CN112280700B

CN112280700B - 一株耐乙酸和甲酸的发酵菌株及其构建方法

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Publication number: CN112280700B
Application number: CN202011121007.0A
Authority: CN
Inventors: 汤岳琴; 缪晡; 李波; 陈栋; 吴娅婧
Original assignee: Sichuan University; China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Shanghai Engineering Co Ltd
Current assignee: Sichuan University; China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Shanghai Engineering Co Ltd
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2020-10-19
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2040-10-19
Also published as: CN112280700A

Abstract

本发明提供了一株耐乙酸和甲酸的发酵菌株及其构建方法，该酿酒酵母菌株为SEB15，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CGMCC No.19588。本发明以具有优良的葡萄糖和木糖发酵能力的工业絮凝型酿酒酵母菌株为出发菌株，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将编码目标转录因子的基因(HAA1)和功能基因(FDH1)的启动子替换为在各典型抑制物胁迫下表达量较高且稳定的UBI4的启动子获得的发酵菌株SEB15。该发酵菌株耐受乙酸和甲酸能力较强，乙醇收率可以达到理论收率的84％，对于利用木质纤维素类原料生产燃料乙醇具有重要意义。

Description

一株耐乙酸和甲酸的发酵菌株及其构建方法

技术领域

本发明涉及发酵菌株的构建技术领域，尤其涉及一株耐乙酸和甲酸的发酵菌株及其构建方法。

背景技术

面对能源日益紧缺，环境污染问题日益严重的形势，开发绿色、可再生的新型能源则变得更加紧迫。若将全球储量大、可再生的木质纤维素类生物质通过发酵转化为清洁能源燃料乙醇，将有助于缓解能源和环境危机。秸秆等木质纤维素类生物质的组织结构非常坚韧，必须经过预处理才能将其细胞结构破坏，释放出其中的糖类物质。伴随糖类物质的释放，各类抑制物如弱酸类、呋喃类、以及酚类也释放到水解液中。抑制物对乙醇发酵微生物酿酒酵母的生长和代谢会产生严重的胁迫作用，致使其繁殖速度慢，乙醇产率降低。因此构建能耐受各类抑制物的酿酒酵母菌株是实现纤维素燃料乙醇工业化生产的基础。

不同来源的生物质及不同的预处理方式，使水解液中各类抑制物的组成和含量不同。弱酸类抑制物，乙酸和甲酸，普遍存在于各类水解液中。其中，乙酸主要是由半纤维素中的乙酰木聚糖生成，而甲酸则由呋喃醛类抑制物进一步衍生而成。一般情况下，水解液中甲酸的浓度低于乙酸，但由于其pKa值较低(甲酸：3.75，乙酸：4.75)，致使甲酸的抑制作用强于乙酸。鉴于弱酸类抑制物的普遍存在性及较高的胁迫浓度，构建耐受弱酸类抑制物的酿酒酵母菌株对于利用木质纤维素类原料生产燃料乙醇具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一株耐乙酸和甲酸的发酵菌株及其构建方法，以具有优良的葡萄糖和木糖发酵能力的工业絮凝型酿酒酵母菌株SEB5为出发菌株，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将编码目标转录因子的基因(HAA1)和功能基因(FDH1)的启动子替换为在各典型抑制物胁迫下表达量较高且稳定的UBI4的启动子，以期达到高表达的目的。待获得目标转化子后，通过合成培养基批次发酵及秸秆水解液发酵评价转化子的性能，获得一株耐受乙酸和甲酸能力较强的菌株SEB15。

本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：

本发明的第一方面是提供一株耐乙酸和甲酸的发酵菌株，其为SEB15，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CGMCC No.19588，保藏日期为2020年04月20日，保藏单位为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二方面是提供上述耐乙酸和甲酸的发酵菌株的构建方法，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将出发菌株SEB5的HAA1和FDH1基因的启动子替换为UBI4启动子，便构建了上述耐乙酸和甲酸的发酵菌株SEB15。

进一步地，上述构建方法具体包括如下步骤：

步骤一，修复片段(UBI4启动子)的扩增：以菌株SEB5的基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增UBI4启动子并纯化；

