CN104328061A - 利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应用 - Google Patents

利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应用。该菌株含有如下核苷酸序列：木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖激酶基因；其中，木酮糖激酶基因过表达。本发明通过同源重组，将组成型强启动子整合到酿酒酵母出发菌株基因组上木酮糖激酶基因上游，得到木酮糖激酶过表达的菌株；再转化入从萄牙假丝酵母获得木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因，得到利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌。该酿酒酵母工程菌能够以木糖为唯一碳源生长，为后续构建木糖和葡萄糖共发酵产乙醇的菌株奠定了基础；并可以该工程菌株为基础进一步筛选和改造，使其以木质纤维素为原料生产乙醇，从而大大降低乙醇的生产成本。

Description

利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应用。
背景技术
木质纤维素是一类丰富而廉价的可再生资源，是生产燃料乙醇的主要材料，经水解后，可得到以葡萄糖和木糖为主的发酵性糖。木糖的有效利用是木质纤维素生物转化生产乙醇的关键环节之一。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae从人类有记载以来就一直是生产乙醇的首选，是目前在工业规模上发酵玉米淀粉和其他糖类化合物产乙醇的菌株，耗糖迅速快、乙醇耐受能力强，在生物质转化中潜力具大。但酿酒酵母不能利用木糖，鉴于自然界缺少能高效转化木糖生产乙醇的酿酒菌种，近年来通过基因工程技术获得了多种不同类型的木糖发酵工程菌株，其中酿酒酵母是主要研究对象。但仍存在许多技术难题，具有进一步提升的空间。
酿酒酵母工程菌株中普遍存在的问题可总结为：碳源代谢抑制、胞内戊糖代谢通路中的氧化还原失衡、以及底物摄取能力低下，在整个木质纤维素的发酵过程中，作为发酵菌株的酿酒酵母还面临着来自环境和物料、遗传途径、胞内调节几方面的压力。然而目前对这些问题尚未有有效的解决办法，将新型外源基因用于构建酿酒酵母木糖代谢途径，可进一步了解其它菌株的代谢机制，是一种提高木糖发酵能力的有效策略，对丰富微生物代谢工程的认识有重要价值。
根据代谢工程理论，构建能利用木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌株的重要途径之一是克隆天然利用木糖的酵母菌的两个关键酶基因，木糖还原酶基因XYL1(xylose reductase，XR)和木糖醇脱氢酶基因XYL2(xylitol dehydrogenase,XDH)，并使其在酿酒酵母细胞中表达。代谢通路中紧接着XYL1和XYL2的木酮糖激酶基因XKS(xylulokinase,XK)也往往是酵母菌代谢木糖的瓶颈。引入外源XYL1、XYL2，过表达宿主菌的XKS，有望得到高效发酵木糖产乙醇的工程菌株。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌。该酿酒酵母工程菌可以以木糖为唯一碳源，发酵生产乙醇。
本发明的另一目的在于提供所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，含有如下核苷酸序列：如SEQ ID NO.1所示的木糖还原酶基因、如SEQ ID NO.2所示的木糖醇脱氢酶基因和如SEQ ID NO.3所示的木酮糖激酶基因；
所述的木糖还原酶基因来自葡萄牙假丝酵母；尚未有利用该基因的报道；
所述的木糖醇脱氢酶基因来自葡萄牙假丝酵母；尚未有利用该基因的报道；
所述的木酮糖激酶基因在所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌中过表达；
所述的过表达优选为使用强启动子启动木酮糖激酶基因的转录；
所述的强启动子优选为磷酸甘油激酶启动子；
所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，优选含有如下核苷酸序列：启动子1+如SEQ ID NO.1所示的木糖还原酶基因+终止子1、启动子2+如SEQ ID NO.2所示的木糖醇脱氢酶基因+终止子2和启动子3+SEQ ID NO.3所示的木酮糖激酶基因+终止子3；
所述的启动子1优选为组成型启动子，特别优选为磷酸丙糖异构酶启动子(pTPI1)，其来自酿酒酵母；
所述的终止子1优选为磷酸丙糖异构酶终止子(tTPI1)，其来自酿酒酵母；
所述的启动子2优选为组成型启动子，特别优选为己糖转运蛋白HXT7的启动子(pHXT7)，其来自酿酒酵母；
所述的终止子2优选为CYC1终止子，其来自载体pYES2；
所述的启动子3优选为组成型强启动子，保证了木酮糖激酶基因过表达；特别优选为磷酸甘油激酶启动子(pPGK1)；
所述的终止子3优选为木酮糖激酶终止子；
所述的核苷酸序列优选为整合到所述酿酒酵母工程菌的染色体上；
所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的出发菌株优选为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CICC 1917；
所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，优选名称为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)004-PGK的菌株，其于2014年8月20日保藏在位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：M 2014385；
所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备方法，包含如下步骤：
(1)设计如下引物(5'-3')
表1
引物名称 引物序列(5'-3'，除第一条引物外，其他括号内为酶切位点)
3sites oligo dT GAGCGGATAACAATTTCACACAGGTTTTTTTTTTTTTTTT(16)
XYL1-DEG-F ATGCTATTAAAGTAGGTTATAGATTATTYGAYGGNGC
