CN111826372B - 利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用。本发明提供了一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：提高生产丁醇的出发菌的基因组中xylE、xylFGH、xylA、xylB、rpe、tktA、rpiA、talB的表达和/或活性，且抑制所述出发菌中的glk基因表达得到的菌。本发明的实验证明了本发明构建的重组菌可以利用木糖为碳源生产丁醇，将其发酵生物质，可以提高生物质的利用率，实现有效利用廉价生物质(多为木质纤维素)或其水解液。

Description

利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

随着全球经济的向前发展，可持续的绿色经济模式已成为人类社会的共识。依赖石油等不可再生资源的产业正逐渐转型为依赖生物质的绿色产业。细胞工厂是以生物质为原料生产化学品或者燃料的重要途径。目前，乙醇等醇类、丁二酸等酸类都能通过细胞工厂来生产。

与乙醇相比，丁醇是更具潜力的燃料。它热值高、疏水性较强、可与汽油以任意比例互溶，是优良的可替代汽油的生物燃料。此外，丁醇也是一种重要的化工品和原料，可直接用作有机溶剂，是合成多种酯类化合物的前体，广泛应用于各种塑料和橡胶制品中。

自然界中存在可天然生产丁醇的梭菌Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)，该菌株能够将淀粉转化为丙酮、丁醇及乙醇。由于丙酮丁醇梭菌是一种严格厌氧生长的革兰氏阳性细菌，其遗传操作系统复杂，不利于进行实验室的研究和工业的生产。所以，近些年来研究人员将注意力转向模式微生物—Escherichia coli(大肠杆菌)。大肠杆菌以葡萄糖为底物生产丁醇的研究已有很多，但能高效利用木糖的菌株未见报道。生物质中含有葡萄糖和木糖为基本单位构成的多糖，若要有效利用廉价生物质(多为木质纤维素)或其水解液生产丁醇，还需构建能高效利用木糖生产丁醇的菌株，尤其是在多种糖分共存情况下仍能够高效利用木糖的菌株。

发明内容

为了构建能高效利用木糖生产丁醇的菌株，本发明提供如下技术方案：

本发明一个目的是提供一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：提高生产丁醇的出发菌中木糖转运和代谢相关基因xylE(木糖：氢离子协同转运体基因，xylose:H⁺symportor)、xylFGH(木糖转运蛋白基因，xylose ABC transporter)、xylA(木糖异构酶基因，xylose isomerase)、xylB(木酮糖激酶基因，xylulokinase)、rpe(磷酸核酮糖差向异构酶基因，ribulose-phosphate 3-epimerase)、tktA(转酮醇酶基因，transketolase)、rpiA(5-磷酸核糖异构酶基因，ribose-5-phosphate isomerase)、talB(转醛醇酶基因，transaldolase)中至少一个的表达和/或活性，且抑制所述出发菌中的glk基因(己糖激酶基因，glucokinase)表达得到的菌。

上述方法中，在本发明的一个实施例中，所述提高生产丁醇的出发菌中木糖转运和代谢相关基因xylE、xylFGH、xylA、xylB、rpe、tktA、rpiA、talB中至少一个的表达和/或活性为提高生产丁醇的出发菌中木糖转运和代谢相关基因xylE、xylFGH、xylA、xylB、rpe、tktA、rpiA和talB在基因组上整合提高表达和/或活性。

上述方法中，所述提高生产丁醇的出发菌中木糖转运和代谢相关基因xylE、xylFGH、xylA、xylB、rpe、tktA、rpiA和talB的表达和/或活性为增加所述出发菌的基因组中xylE、xylFGH、xylA、xylB、rpe、tktA、rpiA和talB的拷贝数。

上述方法中，所述增加出发菌的基因组中xylE、xylFGH、xylA、xylB、rpe、tktA、rpiA和talB的拷贝数为将含有xylE基因和其启动子的同源片段替换出发菌中的paaI基因，且将含有xylFGH基因和其启动子的同源片段替换出发菌中的ykgF基因，且将含有xylA与xylB形成的融合基因和其启动子的同源片段替换出发菌中的lldD基因，且将含有rpe与tktA形成的融合基因和其启动子的同源片段替换出发菌中的crr基因，且将含有rpiA与talB形成的融合基因的同源片段和其启动子替换出发菌中的ptsG基因；

或，所述抑制出发菌中的glk基因表达为敲除或抑制出发菌中的glk基因。

所述敲除或替换均采用基因组定点编辑和/或同源重组的方式进行；

或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑。

上述方法中，所述含有xylE基因和其启动子的同源片段的核苷酸序列为序列表中序列15；

所述含有xylFGH基因和其启动子的同源片段的核苷酸序列为序列表中序列18；

所述含有xylA与xylB形成的融合基因和其启动子的同源片段的核苷酸序列为序列表中序列21；

所述含有rpe与tktA形成的融合基因和其启动子的同源片段的核苷酸序列为序列表中序列24；

所述含有rpiA与talB形成的融合基因和其启动子的同源片段的核苷酸序列为序列表中序列27。

上述方法中，所述各基因的启动子在本发明的实施例均为组成型启动子；所述组成型启动子在本发明的实施例中具体为miniPtac启动子，其核苷酸序列为序列表中序列12。

上述方法中，所述抑制出发菌中的glk基因表达为敲除或抑制出发菌中的glk基因。

上述方法中，所述敲除或替换均采用基因组定点编辑和/或同源重组的方式进行；

或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑。

上述替换均为将表达被替换基因的sgRNA的质粒、同源重组片段和pCas质粒均导入出发菌中。

表达被替换基因的sgRNA的质粒具体如下：

pTargetF-ptsG质粒，该质粒中含有ptsG sgRNA的编码基因，表达ptsG sgRNA(序列9)，该ptsG sgRNA的靶序列为序列10；

pTargetF-paaI质粒，该质粒中含有paaI sgRNA的编码基因，表达paaI sgRNA(序列13)，该paaI sgRNA的靶序列为序列14；表达被替换基因的sgRNA的质粒；