步骤二，构建双链gRNA片段并扩增gRNA线性骨架：

确定HAA1和FDH1基因启动子的PAM位点，构建双链gRNA片段；

以pMEL13质粒为模板，引物为SEQ ID No.13～14，进行PCR扩增得到gRNA线性骨架并纯化；

步骤三，连接上述gRNA片段和消化后的gRNA线性骨架，然后转化，获得gRNA质粒；

步骤四，将提取的Cas 9质粒转入菌株SEB5中，然后进行涂布平板培养并筛选、PCR反应验证获得含Cas 9质粒的酿酒酵母；

步骤五，将上述gRNA质粒和修复片段转入含Cas 9质粒的酿酒酵母，然后进行涂布平板培养并筛选、PCR反应验证获得耐乙酸和甲酸的发酵菌株SEB15菌落。

进一步地，上述构建方法还包括将发酵菌株SEB15菌落中的Cas9质粒和gRNA质粒去除。

进一步地，步骤一中PCR扩增采用的引物的序列为SEQ ID No.1～2。

进一步地，构建双链gRNA片段所需的同源臂序列为：

tgR F：TGCGCATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCN20GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC；

tgR R：GTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACN20GATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAGTTTCGAACGCCGAAACATGCGCA。

进一步地，HAA1和FDH1基因启动子的PAM位点的序列分别为SEQ ID No.15和SEQID No.16。

进一步地，步骤三中gRNA片段和gRNA线性骨架通过Gibson连接方法进行连接；该gRNA片段和gRNA线性骨架按质量比为5：1进行连接。

进一步地，步骤四中Cas 9质粒提取自含Cas9质粒的大肠杆菌。

进一步地，步骤四中涂布平板培养所采用的培养基为含0.005％NAT的2％YPD培养基；该2％YPD培养基包括1％酵母浸出粉、2％蛋白胨和2％葡萄糖。

进一步地，步骤四中PCR反应采用的引物序列为SEQ ID No.11～12。

进一步地，步骤五中涂布平板培养所采用的培养基包括1％酵母浸出粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖、0.01％G418和0.005％NAT。

进一步地，步骤五中PCR反应采用的引物序列为SEQ ID No.5～6和SEQ ID No.9～10。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明以具有优良的葡萄糖和木糖发酵能力的工业絮凝型酿酒酵母菌株为出发菌株，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将编码目标转录因子的基因(HAA1)和功能基因(FDH1)的启动子替换为在各典型抑制物胁迫下表达量较高且稳定的UBI4的启动子获得的发酵菌株SEB15。该发酵菌株耐受乙酸和甲酸能力较强，乙醇收率可以达到理论收率的84％，对于利用木质纤维素类原料生产燃料乙醇具有重要意义。

附图说明

图1为本发明一实施例中菌株SEB5和SEB15在不含抑制物条件下的发酵结果；

图2为本发明一实施例中菌株SEB5和SEB15在乙酸胁迫下的发酵结果；

图3为本发明一实施例中菌株SEB5和SEB15在甲酸胁迫下的发酵结果；

图4为本发明一实施例中菌株SEB5和SEB15在混合的乙酸和甲酸胁迫下的发酵结果；

图5为本发明一实施例中菌株SEB5和SEB15利用预处理秸秆物料的预糖化-同步糖化发酵结果；其中：图A表示接种量为0.05g-干细胞/100g-预处理物料；图B表示接种量为0.5g-干细胞/100g-预处理物料。

具体实施方式

本发明提供了一株耐乙酸和甲酸的发酵菌株，其为SEB15，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CGMCC No.19588，保藏日期为2020年04月20日，保藏单位为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

以下实施例使用的材料如下：

(1)培养基

所用培养基见表1。若培养基为固体培养基，则在灭菌前加入1.5％的琼脂粉。灭菌条件为121℃，15min。所有的抗生素均在培养基灭菌后，待冷却至50～60℃后添加。

表1培养基组成

(2)质粒、菌株及引物

以可高效利用木糖的菌株SEB5(菌株保藏号：CGMCC No.11325)为出发菌株，通过启动子替换的方法，将基因HAA1和FDH1同时过表达获得菌株SEB15，其中所用质粒和菌株见表2；菌株转化所用引物及片段见表3；用于构建gRNA质粒的所需的同源壁序列和PAM位点(NGG)上游的20bp目标序列见表4。

