CN108823113B - 高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及乙醇的生物制备领域，具体地涉及高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法。所述工业菌株的保藏编号为CGMCC No.15568。通过组成型的强启动子将包括木糖还原酶XR基因，木糖醇脱氢酶XDH基因，木酮糖激酶XK基因，以及2份拷贝的木糖转运蛋白基因mgt05196，TAL1，和2份拷贝PYK1基因的基因表达簇整合到酿酒酵母中，从而改善其葡萄糖代谢能力，木糖代谢能力，以及乙醇的产量。

Description

高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法
技术领域
本发明涉及乙醇的生物制备领域，具体地涉及高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法。
背景技术
燃料乙醇是一种新型的可再生清洁能源，可以在各种生物质的作用下通过相应的微生物发酵得到。
木质纤维素是自然界存在的含量最丰富的有机的可再生资源之一，取之不尽用之不竭，是目前国际最主流的工业乙醇的发酵原料。木质纤维素通过水解作用生成多种单糖，其中含量最为丰富的是葡萄糖和木糖，木糖的含量仅次于葡萄糖。同时，水解过程会产生一些对酿酒酵母有毒或有抑制作用的物质，如乙酸、呋喃和糠醛，其中乙酸的含量较高，对酿酒酵母产生主要的抑制和毒害作用。
酿酒酵母代谢葡萄糖产乙醇是通过糖酵解途径。在一系列酶的催化作用下，一分子葡萄糖转化为磷酸烯醇式丙酮酸，而在丙酮酸激酶PYK1作用下最终生成两分子丙酮酸，继而丙酮酸在丙酮酸脱羧酶PDC的催化作用下生成乙醛，最终乙醛在乙醇脱氢酶ADH的作用下生成了乙醇。
因此，需要增强酿酒酵母菌的乙酸耐受和乙酸代谢率，这对于提高木质纤维素水解液中乙醇发酵水平，促进乙醇的工业化生产有很大的帮助
发明内容
本发明为了解决如何提高酿酒酵母的木糖代谢能力，乙酸耐受能力，乙醇产率等等问题，研究不同菌株增加不同拷贝数的“基因表达簇”，以及组合乙酸耐受基因等多种基因的表达对于具备良好的木糖代谢能力和乙酸耐受能力的重组酿酒酵母菌的乙醇发酵性能的影响。
根据本发明的木糖代谢产乙醇的工业菌株其保藏编号为CGMCC No.15568。
根据本发明的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，所述方法包括步骤：选取基因表达簇：木糖还原酶XR基因，木糖醇脱氢酶XDH基因，木酮糖激酶XK基因，以及2份拷贝的木糖转运蛋白基因mgt05196，TAL1，和2份拷贝PYK1基因，选择组成型的强启动子pPGK1、pADH1、pTDH3、pTEF1来随机表达以上六种基因PYK1、TAL1、XR、XDH、XK和mgt05196，并整合到酿酒酵母基因组中。
根据本发明的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，所述方法进一步包括增加上述基因表达簇拷贝数的步骤。
根据本发明的具体实施方式，在单倍体酿酒酵母菌E7(保藏编号为CGMCCNo.15567)的基础上，不断增加“基因表达簇”的拷贝次数，一次拷贝，二次拷贝，菌株的发酵性能逐步提升，糖醇转化率方面初始菌E7，一次拷贝菌1Z(保藏编号为CGMCC No.15568)，二次拷贝菌1Z1Z三者的糖醇转化率分别为45.08％、47.74％、48.19％，分别达到了理论转化率的88.40％、93.6％、94.5％，但是再进行第三次拷贝数增加构建1Z1Z1Z后，菌株的糖醇转化率是47.97％，到了理论转化率的94.1％，对菌株的发酵性能没有提升作用。
根据本发明的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，所述方法进一步包括在二次拷贝菌1Z1Z的基础上，通过酿酒酵母内源的多拷贝位点delta的rDNA的基因重组，随机多拷贝表达上述基因簇的步骤。
根据本发明的具体实施方式，进一步单倍体菌株1Z1Z的基础上进行了“基因表达簇”的随机多拷贝表达，验证其作用是否已经接近阈值。1Z1Z的基础上，通过酿酒酵母内源的多拷贝位点delta的rDNA的基因重组，得到4株性能较好的“基因表达簇”的随机多拷贝表达菌。发酵性能方面，四株菌的乙醇产量都很高，糖醇转化率分别是49.92％，46.14％，49.44％，49.44％；木糖代谢能力DELTA9最强，发酵48h代谢了40.46g木糖，其余三种菌的木糖代谢分别是35.8g、36.3g、35.9g，副产物甘油和木糖醇都较高，乙酸代谢能力较低。探究四株菌的六个基因的转录，发现：(1)XR(K270R)、XDH、PYK1的高表达可以促进细胞的木糖代谢，增加木糖消耗量，此外，如果这三者没有实现同步的基因拷贝数和表达量，出现表达量的差异，会直接导致中间产物木糖醇的积累和副产物甘油的增多；(2)高表达PYK1可以很好的促进糖分子转化为乙醇，糖醇转化率较高。(3)在已经可以进行木糖代谢的菌种中，高表达TAL1，可以促进木糖的代谢，但同时要提高木糖代谢基因表达，否则容易造成副产物的累积。
据本发明的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，所述酿酒酵母为二倍体酿酒酵母，所述方法进一步包括再增加一份拷贝的所述基因表达簇并且与乙酸耐受基因HAA1和PMA1共同表达的步骤。
根据本发明的具体实施方式，在二倍体酿酒酵母A21Z的基础上，研究增加“基因表达簇”的拷贝次数对二倍体酵母的发酵性能影响。增加一份拷贝数的菌株经实验发现，与初始菌相比在乙醇产量和产率上没有太明显的变化，二者的副产物木糖醇差别也较小，乙酸消耗比初始菌株少，但增加一份拷贝数的菌增加了1.33g的木糖消耗。为此，在菌体A21Z中导入乙酸耐受相关的基因HAA1和PMA1，与“基因表达簇”共同转酵母以探究其发酵性能的变化，得到菌株HAA1-PMA1，实验发现，糖醇转化率较A21Z以及单独的基因表达簇二次拷贝的菌都有提高，因此，增加“基因表达簇”的拷贝次数可以增加酵母菌的乙醇发酵性能，但并不能提高乙酸的代谢利用能力。
本发明提供了高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法，该菌株具有改善的在葡萄糖代谢能力，显著提高的木糖代谢能力，以及提高的乙醇的产量，E7、1Z、1Z1Z随着表达簇拷贝数的增加产量逐渐增加，具体表现为E7、1Z、1Z1Z乙醇最高产量分别为53.2g/L、55.1g/L、55.3g/L，糖醇转化率分别是45.08％、47.74％、48.19％，分别达到了理论转化率的88.40％、93.6％、94.5％。
附图说明
图1为载体T1-Z1、T2-Z2、T3-Z3、T4-Z4的图谱。