pTargetF-ykgF质粒，该质粒中含有ykgF sgRNA的编码基因，表达ykgF sgRNA(序列16)，该ykgF sgRNA的靶序列为序列17；

pTargetF-lldD质粒，该质粒中含有lldD sgRNA的编码基因，表达lldD sgRNA(序列19)，该lldD sgRNA的靶序列为序列20；

pTargetF-crr质粒，该质粒中含有crr sgRNA的编码基因，表达crr sgRNA(序列22)，该crr sgRNA的靶序列为序列23；

pTargetF-△ptsG质粒，该质粒中含有ptsG sgRNA的编码基因，表达ptsG sgRNA(序列25)，该ptsG sgRNA的靶序列为序列26。

上述敲除或抑制出发菌中的glk基因为将表达被替换基因glk的sgRNA的质粒、glk同源重组片段和pCas质粒均导入出发菌中。

表达被替换基因glk的sgRNA的质粒pTargetF-glk，该质粒中含有glk sgRNA的编码基因，表达glk sgRNA(序列28)，该glk sgRNA的靶序列为序列29。

glk同源重组片段的核苷酸序列为序列30。

上述方法中，所述生产丁醇的出发菌为以葡萄糖为碳源生产丁醇的大肠杆菌，在本发明的实施例中，所述以葡萄糖为碳源生产丁醇的大肠杆菌具体为大肠杆菌EB243CGMCCNo.12191。

由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组菌的保藏号为CGMCC No.17141。

上述重组菌在以木糖为碳源生产丁醇中的应用也是本发明保护的范围；

本发明还提供了一种菌剂，包括上述重组菌和以葡萄糖为碳源生产丁醇的大肠杆菌(在本发明的实施例中具体为大肠杆菌EB243CGMCC No.12191)；

或，所述菌剂在利用木糖和葡萄糖生产丁醇中的应用也是本发明保护的范围；

或，所述菌剂在发酵生物质或其水解液生产丁醇中的应用也是本发明保护的范围；

或，本发明还提供了一种生产丁醇的方法，包括如下步骤：以木糖为碳源发酵所述重组菌或菌剂；

或，本发明还提供了一种生产丁醇的方法，包括如下步骤：以木糖和葡萄糖为碳源发酵所述菌剂；

或，本发明还提供了一种生产丁醇的方法，包括如下步骤：以生物质或其水解液为碳源发酵所述菌剂。

大肠杆菌EB243TAM-X已于2019年1月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.17141，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli。

本发明的实验证明，本发明通过将含有组成型启动子的各个基因xylE、xylFGH、xylA、xylB、rpe、tktA、rpiA、talB导入生产丁醇的出发菌中，且敲除出发菌中的glk基因得到的菌EB243TAM-X。该菌可以利用木糖为碳源生产丁醇，将其发酵生物质，可以提高生物质的利用率，实现有效利用廉价生物质(多为木质纤维素)或其水解液。

附图说明

图1为大肠杆菌体内的木糖代谢途径。

图2为菌株EB243ΔptsG、EB243T、EB243TA、EB243TAM发酵木糖的利用对比图。

图3为菌株EB243TAM发酵混合糖(葡萄糖+木糖)的过程图。

图4为菌株EB243TAM-X发酵混合糖的过程图。

图5为菌株EB243和EB243TAM-X发酵混合糖的丁醇产量图。

图6为菌株EB243和EB243TAM-X以不同比例接种小管发酵混合糖过程图及丁醇产量图。

图7为菌株EB243和EB243TAM-X以不同比例接种后发酵罐发酵混合糖过程图。

图8为菌株EB243和EB243TAM-X以2:1(以OD600值计)接种后发酵罐发酵混合糖过程图。

图9为菌株EB243和EB243TAM-X单独发酵罐发酵混合糖过程图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述M9培养基的配方为：17.1g/l Na₂HPO₄·12H₂O、3.0g/l KH₂PO₄、0.5g/lNaCl、1.0g/l NH₄Cl、0.5mg/l维生素B1、20g/l C₅H₁₀O₅、2mM MgSO₄·7H₂O、0.1mM CaCl₂和水，在该培养基中添加葡萄糖、木糖或混合糖均可作为发酵用碳源。

含葡萄糖的M9培养基为在M9培养基中添加一定浓度的葡萄糖作为碳源，得到的培养基。

含木糖的M9培养基为在M9培养基中添加一定浓度的木糖作为碳源，得到的培养基。

含葡萄糖和木糖的M9培养基为在M9培养基中添加一定浓度的木糖和一定浓度的葡萄糖作为碳源(葡萄糖和木糖的质量比为1:1)，得到的培养基。

出发菌大肠杆菌EB243已于2016年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.12191，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli。

宿主菌大肠杆菌EB243为EB216敲除基因组上pykA基因、且提高基因组上fdh基因的表达和/或活性；再在氮源不丰富的M9培养基中驯化目的菌A，得到目的菌B；抑制目的菌B基因组上yieP、stpA、yqeG和yagM基因的表达和/或活性，且提高目的菌B中ter基因和crt基因的表达和/或活性，得到重组菌。

宿主菌大肠杆菌EB243为利用葡萄糖为碳源发酵产生丁醇的菌株。

实施例1、重组菌EB243TAM-X的构建

大肠杆菌EB243TAM-X为将含有组成型启动子的xylE、xylFGH、xylA、xylB、rpe、tktA、rpiA、talB整合到大肠杆菌EB243的基因组中，且敲除或沉默大肠杆菌EB243中的glk基因得到的菌。

