccttcagttgttttggaatgtagtggtgctcaaccatgtatctatatgggtgttaaaatcttgaaagctggtggtagatttgttcaaattggtaatgccggtggtgatgtcaatttcccaattgctgatttctcaaccagagaattggcattatatggttctttcagatatggttacggtgactaccaaacttcaattgatattttagacagaaactacgtcaatggtaaagacaaagcaccaattaatttcgaattgttgattactcacagattcaagtttaaagatgccatcaaagcctatgatttggtcagagcaggaaatggtgctgtcaaatgtttgattgacggtccagaatag；
注：T为xyl1或融合蛋白联接肽-(G4S1)3-的核酸序列中最后一位碱基。
<210>6
<211>35
<212>DNA-引物FP1-1Fi的DNA序列
<400>
5’-CCGGAATTCATGTCTACTACTCCTACTATTCCTAC-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>7
<211>36
<212>DNA-引物FP1-1Ri的DNA序列
<400>
5’-CGGGGTACCACCACCAACAAAGATTGGAATGTTGTC-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>8
<211>40
<212>DNA-引物FP2-1Fi的DNA序列
<400>
5’-CGGGGTACCGGTGGTTCTATGACTGCAAACCCATCCTTAG-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>9
<211>32
<212>DNA-引物FP2-1Ri的DNA序列
<400>
5’-CGGGGTACCCTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>10
<211>35
<212>DNA-引物FP1-3Fi的DNA序列
<400>
5’-CCGGAATTCATGTCTACTACTCCTACTATTCCTAC-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>11
<211>50
<212>DNA-引物FP1-3Ri的DNA序列
<400>
5’-CGGGGTACCACCACCAGAACCACCACCACCAACAAAGATTGGAATGTGTC-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>12
<211>54
<212>DNA-引物FP2-3Fi的DNA序列
<400>
5’-CGGGGTACCGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGACTGCAACCCATCCTTAG-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>13
<211>32
<212>DNA-引物FP2-3Ri的DNA序列
<400>
5’-CGGGGTACCCTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
序列表
<110>华中农业大学
<120>一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母SF4
<140>
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<160>13
<210>1
<211>975
<212>DNA-基因xyl1的核苷酸序列
<400>
Atgtctactactcctactattcctaccattaaattaaactctggttatgaaatgccattagttggtttcggatgttggaaagtcaataatgaaactgctgctgaccaaatctacaatgctatcaaaactggttacagattatttgatggtgctgaagattacggtaatgaaaaagaagttggtgaaggtattaacagagccattaaagaaggattagttaaaagagaagaattattcatcacttctaaattatggaacaatttccatgatccaaagaatgttgaaactgctttaaacaaaactttaagtgacttgaacttggactatgttgatttattcttgattcattttccaattgcttttaaatttgttccaattgaagaaaaatacccacctggtttctactgtggtgatggtgataacttccactatgaagatgttccattattagatacttggaaagctttggaaaaattggttgaagctggtaagatcaaatctattggtatttccaattttactggtgctttgatttacgatttgatcagaggtgctactatcaaaccagctgttttacaaattgaacatcacccatacttgcaacaaccaaaattgattgaatatgttcaaaaagctggtattgccattactggttactcttcatttggtccacaatcattcttggaattggaatccaagagagctttgaacaccccaactttatttgaacatgaaactattaaatcaattgctgataaacatggtaaatccccagctcaagttttattaagatgggctactcaaagaaatattgctgttattccaaaatcaaacaatccagaaagattagctcaaaacttgtctgttgttgactttgacttgactaaggatgatttggacaatattgctaaattggacattggtttgagattcaatgatccatgggactgggacaacattccaatctttgtttaa；
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<212>DNA-基因xyl2的核苷酸序列
