CN102220382A

CN102220382A - 采用重组酿酒酵母工程菌株发酵生产乙醇的方法

Info

Publication number: CN102220382A
Application number: CN2010101483701A
Authority: CN
Inventors: 叶凯; 刘敏; 涂振东
Original assignee: Biomass Energy Research Institute Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Biomass Energy Research Institute Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-04-14
Filing date: 2010-04-14
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2030-04-14
Also published as: CN102220382B

Abstract

本发明公开了一种采用重组酿酒酵母工程菌株发酵生产乙醇的方法，其包括以下步骤：(1)粉碎甜高粱秸秆；(2)加入秸秆重量0.05-0.4％的糖化酶；(3)加入秸秆重量0.08-0.2％的重组酿酒酵母工程菌株，所述工程菌株为含有PYES2-GAP-xyl1-xyl2质粒的重组菌，发酵24-90小时。本发明的方法能够减少燃料乙醇发酵所需的单位时间，降低生产成本，减少环境污染，并且可以在不对原有生产条件做改进的情况下使用。

Description

采用重组酿酒酵母工程菌株发酵生产乙醇的方法

技术领域

本发明涉及一种采用重组酿酒酵母工程菌株发酵生产乙醇的方法。

背景技术

木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源之一，其主要成分是纤维素、半纤维素、及木质素，其中纤维素水解得到葡萄糖，能为微生物直接利用，而含量仅次于纤维素的半纤维素的水解产物中，主要成分是葡萄糖和D-木糖，木糖含量稍次之。半纤维素是植物纤维材料的主要成分之一，如秸秆中半纤维素的含量占其干重25％-50％，其主要分解产物也是木糖。在酸或酶的作用下，木质纤维素的水解产物主要为六碳糖(葡萄糖、甘露糖和半乳糖)和五碳糖(木糖和阿拉伯糖)，其中六碳糖可由传统的酿酒酵母发酵生成乙醇，而五碳糖则不能被酿酒酵母发酵利用。因此如何将D-木糖的生物转化产生酒精是生产燃料乙醇的关键环节。

自然界中木糖代谢途径有两条：一是在某些细菌中，木糖异构酶(Xylose isomerase，XI)直接将木糖转化为木酮糖。二是在某些真菌中，如酵母菌和丝状真菌，首先是在依赖NADPH/NADH(主要依赖NADPH为辅酶，也可以利用NADH)的木糖还原酶(Xylose reducetase，XR)的作用下将木糖还原为木糖醇，然后在依赖NAD+的木糖醇脱氢酶(Xylitol dehydrogenase，XDH)的作用下将木糖醇氧化形成木酮糖。木酮糖经过木酮糖激酶(Xylulokinase，XK)磷酸化生成5-磷酸木酮糖，进入磷酸戊糖途径(the Pentose Phosp Pathway，PPP途径)，然后以中间产物6-磷酸葡萄糖和3-磷酸甘油醛进入酵解途径(Embden-meyerh of pathway，EMP)，最终在在厌氧条件下生成乙醇。

根据文献报道，以木质纤维素类物质的降解物(主要为葡萄糖和D-木糖)为原料发酵生产乙醇主要要求发酵微生物具备以下特点：能同时利用五碳糖(主要为D-木糖)和六碳糖(主要为葡萄糖)；对发酵过程中产生的抑制物有良好的耐受力；能承受高浓度的乙醇；比较高的乙醇产量和产率；副产物的生成量要小；对发酵环境的变化要有一定的耐受力；发酵菌种保证安全。在所有发酵菌中，酿酒酵母最能满足以上要求，它具备良好的工业生产性状，其全序列已测定，遗传技术也已经成熟，但酿酒酵母由于缺乏木糖代谢途径中的最初将木糖转化为木酮糖的酶而不能利用木糖。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用重组酿酒酵母工程菌株发酵生产乙醇的方法，其包括以下步骤：

(1)粉碎甜高粱秸秆；

(2)加入秸秆重量0.05-0.4％的糖化酶；

(3)加入秸秆重量0.08-0.2％的重组酿酒酵母工程菌株，所述工程菌株为含有PYES2-GAP-xyl1-xyl2质粒的重组菌，25-30℃半厌氧发酵24-90小时。