图2显示3g/L乙酸、80g/L葡萄糖、40g/L木糖的混合糖培养基中E7(A)、1Z(B)、1Z1Z(C)、(D)1Z1Z1Z的发酵结果。
图3显示80g/L葡萄糖、40g/L木糖和3g/L乙酸条件下1Z1Z以及8株菌在发酵36h、48h时的糖醇转化率(A)，木糖消耗(B)以及乙醇产率(C)。
图4显示3g/L乙酸、80g/L葡萄糖、40g/L木糖的混合糖发酵中1Z1Z(A)DELTA7(B)、DELTA9(C)、rDNA8(D)、rDNA12(E)发酵结果。
图5显示酵母菌株DELTA7(d7)、DELTA9(d9)、rDNA8(r8)、rDNA12(r12)的六种基因XR(K270R)、XDH、XK、TAL1、PYK1和mgt05196的转录水平。
图6显示酵母菌株DELTA7(d7)、DELTA9(d9)、rDNA8(r8)、rDNA12(r12)的六种基因XR(K270R)、XDH、XK、TAL1、PYK1和mgt05196的转录水平
图7为载体T5-HAA1-PMA1图谱；
图8显示3g/L乙酸、80g/L葡萄糖40g/L木糖的混合糖发酵中，A21Z(A)，HAA1-PMA1(B)的发酵结果。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)E7保藏编号为CGMCC No.15567，于2018年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)1Z保藏编号为CGMCC No.15568，于2018年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)。
具体实施方式
实施例1单倍体酿酒酵母菌产乙醇的基因表达簇单拷贝、二次拷贝、三次拷贝对酵母发酵产乙醇的影响
1、酿酒酵母菌产乙醇的基因表达簇
选取木糖还原酶XR、木糖醇脱氢酶XDH、木酮糖激酶XK，以及木糖转运蛋白基因mgt05196、TAL1、PYK1，选择组成型的强启动子pPGK1、pADH1、pTDH3、pTEF1来表达以上六种基因PYK1、TAL1、XR、XDH、XK和mgt05196，并整合到酿酒酵母基因组中。
为了实现6-8个基因共转到酵母基因组中，选用的载体含有整合位点(L1-L6)和表达片段(酿酒酵母内源的终止子)，有完整的整合表达载体骨架，不仅可以实现表达模块之间的同源重组，由于已经含有两个相互反向的酿酒酵母终止子，构建重组质粒时可以排除由于过多的片段而导致的质粒构建失败这一原因。
XYL1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示
ATGCCTTCTATTAAGTTGAACTCTGGTTACGACATGCCAGCCGTCGGTTTCGGCTGTTGGAAAGTCGACGTCGACACCTGTTCTGAACAGATCTACCGTGCTATCAAGACCGGTTACAGATTGTTCGACGGTGCCGAAGATTACGCCAACGAAAAGTTAGTTGGTGCCGGTGTCAAGAAGGCCATTGACGAAGGTATCGTCAAGCGTGAAGACTTGTTCCTTACCTCCAAGTTGTGGAACAACTACCACCACCCAGACAACGTCGAAAAGGCCTTGAACAGAACCCTTTCTGACTTGCAAGTTGACTACGTTGACTTGTTCTTGATCCACTTCCCAGTCACCTTCAAGTTCGTTCCATTAGAAGAAAAGTACCCACCAGGATTCTACTGTGGTAAGGGTGACAACTTCGACTACGAAGATGTTCCAATTTTAGAGACCTGGAAGGCTCTTGAAAAGTTGGTCAAGGCCGGTAAGATCAGATCTATCGGTGTTTCTAACTTCCCAGGTGCTTTGCTCTTGGACTTGTTGAGAGGTGCTACCATCAAGCCATCTGTCTTGCAAGTTGAACACCACCCATACTTGCAACAACCAAGATTGATCGAATTCGCTCAATCCCGTGGTATTGCTGTCACCGCTTACTCTTCGTTCGGTCCTCAATCTTTCGTTGAATTGAACCAAGGTAGAGCTTTGAACACTTCTCCATTGTTCGAGAACGAAACTATCAAGGCTATCGCTGCTAAGCACGGTAAGTCTCCAGCTCAAGTCTTGTTGAGATGGTCTTCCCAAAGAGGCATTGCCATCATTCCAAAGTCCAACACTGTCCCAAGATTGTTGGAAAACAAGGACGTCAACAGCTTCGACTTGGACGAACAAGATTTCGCTGACATTGCCAAGTTGGACATCAACTTGAGATTCAACGACCCATGGGACTGGGACAAGATTCCTATCTTCGTCTAA
XYL2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示
ATGACTGCTAACCCTTCCTTGGTGTTGAACAAGATCGACGACATTTCGTTCGAAACTTACGATGCCCCAGAAATCTCTGAACCTACCGATGTCCTCGTCCAGGTCAAGAAAACCGGTATCTGTGGTTCCGACATCCACTTCTACGCCCATGGTAGAATCGGTAACTTCGTTTTGACCAAGCCAATGGTCTTGGGTCACGAATCCGCCGGTACTGTTGTCCAGGTTGGTAAGGGTGTCACCTCTCTTAAGGTTGGTGACAACGTCGCTATCGAACCAGGTATTCCATCCAGATTCTCCGACGAATACAAGAGCGGTCACTACAACTTGTGTCCTCACATGGCCTTCGCCGCTACTCCTAACTCCAAGGAAGGCGAACCAAACCCACCAGGTACCTTATGTAAGTACTTCAAGTCGCCAGAAGACTTCTTGGTCAAGTTGCCAGACCACGTCAGCTTGGAACTCGGTGCTCTTGTTGAGCCATTGTCTGTTGGTGTCCACGCCTCTAAGTTGGGTTCCGTTGCTTTCGGCGACTACGTTGCCGTCTTTGGTGCTGGTCCTGTTGGTCTTTTGGCTGCTGCTGTCGCCAAGACCTTCGGTGCTAAGGGTGTCATCGTCGTTGACATTTTCGACAACAAGTTGAAGATGGCCAAGGACATTGGTGCTGCTACTCACACCTTCAACTCCAAGACCGGTGGTTCTGAAGAATTGATCAAGGCTTTCGGTGGTAACGTGCCAAACGTCGTTTTGGAATGTACTGGTGCTGAACCTTGTATCAAGTTGGGTGTTGACGCCATTGCCCCAGGTGGTCGTTTCGTTCAAGTCGGTAACGCTGCTGGTCCAGTCAGCTTCCCAATCACCGTTTTCGCCATGAAGGAATTGACTTTGTTCGGTTCTTTCAGATACGGATTCAACGACTACAAGACTGCTGTTGGAATCTTTGACACTAACTACCAAAACGGTAGAGAAAATGCTCCAATTGACTTTGAACAATTGATCACCCACAGATACAAGTTCAAGGACGCTATTGAAGCCTACGACTTGGTCAGAGCCGGTAAGGGTGCTGTCAAGTGTCTCATTGACGGCCCTGAGTAA