XYL1-DEG-R ATTAAATGTGGTTGTTGTAAATATGGRTGRTGYTC
XYL2-DEG-F GTTATAGTTGAAGTTAAGAAAACTGGNATHTGYGG
XYL2-DEG-R CAGCTAATAAACCAACTGGACCNGCNCCRAA
xyl1 3sites F CTTGAACCTCGAGTACCTTG
xyl2 3sites F CCACATCCAAAGAAGGCGAAC
3sites Adaptor GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
5sites Tri-G AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG
xyl1 5sites R AAGTCGCTCAATGTCTTGTCC
xyl2 5sites R TGGTCTGGCAACTTAACCAA
5sites Adaptor AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC
xyl1-cDNA-F GCTTTCCCGATGACACGTTTGCGAAAAT
xyl1-cDNA-R AATATGACTAATAGAAGGTAATTTT
xyl2-cDNA-F CCACCTCAAGGTATGAGCCTAT
xyl2-cDNA-R AACGGAGAAGAAAACCATTAGCTTT
pXKS1-F GGGCCCGAATTCAGCCCGACGGATATACCACTTATGT(EcoRI)
pXKS1-R GGGCCCGGTACCTAAAGTACTAATCTCATCCTCCTTT(KpnI)
pPGK1-F GGGCCCGGTACCAAGAAATTACCGTCGCTCGTG(KpnI)
pPGK1-R GGGCCCGGATCCTGTTTTATATTTGTTGTAAA(BamHI)
XKS1ORF-F GGGCCCGGATCCATGTTGTGTTCAGTAATTCA(BamHI)
XKS1ORF-R GGGCCCGTCGACTTAGATGAGAGTCTTTTCCA(SalI)
XKS1-ext-R GCGCTAATTTGATTTGTCT
pTPI1-F GGGCCCACTAGTCTACGTATGGTCATTTCTTC(SpeI)
pTPI1-R GGGCCCGAATTCCTGTATGTGTTTTTTGTAGT(EcoRI)
xyl1-F GGGCCCGAATTCATGGCCACTATTAAGTTGAA(EcoRI)
xyl1-R TTTATATAATTATATTAATCGGTACCCTAGTGGAAGATTGGGATTT(KpnI)
tTPI1-F AAATCCCAATCTTCCACTAGGGTACCGATTAATATAATTATATAAA(KpnI)
tTPI1-R CATACCCCTCATTTCCACGGGAGCTCGCTCTTCTATATAACAGTTG(SacI)
pHXT7-F CAACTGTTATATAGAAGAGCGAGCTCCCGTGGAAATGAGGGGTATG(SacI)
pHXT7-R TGTCTGGCAATGCGCCCCACGGATCCTTTTTGATTAAAATTAAAAA(BamHI)
xyl2-F TTTTTAATTTTAATCAAAAAGGATCCATGTCCAACCCATCTTTGGT(BamHI)
xyl2-R GGGCCCTCTAGATTACTCAGGACCGTCAATAA(XbaI)
注：引物名称中最末尾带有F的为上游引物，最末尾带有R的为下游引物
(2)获得木糖还原酶基因(xyl1)和木糖醇脱氢酶基因(xyl2)
①提取葡萄牙假丝酵母的总RNA，使用引物3sites oligo dT进行反转录，得到cDNA；
②以得到的cDNA作为模板，使用引物对XYL1-DEG-F+XYL1-DEG-R以及引物对XYL2-DEG-F+XYL2-DEG-R分别进行PCR，PCR产物经过纯化后与T载体连接，测序后证明是木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的部分序列；
③3’RACE：以步骤①得到的cDNA为模板，分别使用特异引物xyl1 3sites F和xyl2 3sitesF结合3sites Adaptor引物进行PCR反应，PCR产物纯化后连接T载体后测序；
④5’RACE：提取葡萄牙假丝酵母的总RNA，使用引物3sites oligo dT和5sites Tri-G进行反转录，得到cDNA；以该cDNA为模板，分别使用特异引物xyl1 5sites R和xyl2 5sites R结合5sites Adaptor引物进行PCR反应，PCR产物纯化后连接T载体后测序；
⑤再以步骤①得到的cDNA为模板，使用xyl1-cDNA-F和xyl1-cDNA-R为引物对，PCR得到木糖还原酶基因；使用xyl2-cDNA-F和xyl2-cDNA-R为引物对，PCR得到木糖醇脱氢酶基因；
(3)获得木酮糖激酶启动子(pXKS)片段、磷酸甘油激酶启动子(pPGK1)片段、木酮糖激酶基因(XKS)片段、磷酸丙糖异构酶启动子(pTPI1)片段、磷酸丙糖异构酶终止子(tTPI1)片段、葡萄糖转运蛋白HXT7启动子(pHXT7)片段
以酿酒酵母基因组DNA为模板，以pXKS1-F和pXKS1-R为引物对，PCR得到木酮糖激酶启动子片段；以pPGK1-F和pPGK1-R为引物对，PCR得到磷酸甘油激酶启动子片段；以XKS1ORF-F和XKS1ORF-R为引物对，PCR得到木酮糖激酶基因片段；以pTPI1-F和pTPI1-R为引物对，PCR得到磷酸丙糖异构酶启动子片段；以tTPI1-F和tTPI1-R为引物对，PCR得到磷酸丙糖异构酶终止子片段；以pHXT7-F和pHXT7-R为引物对，PCR得到葡萄糖转运蛋白HXT7的启动子片段；
(4)重组载体的构建
I、酿酒酵母整合型表达载体YIplac211-dpXKS的构建
用BamHI-KpnI酶切磷酸甘油激酶启动子片段，连入YIplac211的BamHI-KpnI切口，得到质粒YIplac211-Pp；接着用KpnI-EcoRI酶切木酮糖激酶启动子片段，连入YIplac211-Pp的KpnI-EcoRI切口，得到质粒YIplac211-dp；用SalI-BamHI酶切木酮糖激酶基因片段，连入YIplac211-dp的SalI-BamHI切口，得到质粒YIplac211-dpXKS；