大肠杆菌EB243TAM-X具体构建方法如下：

下面的实施例用的是CRISPR/Cas系统介导筛选的λ-red同源重组系统进行基因敲除、基因在染色体上的替换或插入，其中涉及的质粒：

pCas记载(该质粒表达Red重组酶、Cas9蛋白和pTargetF的sgRNA)在如下文献中：Jiang,Yu,et al.Multigene editing in the Escherichia coli genome via theCRISPR-Cas9system.Applied and Environmental Microbiology 81.7(2015):2506-2514；

pTargetF记载在如下文献中：Jiang,Yu,et al.Multigene editing in theEscherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system.Applied and EnvironmentalMicrobiology 81.7(2015):2506-2514；

pACYC184记载在如下文献中：Rose RE.The nucleotide sequence ofpACYC184.Nucleic Acids Research16.1(1988):355；

涉及的野生型菌株BW25113记载在如下文献中：Datsenko,Kirill A.,and BarryL.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12(2000):6640-6645；

xylE基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；

xylFGH基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；

xylA与xylB形成的融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

rpe基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示；

tktA基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示；

rpiA基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示；

talB基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示；

glk基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示。

一、模块化加强木糖利用途径构建菌株EB243TAM

A、菌株EB243TAM的构建过程

1、大肠杆菌EB243感受态细胞的制备

EB243感受态细胞：在三角瓶中培养至对数生长中期的200ml EB243菌液，冰浴30min。4℃，3000g离心5min。弃掉上清液，用预冷的无菌10％甘油重悬菌体，洗涤两次。最后加入1ml预冷的10％甘油重悬菌体，50μl每管分装至预冷的1.5ml无菌离心管中备用，得到EB243感受态细胞。

2、大肠杆菌EB243(pCas)感受态细胞的制备

EB243(pCas)重组菌：取1μl pCas与上述EB243感受态细胞混合，冰浴5min，将混合物转移至2mm电击杯内进行转化，电击转化参数为：电压2.5kV，25μF，电阻200Ω。电击转化完毕后，立即将菌液转移至1ml LB中，30℃复壮1h，涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，30℃培养12h，得到EB243(pCas)重组菌；

EB243(pCas)感受态细胞：将上述涂布的平板上长出的EB243(pCas)重组菌菌落转接至含50μg/ml卡那霉素的液体LB中，30℃培养至OD600值约为0.2时，加入终浓度为10mmol/l的阿拉伯糖进行诱导，诱导至对数生长中期的菌体按照上述制备EB243的方法制备EB243(pCas)感受态细胞。

3、出发菌EB243△ptsG(pCas)的构建

1)构建靶向质粒pTargetF-ptsG和同源片段

以pTargetF为模板，以引物pTargetF-ptsGN20-1(TCCTAGGTATAATACTAGTGACATTCCGCGTTATATGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)和pTargetF-2(ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG)PCR扩增出线性片段，转化至DH5α中，自连后形成的质粒即为靶向质粒pTargetF-ptsG，该质粒中含有ptsG sgRNA的编码基因，表达ptsG sgRNA(序列9)，该ptsG sgRNA的靶序列为序列10；

以大肠杆菌BW25113基因组为模板，用引物ptsG-up-F(ACTCTCAATTATGTTTAAGAATGC)/ptsG-up-R(CCAGAAATGATCGGCACAAAGCGTTTACCGGCAAAGAA)和ptsG-down-F(TTCTTTGCCGGTAAACGCTTTGTGCCGATCATTTCTGGCGACTTCATCGTTCTGTCTGG)/ptsG-down-R(GTCTTACGGATTAGTGGTTACGGAT)分别扩增出ptsG的上、下游同源片段；以该上、下游同源片段为模板，以引物ptsG-up-F(ACTCTCAATTATGTTTAAGAATGC)和ptsG-down-R(GTCTTACGGATTAGTGGTTACGGAT)进行融合PCR，扩增出的片段即为ptsG的同源片段。经过测序，ptsG同源片段的核苷酸序列为序列表中序列11。

2)构建EB243△ptsG(pCas)

将1μl上述1)制备的pTargetF-ptsG和1μl上述1)制备的ptsG同源片段与上述2制备的EB243(pCas)感受态细胞混合，按照上述2中电击转化方法进行转化，30℃复壮1h，涂布于含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml壮观霉素的LB平板上，30℃培养24h，得到中间菌。挑取适量中间菌，用引物ptsG-up-F(ACTCTCAATTATGTTTAAGAATGC)和ptsG-down-R(GTCTTACGGATTAGTGGTTACGGAT)进行菌落PCR验证ptsG的敲除，使用EB243(pCas)作对照。电泳得到约900bp大小条带的为ptsG敲除成功的菌落，对照的条带大小为约为1.45kb。此时中间菌中含pCas和pTargetF-ptsG两种质粒。

3)去除质粒pTargetF-ptsG

挑取上述2)中ptsG敲除成功的中间菌接至含50μg/ml卡那霉素和0.5mM IPTG(IPTG诱导pCas质粒表达靶向质粒pTargetF-ptsG骨架序列的sgRNA)；的LB中30℃过夜活化。用灭菌的牙签蘸取活化后的菌液在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上进行单菌落划线，30℃培养12h。挑取几个长出的单菌落依次在含50μg/ml壮观霉素和含50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线，30℃培养6h。筛选出在含壮观霉素平板上不长、在对应的含卡那霉素平板上长的菌落即为pTargetF-ptsG质粒已去除的菌株，即EB243△ptsG(pCas)。按照上述2制备感受态的方法制备EB243△ptsG(pCas)感受态备用。

4、整合xylE、xylFGH至EB243△ptsG获得EB243T

为进一步加强重组菌对木糖(或水解液)的利用能力，需对木糖的转运、激活、代谢过程依次进行强化。

1)构建质粒pAC2作为表达载体

以pACYC184质粒为模板，以引物pAC2-1A(ATCGGGATCCCATATGGAATTCCTCGAGCAATTCCACACATTATACGAGCCGATGATTA)、pAC2-1B(CACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAATCGATGATAAGCTGTCAAACATG)和pAC2-2(ATCGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTCGGTGCATGGAGCCGGGCC)PCR扩增出片段，用BamHI酶切后自连，得到质粒pAC2，该质粒含有组成型启动子miniPtac(该启动子的核苷酸序列为序列表中序列12)。