XKS1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示
ATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGACAGACAAGAGAGGTTTCCAACACAATGTCTTTAGACTCATACTATCTTGGGTTTGATCTTTCGACCCAACAACTGAAATGTCTCGCCATTAACCAGGACCTAAAAATTGTCCATTCAGAAACAGTGGAATTTGAAAAGGATCTTCCGCATTATCACACAAAGAAGGGTGTCTATATACACGGCGACACTATCGAATGTCCCGTAGCCATGTGGTTAGAGGCTCTAGATCTGGTTCTCTCGAAATATCGCGAGGCTAAATTTCCATTGAACAAAGTTATGGCCGTCTCAGGGTCCTGCCAGCAGCACGGGTCTGTCTACTGGTCCTCCCAAGCCGAATCTCTGTTAGAGCAATTGAATAAGAAACCGGAAAAAGATTTATTGCACTACGTGAGCTCTGTAGCATTTGCAAGGCAAACCGCCCCCAATTGGCAAGACCACAGTACTGCAAAGCAATGTCAAGAGTTTGAAGAGTGCATAGGTGGGCCTGAAAAAATGGCTCAATTAACAGGGTCCAGAGCCCATTTTAGATTTACTGGTCCTCAAATTCTGAAAATTGCACAATTAGAACCAGAAGCTTACGAAAAAACAAAGACCATTTCTTTAGTGTCTAATTTTTTGACTTCTATCTTAGTGGGCCATCTTGTTGAATTAGAGGAGGCAGATGCCTGTGGTATGAACCTTTATGATATACGTGAAAGAAAATTCAGTGATGAGCTACTACATCTAATTGATAGTTCTTCTAAGGATAAAACTATCAGACAAAAATTAATGAGAGCACCCATGAAAAATTTGATAGCGGGTACCATCTGTAAATATTTTATTGAGAAGTACGGTTTCAATACAAACTGCAAGGTCTCTCCCATGACTGGGGATAATTTAGCCACTATATGTTCTTTACCCCTGCGGAAGAATGACGTTCTCGTTTCCCTAGGAACAAGTACTACAGTTCTTCTGGTCACCGATAAGTATCACCCCTCTCCGAACTATCATCTTTTCATTCATCCAACTCTGCCAAACCATTATATGGGTATGATTTGTTATTGTAATGGTTCTTTGGCAAGGGAGAGGATAAGAGACGAGTTAAACAAAGAACGGGAAAATAATTATGAGAAGACTAACGATTGGACTCTTTTTAATCAAGCTGTGCTAGATGACTCAGAAAGTAGTGAAAATGAATTAGGTGTATATTTTCCTCTGGGGGAGATCGTTCCTAGCGTAAAAGCCATAAACAAAAGGGTTATCTTCAATCCAAAAACGGGTATGATTGAAAGAGAGGTGGCCAAGTTCAAAGACAAGAGGCACGATGCCAAAAATATTGTAGAATCACAGGCTTTAAGTTGCAGGGTAAGAATATCTCCCCTGCTTTCGGATTCAAACGCAAGCTCACAACAGAGACTGAACGAAGATACAATCGTGAAGTTTGATTACGATGAATCTCCGCTGCGGGACTACCTAAATAAAAGGCCAGAAAGGACTTTTTTTGTAGGTGGGGCTTCTAAAAACGATGCTATTGTGAAGAAGTTTGCTCAAGTCATTGGTGCTACAAAGGGTAATTTTAGGCTAGAAACACCAAACTCATGTGCCCTTGGTGGTTGTTATAAGGCCATGTGGTCATTGTTATATGACTCTAATAAAATTGCAGTTCCTTTTGATAAATTTCTGAATGACAATTTTCCATGGCATGTAATGGAAAGCATATCCGATGTGGATAATGAAAATTGGGATCGCTATAATTCCAAGATTGTCCCCTTAAGCGAACTGGAAAAGACTCTCATCTAA
TAL1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示
ATGTCTGAACCAGCTCAAAAGAAACAAAAGGTTGCTAACAACTCTCTAGAACAATTGAAAGCCTCCGGCACTGTCGTTGTTGCCGACACTGGTGATTTCGGCTCTATTGCCAAGTTTCAACCTCAAGACTCCACAACTAACCCATCATTGATCTTGGCTGCTGCCAAGCAACCAACTTACGCCAAGTTGATCGATGTTGCCGTGGAATACGGTAAGAAGCATGGTAAGACCACCGAAGAACAAGTCGAAAATGCTGTGGACAGATTGTTAGTCGAATTCGGTAAGGAGATCTTAAAGATTGTTCCAGGCAGAGTCTCCACCGAAGTTGATGCTAGATTGTCTTTTGACACTCAAGCTACCATTGAAAAGGCTAGACATATCATTAAATTGTTTGAACAAGAAGGTGTCTCCAAGGAAAGAGTCCTTATTAAAATTGCTTCCACTTGGGAAGGTATTCAAGCTGCCAAAGAATTGGAAGAAAAGGACGGTATCCACTGTAATTTGACTCTATTATTCTCCTTCGTTCAAGCAGTTGCCTGTGCCGAGGCCCAAGTTACTTTGATTTCCCCATTTGTTGGTAGAATTCTAGACTGGTACAAATCCAGCACTGGTAAAGATTACAAGGGTGAAGCCGACCCAGGTGTTATTTCCGTCAAGAAAATCTACAACTACTACAAGAAGTACGGTTACAAGACTATTGTTATGGGTGCTTCTTTCAGAAGCACTGACGAAATCAAAAACTTGGCTGGTGTTGACTATCTAACAATTTCTCCAGCTTTATTGGACAAGTTGATGAACAGTACTGAACCTTTCCCAAGAGTTTTGGACCCTGTCTCCGCTAAGAAGGAAGCCGGCGACAAGATTTCTTACATCAGCGACGAATCTAAATTCAGATTCGACTTGAATGAAGACGCTATGGCCACTGAAAAATTGTCCGAAGGTATCAGAAAATTCTCTGCCGATATTGTTACTCTATTCGACTTGATTGAAAAGAAAGTTACCGCTTAA