II、质粒pOJ04的构建
以步骤(2)①得到的cDNA为模板，以xyl1-F和xyl1-R为引物对，扩增得到xyl1基因；以步骤(2)①得到的cDNA为模板，以xyl2-F和xyl2-R为引物对，扩增得到xyl2基因；用SpeI-EcoRI酶切上一步骤得到的磷酸丙糖异构酶启动子片段，连入pYES2的SpeI-EcoRI切口，得到质粒pOJ01；将xyl1基因和上一步骤得到的磷酸丙糖异构酶终止子片段等摩尔比混合后作为模板，使用引物对xyl1-F+tTPI1-R扩增得到XYL1-tTPI1；将xyl2基因和上一步骤得到的葡萄糖转运蛋白HXT7启动子片段等摩尔比混合后作为模板，使用引物对pHXT7-F+xyl2-R扩增得到pHXT7-XYL2；XYL1-tTPI1和pHXT7-XYL2经纯化后，以之作为模板再次进行融合PCR，使用引物对xyl1-F+xyl2-R，得到4片段的融合产物XYL1-t-p-2；XYL1-t-p-2用EcoRI-XbaI酶切，连入pOJ01的EcoRI-XbaI切口，得到质粒pOJ04；
(5)木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌的制备
将线性化的YIplac211-dpXKS转化入酿酒酵母感受态细胞，涂布于含有1M山梨醇溶液的尿嘧啶省却培养基选择性平板，30℃倒置培养；使用引物pPGK1-F和XKS1-ext-R通过菌落PCR筛选得到阳性克隆；将阳性克隆涂布于含有5-FOA的筛选平板上，使用引物pPGK1-F和XKS1-ext-R再次筛选pPGK1正确插入到XKS ORF之前的转化子，得到木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌；
(6)表达木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株的获得
将木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌处理成感受态细胞；接着将线性化的pOJ04转化入木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌感受态细胞中，涂布于含有1M山梨醇溶液的尿嘧啶省却培养基选择性平板，30℃倒置培养，使用引物xyl1-F和xyl1-R进行菌落PCR，筛选出表达木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株。
步骤(2)中所述的葡萄牙假丝酵母优选为萄萄牙假丝酵母Candida lusitaniae CICC 1461；
步骤(2)①中所述的反转录的体系和反应条件按说明书操作；
步骤(2)②和⑤中所述的PCR的体系优选为：Premix LA Taq 25μL、浓度为10mM的上游引物4μL、浓度为10mM的下游引物4μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL；
步骤(2)③中所述的PCR的体系优选为：Premix LA Taq 25μL、浓度为10mM的特异引物2μL、浓度为10mM的3sites Adaptor 2μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL；
步骤(2)④中所述的反转录的具体步骤如下：
A、将浓度1μg/μL的总RNA 2.75μL和浓度为100μM的3sites oligo dT引物1μL混合均匀，离心后在PCR仪上72℃温育3min，然后冷却至42℃处理2min，离心后冰浴；
B、往步骤A得到的反应液中加入浓度为20μM的5sites Tri-G引物1μL，混合均匀；接着加入Master Micture溶液，混合均匀；42℃温育90min进行逆转录；70℃处理10min终止反应；加入100μL Tris-EDTA缓冲液，得到cDNA；Master Micture溶液的组成如下：ddH2O0.75μl、5×Buffer 2μl、浓度为10mM的dNTP mixture 1μl、浓度为20U/μl的RNase Inhibitor0.5μl、浓度为100U的SMARTScribe Reverse Transcriptase 1μl；
步骤(2)④中所述的PCR的体系为：Premix LA Taq 25μL、浓度为10mM的特异引物2μL、浓度为10mM的5sites Adaptor 2μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL；
步骤(2)中所述PCR的条件为：94℃1min；94℃30s，55℃30s，72℃延伸1kb/min，30cycles；72℃10min；
步骤(3)和步骤(5)中所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CICC1917；
步骤(3)中所述的PCR的反应体系优选为：Premix LA Taq 25μL、上游引物(10mM)2μL、下游引物(10mM)2μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL。
所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌可用于以木糖为原料生产乙醇。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供的酿酒酵母工程菌可以同时表达来自葡萄牙假丝酵母的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，并且过表达自身的木酮糖激酶，能够以木糖为唯一碳源生长，为后续构建木糖和葡萄糖共发酵产乙醇的菌株奠定了基础。并可以该工程菌株为基础进一步筛选和改造，使其以木质纤维素为原料生产乙醇，从而大大降低乙醇的生产成本。
附图说明
图1是整合型表达载体YIplac211-dpXKS的结构示意图。
图2是附加型表达载体pOJ04的结构示意图。
图3是酿酒酵母工程菌株在好氧条件下的发酵产物结果图。
图4是酿酒酵母工程菌株在限氧条件下的发酵产物结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备
(1)实现本发明所设计的引物如前文表1所示，由生工生物工程(上海)有限公司合成。
(2)获得木糖还原酶基因(xyl1)和木糖醇脱氢酶基因(xyl2)