2)构建表达载体pAC2-xylE

以大肠杆菌BW25113基因组为模板，以引物xylE-1(AGCTCGAGTCAGAATGGTCTAAGGCAGGTCTG)和xylE-2(ACGGATCCTCGTCGATCATAAATCGCCACTG)PCR扩增xylE基因片段，该片段与质粒pAC2共同使用XhoI和BamHI酶切，连接后形成的新质粒命名为pAC2-xylE。

3)构建靶向质粒pTargetF-paaI和同源片段

以pTargetF为模板，以引物pTargetF-paaIN20-1(TCCTAGGTATAATACTAGTACGATTGATTTTTTGCGTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)和引物pTargetF-2(ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG)PCR扩增出线性片段，转化至DH5α中，自连后形成的质粒即为靶向质粒pTargetF-paaI，该质粒中含有paaI sgRNA的编码基因，表达paaI sgRNA(序列13)，该paaIsgRNA的靶序列为序列14；

以大肠杆菌BW25113基因组为模板，用引物paaI-up-F(GGGCTGCATTTTTTTAACCCGGC)/paaI-up-R(ATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACACAAAGCCTTCATCCATTGAGATAATGTCG)和paaI-down-F(ACACATCCAGTGGCGATTTATGATCGACGACAACAAAAAACGGTTGCGCTGTTTCGCGG)/paaI-down-R(AGTACACCCAACGCCTGGGCC)分别扩增出paaI的上、下游同源片段；

以pAC2-xylE为模板，以引物miniPtac-xylE-F(CGACATTATCTCAATGGATGAAGGCTTTGTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAAT)和miniPtac-xylE-R

(CCGCGAAACAGCGCAACCGTTTTTTGTTGTCGTCGATCATAAATCGCCACTGGATGTGT)PCR扩增出xylE基因片段；

以paaI的上、下游同源片段和xylE基因片段为模板，以引物paaI-up-F(GGGCTGCATTTTTTTAACCCGGC)和paaI-down-R(AGTACACCCAACGCCTGGGCC)融合PCR扩增出paaI的同源片段，该同源片段中间携带miniPtac启动的xylE基因(含有xylE基因和其启动子的同源片段)，该同源片段的核苷酸序列为序列15。

4)构建菌株EB243△ptsG△paaI::xylE

将1μl上述3)制备的pTargetF-paaI和1μl上述3)制备的paaI同源片段与上述3制备的EB243△ptsG(pCas)感受态细胞混合，按照上述2中电击转化方法进行转化，30℃复壮1h，涂布于含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml壮观霉素的LB平板上，30℃培养24h，得到中间菌。挑取适量中间菌，用引物paaI-up-F(GGGCTGCATTTTTTTAACCCGGC)和paaI-down-R(AGTACACCCAACGCCTGGGCC)进行菌落PCR验证xylE在paaI位点的整合，使用EB243△ptsG(pCas)作对照。电泳得到约3.87kb大小条带的为xylE整合成功的菌落，对照的条带大小为约为2.42kb。此时中间菌中含pCas和pTargetF-paaI两种质粒。按照上述3去除pTargetF质粒的方法，得到的去除了pTargetF-paaI质粒的菌为EB243△ptsG△paaI::xylE(pCas)；按照上述2制备感受态的方法制备EB243△ptsG△paaI::xylE(pCas)感受态备用。

5)构建菌株EB243T

按照上述2)的方法，以大肠杆菌BW25113基因组为模板，以引物xylFGH-1(GAATTGCTCGAGGAATTCCACTACAGAAGGCCCTACAC)和xylFGH-2(CGACTCTAGAGGATCCCATAGAATCATGCAAAAACTCAAAAC)PCR扩增xylFGH基因片段，与pAC2连接形成pAC2-xylFGH。

以pTargetF为模板，以引物pTargetF-ykgFN20-1(TCCTAGGTATAATACTAGTGATTTCCTCAGTGCTGAAATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)和pTargetF-2(ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG)PCR扩增并构建pTargetF-ykgF质粒，该质粒中含有ykgF sgRNA的编码基因，表达ykgF sgRNA(序列16)，该ykgF sgRNA的靶序列为序列17；

以大肠杆菌BW25113基因组为模板，用引物ykgF-up-F(TGAATAGGTATAAGGGATGTAG)/ykgF-up-R(TTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACATCAGCGGCTCATCAACACTTCAGCAATATG)和ykgF-down-F(GTATTACCGGTTTTGAGTTTTTGCATGATTCCGTAGTTGGTTTAAGAAACATCAGGCGC)/ykgF-down-R(TGTAATTTCTGTAATGTTTTGC)分别扩增出ykgF的上、下游同源片段；

以pAC2-xylFGH为模板，以引物miniPtac-xylFGH-F(CATATTGCTGAAGTGTTGATGAGCCGCTGATGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAA)和miniPtac-xylFGH-R(GCGCCTGATGTTTCTTAAACCAACTACGGAATCATGCAAAAACTCAAAACCGGTAATAC)PCR扩增出xylFGH基因片段；

以ykgF的上、下游同源片段和xylFGH基因片段为模板，以引物ykgF-up-F(TGAATAGGTATAAGGGATGTAG)和ykgF-down-R(TGTAATTTCTGTAATGTTTTGC)融合PCR扩增出ykgF的同源片段，该同源片段中间携带miniPtac启动的xylFGH基因(含有xylFGH基因和其启动子的同源片段)，该同源片段的核苷酸序列为序列18。