PYK1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示
ATGTCTAGATTAGAAAGATTGACCTCATTAAACGTTGTTGCTGGTTCTGACTTGAGAAGAACCTCCATCATTGGTACCATCGGTCCAAAGACCAACAACCCAGAAACCTTGGTTGCTTTGAGAAAGGCTGGTTTGAACATTGTCCGTATGAACTTCTCTCACGGTTCTTACGAATACCACAAGTCTGTCATTGACAACGCCAGAAAGTCCGAAGAATTGTACCCAGGTAGACCATTGGCCATTGCTTTGGACACCAAGGGTCCAGAAATCAGAACTGGTACCACCACCAACGATGTTGACTACCCAATCCCACCAAACCACGAAATGATCTTCACCACCGATGACAAGTACGCTAAGGCTTGTGACGACAAGATCATGTACGTTGACTACAAGAACATCACCAAGGTCATCTCCGCTGGTAGAATCATCTACGTTGATGATGGTGTTTTGTCTTTCCAAGTTTTGGAAGTCGTTGACGACAAGACTTTGAAGGTCAAGGCTTTGAACGCCGGTAAGATCTGTTCCCACAAGGGTGTCAACTTACCAGGTACCGATGTCGATTTGCCAGCTTTGTCTGAAAAGGACAAGGAAGATTTGAGATTCGGTGTCAAGAACGGTGTCCACATGGTCTTCGCTTCTTTCATCAGAACCGCCAACGATGTTTTGACCATCAGAGAAGTCTTGGGTGAACAAGGTAAGGACGTCAAGATCATTGTCAAGATTGAAAACCAACAAGGTGTTAACAACTTCGACGAAATCTTGAAGGTCACTGACGGTGTTATGGTTGCCAGAGGTGACTTGGGTATTGAAATCCCAGCCCCAGAAGTCTTGGCTGTCCAAAAGAAATTGATTGCTAAGTCTAACTTGGCTGGTAAGCCAGTTATCTGTGCTACCCAAATGTTGGAATCCATGACTTACAACCCAAGACCAACCAGAGCTGAAGTTTCCGATGTCGGTAACGCTATCTTGGATGGTGCTGACTGTGTTATGTTGTCTGGTGAAACCGCCAAGGGTAACTACCCAATCAACGCCGTTACCACTATGGCTGAAACCGCTGTCATTGCTGAACAAGCTATCGCTTACTTGCCAAACTACGATGACATGAGAAACTGTACTCCAAAGCCAACCTCCACCACCGAAACCGTCGCTGCCTCCGCTGTCGCTGCTGTTTTCGAACAAAAGGCCAAGGCTATCATTGTCTTGTCCACTTCCGGTACCACCCCAAGATTGGTTTCCAAGTACAGACCAAACTGTCCAATCATCTTGGTTACCAGATGCCCAAGAGCTGCTAGATTCTCTCACTTGTACAGAGGTGTCTTCCCATTCGTTTTCGAAAAGGAACCTGTCTCTGACTGGACTGATGATGTTGAAGCCCGTATCAACTTCGGTATTGAAAAGGCTAAGGAATTCGGTATCTTGAAGAAGGGTGACACTTACGTTTCCATCCAAGGTTTCAAGGCCGGTGCTGGTCACTCCAACACTTTGCAAGTCTCTACCGTTTAA
MGT05196基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示
ATGTCGTCGAATGAGCAGGTTACTCCAAGGGTGTCGGAAGACAACCTAGATGGCAAAAAGTCTATGGAAACTCCCCAGAGCCCTTCTGATATCCCCACCACCAAAGATATCACCGCAGAGCAACCAACTTTACCGGAAAAATCCTTGAAAGATTACATTTCCATCTCTCTTTTTTGTATTCTTGTTGCATTCGGTGGATTCGTGTTCGGTTTCGACACCGGAACCATCTCCGGGTTTGTCAATATGACCGACTATAAGCGTCGGTTTGGTACACTTCAAAGTGATGGAACCTATGGTTTTACCGATACTAGAACCGGAGTCATTGTGGCTATTTTCAACGCTGGATGTGCTATTGGTGGTATTTTCTTGTCCAAGATTGCCGATGTTGCTGGAAGAAGAATGGGATTGATGTTTTCTATGATTATTTATGTCATTGGAATTATTGTTCAGATTACTTCAACCACCAAATGGTACCAAATTGTCATTGGAAGAGCCATTGCTGGACTTGCCGTGGGGTGTGTTTCGGTGTTATCACCACTTTTCATTGGTGAAACTGCTCCAAAAATGTTGAGAGGAACCTTGGTTTGCAGTTTCCAATTGTTTATTACCATGGGTATTTTCTTGGGTTACTGTACCACCTACGGAACAAAGCAGTATGATGATGCTCGTCAGTGGAGAATTCCATTGGGATTGTGTTTCGCTTGGGCTGCTCTTTTGGTGGGTGGAATGCTTGCTATGCCTGAGTCACCTCGGTACTTGATTGAAAAGAACAAAATTGACGAAGCCAAAAAGTCGCTTGCCAAGTCCAACAAGGTCCATGTCGACGATCCCGCAATCTACACCGAAGTGCAATTGATCCATGCTGGTATCGAGAGAGAAAGATTGGCGGGTTCTGCTTCTTGGACTCAATTGTTGTTTGGTAAGCCCAGAATTTTCGAAAGAGTTCTTACTGGAGTGGTCCTTCAGTCCATGCAACAACTCACCGGTAACAATTACTTTTTTTACTATGGAACCACCATTTTCAAAGCTGTTGGAATGGCCGATTCTTTCCAAACATCAATTGTTCTTGGTATAGTGTTCTTTGCATCCACTTTTGTTGGAATCTATGCCATTGAAAGATTGGGTAGAAGAATGTGCTTGTTGATAGGTTCCGTGTGGATGACTATCTGTTTCATCATCTACTCGGTATTGGGTTCTGTTCACTTGTACAGAAGTGGTTATGACAATCCTAACGACACATACAAGTCATCTGGTAACGCCATGATTTTCATCACTTGTTTGTTCATTTTCTTCTTTGCATCTACATGGGCTGGTGGTGTCTACTCCATCATTTCGGAAATTTACCCATTAAGAATTAGATCCAAGGCTATGTCGGTAGCCACCGCAGCCAATTGGATTTGGGGATTTTTGATCTCGTTTTTCAGTCCTTTCATTACTTCTGCCATCCACTTCTACTACGGATTCGTGTTCACTGGATGTTTGATTTTCTCGTTTTTCTACGTCTACTTTTTCGTCTACGAAACCAAGGGCTTGTCTTTGGAAGAAGTCGATGAGCTTTATGCCCAAAAAATGCCTGCATGGAAATCCTCTGGCTGGGTTCCTCCTTCTCAGGACGAGATGGCCACCTCCACCGGCTACGCGCGTCACACCAAACCTGAGGTGGACGAAGCCGAAAGGGTTTGA
组成型强启动子pPGK1、pADH1、pTDH3、pTEF1以随机组合的方式表达六种基因PYK1、TAL1、XR、XDH、XK和mgt05196，详细信息和图谱(图1)如下。
载体T1-Z1：pTDH3-XR(K270R)-tTPI1、pADH1-XDH-tPGI1；
载体T2-Z2：pPGK1-XKS1-tADH1、pTEF2-TAL1-tCYC1；
载体T3-Z3：pTDH3-PYK1-tFBA1、pADH1-mgt05196-tPDC1；
载体T4-Z4：pPGK1-PYK1-tRPS2、pTEF2-mgt05196-tTDH1；
以上组件T1-Z1、T2-Z2、T3-Z3、T4-Z4为表达簇，包含XR(K270R)、XDH、XK、TAL1、PYK1(2份拷贝)、mgt05196(2份拷贝)。各相邻组间均有同源臂，以共转化形式转入初始菌株E7中。
2、混合糖发酵结果比较
如图2为E7(CGMCC No.15567)、1Z(CGMCC No.15568)、1Z1Z(2拷贝的1Z)、1Z1Z1Z(3拷贝的1Z)的混合糖发酵结果，混合糖包括80g/L葡萄糖和40g/L木糖与3g/L乙酸，每隔12h取一次样，从0h到48h共取样5次。
结果表明，(1)在葡萄糖代谢方面，E7、1Z这两株菌12h几乎都消耗掉了所有的葡萄糖，相差不大。而菌株1Z1Z经24h才消耗掉所有的葡萄糖。(2)对于木糖代谢方面，初始菌株E7代谢木糖能力最差，其余两株菌1Z、1Z1Z都可以很好地代谢木糖，在发酵48h剩余木糖约2g，相差不大。(3)乙酸方面，对乙酸基本上没有太强的代谢能力，1Z1Z最多代谢掉1.5g乙酸，发酵48h乙酸含量基本保持在2g左右。副产物木糖醇的产量随着表达簇拷贝数的增加而又些许的增加，变化不大。副产物甘油也是同样的规律，并且甘油产量相对较高。乙醇的产量，E7、1Z、1Z1Z随着表达簇拷贝数的增加产量逐渐增加，具体表现为E7、1Z、1Z1Z乙醇最高产量分别为53.2g/L、55.1g/L、55.3g/L，糖醇转化率分别是45.08％、47.74％、48.19％，分别达到了理论转化率的88.40％、93.6％、94.5％。
因此，增加表达簇的拷贝数，在两次拷贝之内可以提高酿酒酵母的产乙醇和木糖代谢能力，而接着增加三份拷贝1Z1Z1Z的发酵性能略有提升但并不显著。(图2中的D)。
实施例2单倍体酿酒酵母菌基因表达簇随机性多拷贝对酵母发酵产乙醇的影响
将实施例1中的表达簇：T1-Z1、T2-Z2、T3-Z3、T4-Z4(包含XR(K270R)、XDH、XK、TAL1、PYK1(2份拷贝)、mgt05196(2份拷贝))以DELTADNA或rDNA介导随机多拷贝形式整合在1Z1Z菌中，以此探究该表达簇的多拷贝对于酿酒酵母发酵结果的影响。
DELTA7、DELTA9为以DELTA DNA介导的两株随机多拷贝菌株，rDNA8、rDNA12为以rDNA介导的两株随机多拷贝菌株。
初始菌株1Z1Z与DELTA7、DELTA9、rDNA8、rDNA12的发酵结果如下图4：
经过AbA抗性平板筛选抗性菌株以及PCR克隆验证序列正确后，一共筛选出8株菌是阳性克隆，其混合糖发酵结果如下图3。根据糖醇转化率，木糖消耗以及乙醇产率选出四株性能较好的菌株DELTA7、DELTA9、rDNA8、rDNA12。
从发酵结果可知，相比较初始菌株1Z1Z，四株随机多拷贝菌株DELTA7、DELTA9、rDNA8、rDNA12都有很好的发酵性能。
首先80g葡萄糖12h都已耗尽，而木糖代谢能力DELTA9最强，发酵48h代谢了40.46g木糖，其余三种菌的木糖代谢分别是35.8g、36.3g、35.9g。四株菌的乙醇产量、糖醇转化率如表1。就乙醇产量来说四株菌的乙醇产量都很高。而就糖醇转化率来说，DELTA7糖醇转化率最高，是49.92％，最低的是DELTA9，为46.14％。就乙酸浓度来说，DELTA7、DELTA9、rDNA8、rDNA12这四株菌的乙酸代谢能力都比较低，发酵48h分别剩余2.6g、2.2g、2.3g、2.2g的乙酸，分别代谢掉的乙酸是1.0g、1.6g、0.8g、1.3g。副产物主要是甘油，四株菌在发酵48h都含有4.3g、5.1g、4.5g、4.3g的甘油，以及1.6g、2.0g、1.3g、1.7g木糖醇。
表1DELTA7、DELTA9、rDNA8、rDNA12四株菌的乙醇产量值、糖醇转化率
乙醇产量(g/L) 糖醇转化率
DELTA7 59.34 0.4992
DELTA9 59.18 0.4614
RDNA8 58.24 0.4944
RDNA12 56.38 0.4944
实施例3单倍体酵母菌随机多拷贝基因表达簇的转录水平分析
当基因表达簇以随机地多拷贝的形式整合在酵母基因组中表达时，不仅没有出现基因表达簇在三次拷贝时出现的发酵性能与二次拷贝区别不大的现象，反而是表现出了很高的乙醇发酵性能。检测DELTA7、DELTA9、rDNA8、rDNA12四株菌中，六个基因XR(K270R)、XDH、XK、TAL1、PYK1和mgt05196的转录水平的区别，由此判断导致菌的乙醇发酵性能提高的原因。以下是DELTA7、DELTA9、rDNA8、rDNA12四株菌相比于原始菌株1Z1Z的六个基因XR(K270R)、XDH、XK、TAL1、PYK1和mgt05196的转录水平倍数，如图5。