表2构建菌株SEB15过程中所用质粒及菌株信息

表3菌株转化所需引物及片段信息

注：RF：修复片段，V_p：验证引物；F：上游引物；R：下游引物；下划线：同源臂

表4构建gRNA所需的同源臂序列和PAM位点(NGG)上游的20bp目标序列

注：N20：gRNA所含的PAM位点(NGG)上游的20bp的目标序列；下划线：PAM位点(NGG)

而其余未具体说明的原料、工艺、仪器以及操作方法等均为本领域的常规市售原料或常规技术。

实施例1

本实施例提供耐乙酸和甲酸的发酵菌株SEB15的构建方法，包括如下步骤：

步骤一，UBI4启动子(修复片段)的扩增

以菌株SEB5的基因组DNA为模板，通过PCR扩增UBI4启动子(即修复片段)(碱基序列如表5中的SEQ ID No.17所示)；PCR反应体系和反应条件如表6。RF F/RF R为包含同源臂的UBI4的引物，序列见表3。利用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物电泳(100V，30min)，于EB中染色30min，紫外灯下观察是否有目标条带。将所得PCR产物保存于-20℃冰箱，备用。

表5 UBI4启动子基因序列表

表6 PCR扩增UBI4启动子(修复片段)

步骤二，构建双链gRNA片段

在Saccharomyces Genome Database(SGD https://www.yeastgenome.org/)网站上搜索目标基因启动子区域的碱基序列。将该序列输入到E-CRISP(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)网站，查找目标片段的PAM位点(NGG)上游的20bp目标序列(表4)。将包含上下游50bp同源臂和20bp目标序列(共120bp)的gRNA片段进行人工合成。待合成之后，用灭菌水稀释至100μM之后将两条互补的序列溶液按体积比1：1混合，于PCR仪上95℃热击5min，获得双链gRNA片段。

步骤三，扩增gRNA线性骨架

以pMEL13质粒为模板，扩增gRNA的线性骨架，PCR反应体系和反应条件如表7。利用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳(100V，30min)，于EB中染色30min，紫外灯下观察是否有目标条带。将所得PCR产物保存于-20℃冰箱，备用。

表7 PCR扩增gRNA线性骨架

步骤四，纯化修复片段(UBI4启动子)和gRNA线性骨架

由于经PCR扩增后所得的产物中含有模板、DNA聚合酶和相应的缓冲液，利用

PCR Purification Kit纯化试剂盒进行纯化。具体方法如下：取50～100μL PCR产物，加入5倍体积的结合缓冲液，混匀后加入离心柱中，为了提高纯化产量，可选择室温静置1min，10000×g离心1min，弃去流出液。加入650μL清洗缓冲液，10000×g离心1min，弃去流出液。10000×g离心2min，彻底去除残留的清洗缓冲液。将离心柱置于一干净的离心管中，在柱子中央加入30～50μL灭菌水(为了提高纯化产量，可选择60℃预热灭菌水)，室温静置1min，10000×g离心1min，洗脱DNA。所得DNA于-20℃保存，或置于冰上备用。

步骤五，gRNA线性骨架模板消化

酶切消化体系和反应条件见表8。反应体系中所加的Quick cut Dpn1依据扩增gRNA线性骨架时所加的pMEL13模板量确定。经纯化获得gRNA线性骨架。

表8 gRNA线性骨架模板消化体系

步骤六，Gibson连接gRNA片段和gRNA线性骨架

(1)将所得的gRNA片段和gRNA线性骨架通过Gibson连接方法进行连接，连接体系见表9。gRNA(120bp)和pMEL13线性骨架按质量比为5：1的量加入连接体系中。将5μL反应体系在PCR仪上连接(50℃，15min)。

(2)取2μL或者全部反应液用于大肠杆菌转化。

(3)转化后菌体首先涂在LB-Amp平板上。待菌株长出后，将其划线于LB-Kana平板上，于37℃培养12h。用牙签挑去少量菌体转接于含5mL LB+Kana液体培养基的试管中培养12～16h(140rpm，37℃)。

(4)收集菌体，利用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，从大肠杆菌中提取gRNA质粒。

(5)利用1％的琼脂糖凝胶，对gRNA质粒进行电泳(100V，30min)，于EB中染色30min，紫外灯下观察是否有目标条带。将所得的gRNA质粒进行测序确认，获得序列正确的gRNA质粒。