按照上述4)的方法将pTargetF-ykgF质粒和ykgF的同源片段转化至EB243△ptsG△paaI::xylE(pCas)感受态中获得中间菌；用引物ykgF-up-F(TGAATAGGTATAAGGGATGTAG)和ykgF-down-R(TGTAATTTCTGTAATGTTTTGC)进行菌落PCR验证xylFGH在ykgF位点的整合，使用EB243△ptsG△paaI::xylE(pCas)作对照。电泳得到约4.89kb大小条带的为xylFGH整合成功的菌落，对照的条带大小为约为2.41kb。此时中间菌中含pCas和pTargetF-ykgF两种质粒。按照上述3去除pTargetF质粒的方法，得到的去除了pTargetF-ykgF质粒的菌为EB243△ptsG△paaI::xylE△ykgF::xylFGH(pCas)，命名为EB243T(pCas)；按照上述2制备感受态的方法制备EB243T(pCas)感受态备用。

挑取上述EB243T(pCas)转接至无抗的液体LB中，42℃培养，经过两次传代培养后，稀释涂布于无抗平板上，37℃培养12h，经过2次42℃培养去除了温敏质粒pCas。挑取上述稀释涂布平板上的单菌落依次划线至卡那霉素抗性平板和无抗平板，37℃培养6h。之后，筛选出在卡那霉素抗性平板上不长、在对应的无抗平板上长的菌落即为去除了质粒pCas的重组菌，命名为EB243T。

5、整合xylA、xylB至EB243T获得EB243TA

按照上述2)的方法，以大肠杆菌BW25113基因组为模板，以引物xylAB-1(GAATTGCTCGAGGAATTCCACATTACCTGATTATGGAGTTC)和xylAB-2(CGACTCTAGAGGATCCCATAGATCTCCATATCTACCAGC)PCR扩增xylAB基因片段(xylA与xylB形成的融合基因)，与pAC2连接形成pAC2-xylAB。

以pTargetF为模板，以引物pTargetF-lldDN20-1(TCCTAGGTATAATACTAGTTGCGCTGGCAACAGCGGGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)和pTargetF-2(ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG)PCR扩增并构建pTargetF-lldD质粒，该质粒中含有lldD sgRNA的编码基因，表达lldD sgRNA(序列19)，该lldD sgRNA的靶序列为序列20；

以大肠杆菌BW25113基因组为模板，用引物lldD-up-F(CAAATTGGCGTCTCTGATCTGTTG)/lldD-up-R(ATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACACTTCTGACAAATCTTCCACGTTGCGGCGC)和lldD-down-F(GTAATGTATCGCTGGTAGATATGGAGATCCTGTATGTACTCCCTCACTCTGAAACGACA)/lldD-down-R(TGGCGGTACGGGTAAATCTGGTG)分别扩增出lldD的上、下游同源片段；

以pAC2-xylAB为模板，以引物miniPtac-xylAB-F(GCGCCGCAACGTGGAAGATTTGTCAGAAGTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAAT)和miniPtac-xylAB-R(TGTCGTTTCAGAGTGAGGGAGTACATACAGGATCTCCATATCTACCAGCGATACATTAC)PCR扩增出xylAB基因片段(xylA与xylB形成的融合基因)；

以lldD的上、下游同源片段和xylAB基因片段为模板，以引物lldD-up-F(CAAATTGGCGTCTCTGATCTGTTG)和lldD-down-R(TGGCGGTACGGGTAAATCTGGTG)融合PCR扩增出lldD的同源片段，该同源片段中间携带miniPtac启动的xylAB基因(含有xylA与xylB形成的融合基因和其启动子的的同源片段)，该同源片段的核苷酸序列为序列21。

按照上述4)的方法将pTargetF-lldD质粒和lldD的同源片段转化至EB243T(pCas)感受态中获得中间菌；用引物lldD-up-F(CAAATTGGCGTCTCTGATCTGTTG)和lldD-down-R(TGGCGGTACGGGTAAATCTGGTG)进行菌落PCR验证xylAB在lldD位点的整合，使用EB243T(pCas)作对照。电泳得到约5.16kb大小条带的为xylAB整合成功的菌落，对照的条带大小为约为3.19kb。此时中间菌中含pCas和pTargetF-lldD两种质粒。按照上述3去除pTargetF质粒的方法，得到的去除了pTargetF-lldD质粒的菌为EB243T△lldD::xylAB(pCas)，命名为EB243TA(pCas)；按照上述2制备感受态的方法制备EB243TA(pCas)感受态备用。按上述4去除pCas质粒的方法去除pCas得到的菌株命名为EB243TA。

6、整合rpe-tktA、rpiA-talB至EB243TA获得EB243TAM

1)整合rpe-tktA

以大肠杆菌BW25113基因组为模板，以引物rpe-1(TTCTCAAGGAGAAGCGGATGA)和rpe-2(TTATTCATGACTTACCTTTGCCAGTTCACTGCGCATTT)PCR扩增rpe基因片段；以大肠杆菌BW25113基因组为模板，以引物tktA-1(AAATGCGCAGTGAACTGGCAAAGGTAAGTCATGAATAAAAGGGCGTGCCCTTCATCATC)和tktA-2(AGGGTACCGTCCGGCGGTAAA)PCR扩增tktA基因片段；以rpe基因片段和tktA基因片段为模板，以引物rpe-tktA-1(GAATTGCTCGAGGAATTCCATTCTCAAGGAGAAGCGGATGAAACAG)和rpe-tktA-2(CGACTCTAGAGGATCCCATAGGGTACCGTCCGGCGGTA)融合PCR扩增rpe-tktA片段，与pAC2连接形成pAC2-rpe-tktA。

以pTargetF为模板，以引物pTargetF-crrN20-1(TCCTAGGTATAATACTAGTGAGATCATTGCTCCGCTCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)和pTargetF-2(ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG)PCR扩增并构建pTargetF-crr质粒，该质粒中含有crr sgRNA的编码基因，表达crrsgRNA(序列22)，该crr sgRNA的靶序列为序列23；