结果表明，由于DELTA7糖醇转化率最高，是49.92％，而DELTA7较其他菌株而言XR(K270R)的表达量较高，XK表达量也较高，因此这有利于更多的木糖进入代谢通道；而XDH、PYK1等表达量变化不大，因此会造成副产物木糖醇的积累，发酵48h产生1.6g木糖醇。同理根据q-PCR结果rDNA12也由于木糖代谢基因表达不均衡，XR(K270R)、XK表达量较低而XDH表达量较高，导致木糖代谢过程不均衡，副产物木糖醇的积累较多，发酵48h积累了1.7g木糖醇。而rDNA12有最高的PYK1表达量，糖醇转化率很高为0.4944。四株菌中DELTA9的木糖代谢能力最强，发酵48h一共代谢了40.46g木糖，但它有最低的糖醇转化率0.4614。根据q-PCR结果，DELTA9有最高的TAL1表达量，副产物木糖醇(DELTA9的最高，为2.0g)和甘油(DELTA9的最高，为1.6g)大量累积。而所有菌株的mgt05196表达量都较低。
木糖代谢基因XR(K270R)、XDH、XK的不均衡表达会导致酵母菌体内的木糖代谢途径不均衡，造成中间产物木糖醇的大量积累，当然也会促进更多的木糖进入代谢途径。高表达量的PYK1可以很好的促进糖分子转化为乙醇，得到很高的糖醇转化率。在已经具备木糖代谢能力的菌种，高表达TAL1，可以促进木糖的代谢，但与此同时木糖代谢基因需要同步高表达，否则会造成一系列副产物如甘油、木糖醇的累积。
实施例4二倍体酵母菌的基因表达簇多拷贝对酵母发酵产乙醇的影响
初始菌株是具有一定木糖代谢和乙酸耐受性能的二倍体A21Z是基因表达簇在二倍体工业安琪酵母A2菌株中经过增加一次拷贝的基因表达簇得到的菌。在二倍体菌株A21Z的基础上再增加一份的基因簇拷贝数，得到菌株site，比较二者的混合糖发酵结果情况。如下图6。
探究基因表达簇在二倍体酵母中进行多拷贝，对于二倍体的发酵性能的影响。从发酵结果来分析，首先是葡萄糖代谢，都在发酵时间12h内消耗完。木糖代谢方面，总体趋势相同，发酵时间48h时A21Z剩余木糖11.46g，site剩余9.54g,木糖消耗量A21Z为28.65g，site为29.98g，即二次拷贝的二倍体菌株site木糖消耗更多，这一点达到预期效果。乙酸代谢方面，A21Z消耗乙酸1.26g，剩余乙酸2.17g，而site消耗乙酸0.97g，剩余乙酸2.23g,即site消耗乙酸量比A21Z少。副产物积累方面，二者的木糖醇积累量相差甚小，均为0.5g/L,甘油积累量A21Z较高，为3.12g，site较低，为2.80g。产乙醇方面，二者在产量和糖醇转化率上相差较小，A21Z乙醇产量54.83g，糖醇转化率0.4649，占理论值91.16％，site乙醇产量54.26g，糖醇转化率0.4669，占理论值的91.55％。
结果显示，在二倍体中再增加一份拷贝的基因表达簇，在乙醇产量和产率上没有太明显的影响，二者的副产物木糖醇差别较小。区别在于比对照增加了1.33g的木糖消耗，甘油累积也比对照少，但乙酸消耗比对照菌株少。因此，为了减少乙酸对具体发酵性能的影响，将菌体中导入乙酸耐受相关的基因，以求能提高菌株性能。
实施例5二倍体酵母菌的基因表达簇与乙酸耐受基因的共同表达对酵母发酵性能的影响
乙酸是木质纤维素水解液中的一种主要抑制剂，当细胞处于pH较低的环境中，环境中未解离的醋酸分子可以通过蛋白FPS1(水-甘油通道蛋白)进入细胞内，而细胞内的pH相对较高，一般保持在7.4左右，这种情况下醋酸分子会解离，释放质子H。细胞内累积的质子H不但会造成细胞内环境的pH降低，从而影响细胞正常的物质代谢过程和各种蛋白质的活性，不利于细胞生长。而且细胞的质子H，需要ATP水解酶消耗ATP才能将质子泵出细胞外，会加重细胞的负担。
PMA1基因是一种ATP酶，编码产生质膜上的一种H+-ATPase质子泵，质子泵通过水解ATP可以将质子泵出胞外，使胞内pH恢复稳定状态。HAA1是一种转录激活因子，它可以特异性地调控由乙酸诱导的一半基因的表达。
将HAA1、PMA1两个基因构建到同一个载体上，详细信息和图谱(图7)如下。载体T5-HAA1-PMA1：pTDH3-HAA1-tCCW12、pADH1-PMA1-t RPL9A
将T1Z1、T1-Z1、T2-Z2、T3-Z3、T4-Z4、T5-HAA1-PMA1共转化，以CAT8基因为整合位点整合到初始菌株A21Z中，得到一种基因表达簇与乙酸耐受基因HAA1和PMA1的共同表达的菌体-HAA1PMA1。
初始菌株A21Z、基因表达簇与乙酸耐受基因HAA1和PMA1的共同表达的菌体、HAA1-PMA1的混合糖发酵结果如下图8。
结果表明，首先葡萄糖代谢方面，都在发酵12H内消耗完全部80g葡萄糖，木糖代谢方面，三者的代谢能力有一定差距，发酵48H时，A21Z代谢木糖28.65g，HAA1-PMA1代谢木糖29.36，HAA1-PMA1比初始菌的木糖代谢增加。乙醇产量方面，发酵48H时，A21Z乙醇产量54.84g，糖醇转化率0.4649，占理论值的91.16％；HAA1-PMA1乙醇产量55.22g,糖醇转化率0.4695，占理论值的92.06％.因此HAA1-PMA1比初始菌的乙醇产量和产率都有所提高。乙酸代谢方面，发酵48H时，A21Z代谢乙酸1.26g,HAA1-PMA1代谢乙酸1.08g。副产物方面，HAA1-PMA1比初始菌的甘油累积量和木糖醇积累量都减少。发酵48H时，A21Z甘油积累0.56g,木糖醇积累3.12g，而HAA1-PMA1甘油积累0.45g，木糖醇积累2.79g。
因此，当在初始菌株A21Z的基础上再增加一份拷贝的基因表达簇并且与乙酸耐受基因HAA1和PMA1共同表达的情况下，糖醇转化率较初始菌株以及单独的基因表达簇二次拷贝的菌site都有所提高，可以增加酵母菌的乙醇发酵性能，但不能提高乙酸的代谢利用能力。
序列表
<110> 首都师范大学
<120> 高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgccttcta ttaagttgaa ctctggttac gacatgccag ccgtcggttt cggctgttgg 60
aaagtcgacg tcgacacctg ttctgaacag atctaccgtg ctatcaagac cggttacaga 120
ttgttcgacg gtgccgaaga ttacgccaac gaaaagttag ttggtgccgg tgtcaagaag 180
gccattgacg aaggtatcgt caagcgtgaa gacttgttcc ttacctccaa gttgtggaac 240
aactaccacc acccagacaa cgtcgaaaag gccttgaaca gaaccctttc tgacttgcaa 300