将葡萄牙假丝酵母Candida lusitaniae CICC 1461(中国工业微生物菌种保藏管理中心)接种于YPX平板培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，木糖20g/L，琼脂15g/L，pH自然)中30℃培养活化。取活化后的酵母接种于(1％(v/v)接种量)YPX液体培养基，30℃、200rpm培养18h，得到处于对数期的细胞。在1.5mL离心管中加入400μL AE缓冲液(pH 5.2，50mMNaAc，10mM EDTA)，50μL 10％(w/v)SDS和600μL酚/氯仿混合液(酚和氯仿按体积比＝1:1混合)，混合均匀后加入到离心收集的细胞中，剧烈振荡重悬。混合物于65℃恒温振荡30min，通过冰浴5min冷却，室温12000g离心7min，然后取400μL上清至装有1mL无水乙醇和40μL 3M NaAc(pH 5.2)的1.5mL离心管中，上下颠倒混匀，置-20℃沉淀30min以上。随后室温12000g离心10min，去上清，加入1mL 75％(v/v)乙醇洗涤沉淀；室温12000g离心5min，去上清，室温晾干3min，加入50-100μL DEPC水溶解沉淀。通过分光光度计和琼脂糖凝胶电泳测定RNA浓度和质量。
使用First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)反转录，所用引物为3sites oligo dT，得到cDNA。逆转录体系和过程按说明书操作。
以得到的cDNA作为模板，使用YL1-DEG-F1+XYL1-DEG-R为引物对，PCR得到木糖还原酶基因的部分序列；使用XYL2-DEG-F2+XYL2-DEG-R为引物对，PCR得到木糖醇脱氢酶基因的部分序列。
PCR扩增反应体系为：Premix LA Taq 25μL、上游引物(10mM)4μL、下游引物(10mM)4μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL。
PCR扩增反应条件为：94℃1min；94℃30s、55℃30s、72℃延伸(1kb/min)，30个循环；72℃10min。
将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳。使用小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(庄盟国际生物科技有限公司，中国北京)进行回收纯化。使用pEASY-T1Simple Cloning Kit(全式金生物科技有限公司，中国北京)将T载体与xyl1基因片段、xyl2基因片段分别连接(按说明书操作)，每5μL连接产物转化50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。通过菌落PCR鉴定筛选阳性克隆子并送交测序(委托上海生工生物工程有限公司完成)。测序结果与GenBank数据库进行比对，证实阳性克隆子的插入片段是木糖还原酶基因部分序列和木糖醇脱氢酶基因部分序列。
以cDNA为模板，分别使用特异引物xyl1 3sites F和xyl2 3sites F结合3sites Adaptor引物进行PCR反应。PCR扩增反应体系为：Premix LA Taq 25μL、上游引物(10mM)2μL、3sites Adaptor(10mM)2μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL，PCR产物纯化后连接T载体后测序。
总RNA(1μg/μL)2.75μL，3sites oligo dT(100μM)引物1μL，混合均匀，短暂离心后在PCR仪上72℃温育3min，后冷却至42℃处理2min，短暂离心后冰浴；往反应液中加入5sitesTri-G(20μM)引物1μL，混合均匀；将Master Micture(ddH2O 0.75μl、5×Buffer(First StrandcDNA Synthesis Kit)2μl、dNTP mixture(10mM)1μl、RNase Inhibitor(20U/μl)0.5μl、SMARTScribeReverse Transcriptase(100U，Clontech)1μl)全部加入变性RNA中，混合均匀，总体积为10μL；42℃温育90min进行逆转录；70℃处理10min终止反应；加入100μL Tris-EDTA缓冲液，样品存于-20℃。以得到的cDNA用作模板，分别使用特异引物xyl15sites R和xyl25sites R结合5sites Adaptor引物进行PCR反应。PCR扩增反应体系为：Premix LA Taq 25μL、上游引物(10mM)2μL、5sites Adaptor(10mM)2μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL，PCR产物纯化后连接T载体后测序。
通过RACE克隆及测序后获得cDNA两端及中间的大部分序列，使用xyl1-cDNA-F+xyl1-cDNA-R和xyl2-cDNA-F+xyl2-cDNA-R两对引物，以cDNA为模板扩增XYL1和XYL2两个基因的全长cDNA，得到如SEQ ID NO.4所示的木糖还原酶基因和如SEQ ID NO.5所示的木糖醇脱氢酶基因。
PCR体系为Premix LA Taq 25μL、上游引物(10mM)4μL、下游引物(10mM)4μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL
PCR扩增反应条件为：94℃1min；94℃30s，55℃30s，72℃延伸(1kb/min)，30cycles；72℃10min。
(3)获得木酮糖激酶启动子(pXKS)、木酮糖激酶基因(XKS)、磷酸甘油激酶启动子(pPGK1)、磷酸丙糖异构酶启动子(pTPI1)、磷酸丙糖异构酶终止子(tTPI1)、葡萄糖转运蛋白HXT7的启动子(pHXT7)
酿酒酵母出发菌株为Saccharomyces cerevisiae CICC 1917(中国工业微生物菌种保藏管理中心)。挑取酵母的单菌落接种于10mL YPD培养基(酵母抽提物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，pH自然)，30℃、200rpm摇床过夜。使用北京庄盟的酵母基因组提取试剂盒制备酿酒酵母基因组DNA，以之作为模板。
以pXKS1-F和pXKS1-R为引物对，扩增得到启动子pXKS片段，含EcoRI和KpnI酶切位点。