以大肠杆菌BW25113基因组为模板，用引物crr-up-F(AATTGAAATCGGCGTAATGGTGG)/crr-up-R(ATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGTTTATCGAACAAACCCATGATCTTCTCC)和crr-down-F(GTATTTTATTTTTACCGCCGGACGGTACCCGCTTCCGCCAGCGGCGGCAAAATCAATTC)/crr-down-R(ACGGCATCGCAAATCAAAATCCTTG)分别扩增出crr的上、下游同源片段；以pAC2-rpe-tktA为模板，以引物miniPtac-rpe-tktA-F(GGAGAAGATCATGGGTTTGTTCGATAAACTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAAT)和miniPtac-rpe-tktA-R(GAATTGATTTTGCCGCCGCTGGCGGAAGCGGGTACCGTCCGGCGGTAAAAATAAAATAC)PCR扩增出rpe-tktA基因片段；以crr的上、下游同源片段和rpe-tktA基因片段为模板，以引物crr-up-F(AATTGAAATCGGCGTAATGGTGG)和crr-down-R(ACGGCATCGCAAATCAAAATCCTTG)融合PCR扩增出crr的同源片段，该同源片段中间携带miniPtac启动的rpe-tktA基因(含有rpe与tktA形成的融合基因和其启动子的同源片段)，该同源片段的核苷酸序列为序列24。

按照上述4)的方法将pTargetF-crr质粒和crr的同源片段转化至EB243TA(pCas)感受态中获得中间菌；用引物crr-up-F(AATTGAAATCGGCGTAATGGTGG)和crr-down-R(ACGGCATCGCAAATCAAAATCCTTG)进行菌落PCR验证rpe-tktA在crr位点的整合，使用EB243TA(pCas)作对照。电泳得到约4.13kb大小条带的为rpe-tktA整合成功的菌落，对照的条带大小为约为1.61kb。此时中间菌中含pCas和pTargetF-crr两种质粒。按照上述3去除pTargetF质粒的方法，得到的去除了pTargetF-crr质粒的菌为EB243TA△crr::rpe-tktA(pCas)；按照上述2制备感受态的方法制备EB243TA△crr::rpe-tktA(pCas)感受态备用。

2)整合rpiA-talB

以大肠杆菌BW25113基因组为模板，以引物rpiA-1(ATTTCATACCACAGGCGAAACGATC)和rpiA-2(TCATTTCACAATGGTTTTGACACCGTCAGGTGTGCCAA)PCR扩增rpiA基因片段；以大肠杆菌BW25113基因组为模板，以引物talB-1(TTGGCACACCTGACGGTGTCAAAACCATTGTGAAATGACCTAACAAGCTGTTTAAAGAG)和talB-2(CAAGATTTTTCCGTTTAAACAGT)PCR扩增talB基因片段；以rpiA基因片段和talB基因片段为模板，以引物rpiA-talB-1(GAATTGCTCGAGGAATTCCAATTTCATACCACAGGCGAAAC)和rpiA-talB-2(CGACTCTAGAGGATCCCATACAAGATTTTTCCGTTTAAACAGTC)融合PCR扩增rpiA-talB片段，与pAC2连接形成pAC2-rpiA-talB。

以pTargetF为模板，以引物pTargetF-△ptsGN20-1(TCCTAGGTATAATACTAGTAGTTGTTGCCTATGGCATCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)和pTargetF-2(ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG)PCR扩增并构建pTargetF-△ptsG质粒，该质粒中含有ptsG sgRNA的编码基因，表达ptsG sgRNA(序列25)，该ptsG sgRNA的靶序列为序列26；

以大肠杆菌BW25113基因组为模板，用引物△ptsG-up-F(ATTATTATTACACGCCGGAAAC)/△ptsG-up-R(ATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAAATTGAGAGTGCTCCTGAGTATGGGTGCT)和△ptsG-down-F(CAGTGTATCATTCTGTTTAACGAGACTGTTTCCGTAAGACGTTGGGGAGACTAAGGCAG)/△ptsG-down-R(ACTTACAGCATGGAGAAAAACCAC)分别扩增出ptsG的上、下游同源片段；以pAC2-rpiA-talB为模板，以引物miniPtac-rpiA-talB-F(AGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAAT)和miniPtac-rpiA-talB-R(CTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAAACAGTCTCGTTAAACAGAATGATACACTG)PCR扩增出rpiA-talB基因片段；以ptsG的上、下游同源片段和rpiA-talB基因片段为模板，以引物△ptsG-up-F(ATTATTATTACACGCCGGAAAC)和△ptsG-down-R(ACTTACAGCATGGAGAAAAACCAC)融合PCR扩增出ptsG的同源片段，该同源片段中间携带miniPtac启动子的rpiA-talB基因(含有rpiA与talB形成的融合基因和其启动子的同源片段)，该同源片段的核苷酸序列为序列27。

按照上述4)的方法将pTargetF-△ptsG质粒和ptsG的同源片段转化至EB243TA△crr::rpe-tktA(pCas)感受态中获得中间菌；用引物△ptsG-up-F(ATTATTATTACACGCCGGAAAC)和△ptsG-down-R(ACTTACAGCATGGAGAAAAACCAC)进行菌落PCR验证rpiA-talB在ptsG位点的整合，使用EB243TA△crr::rpe-tktA(pCas)作对照。电泳得到约4.13kb大小条带的为rpiA-talB整合成功的菌落，对照的条带大小为约为1.61kb。此时中间菌中含pCas和pTargetF-△ptsG两种质粒。按照上述3去除pTargetF质粒的方法，得到的去除了pTargetF-△ptsG质粒的菌为EB243TA△crr::rpe-tktA△ptsG::rpiA-talB(pCas)，命名为EB243TAM(pCas)；按照上述2制备感受态的方法制备EB243TAM(pCas)感受态备用。按上述4去除pCas质粒的方法去除pCas得到的菌株命名为EB243TAM。图1为木糖代谢途径。