本发明的方法，其中所述步骤(3)中采用的工程菌株为发明人构建的，其构建方法为：从毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中克隆GAP基因片段，更换PYES2载体的诱导性启动子为组成型GAP启动子，然后将木糖还原酶基因xyl1片段和木糖醇脱氢酶基因xyl2片段串联在一起，导入含组成型GAP的PYES2载体中，构建PYES2-GAP-xyl1-xyl2质粒，将该质粒导入酿酒酵母中。得到的工程菌株为：INVSc1/GAP1-(GAP1-xyl2-CYC1)-(GAP1-xyl1-CYC1)-CYC1或INVSc1/GAP1-(GAP1-xyl1-CYC1)-(GAP1-xyl2-CYC1)-CYC1。此工程菌具有如下优点：

1、两个基因表达盒分别连于换成GAP启动子的pYES2的E-N和N-XhoI，(可得到两个串联表达载体，分别是xyl2-xyl1和xyl1-xyl2)，这个串联表达载体的xyl1、xyl2，它们分别位于GAP的双启动子控制之下，木糖发酵生成酒精的能力更强，且不需要半乳糖的诱导，不必更换碳源，就可以直接发酵，工艺简单。

2、酶的活性高，表达量高，INVSc1/pYES2-GAP-xyl1的比酶活是对照菌(INVSc1/pYES2-GAL1-xyl1)的12.13倍，INVSc1/pYES2-GAP-xyl2的比酶活是对照菌(INVScl/pYES2-GAL1-xyl2)的8.75倍。

3、该工程菌株既能代谢五碳糖又能代谢六碳糖，该工程菌株代谢秸秆生物转化乙醇产率高，与市场上的高活性的安琪酵母相比，工程菌乙醇产率是92％左右，对照菌株乙醇产率是84％左右。

用此菌株发酵生产乙醇具有如下优点：

1、能够减少燃料乙醇发酵所需的单位时间，降低生产成本，减少环境污染。

2、该方法可以在不对原有生产条件做改进的情况下使用。

附图说明

图1是本发明实验例中秸秆发酵过程中的酒精含量的变化曲线图；

图2是本发明实验例中秸秆发酵过程中的糖含量的变化曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：重组酿酒酵母工程菌株的构建

1、从近平滑假丝酵母中克隆出木糖还原酶基因(xyl1)片段(如SEQ ID NO.1所示)，与Genebank发布的近平滑假丝酵母木糖还原酶基因序列作Blast比对，进行同源性比较分析，结果显示，克隆的xyl1基因片断与该基因库发布的近平滑假丝酵母木糖还原酶基因的同源性达100％。

2、从热带假丝酵母中克隆出木糖醇脱氢酶基因(xyl2)片段(如SEQ ID NO.2所示)，将测序得出的序列与基因库(Pubmed+NCBI+Nucleotide)中xyl2基因序列做同源性分析，结果表明该序列与Genebank发布的热带假丝酵母xyl2基因组DNA序列完全一致。

3、从毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中克隆GAP基因片段

引物序列：

上游引物：5’＞GG ACTAGT TTT TTG TAG AAA TG＜3’(如SEQID NO.3所示)，下划线为Spe I；

下游引物：5’＞GGGAATTC ATA GTT GTT CAA TTG＜3’(如SEQ ID NO.4所示)，下划线为EcoR I。

更换PYES2载体的诱导性启动子为组成型GAP启动子(甘油醛磷酸脱氢酶组成型启动子)。

4、将木糖还原酶基因(xyl1)片段和木糖醇脱氢酶基因(xyl2)片段串联在一起，导入PYES2(含组成型GAP)载体中，构建PYES2-GAP-xyl1-xyl2质粒，将该质粒导入酿酒酵母中，构建新的菌株，使木糖还原酶和木糖醇脱氢酶进行共表达，具体过程如下：

xyl1基因连接到酿酒酵母表达载体pYES2的多克隆位点上，然后将原载体上的启动子GAL1更换成GAP1，xyl1基因的表达盒结构为GAP1-xyl1-CYC1；

xyl2基因连接到酿酒酵母表达载体pYES2的多克隆位点上，然后将原载体上的启动子GAL1更换成GAP1，xyl2基因的表达盒结构为GAP1-xyl2-CYC1；