以pPGK1-F和pPGK1-R为引物对，扩增得到启动子pPGK1片段，含KpnI和BamHI酶切位点。
以XKS1 ORF-F和XKS1 ORF-R为引物对，扩增得到XKS基因，含BamHI和SalI酶切位点。
以pTPI1-F和pTPI1-R为引物对，扩增得到启动子pTPI1片段，含SpeI和EcoRI酶切位点。
以tTPI1-F和tTPI1-R为引物对，扩增得到终止子tTPI1片段，含KpnI和SacI酶切位点。
以pHXT7-F和pHXT7-R为引物对，扩增得到启动子pHXT7序列，含SacI和BamHI酶切位点。
PCR扩增反应体系为：Premix LA Taq 25μL、上游引物(10mM)2μL、下游引物(10mM)2μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL。
PCR反应条件、PCR产物的纯化同步骤(2)。
(4)重组载体的构建
I、酿酒酵母整合型表达载体YIplac211-dpXKS的构建
用BamHI-KpnI酶切启动子pPGK1片段，连入YIplac211(ATCC)的BamHI-KpnI切口(即质粒已进行双酶切处理，下同)，得到质粒YIplac211-Pp。接着用KpnI-EcoRI酶切启动子XKS片段，连入YIplac211-Pp的KpnI-EcoRI切口，得到质粒YIplac211-dp。用SalI-BamHI酶切XKS基因，连入YIplac211-dp的SalI-BamHI切口，得到质粒YIplac211-dpXKS(如图1所示)。测序，可知质粒YIplac211-dpXKS所包含元件XKS ORF、pPGK1和pXKS的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
质粒的酶切体系为：10×Green Buffer 4μL、酶(两种酶)各2μL、质粒DNA 2μg、AlkalinePhosphatase(碱性磷酸化酶)2μL，双蒸水补足至60μL。
插入片段的酶切体系为：10×Green Buffer 4μL、酶(两种酶)各2μL、片段DNA 0.2μg，双蒸水补足至60μL。
酶切条件：PCR仪控温，37℃处理30min。
线性化质粒使用小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收。
连接体系及方法为：分别加入载体和插入片段的回收产物，使两者的摩尔比为1:1～1:5，10×T4DNA连接酶缓冲液2μL，T4DNA连接酶2U，最终体积为20μL。PCR仪控温，22℃连接1h，反应结束后取10μL连接产物转化100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过菌落PCR鉴定筛选阳性克隆子并送交测序。
II、质粒pOJ04的构建
以步骤(2)得到的cDNA为模板，以xyl1-F和xyl1-R为引物对，扩增得到xyl1基因，含EcoRI和KpnI酶切位点。
以步骤(2)得到的cDNA为模板，以xyl2-F和xyl2-R为引物对，扩增得到xyl2基因，含BamHI和XbaI酶切位点。
用SpeI-EcoRI酶切上一步骤得到的启动子pTPI1片段，连入pYES2(invitrogen)的SpeI-EcoRI切口，得到质粒pOJ01。将xyl1基因和上一步骤得到的终止子tTPI1片段等摩尔比混合后作为模板，使用引物对xyl1-F+tTPI1-R扩增XYL1-tTPI1；将xyl2基因和上一步骤得到的启动子pHXT7序列等摩尔比混合后作为模板，使用引物对pHXT7-F+xyl2-R扩增pHXT7-XYL2。XYL1-tTPI1和pHXT7-XYL2经纯化后，以之作为模板再次进行融合PCR，使用引物对xyl1-F+xyl2-R，得到4片段的融合产物XYL1-t-p-2。XYL1-t-p-2用EcoRI-XbaI酶切，连入pOJ01的EcoRI-XbaI切口，得到质粒pOJ04(如图2所示)。PCR反应体系、反应条件及PCR产物纯化同步骤(3)。质粒所包含元件启动子pTPI1和pHXT7、终止子tTPI1和tCYC1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.11所示。其中tCYC1为出发质粒pYES2自带的终止子。
(5)酿酒酵母感受态细胞的制备
挑取酵母受体菌(Saccharomyces cerevisiae CICC 1917)的单菌落接种于10mL YPD培养基，30℃、200rpm摇床过夜；以1％(v/v)接种量转接至100mL YPD液体培养基，30℃、200rpm摇床过夜至OD600＝1.3-1.5；分别用100mL和50mL冰预冷无菌水将菌体重悬并于4℃冷冻离心；再用20mL 1mol/L预冷的山梨醇溶液洗涤1次，每次洗涤后于5000rpm冷冻离心10min；重悬于100μL 1mol/L在冰上预冷的山梨醇溶液，分装65μL/管，制备好的感受态细胞立即用于转化，剩余的细胞存放于-80℃，于两周内使用。
(6)木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌的制备
I、整合型表达载体YIplac211-dpXKS的线性化
线性化反应体系如下：DNA 20μg、10×Green Buffer 40μL、SacI 20μL，双蒸水补足至400μL。
PCR仪控温，37℃处理30min。线性化质粒使用小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，并使用去离子水洗脱得到高纯度DNA。
II、酿酒酵母的转化
使用Electroporator 2510电转化仪及Biorad 2mm电击杯，设定电压为1500V；往65μL感受态细胞中加入5μL线性化DNA溶液，冰浴5min；将细胞/质粒混合物转移至预冷的电击杯中，擦干表面，装入仪器中；电击，马上加入1mL预冷的1M山梨醇溶液，随后涂布于含有1M山梨醇溶液的选择性平板，30℃倒置培养。酿酒酵母筛选所用培养基参照《酵母遗传学方法实验指南》(科学出版社，2000年)进行配制。
III、同源重组及重组子的鉴定
把YIplac211-dpXKS线性化后转入酵母细胞后，质粒整合到染色体上。在尿嘧啶营养缺陷型培养基上培养3-5d后可观察到明显的菌落。用20μL移液枪吸头挑取适量菌体，转接于1mL液体筛选培养基(尿嘧啶营养缺陷型培养基)中，并将菌体分散于PCR反应体系中。使用引物pPGK1-F和XKS1-ext-R，通过菌落PCR筛选得到的阳性菌株命名为得到菌株命名为1917-YIP。
把正确整合到染色体上的转化子涂布于含有VVV5-FOA的筛选平板(SC-5-FOA筛选培养基)上，通过同源重组将URA3标记基因的质粒弹出来(使细胞内的质粒丢失)。筛选平板上长出来的转化子使用引物pPGK1-F和XKS1-ext-R筛选pPGK1正确插入到XKS ORF之前的转化子。阳性菌落可得到长约2300bp的PCR产物。得到的菌株命名为酿酒酵母1917-PGK。
(7)表达木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株的获得
酿酒酵母1917-PGK感受态的制备，同步骤(5)。
质粒pOJ04的线性化，及转化酿酒酵母1917-PGK感受态，同步骤(6)。
在含有1M山梨醇溶液的选择性平板(尿嘧啶营养缺陷型培养基)培养3-5d后，使用引物xyl1-F和xyl1-R进行菌落PCR筛选出携带XYL1和XYL2的阳性菌株，命名为酿酒酵母004-PGK,于2014年8月20日保藏在位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：M 2014385。
实施例2木糖还原酶和木糖醇脱氢酶在酿酒酵母中的酶活测定
(1)粗酶液制备
将酵母菌株004-PGK和酿酒酵母出发菌株1917接入5mL YPX液体培养基中，30℃，200rpm过夜振荡培养，转接入50mL新鲜YPX培养基中，使初始OD600为0.1，30℃、200rpm摇瓶培养，至OD600约为1。使用预先冷冻的50mL离心管在4℃、3000rpm离心15min，收集细胞，弃去上清，用等量预冷的三乙醇胺缓冲液(100mM、pH7.0)将菌体重悬洗涤细胞，离心弃去上清；随后用10mL冰冷的三乙醇胺缓冲液重悬细胞，取1.5mL转移到预先冷冻的含有750mg玻璃珠的细胞破碎管中，加入15μL PMSF(1mmol)和7.5μL DTT(0.5mmol)。将装有玻璃珠和细胞的细胞破碎管放于匀浆机中，以最大速度破碎30s，重复10次，每次间隔2min并冰浴冷却。将破碎后的细胞转入干净无菌离心管内，于冷冻离心机12,000rpm高速离心10min，取上清液用于酶活测定。
(2)酶活测定
酶活测定体系详细列于表2，其中木酮糖激酶活力的测定方法如下：在不添加ATP的条件下测定木糖醇脱氢酶的活性，添加ATP后测定木酮糖激酶和木糖醇脱氢酶的总活力，两者差值即为XK酶活。测定步骤及相关参数为：取0.1mL粗酶液与相应的缓冲液、协同反应物、辅酶混合均匀；将酶促反应体系和起始反应物分别置于烘箱中，30℃恒温放置5min；在Unico2802S紫外分光光度计中设定动力学测定方法；取起始反应物与酶促反应体系混合后，迅速转移至比色皿并测定反应曲线。1U(酶活单位)定义为lmin内转化1pmol NAD(P)H的酶量，NAD(P)H的摩尔吸光系数6.22cm-1μmol-1。
酶活测定结果列于表3，数据显示XYL1和XYL2基因在酿酒酵母中得到了活性表达，酿酒酵母自身的XK活性提高了46.1％。
表2 酶活测定反应体系
注：各浓度指最终混合物中的浓度，终体积为1mL
表3 酶活测定结果
实施例3工程菌在木糖为唯一碳源培养基中的代谢产物检测
(1)发酵方法
发酵温度控制在酵母最适生长温度30℃，使用YPX培养基。好氧发酵如下：使用250mL三角瓶，装液量50mL，使用纱布封口，选择200rpm转速。厌氧发酵如下：使用100mL血清瓶，装液量50mL，用厌氧抽排系统对血清瓶进行抽真空充氮气形成厌氧条件。待测酵母菌在YPX平板上划线分离单菌落，挑取菌体接种至50mL液体YPX培养基中，30℃转速200rpm培养至OD600为1.0-1.5间，离心收集菌体，接种至相应的发酵培养基中，使初始OD600为0.1。取样经离心取上清、稀释调酸处理后作为色谱样品。
(2)代谢产物检测
使用Waters 2695高效液相色谱仪，示差折光检查器(RI-2414；Milford,USA)，色谱柱：Aminex HPX-87H column(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)。流动相为2.5mM H2SO4，在每1.9mL样品加入10％(v/v)硫酸0.1mL以调整样品pH在1-3范围内，离心并过0.22μm微孔滤膜后进样；流速为0.6mL/min，柱温60℃，检测器温度40℃；进样量10μL，运行时间30min。流动相配制时使用去离子水，并进行超声波脱气。标准样品使用色谱纯药品并使用超纯水进行配制。采用外标法对实验结果进行测定。
经检测，重组酿酒酵母能够在上述条件下发酵木糖生产乙醇，004-PGK在好氧条件下144h的发酵周期内利用了约15％的木糖(如图3所示)，在限氧条件下144h内利用了约7.5％的木糖(如图4所示)，而酿酒酵母出发菌株没有该能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于含有如下核苷酸序列：如SEQ ID NO.1所示的木糖还原酶基因、如SEQ ID NO.2所示的木糖醇脱氢酶基因和如SEQ IDNO.3所示的木酮糖激酶基因。
2.根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的木酮糖激酶基因在所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌中过表达。
3.根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于含有如下核苷酸序列：启动子1+如SEQ ID NO.1所示的木糖还原酶基因+终止子1、启动子2+如SEQ IDNO.2所示的木糖醇脱氢酶基因+终止子2和启动子3+SEQ ID NO.3所示的木酮糖激酶基因+终止子3。
4.根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的启动子1为磷酸丙糖异构酶启动子；
所述的终止子1为磷酸丙糖异构酶终止子；
所述的启动子2为己糖转运蛋白HXT7的启动子；
所述的终止子2为CYC1终止子；
所述的启动子3为磷酸甘油激酶启动子；
所述的终止子3为木酮糖激酶终止子。
5.根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的核苷酸序列为整合到所述酿酒酵母工程菌的染色体上。