B、增强木糖代谢途径的相关菌株的发酵测试

上述得到的4个菌株在M9培养基中发酵72小时，发酵产物利用高效液相色谱(HPLC)进行检测，检测采用Agilent 1260液相色谱仪，示差折光检测器，BioRad AminexHPX-87H有机酸柱，柱温55℃，流动相为5mmol/l硫酸水溶液，流速0.5ml/min，进样量10μl。

具体发酵方法为：灭菌后的培养基分装至15ml离心管(BD Biosciences)内，每管分装10ml。接种0.5ml过夜活化的种子液，拧紧离心管的螺旋盖后再拧松半圈，置于37℃静置发酵72小时。

HPLC分析的标准品为葡萄糖、木糖、丁醇，保留时间依次为10.2min，11.2min，41.0min左右，发酵液上清在相应时间也有峰出现，说明发酵液上清中确实含有葡萄糖、木糖、丁醇。

根据标准品浓度与峰面积的对应关系，确定的计算公式为：

葡萄糖浓度的计算公式：y＝177110x，R²＝0.9998，其中x表示葡萄糖浓度(g/L)，y表示实际峰面积；

木糖浓度的计算公式：y＝185948x，R²＝0.9985，其中x表示木糖浓度(g/L)，y表示实际峰面积；

丁醇浓度的计算公式：y＝122098x，R²＝0.9991，其中x表示丁醇浓度(g/L)，y表示实际峰面积。

检测4个菌株在含20g/L木糖的M9培养基中发酵72小时后消耗的木糖量(初始木糖浓度-剩余木糖浓度)；检测结果如图2所示，可以看出随着木糖代谢基因的逐步整合，菌株的木糖利用能力逐步增强，其中，重组菌EB243TAM-X的木糖消耗量最大。

检测重组菌EB243TAM在含20g/L木糖和20g/L葡萄糖的M9培养基中不同发酵时间的木糖浓度和葡萄糖浓度，结果如图3所示，但该菌株仍能利用葡萄糖，这可能会产生代谢物阻遏效应，影响木糖的利用。

二、进一步阻断葡萄糖的利用获得菌株EB243TAM-X

A、敲除葡萄糖利用过程中的己糖激酶基因glk，得到EB243TAM-X

以pTargetF为模板，以引物pTargetF-glkN20-1(TCCTAGGTATAATACTAGTGGCGATGACCAACCATACCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC)和pTargetF-2(ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG)PCR扩增出线性片段，转化至DH5α中，自连后形成的质粒即为靶向质粒pTargetF-glk，该质粒中含有glk sgRNA的编码基因，表达glk sgRNA(序列28)，该glk sgRNA的靶序列为序列29；

以大肠杆菌BW25113基因组为模板，用引物glk-up-F(CGCAGAGGGCGGAACCGGTGC)/glk-up-R(GAGTTACCTCCCGATATAAAAGGAAGGATTCTTCAACTGCTCCGCTAAAGTCAAAATAA)和glk-down-F(TTATTTTGACTTTAGCGGAGCAGTTGAAGAATCCTTCCTTTTATATCGGGAGGTAACTC)/glk-down-R(GCCCGCAGCGTTTTTAATTGCG)分别扩增出glk的上、下游同源片段；以该上、下游同源片段为模板，以引物glk-up-F(CGCAGAGGGCGGAACCGGTGC)和glk-down-R(GCCCGCAGCGTTTTTAATTGCG)进行融合PCR，扩增出的片段即为glk的同源片段(序列30)。

按照上述4的方法将pTargetF-glk质粒和glk的同源片段转化至EB243TAM(pCas)感受态中获得中间菌；用引物glk-up-F(CGCAGAGGGCGGAACCGGTGC)和glk-down-R(GCCCGCAGCGTTTTTAATTGCG)进行菌落PCR验证glk的敲除，使用EB243TAM(pCas)作对照。电泳得到约1.0kb大小条带的为glk敲除成功的菌落，对照的条带大小为约为1.96kb。此时中间菌中含pCas和pTargetF-glk两种质粒。按照上述3去除pTargetF质粒的方法，得到的去除了pTargetF-glk质粒的菌为EB243TAM△glk(pCas)，命名为EB243TAM-X(pCas)；按上述4去除pCas质粒的方法去除pCas得到的菌株命名为EB243TAM-X(也可称为EB243X)。

B、菌株EB243TAM-X发酵测试

按照上述一的发酵方法，将EB243TAM-X在以含20g/L葡萄糖和20g/L木糖的M9培养基中发酵72小时，并按照HPLC检测方法进行检测木糖消耗量和葡萄糖消耗量。

结果见图4，显示，EB243TAM-X几乎不能利用葡萄糖而专一利用木糖，且利用木糖的能力较EB243TAM进一步提升，丁醇产量略有提升(图5)。

大肠杆菌EB243TAM-X已于2019年1月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.17141，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli。

实施例2、使用重组菌EB243TAM-X和EB243混合菌剂进行混合糖的发酵

一、使用小管微好氧发酵

按照实施例1中的发酵方法，将菌株EB243和实施例1制备的EB243TAM-X以不同的混合比例分别接至含20g/L葡萄糖和20g/L木糖的M9培养基中发酵72小时。检测发酵产物中丁醇产量，葡萄糖和木糖的消耗量。

结果见图6，a：EB243和EB243TAM-X的初始接种OD600值比为1:1发酵后葡萄糖和木糖的含量；b：EB243和EB243TAM-X的初始接种OD600值比为1:2发酵后葡萄糖和木糖的含量；c：EB243和EB243TAM-X的初始接种OD600值比为1:4发酵后葡萄糖和木糖的含量；d：不同接种比例下丁醇产量和得率；结果显示，当菌株EB243和EB243TAM-X的初始接种比例为1:4(以OD600值计)时，培养基中的葡萄糖和木糖基本以同等速率被消耗，丁醇产量为8.66g/L(发酵产物)，丁醇得率为35.6％。