gttgactacg ttgacttgtt cttgatccac ttcccagtca ccttcaagtt cgttccatta 360
gaagaaaagt acccaccagg attctactgt ggtaagggtg acaacttcga ctacgaagat 420
gttccaattt tagagacctg gaaggctctt gaaaagttgg tcaaggccgg taagatcaga 480
tctatcggtg tttctaactt cccaggtgct ttgctcttgg acttgttgag aggtgctacc 540
atcaagccat ctgtcttgca agttgaacac cacccatact tgcaacaacc aagattgatc 600
gaattcgctc aatcccgtgg tattgctgtc accgcttact cttcgttcgg tcctcaatct 660
ttcgttgaat tgaaccaagg tagagctttg aacacttctc cattgttcga gaacgaaact 720
atcaaggcta tcgctgctaa gcacggtaag tctccagctc aagtcttgtt gagatggtct 780
tcccaaagag gcattgccat cattccaaag tccaacactg tcccaagatt gttggaaaac 840
aaggacgtca acagcttcga cttggacgaa caagatttcg ctgacattgc caagttggac 900
atcaacttga gattcaacga cccatgggac tgggacaaga ttcctatctt cgtctaa 957
<210> 2
<211> 1092
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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gatgccccag aaatctctga acctaccgat gtcctcgtcc aggtcaagaa aaccggtatc 120
tgtggttccg acatccactt ctacgcccat ggtagaatcg gtaacttcgt tttgaccaag 180
ccaatggtct tgggtcacga atccgccggt actgttgtcc aggttggtaa gggtgtcacc 240
tctcttaagg ttggtgacaa cgtcgctatc gaaccaggta ttccatccag attctccgac 300
gaatacaaga gcggtcacta caacttgtgt cctcacatgg ccttcgccgc tactcctaac 360
tccaaggaag gcgaaccaaa cccaccaggt accttatgta agtacttcaa gtcgccagaa 420
gacttcttgg tcaagttgcc agaccacgtc agcttggaac tcggtgctct tgttgagcca 480
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gctgctactc acaccttcaa ctccaagacc ggtggttctg aagaattgat caaggctttc 720
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gctattgaag cctacgactt ggtcagagcc ggtaagggtg ctgtcaagtg tctcattgac 1080
ggccctgagt aa 1092
<210> 3
<211> 1803
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgttgtgtt cagtaattca gagacagaca agagaggttt ccaacacaat gtctttagac 60
tcatactatc ttgggtttga tctttcgacc caacaactga aatgtctcgc cattaaccag 120
gacctaaaaa ttgtccattc agaaacagtg gaatttgaaa aggatcttcc gcattatcac 180
acaaagaagg gtgtctatat acacggcgac actatcgaat gtcccgtagc catgtggtta 240
gaggctctag atctggttct ctcgaaatat cgcgaggcta aatttccatt gaacaaagtt 300
atggccgtct cagggtcctg ccagcagcac gggtctgtct actggtcctc ccaagccgaa 360
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gtagcatttg caaggcaaac cgcccccaat tggcaagacc acagtactgc aaagcaatgt 480
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gcaagggaga ggataagaga cgagttaaac aaagaacggg aaaataatta tgagaagact 1140
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taa 1803
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<211> 1008
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acctccatca ttggtaccat cggtccaaag accaacaacc cagaaacctt ggttgctttg 120
agaaaggctg gtttgaacat tgtccgtatg aacttctctc acggttctta cgaataccac 180
aagtctgtca ttgacaacgc cagaaagtcc gaagaattgt acccaggtag accattggcc 240
attgctttgg acaccaaggg tccagaaatc agaactggta ccaccaccaa cgatgttgac 300
tacccaatcc caccaaacca cgaaatgatc ttcaccaccg atgacaagta cgctaaggct 360