表9 Gibson连接的反应体系

步骤七，Cas9质粒提取

取含Cas9质粒的大肠杆菌菌保，在恒温培养箱中于LB+NAT固体平板上活化(37℃，24h)。用牙签挑取细胞转接于含5mL LB+NAT液体培养基的试管中培养12～16h(140rpm，37℃)。收集菌体，利用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，从大肠杆菌中提取Cas9质粒。在1％的琼脂糖凝胶对Cas9质粒进行电泳(100V，30min)，于EB中染色30min，紫外灯下观察条带，确认是否提取成功。

步骤八，Cas9质粒转入目标酿酒酵母菌株

(1)将目标菌株在2％YPD固体平板上活化24h，用牙签挑取细胞转接于含5mL 2％YPD液体培养基的试管中培养16h(160rpm，30℃)。

(2)在超净台上，将试管震荡均匀，取2～3mL至含300mL 2％YPD液体培养基的500-mL锥形瓶中，于摇床上培养2～3h(180rpm，29℃)。

(3)每隔1h取样，8,000×g离心去培养液，将菌体用0.05mM的EDTA溶液分散后测定600nm下的吸光度(OD₆₀₀)。待OD₆₀₀达到0.2～0.3时，8,000×g离心2min收集菌体，用灭菌水将菌体洗涤2次，离心去上清。

(4)然后用0.6mL灭菌水分散菌体，置于冰上备用。取配制好的鲑鱼精DNA，于沸水浴上加热5min，立即置于冰上，备用。取已灭菌的1.5mL离心管若干，分别向其中加入60％PEG4000(115μL)、4M的醋酸锂溶液(5μL)和鲑鱼精DNA(10μL)。实验组中加入Cas9质粒(100ng)，对照组中加等量的灭菌水，于涡旋振荡器上振荡混匀。

(5)向混匀后的离心管中加入50μL宿主细胞，轻微涡旋振荡混匀。42℃热击40min，期间每20min取出上下颠倒数次。8,000×g离心2min，弃转化液。

(6)用灭菌水将细胞洗涤2次，然后向离心管中加入1mL 2％YPD液体培养基，于摇床上培养4h(160rpm，30℃)。8,000×g离心2min去掉培养液，用灭菌水洗涤2次。

(7)加1mL灭菌水分散菌体，取100μL菌悬液，涂布于含0.005％NAT的2％YPD平板上，于恒温培养箱中30℃培养1～2天。

步骤九，Cas9质粒转化菌落PCR验证

挑选2％YPD+NAT平板上长出的转化子，划线于2％YPD+NAT固体平板上培养24h，进行菌落PCR验证。具体方法如下：

(1)挑取2％YPD+NAT平板上的菌落于含95μL 1％SDS和5μL 4M的醋酸锂溶液的1.5mL离心管中，涡旋振荡75℃热击10min。向离心管中添加300μL的无水乙醇，涡旋振荡。室温13000rpm离心3min，弃上清液，将离心管盖打开，于37℃的培养箱中干燥。

(2)向离心管中添加100μL灭菌水，彻底涡旋振荡，室温13000rpm离心1min。

(3)以上清液作为模板进行PCR验证，PCR反应体系和反应条件如表10。

(4)利用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳(100V，30min)，于EB中染色30min，紫外灯下观察是否有目标条带。

表10 Cas9质粒验证PCR体系

步骤十，酵母转化

酵母菌株的转化与Cas9质粒转化方法类似，只是所含抗生素和转化体系不同。具体方法如下：

(1)将含Cas9质粒的酿酒酵母在2％YPD+NAT固体平板上活化24h，用牙签挑取细胞转接于含5mL 2％YPD+NAT液体培养基的试管中培养16h(160rpm，30℃)。

(2)在超净台上，将试管震荡均匀，取2～3mL至含300mL 2％YPD+NAT液体培养基的500mL锥形瓶中，于摇床上培养2～3h(180rpm，29℃)。每隔1h取样，8,000×g离心2min，弃培养液，将菌体用0.05mM的EDTA溶液分散后测定OD₆₀₀值。待OD₆₀₀达到0.2～0.3时，8,000×g离心2min收集菌体，用灭菌水将菌体洗涤2次，然后用0.6mL灭菌水分散菌体，置于冰上备用。取配制的鲑鱼精DNA，于沸水浴上加热5min，立即置于冰上，备用。