依据GAP1和CYC1两端的碱基序列设计对引物

对xyl1-Jph和xyl2-R，它们分别连接于pYES2的HindIII和XbaI，设计引物扩增出它们的完整基因表达盒。

第一对串上游(如SEQ ID NO.5所示)：GAATTC TTTTTGTAGAAATGTCTTGG(EcoRI)

第一对串下游(如SEQ ID NO.6所示)：GCGGCCGC GCAAA TTAAAGCCTT CGAGC(NotI)

第二对串上游(如SEQ ID NO.7所示)：GCGGCCGC TTTTTGTAGAAATGTCTTGG(NotI)

第二对串下游(如SEQ ID NO.8所示)：CTCGAG GCAAA TTAAA GCCTT CGAGC(XhoI)

酶切位点的设计依据pYES2多克隆位点设计。这两个基因表达盒分别连接到pYES2的多克隆位点上，最后将pYES2上的GAL1启动子换成GAP1，得到表达载体结构：GAP1-(GAP1-xyl1-CYC1)-(GAP1-xyl2-CYC1)-CYC1。

5、重组酿酒酵母工程菌株的构建与鉴定

将上述构建成功的表达载体通过电转移法导入到酿酒酵母INVsC1中，因该菌株是尿嘧啶缺陷型的，质粒表达载体上含有产生尿嘧啶的基因序列，故转化成功的工程菌株可以在不含尿嘧啶的培养基上生长，而没有转化成功的菌株不能生长。

6、木糖碳源培养基平板上筛选鉴定

挑取多个转化子，以灭菌的牙签接种到以木糖为唯一碳源的平板上，同时接种一没有转化的酿酒酵母原菌作为对照，如果对照菌不能生长，而转化的工程菌株却能生长良好，说明重组菌能较好地利用木糖，挑选几个生长健壮的菌株作为种子菌株作进一步的发酵实验。

实施例2：木糖还原酶基因xyl1和木糖醇脱氢酶基因xyl2在酿酒酵母中的表达鉴定及活性分析

挑选实施例1筛选出的几个健壮的菌株摇瓶培养，破壁，SDS-PAGE分析表达情况；挑选表达量最高的菌株，大量培养，纯化出目的蛋白质，体外测定酶活，其中木糖还原酶基因xyl1比酶活为：0.521±0.008左右；木糖醇脱氢酶基因xyl2比酶活为：0.401±0.004左右。

实验例1：

新疆吉木萨尔三台酒厂实验

实验目的：在尽量相同的条件下，进行大规模发酵，发酵秸秆量为1吨，在发酵的过程中适时检测发酵液中糖和酒精的变化，以检验菌株在三台酒厂实际生产过程中酒精的终产量效果。

实验器材及试剂：722S分光光度计，水浴锅，电炉，Φ15mm×180mm试管，1.5ml离心管。乙醇(分析纯)、葡萄糖(分析纯)、重铬酸钾(分析纯)、纯水、新疆甜高粱秸杆。

实验步骤：

1、准备15个发酵缸，分为一、二、三3个组，每组5个发酵缸，编号为：11、12、13、14、15；21、22、23、24、25；31、32、33、34、35。

2、打碎3吨秸秆，分为3组，每组1吨，分别加1号菌株、2号菌株、三台酒厂的酵母，其中1号菌株为利用实施例1的方法筛选出的健壮菌株INVSc1/GAP1-(GAP1-xyl2-CYC1)-(GAP1-xyl1-CYC1)-CYC1；2号菌株为利用实施例1的方法筛选出的健壮菌株INVSc1/GAP1-(GAP1-xyl1-CYC1)-(GAP1-xyl2-CYC1)-CYC1；三台酒厂的酵母为高活性安琪酵母。

第一组加1号菌株的量为0.06％，第二组加2号菌株的量为0.1％，第三组加三台酒厂的酵母的量为0.2％。糖化酶均各加1kg，水分别加72kg、60kg、60kg。