tgtgacgaca agatcatgta cgttgactac aagaacatca ccaaggtcat ctccgctggt 420
agaatcatct acgttgatga tggtgttttg tctttccaag ttttggaagt cgttgacgac 480
aagactttga aggtcaaggc tttgaacgcc ggtaagatct gttcccacaa gggtgtcaac 540
ttaccaggta ccgatgtcga tttgccagct ttgtctgaaa aggacaagga agatttgaga 600
ttcggtgtca agaacggtgt ccacatggtc ttcgcttctt tcatcagaac cgccaacgat 660
gttttgacca tcagagaagt cttgggtgaa caaggtaagg acgtcaagat cattgtcaag 720
attgaaaacc aacaaggtgt taacaacttc gacgaaatct tgaaggtcac tgacggtgtt 780
atggttgcca gaggtgactt gggtattgaa atcccagccc cagaagtctt ggctgtccaa 840
aagaaattga ttgctaagtc taacttggct ggtaagccag ttatctgtgc tacccaaatg 900
ttggaatcca tgacttacaa cccaagacca accagagctg aagtttccga tgtcggtaac 960
gctatcttgg atggtgctga ctgtgttatg ttgtctggtg aaaccgccaa gggtaactac 1020
ccaatcaacg ccgttaccac tatggctgaa accgctgtca ttgctgaaca agctatcgct 1080
tacttgccaa actacgatga catgagaaac tgtactccaa agccaacctc caccaccgaa 1140
accgtcgctg cctccgctgt cgctgctgtt ttcgaacaaa aggccaaggc tatcattgtc 1200
ttgtccactt ccggtaccac cccaagattg gtttccaagt acagaccaaa ctgtccaatc 1260
atcttggtta ccagatgccc aagagctgct agattctctc acttgtacag aggtgtcttc 1320
ccattcgttt tcgaaaagga acctgtctct gactggactg atgatgttga agcccgtatc 1380
aacttcggta ttgaaaaggc taaggaattc ggtatcttga agaagggtga cacttacgtt 1440
tccatccaag gtttcaaggc cggtgctggt cactccaaca ctttgcaagt ctctaccgtt 1500
taa 1503
<210> 6
<211> 1683
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgtcgtcga atgagcaggt tactccaagg gtgtcggaag acaacctaga tggcaaaaag 60
tctatggaaa ctccccagag cccttctgat atccccacca ccaaagatat caccgcagag 120
caaccaactt taccggaaaa atccttgaaa gattacattt ccatctctct tttttgtatt 180
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ttcattggtg aaactgctcc aaaaatgttg agaggaacct tggtttgcag tttccaattg 600
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gatgctcgtc agtggagaat tccattggga ttgtgtttcg cttgggctgc tcttttggtg 720
ggtggaatgc ttgctatgcc tgagtcacct cggtacttga ttgaaaagaa caaaattgac 780
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gcccaaaaaa tgcctgcatg gaaatcctct ggctgggttc ctccttctca ggacgagatg 1620
gccacctcca ccggctacgc gcgtcacacc aaacctgagg tggacgaagc cgaaagggtt 1680
tga 1683

Claims (6)

1.木糖代谢产乙醇的工业菌株，其特征在于，所述工业菌株的保藏编号为CGMCCNo.15568。
2.一种提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：通过组成型的强启动子将基因表达簇整合到酿酒酵母基因组中，其中，所述酿酒酵母为保藏编号为CGMCC No.15567的单倍体酿酒酵母，所述基因表达簇包括：木糖还原酶XR基因，木糖醇脱氢酶XDH基因，木酮糖激酶XK基因，以及2份拷贝的木糖转运蛋白基因mgt05196，TAL1，和2份拷贝PYK1基因。
3.根据权利要求2所述的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，其特征在于，所述组成型的强启动子为启动子pPGK1、pADH1、pTDH3和/或pTEF1。
4.根据权利要求2所述的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，其特征在于，所述方法进一步包括在所述酿酒酵母中增加一份拷贝的所述基因表达簇的步骤。
5.根据权利要求4所述的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，其特征在于，所述方法进一步包括通过酿酒酵母内源的多拷贝位点delta的rDNA的基因重组，随机多拷贝表达所述基因簇的步骤。
6.根据权利要求2所述的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，其特征在于，所述酿酒酵母为二倍体酿酒酵母，所述方法进一步包括再增加一份拷贝的所述基因表达簇并且与乙酸耐受基因HAA1和PMA1共同表达的步骤。
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