(3)取已灭菌的1.5mL离心管若干，分别向其中加入60％PEG4000(240μL)、4M的醋酸锂(9μL)和鲑鱼精DNA(25μL)。实验组中加入gRNA质粒(300～600ng)和修复片段(800～1600ng)，对照组中加入等量的灭菌水，于涡旋振荡器上振荡混匀。向混匀的离心管中加入50μL宿主细胞，轻微振荡混匀。42℃热击40min，每隔20min取出上下颠倒数次。8,000×g离心2min，弃转化液。

(4)用灭菌水将细胞洗涤2～3次，向离心管中加入1mL 2％YPD液体培养基，于摇床中培养4h(160rpm，30℃)。8,000×g离心2min，弃培养液。用灭菌水洗涤2次后，用150μL灭菌水分散菌体。将全部菌体涂布于含0.005％NAT和0.01％G418的2％YPD平板上，恒温培养箱中30℃培养2天。

步骤十一，目标菌株转化菌落PCR验证

挑选2％YPD+NAT+G418平板上长出的转化子，划线于2％YPD+NAT+G418固体平板上培养24h，进行菌落PCR验证。利用目标基因的验证引物(表3)，扩增目标基因的启动子被替换后的片段。PCR反应体系和反应条件见表10，其中的退火温度和片段延伸时间由相应的验证引物决定。

步骤十二，质粒去除

选取菌落PCR验证是正确的转化子，将其中的Cas9质粒和gRNA质粒去除。具体方法如下：

(1)挑取正确的转化子划线培养于2％YPD固体平板上(30℃，24h)。

(2)挑取2％YPD固体平板上的菌落培养在含5mL液体培养基的试管中(30℃，16h)。

(3)吸取1mL菌液，8000×g离心2min，弃上清。用灭菌水梯度稀释10⁵倍，取100μL菌液涂板，于30℃恒温培养箱中培养1～2d。

(4)挑取单菌落分别在2％YPD、2％YPD+NAT和2％YPD+G418的平板上点板，于30℃恒温培养箱中培养1～2天。若该菌落仅可以在2％YPD上生长，证明该菌落的质粒已经被去除。

验证实施例

本实施例以出发菌株SEB5为对照组，验证菌株SEB15在各种胁迫条件下的发酵性能。具体的试验步骤和结果如下：

批次发酵评价

将目标菌株接种于2％YPD固体培养基，于30℃培养箱中活化24h。用接种环取菌体接种到含100mL 5％YPD培养基的500mL锥形瓶中，摇床振荡培养16h(30℃、160rpm)。预培养液经4℃，8000×g离心2min后，收集湿菌体接种于含100mL 10％YPDX培养基的300-mL锥形瓶中，初始菌体浓度为5g干细胞/L。目标抑制物按浓度要求添加至灭菌且分装好的培养基中，锥形瓶置于恒温水浴锅中磁力搅拌发酵(35℃，200rpm)。批次发酵评价包括不含抑制物，乙酸(Aa，40mM)，甲酸(Fa，10mM)，以及混合乙酸和甲酸(Aa_Fa，40+10mM)，定时取样分析残余葡萄糖和木糖、乙醇、木糖醇、和甘油的浓度，结果如图1-4。

如图1所示，在不含抑制物条件下，发酵18h时，菌株SEB5的残留木糖为8.03g/L，乙醇生产速率为1.65g/L/h，乙醇收率为0.31g/g-总糖；菌株SEB15的残留木糖为1.85g/L，乙醇生产速率为1.85g/L/h，乙醇收率为0.35g/g-总糖。相比于SEB5，菌株SEB15的木糖消耗速率提高了18.65％，乙醇收率提升了12.90％。这表明同时高表达HAA1和FDH1所构建的菌株SEB15的发酵性能在不含抑制物条件下显著提升。

如图2所示，在乙酸胁迫下，发酵24h时，菌株SEB5的残留木糖为15.47g/L，乙醇生产速率为1.24g/L/h，乙醇收率为0.33g/g-总糖；菌株SEB15的残留木糖为4.66g/L，乙醇生产速率为1.39g/L/h，乙醇收率为0.36g/g-总糖。相比于SEB5，SEB15的木糖消耗速率提高了50.84％，乙醇收率提升了9.10％。这表明菌株SEB15在乙酸胁迫下的发酵性能得到了显著提升。