3、入缸，密封。

4、发酵过程中，适时检测发酵的温度、以及糖和酒精的浓度变化。

测量方法：3，5-二硝基水杨酸比色法测定秸秆培养物中还原糖的含量

重铬酸钾氧化分光光度计法测定秸秆培养物中乙醇的含量

实验数据及其处理：

发酵过程中酒精含量的变化

取样均为50g秸秆，将50g秸秆用100ml水浸泡1h，挤出发酵液进行测量。

表1：秸秆发酵过程中酒精的含量，单位mg/ml

注：“-”表示开始蒸馏。

结论：2号菌株酒精产量最高，三台次之。

发酵过程中秸秆酒精含量的变化曲线图如图1所示。

结论：1号菌株、三台酒厂的酵母在发酵24h时，酒精的浓度已达最大值，以后酒精的浓度平缓的减小。2号菌株在发酵90h时，酒精的浓度达最大值，以后酒精的浓度平缓的减小。

发酵过程中秸秆糖含量的变化

取样均为50g秸秆，将50g秸秆用水浸泡1h，挤出发酵液进行测量。

表2：秸秆发酵过程中糖的含量，单位mg/ml

注：“-”表示开始蒸馏。

结论：起始糖含量偏低，1号菌株发酵的秸秆为堆放时间较长的打碎了的秸秆，2号菌株与三台酒厂的酵母发酵的秸秆为打碎后即进行发酵的秸秆。

发酵过程中秸秆发酵液中的糖含量的变化曲线图见图2。

结论：由图2可以看出，起始糖含量偏低，发酵速率非常快，糖的含量在24h时，已基本被耗尽。

5、产率：

称量最终蒸馏的酒精体积，测量酒精的浓度。

表3：秸秆发酵过程中酒精的含量

结论：第一桶折算成61度酒的产量：1号酵母为32.23kg、2号酵母为40.58、三台酒厂的酵母为36.57kg。三台酒厂的酵母出的后几桶体积认为同2号酵母，均为50L。

实验例2：

采用上述的2号酵母进行发酵生产乙醇，步骤如下：

(1)粉碎甜高粱秸秆至细度8毫米；

(2)加入秸秆重量0.1％的糖化酶；

(3)加入秸秆重量0.1％的重组酿酒酵母工程菌株(2号菌株)，所述工程菌株为含有PYES2-GAP-xyl1-xyl2质粒的重组菌，25-30℃密闭发酵，偶尔通风，发酵48小时。发酵完毕后测定乙醇产率为88％左右。

实验例3：

采用上述的2号酵母进行发酵生产乙醇，步骤如下：

(1)粉碎甜高粱秸秆至细度15毫米；

(2)加入秸秆重量0.4％的糖化酶；

(3)加入秸秆重量0.08％的重组酿酒酵母工程菌株(2号菌株)，所述工程菌株为含有PYES2-GAP-xyl1-xyl2质粒的重组菌，25-30℃密闭发酵，偶尔通风，发酵90小时。发酵完毕后测定乙醇产率为85％左右。

实验例4：

采用上述的2号酵母进行发酵生产乙醇，步骤如下：

(1)粉碎甜高粱秸秆至细度5毫米；

(2)加入秸秆重量0.1％的糖化酶；

(3)加入秸秆重量0.1％的重组酿酒酵母工程菌株(2号菌株)，所述工程菌株为含有PYES2-GAP-xyl1-xyl2质粒的重组菌，25-30℃密闭发酵，偶尔通风，发酵24小时。发酵完毕后测定乙醇产率为92％左右。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>新疆农业科学院