6.根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的出发菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeCICC 1917。
7.根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌为名称为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)004-PGK的菌株，其于2014年8月20日保藏在位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：M 2014385。
8.权利要求1～7任一项所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)设计如下引物，引物方向均为5'-3'：
3sites oligo dT：GAGCGGATAACAATTTCACACAGGTTTTTTTTTTTTTTTT；
XYL1-DEG-F：ATGCTATTAAAGTAGGTTATAGATTATTYGAYGGNGC；
XYL1-DEG-R：ATTAAATGTGGTTGTTGTAAATATGGRTGRTGYTC；
XYL2-DEG-F：GTTATAGTTGAAGTTAAGAAAACTGGNATHTGYGG；
XYL2-DEG-R：CAGCTAATAAACCAACTGGACCNGCNCCRAA；
xyl1 3sites F：CTTGAACCTCGAGTACCTTG；
xyl2 3sites F：CCACATCCAAAGAAGGCGAAC；
3sites Adaptor：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG；
5sites Tri-G：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG；
xyl1 5sites R：AAGTCGCTCAATGTCTTGTCC；
xyl2 5sites R：TGGTCTGGCAACTTAACCAA；
5sites Adaptor：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC；
xyl1-cDNA-F：GCTTTCCCGATGACACGTTTGCGAAAAT；
xyl1-cDNA-R：AATATGACTAATAGAAGGTAATTTT；
xyl2-cDNA-F：CCACCTCAAGGTATGAGCCTAT；
xyl2-cDNA-R：AACGGAGAAGAAAACCATTAGCTTT；
pXKS1-F：GGGCCCGAATTCAGCCCGACGGATATACCACTTATGT；
pXKS1-R：GGGCCCGGTACCTAAAGTACTAATCTCATCCTCCTTT；
pPGK1-F：GGGCCCGGTACCAAGAAATTACCGTCGCTCGTG；
pPGK1-R：GGGCCCGGATCCTGTTTTATATTTGTTGTAAA；
XKS1 ORF-F：GGGCCCGGATCCATGTTGTGTTCAGTAATTCA；
XKS1 ORF-R：GGGCCCGTCGACTTAGATGAGAGTCTTTTCCA；
XKS1-ext-R：GCGCTAATTTGATTTGTCT；
pTPI1-F：GGGCCCACTAGTCTACGTATGGTCATTTCTTC；
pTPI1-R：GGGCCCGAATTCCTGTATGTGTTTTTTGTAGT；
xyl1-F：GGGCCCGAATTCATGGCCACTATTAAGTTGAA；
xyl1-R：TTTATATAATTATATTAATCGGTACCCTAGTGGAAGATTGGGATTT；
tTPI1-F：AAATCCCAATCTTCCACTAGGGTACCGATTAATATAATTATATAAA；
tTPI1-R：CATACCCCTCATTTCCACGGGAGCTCGCTCTTCTATATAACAGTTG；
pHXT7-F：CAACTGTTATATAGAAGAGCGAGCTCCCGTGGAAATGAGGGGTATG；
pHXT7-R：TGTCTGGCAATGCGCCCCACGGATCCTTTTTGATTAAAATTAAAAA；
xyl2-F：TTTTTAATTTTAATCAAAAAGGATCCATGTCCAACCCATCTTTGGT；
xyl2-R：GGGCCCTCTAGATTACTCAGGACCGTCAATAA；
(2)获得木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因
①提取葡萄牙假丝酵母的总RNA，使用引物3sites oligo dT进行反转录，得到cDNA；
②以得到的cDNA作为模板，使用引物对XYL1-DEG-F+XYL1-DEG-R以及引物对XYL2-DEG-F+XYL2-DEG-R分别进行PCR，PCR产物经过纯化后与T载体连接，测序后证明是木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的部分序列；
③3’RACE：以步骤①得到的cDNA为模板，分别使用特异引物xyl1 3sites F和xyl2 3sitesF结合3sites Adaptor引物进行PCR反应，PCR产物纯化后连接T载体后测序；
④5’RACE：提取葡萄牙假丝酵母的总RNA，使用引物3sites oligo dT和5sites Tri-G进行反转录，得到cDNA；以该cDNA为模板，分别使用特异引物xyl1 5sites R和xyl2 5sites R结合5sites Adaptor引物进行PCR反应，PCR产物纯化后连接T载体后测序；
⑤再以步骤①得到的cDNA为模板，使用xyl1-cDNA-F和xyl1-cDNA-R为引物对，PCR得到木糖还原酶基因；使用xyl2-cDNA-F和xyl2-cDNA-R为引物对，PCR得到木糖醇脱氢酶基因；
(3)获得木酮糖激酶启动子片段、磷酸甘油激酶启动子片段、木酮糖激酶基因片段、磷酸丙糖异构酶启动子片段、磷酸丙糖异构酶终止子片段、葡萄糖转运蛋白HXT7启动子片段
以酿酒酵母基因组DNA为模板，以pXKS1-F和pXKS1-R为引物对，PCR得到木酮糖激酶启动子片段；以pPGK1-F和pPGK1-R为引物对，PCR得到磷酸甘油激酶启动子片段；以XKS1 ORF-F和XKS1 ORF-R为引物对，PCR得到木酮糖激酶基因片段；以pTPI1-F和pTPI1-R为引物对，PCR得到磷酸丙糖异构酶启动子片段；以tTPI1-F和tTPI1-R为引物对，PCR得到磷酸丙糖异构酶终止子片段；以pHXT7-F和pHXT7-R为引物对，PCR得到葡萄糖转运蛋白HXT7的启动子片段；