如图3所示，在甲酸胁迫下，发酵24h时，菌株SEB5的残留木糖为12.77g/L，乙醇生产速率为1.24g/L/h，乙醇收率为0.33g/g-总糖；菌株SEB15的残留木糖为2.17g/L，乙醇生产速率为1.37g/L/h，乙醇收率为0.36g/g-总糖。相比于SEB5，SEB15的木糖消耗速率提高了44.52％，乙醇收率提升了9.10％。这表明菌株SEB15在甲酸胁迫下的发酵性能得到显著提升。

如图4所示，在混合乙酸和甲酸胁迫下，发酵24h时，菌株SEB5的残留木糖为22.92g/L，乙醇生产速率为1.19g/L/h，乙醇收率为0.31g/g-总糖；菌株SEB15的残留木糖为7.49g/L，乙醇生产速率为1.40g/L/h，乙醇收率为0.36g/g-总糖。相比于SEB5，SEB15的木糖消耗速率提高了97.12％，乙醇收率提升了16.10％。这表明菌株SEB15在混合酸胁迫下的发酵性能得到显著提升。

秸秆物料发酵评价

在合成培养基中，相比于SEB5，菌株SEB15在乙酸和甲酸胁迫下发酵性能得到显著提升，进一步选择秸秆物料进行发酵评价。所用秸秆物料的组成如表11所示，将固含量调为20％，采用预糖化同步糖化发酵评价目标菌株的发酵及耐受抑制物的能力。

用pH＝5的PBS缓冲液调节物料固含量至20％，CTec3添加量为30FPU/(g纤维素)，添加青霉素浓度为100mg/kg。充分混合混匀后，分装至500-mL锥形瓶中，每瓶分装120g，于50℃、200rpm，预糖化11h。预糖化后混匀，调节pH至5.0，分装至300-mL的锥形瓶中。使用一定体积的PBS将目标菌体0.05g或0.5g(干重)接种入预糖化后的物料中。每瓶包含物料和PBS(2mL或6mL)的总质量为100g。于200rpm、35℃水浴条件下进行同步糖化发酵。

分别于预糖化0和11h，及发酵24、48、72、96和120h吸取3mL醪液。称取一定质量进行稀释，经0.22μm的滤膜过滤后测定乙醇、还原糖(或总糖)、木糖醇和甘油的浓度，结果如图5所示。基于总糖的乙醇收率的计算公式如(1)和(2)。

注：A为HPLC或GC数据，mg/L，C单位为g/(kg湿物料)，乙醇收率单位为g/(g总糖)，乙醇、糖的浓度单位为g/(kg湿物料)

表11预处理秸秆物料组成成分

如图5所示，预糖化11h后，物料中葡萄糖和木糖的含量分别为57.12±3.30g/kg和8.00±1.75g/kg。基于预处理秸秆物料中总葡萄糖和木糖的含量，糖化11h时，葡萄糖的糖化效率为60.84％，木糖的糖化效率为54.02％。

相比于高接种量，低接种量发酵120h时乙醇浓度积累较高。SEB15在发酵120h时，低接种量条件下乙醇浓度为46.6g/kg，乙醇收率为0.43(g-乙醇/g-总糖)；高接种量条件下乙醇浓度为43.4g/kg，乙醇收率为0.40(g-乙醇/g-总糖)。与SEB5相比，SEB15基于总糖的乙醇收率在低接种和高接种条件下分别提升了4.7％和5.3％。综合合成培养基中的发酵结果，表明菌株SEB15耐受乙酸和甲酸的能力得到显著提升，具有一定的工业应用潜力。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

参考文献

[1]Zhang G C,Kong I I,Kim H,et al.Construction of a quadrupleauxotrophic mutant of an industrial polyploid Saccharomyces cerevisiae strainby using RNA-guided Cas9 nuclease[J].Applied and Environmental Microbiology,2014,80(24):7694-7701.

[2]Mans R,van Rossum H M,Wijsman M,et al.CRISPR/Cas9:a molecularswiss army knife for simultaneous introduction of multiple geneticmodifications in Saccharomyces cerevisiae[J].FEMS Yeast Research,2015,15(2):fov004.