<120>采用重组酿酒酵母工程菌株发酵生产乙醇的方法

<130>KHP09113816.9

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>975

<212>DNA

<213>xyl1

<400>1

atgtctactg ctactgcttc cccagctgtc aaattgaact ccggctacga aatcccattg 60

gttggtttcg gctgctggaa attgaccaac gacgttgctt ccgaccagat ctacagagcc 120

atcaagtccg gctacagatt gttcgacggt gccgaggact acgccaacga gcaggaagtc 180

ggtgaaggta tcaaaagagc catcaaggaa ggcatcgtca agagagaaga gttgttcatt 240

acctccaagt tatggaactc cttccacgac aagaagaacg tcgaggtcgc tttgatgaag 300

accttgagcg acttgaactt ggactacgtc gacttgttct acatccactt cccaattgct 360

cagaagccag tcccaattga aaagaaatac ccacctggct tctactgcgg agacggcgac 420

aagtggagca tcgaagaagt cccattgttg gacacctgga gagctttgga gaagttggtt 480

gaccagggct tggctaagtc catcggtatc tccaacttca gcgctcagtt gatctacgac 540

ttgatcaggg gctgtaccat caagcccgtc gccttgcaga tcgaacacca cccatacttg 600

acccagccaa agttggtcga gtacgtccag ttgcacgaca tccagatcac cgggtactcc 660

tccttcggtc cacagtcctt cttggagatg gacttgaaga gagccttgga cacccctgtc 720

ttgttggagg agccaacggt caagtccatt gccgacaagc acggcaagtc gccagcccag 780

gtcttgttga gatatcagac ccagagaggc atcgctgtca ttccaagatc caactcccca 840

gacagaatgg ctcagaactt gtctgtcatt gactttgagt tgacccagga cgacttgcag 900

gccattgccg agttggactg taacttgaga ttcaacgagc catgggactt ctccaacatt 960

ccagtttttg tttaa 975

<210>2

<211>1095

<212>DNA

<213>xyl2

<400>2

ctattctgga ccatcaatta aacatttgac agcaccattt cctgctctga ccaaatcata 60

ggctttgatg gcatctttaa acttgaatct gtgagtaatc aacaattcga aattaattgg 120

tgctttgtct ttaccattga cgtagtttct gtctaaaata tcaattgaag tttggtagtc 180

accgtaacca tatctgaaag aaccatataa tgccaattct ctggttgaga aatcagcaat 240

tgggaaattg acatcaccac cggcattacc aatttgaaca aatctaccac cagctttcaa 300

gattttaaca cccatataga tacatggttg agcaccacta cattccaaaa caactgaagg 360

ttgaacacca tcaaaactct tgatcaaatc ttgataatca ccaccggttt ttgagttgaa 420

aatatgagtg gcagcaccca tatcttttgc catcttcaat ttgttgtcaa aaatatcaac 480

aaccatgact cttttagcac caattgttct agcaacggca gcggtcaaca aaccaactgg 540

accggcacca aaaacaacaa cgtcttcacc aaatttcaaa tcagccaatt tacaaccgtg 600

gacaccaaca gttaatggtt caaccatagc acccaactcc aaagaaacat gatctggtaa 660

tttgaataaa aagtcacatg ggactctgta gtatttacat aaagtacctt gaggatttgg 720

ttcatctggg ttaactggtg gggtggcggc aaaagacata tgtgggcaca aatgataatg 780

accagatttg gtctcatcac taaatcttga aggtacacca ggttcaatgg caactctatc 840

accaaccttc aagttggtaa cttcacttcc gacagcagaa acaacacctg ctgattcgtg 900

acctaaaacc attggttttc ttaaaataaa tggaccaatt gaaccatggg catagtaatg 960

gatatctgat ccacagatac cagttttctt aacttcaaca atgacatctc ttggtgattc 1020

gagttttgga gcttcgtatt cttcaaagga aatatcgtca actttgttaa gaactaatga 1080

tgggtttgca gtcat 1095

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ggactagttt tttgtagaaa tg 22

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gggaattcat agttgttcaa ttg 23

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gaattctttt tgtagaaatg tcttgg 26

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gcggccgcgc aaattaaagc cttcgagc 28

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gcggccgctt tttgtagaaa tgtcttgg 28

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ctcgaggcaa attaaagcct tcgagc 26

Claims

1.一种采用重组酿酒酵母工程菌株发酵生产乙醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)粉碎甜高梁秸秆；

(2)加入秸秆重量0.05-0.4％的糖化酶；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中采用的工程菌株的构建方法为：从毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中克隆GAP基因片段，更换PYES2载体的诱导性启动子为组成型GAP启动子，然后将木糖还原酶基因xyl1片段和木糖醇脱氢酶基因xyl2片段串联在一起，导入含组成型GAP的PYES2载体中，构建PYES2-GAP-xyl1-xyl2质粒，将该质粒导入酿酒酵母中。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中采用的工程菌株为：INVSc1/GAP1-(GAP1-xyl2-CYC1)-(GAP1-xyl1-CYC1)-CYC1或INVSc1/GAP1-(GAP1-xyl1-CYC1)-(GAP1-xyl2-CYC1)-CYC1。