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Atgactgcaaacccatccttagttcttaacaaagttgacgatatttcctttgaagaatacgaagctccaaaactcgaatcaccaagagatgtcattgttgaagttaagaaaactggtatctgtggatcagatatccattactatgcccatggttcaattggtccatttattttaagaaaaccaatggttttaggtcacgaatcagcaggtgttgtttctgctgtcggaagtgaagttaccaacttgaaggttggtgatagagttgccattgaacctggtgtaccttcaagatttagtgatgagaccaaatctggtcattatcatttgtgcccacatatgtcttttgccgccaccccaccagttaacccagatgaaccaaatcctcaaggtactttatgtaaatactacagagtcccatgtgactttttattcaaattaccagatcatgtttctttggagttgggtgctatggttgaaccattaactgttggtgtccacggttgtaaattggctgatttgaaatttggtgaagacgttgttgtttttggtgccggtccagttggtttgttgaccgctgccgttgctagaacaattggtgctaaaagagtcatggttgttgatatttttgacaacaaattgaagatggcaaaagatatgggtgctgccactcatattttcaactcaaaaaccggtggtgattatcaagatttgatcaagagttttgatggtgttcaaccttcagttgttttggaatgtagtggtgctcaaccatgtatctatatgggtgttaaaatcttgaaagctggtggtagatttgttcaaattggtaatgccggtggtgatgtcaatttcccaattgctgatttctcaaccagagaattggcattatatggttctttcagatatggttacggtgactaccaaacttcaattgatattttagacagaaactacgtcaatggtaaagacaaagcaccaattaatttcgaattgttgattactcacagattcaagtttaaagatgccatcaaagcctatgatttggtcagagcaggaaatggtgctgtcaaatgtttgattgacggtccagaatag；
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<212>DNA-基因xks1的核苷酸序列
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<212>DNA-融合蛋白联接肽-(G4S1)3-的核酸序列
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Ggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttct；
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<211>2109
<212>DNA-融合蛋白XYL1-(G4S1)3-XYL2的DNA序列
<400>
atgtctactactcctactattcctaccattaaattaaactctggttatgaaatgccattagttggtttcggatgttggaaagtcaataatgaaactgctgctgaccaaatctacaatgctatcaaaactggttacagattatttgatggtgctgaagattacggtaatgaaaaagaagttggtgaaggtattaacagagccattaaagaaggattagttaaaagagaagaattattcatcacttctaaattatggaacaatttccatgatccaaagaatgttgaaactgctttaaacaaaactttaagtgacttgaacttggactatgttgatttattcttgattcattttccaattgcttttaaatttgttccaattgaagaaaaatacccacctggtttctactgtggtgatggtgataacttccactatgaagatgttccattattagatacttggaaagctttggaaaaattggttgaagctggtaagatcaaatctattggtatttccaattttactggtgctttgatttacgatttgatcagaggtgctactatcaaaccagctgttttacaaattgaacatcacccatacttgcaacaaccaaaattgattgaatatgttcaaaaagctggtattgccattactggttactcttcatttggtccacaatcattcttggaattggaatccaagagagctttgaacaccccaactttatttgaacatgaaactattaaatcaattgctgataaacatggtaaatccccagctcaagttttattaagatgggctactcaaagaaatattgctgttattccaaaatcaaacaatccagaaagattagctcaaaacttgtctgttgttgactttgacttgactaaggatgatttggacaatattgctaaattggacattggtttgagattcaatgatccatgggactgggacaacattccaatctttgtTggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttcTactgcaaacccatccttagttcttaacaaagttgacgatatttcctttgaagaatacgaagctccaaaactcgaatcaccaagagatgtcattgttgaagttaagaaaactggtatctgtggatcagatatccattactatgcccatggttcaattggtccatttattttaagaaaaccaatggttttaggtcacgaatcagcaggtgttgtttctgctgtcggaagtgaagttaccaacttgaaggttggtgatagagttgccattgaacctggtgtaccttcaagatttagtgatgagaccaaatctggtcattatcatttgtgcccacatatgtcttttgccgccaccccaccagttaacccagatgaaccaaatcctcaaggtactttatgtaaatactacagagtcccatgtgactttttattcaaattaccagatcatgtttctttggagttgggtgctatggttgaaccattaactgttggtgtccacggttgtaaattggctgatttgaaatttggtgaagacgttgttgtttttggtgccggtccagttggtttgttgaccgctgccgttgctagaacaattggtgctaaaagagtcatggttgttgatatttttgacaacaaattgaagatggcaaaagatatgggtgctgccactcatattttcaactcaaaaaccggtggtgattatcaagatttgatcaagagttttgatggtgttcaaccttcagttgttttggaatgtagtggtgctcaaccatgtatctatatgggtgttaaaatcttgaaagctggtggtagatttgttcaaattggtaatgccggtggtgatgtcaatttcccaattgctgatttctcaaccagagaattggcattatatggttctttcagatatggttacggtgactaccaaacttcaattgatattttagacagaaactacgtcaatggtaaagacaaagcaccaattaatttcgaattgttgattactcacagattcaagtttaaagatgccatcaaagcctatgatttggtcagagcaggaaatggtgctgtcaaatgtttgattgacggtccagaatag；
注：T为xyl1或融合蛋白联接肽-(G4S1)3-的核酸序列中最后一位碱基。
<210>6
<211>35
<212>DNA-引物FP1-1Fi的DNA序列
<400>
5’-CCGGAATTCATGTCTACTACTCCTACTATTCCTAC-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>7
<211>36
<212>DNA-引物FP1-1Ri的DNA序列
<400>
5’-CGGGGTACCACCACCAACAAAGATTGGAATGTTGTC-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>8
<211>40
<212>DNA-引物FP2-1Fi的DNA序列
<400>
5’-CGGGGTACCGGTGGTTCTATGACTGCAAACCCATCCTTAG-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>9
<211>32
<212>DNA-引物FP2-1Ri的DNA序列
<400>
5’-CGGGGTACCCTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>10
<211>35
<212>DNA-引物FP1-3Fi的DNA序列
<400>
5’-CCGGAATTCATGTCTACTACTCCTACTATTCCTAC-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>11
<211>50
<212>DNA-引物FP1-3Ri的DNA序列
<400>
5’-CGGGGTACCACCACCAGAACCACCACCACCAACAAAGATTGGAATGTGTC-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>12
<211>54
<212>DNA-引物FP2-3Fi的DNA序列
<400>
5’-CGGGGTACCGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGACTGCAACCCATCCTTAG-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。
<210>13
<211>32
<212>DNA-引物FP2-3Ri的DNA序列
<400>
5’-CGGGGTACCCTATTCTGGACCGTCAATCAAAC-3’
注：pYPGE15XYL1-（G4S1）1-XYL2载体构建中，由于构建此融合蛋白需要在两个蛋白质中间加入一段（G4S1）1作为连接肽，因此设计了引物。

Claims (3)

1.一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母SF4，其特征在于：
酿酒酵母SF4是通过寡肽链[-(G4S1)3-]链接的2个木糖利用酶即木糖还原酶XYL1和木糖醇氧化酶XYL2构成的融合蛋白基因；
XYL1的基因序列如SEQ ID NO：1，XYL2的基因序列如SEQ ID NO：2，融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：3；
酿酒酵母SF4于2016年10月17日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国 武汉 武汉大学 邮编：430072），保藏编号为CCTCC NO：M 2016563。
2.按权利要求1所述的酿酒酵母SF4的获得方法，其特征在于：
将木糖代谢途径中关键酶基因木糖还原酶基因xyl1和木糖醇氧化酶基因xyl2通过寡肽-（G4S1）3-DNA序列连接，然后与木酮糖激酶基因 xks1一道构建到整合型表达载体pAUR101上，并转化到高温酿酒酵母SF7中。
3.按权利要求1所述的酿酒酵母SF4的应用，其特征在于：
将转基因工程酿酒酵母SF4应用于秸秆水解产物的乙醇发酵中。
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