序列表

<110> 中国石油化工股份有限公司

中石化上海工程有限公司

四川大学

<120> 一株耐乙酸和甲酸的发酵菌株及其构建方法

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cttcaaataa cccgttca 18

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agttcacgtt ttataagtcc tttccgttct ctttatcagt cttcaaataa cccgttca 58

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acctctcaca ggcatacttt atgccattta tcaagaccat aatctattag ttaaagta 58

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ttggaccaac agcccaagcg gcttatccct tttctttttt tcccttataa tcgggaattt 60

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ctgctcttca gcatgcttac caccttcgta aagaaccagc aaaacctttc ccttcgacat 60

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tcacccttac gttgtttgaa 20

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aagcttttcc aaggaaaaga ggg 23

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cttcaaataa cccgttcaga tgattttaga gtcttccttg accaatcatc ttattcgcgc 60

agggcaaccc atgataggaa atgtcccttt aaacgaactg tgggaaatcc tgcaaaagtg 120

atgaaagtga cgttttatga aaagaaagtg aaaaagttct tgtttgacaa tattctattc 180

cgaaaagtct ttgtggtcag tattgtttct agaacgttct agaataatcc tggataaacc 240

aatttcggta ccaaaaaaaa aaatagccgc ccagtggagc atcacacagc cgtacatccg 300

gccacacacg gtggttaccc cacttcgttt cttttttcag gggcgatgcc acttatcagt 360

tgtttttaga attcagtgtc atttgagggc ggttcctcct tttgggggta tatatagaga 420

ggctccgggt tttgccacct ttgaattcgc ctgcttatct ttcttcttcc gaaagtgcta 480

cttcagaaag agcaagaact gtacggataa ggataagtat atcttctatc tactacaata 540

cgacaagaac tctcgaactc tccctcccac tttactttaa ctaatagatt 590

Claims

1.一株耐乙酸和甲酸的发酵菌株，其特征在于，为SEB15，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏编号为CGMCC No.19588，保藏日期为2020年04月20日，保藏单位为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

所述发酵菌株的构建方法为：采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将出发菌株SEB5的HAA1和FDH1基因的启动子替换为UBI4启动子，便构建了所述耐乙酸和甲酸的发酵菌株SEB15。

2.根据权利要求1所述的发酵菌株，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

步骤一，修复片段的扩增：以菌株SEB5的基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增所述UBI4启动子并纯化；

步骤二，构建双链gRNA片段并扩增gRNA线性骨架：

确定所述HAA1和FDH1基因启动子的PAM位点，构建所述双链gRNA片段；

以pMEL13质粒为模板，引物为SEQ ID No.13～14，进行PCR扩增得到所述gRNA线性骨架并纯化；

步骤三，连接所述gRNA片段和消化后的gRNA线性骨架，然后转化，获得gRNA质粒；

步骤四，将提取的Cas 9质粒转入所述菌株SEB5中，然后进行涂布平板培养并筛选、PCR反应验证获得含Cas 9质粒的酿酒酵母；

步骤五，将所述gRNA质粒和修复片段转入所述含Cas 9质粒的酿酒酵母，然后进行涂布平板培养并筛选、PCR反应验证获得耐乙酸和甲酸的发酵菌株SEB15菌落。

3.根据权利要求1所述的发酵菌株，其特征在于，所述构建方法还包括将所述发酵菌株SEB15菌落中的Cas9质粒和gRNA质粒去除。

4.根据权利要求2所述的发酵菌株，其特征在于，步骤一中所述PCR扩增采用的引物的序列为SEQ ID No.1～2。

5.根据权利要求2所述的发酵菌株，其特征在于，构建所述双链gRNA片段所需的同源臂序列为：

tgRF：TGCGCATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCN20GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC；

6.根据权利要求2所述的发酵菌株，其特征在于，所述HAA1和FDH1基因启动子的PAM位点的序列分别为SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。

7.根据权利要求2所述的发酵菌株，其特征在于，步骤三中所述gRNA片段和gRNA线性骨架通过Gibson连接方法进行连接；所述gRNA片段和gRNA线性骨架按质量比为5：1进行连接。

8.根据权利要求2所述的发酵菌株，其特征在于，步骤四中PCR反应采用的引物序列为SEQ ID No.11～12。

9.根据权利要求2所述的发酵菌株，其特征在于，步骤五中PCR反应采用的引物序列为SEQ ID No.5～6和SEQ ID No.9～10。