(4)重组载体的构建
I、酿酒酵母整合型表达载体YIplac211-dpXKS的构建
用BamHI-KpnI酶切磷酸甘油激酶启动子片段，连入YIplac211的BamHI-KpnI切口，得到质粒YIplac211-Pp；接着用KpnI-EcoRI酶切木酮糖激酶启动子片段，连入YIplac211-Pp的KpnI-EcoRI切口，得到质粒YIplac211-dp；用SalI-BamHI酶切木酮糖激酶基因片段，连入YIplac211-dp的SalI-BamHI切口，得到质粒YIplac211-dpXKS；
II、质粒pOJ04的构建
以步骤(2)①得到的cDNA为模板，以xyl1-F和xyl1-R为引物对，扩增得到xyl1基因；以步骤(2)①得到的cDNA为模板，以xyl2-F和xyl2-R为引物对，扩增得到xyl2基因；用SpeI-EcoRI酶切上一步骤得到的磷酸丙糖异构酶启动子片段，连入pYES2的SpeI-EcoRI切口，得到质粒pOJ01；将xyl1基因和上一步骤得到的磷酸丙糖异构酶终止子片段等摩尔比混合后作为模板，使用引物对xyl1-F+tTPI1-R扩增得到XYL1-tTPI1；将xyl2基因和上一步骤得到的葡萄糖转运蛋白HXT7启动子片段等摩尔比混合后作为模板，使用引物对pHXT7-F+xyl2-R扩增得到pHXT7-XYL2；XYL1-tTPI1和pHXT7-XYL2经纯化后，以之作为模板再次进行融合PCR，使用引物对xyl1-F+xyl2-R，得到4片段的融合产物XYL1-t-p-2；XYL1-t-p-2用EcoRI-XbaI酶切，连入pOJ01的EcoRI-XbaI切口，得到质粒pOJ04；
(5)木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌的制备
将线性化的YIplac211-dpXKS转化入酿酒酵母感受态细胞，涂布于含有1M山梨醇溶液的尿嘧啶省却培养基选择性平板，30℃倒置培养；使用引物pPGK1-F和XKS1-ext-R通过菌落PCR筛选得到阳性克隆；将阳性克隆涂布于含有5-FOA的筛选平板上，使用引物pPGK1-F和XKS1-ext-R再次筛选pPGK1正确插入到XKS ORF之前的转化子，得到木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌；
(6)表达木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株的获得
将木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌处理成感受态细胞；接着将线性化的pOJ04转化入木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌感受态细胞中，涂布于含有1M山梨醇溶液的尿嘧啶省却培养基选择性平板，30℃倒置培养，使用引物xyl1-F和xyl1-R进行菌落PCR，筛选出表达木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株。
9.根据权利要求8所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的葡萄牙假丝酵母为萄萄牙假丝酵母Candida lusitaniae CICC 1461；
步骤(2)②和⑤中所述的PCR的体系为：Premix LA Taq 25μL、浓度为10mM的上游引物4μL、浓度为10mM的下游引物4μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL；
步骤(2)③中所述的PCR的体系为：Premix LA Taq 25μL、浓度为10mM的特异引物2μL、浓度为10mM的3sites Adaptor 2μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL；
步骤(2)④中所述的反转录的具体步骤如下：
A、将浓度1μg/μL的总RNA2.75μL和浓度为100μM的3sites oligo dT引物1μL混合均匀，离心后在PCR仪上72℃温育3min，然后冷却至42℃处理2min，离心后冰浴；
B、往步骤A得到的反应液中加入浓度为20μM的5sites Tri-G引物1μL，混合均匀；接着加入Master Micture溶液，混合均匀；42℃温育90min进行逆转录；70℃处理10min终止反应；加入100μL Tris-EDTA缓冲液，得到cDNA；Master Micture溶液的组成如下：ddH2O0.75μl、5×Buffer 2μl、浓度为10mM的dNTP mixture 1μl、浓度为20 U/μl的RNase Inhibitor0.5μl、浓度为100U的SMARTScribe Reverse Transcriptase 1μl；
步骤(2)④中所述的PCR的体系为：Premix LA Taq 25μL、浓度为10mM的特异引物2μL、浓度为10mM的5sites Adaptor 2μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL；
步骤(2)中所述PCR的条件为：94℃1min；94℃30s，55℃30s，72℃延伸1kb/min，30cycles；72℃10min；
步骤(3)和步骤(5)中所述的酿酒酵母为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CICC 1917；
步骤(3)中所述的PCR的反应体系为：Premix LA Taq 25μL、浓度为10mM的上游引物2μL、浓度为10mM的下游引物2μL、模板2μL，ddH2O补足至50μL。
10.权利要求1～7任一项所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的应用，其特征在于：所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌用于以木糖为原料生产乙醇。
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