丁醇得率＝丁醇产量(g/L)/消耗的糖(g/L)×100％

二、使用发酵罐进行两阶段发酵

为了控制发酵过程中的pH，以及采取先好氧生长获得较多的细胞量然后再进行丁醇厌氧发酵的策略来进一步提高丁醇产量，采用NBS公司BioFlo 110发酵系统进行丁醇发酵，发酵罐体积为7L，装液量3L，发酵培养基为含35g/L葡萄糖和35g/L木糖的M9培养基，混合菌接种量5％(菌株EB243和EB243TAM-X的初始接种比例为1:4、1:2、1:1、2:1、(以OD600值计))，发酵罐培养温度37℃，转速200rpm，pH控制为6.80，发酵培养基为M9。具体为：首先以1vvm水平通空气24小时，使OD600值达到15-20，然后关闭空气，50rpm搅拌发酵。

发酵结果如图7所示，a：EB243:EB243TAM-X＝1:4；b：EB243:EB243TAM-X＝1:2；c：EB243:EB243TAM-X＝1:1；d：EB243:EB243TAM-X＝2:1；可以看出，当菌株EB243和EB243TAM-X的初始接种比例为2:1(以OD600值计)时，培养基中的葡萄糖和木糖基本以同等速率被消耗。

EB243:EB243TAM-X＝2:1的发酵结果如图8所示，当菌株EB243和EB243TAM-X的初始接种比例为2:1(以OD600值计)时，培养基中的葡萄糖和木糖基本以同等速率被消耗，最终丁醇产量可达到20.8g/L，得率为35％。

采用同样的方法，用菌株EB243和菌株EB243TAM-X单独发酵混合糖，结果如图9所示，a：菌株EB243单独发酵混合糖过程图；b：菌株EB243TAM-X单独发酵混合糖过程图；对比混合菌剂结果，可以看出，使用混合菌剂发酵混合糖的丁醇产量远高于单独使用一种菌时的产量。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgaataccc agtataattc cagttatata ttttcgatta ccttagtcgc tacattaggt 60

ggtttattat ttggctacga caccgccgtt atttccggta ctgttgagtc actcaatacc 120

gtctttgttg ctccacaaaa cttaagtgaa tccgctgcca actccctgtt agggttttgc 180

gtggccagcg ctctgattgg ttgcatcatc ggcggtgccc tcggtggtta ttgcagtaac 240

cgcttcggtc gtcgtgattc acttaagatt gctgctgtcc tgttttttat ttctggtgta 300

ggttctgcct ggccagaact tggttttacc tctataaacc cggacaacac tgtgcctgtt 360

tatctggcag gttatgtccc ggaatttgtt atttatcgca ttattggcgg tattggcgtt 420

ggtttagcct caatgctctc gccaatgtat attgcggaac tggctccagc tcatattcgc 480

gggaaactgg tctcttttaa ccagtttgcg attattttcg ggcaactttt agtttactgc 540

gtaaactatt ttattgcccg ttccggtgat gccagctggc tgaatactga cggctggcgt 600

tatatgtttg cctcggaatg tatccctgca ctgctgttct taatgctgct gtataccgtg 660

ccagaaagtc ctcgctggct gatgtcgcgc ggcaagcaag aacaggcgga aggtatcctg 720

cgcaaaatta tgggcaacac gcttgcaact caggcagtac aggaaattaa acactccctg 780

gatcatggcc gcaaaaccgg tggtcgtctg ctgatgtttg gcgtgggcgt gattgtaatc 840

ggcgtaatgc tctccatctt ccagcaattt gtcggcatca atgtggtgct gtactacgcg 900

ccggaagtgt tcaaaacgct gggggccagc acggatatcg cgctgttgca gaccattatt 960

gtcggagtta tcaacctcac cttcaccgtt ctggcaatta tgacggtgga taaatttggt 1020

cgtaagccac tgcaaattat cggcgcactc ggaatggcaa tcggtatgtt tagcctcggt 1080

accgcgtttt acactcaggc accgggtatt gtggcgctac tgtcgatgct gttctatgtt 1140

gccgcctttg ccatgtcctg gggtccggta tgctgggtac tgctgtcgga aatcttcccg 1200

aatgctattc gtggtaaagc gctggcaatc gcggtggcgg cccagtggct ggcgaactac 1260

ttcgtctcct ggaccttccc gatgatggac aaaaactcct ggctggtggc ccatttccac 1320

aacggtttct cctactggat ttacggttgt atgggcgttc tggcagcact gtttatgtgg 1380

aaatttgtcc cggaaaccaa aggtaaaacc cttgaggagc tggaagcgct ctgggaaccg 1440

gaaacgaaga aaacacaaca aactgctacg ctgtaa 1476

<210> 2

<211> 3771

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atgaaaataa agaacattct actcaccctt tgcacctcac tcctgcttac caacgttgct 60

gcacacgcca aagaagtcaa aataggtatg gcgattgatg atctccgtct tgaacgctgg 120

caaaaagatc gagatatctt tgtgaaaaag gcagaatctc tcggcgcgaa agtatttgta 180

cagtctgcaa atggcaatga agaaacacaa atgtcgcaga ttgaaaacat gataaaccgg 240

ggtgtcgatg ttcttgtcat tattccgtat aacggtcagg tattaagtaa cgttgtaaaa 300

gaagccaaac aagaaggcat taaagtatta gcttacgacc gtatgattaa cgatgcggat 360

atcgattttt atatttcttt cgataacgaa aaagtcggtg aactgcaggc aaaagccctg 420

gtcgatattg ttccgcaagg taattacttc ctgatgggcg gctcgccggt agataacaac 480

gccaagctgt tccgcgccgg acaaatgaaa gtgttaaaac cttacgttga ttccggaaaa 540

attaaagtcg ttggtgacca atgggttgat ggctggttac cggaaaacgc attgaaaatt 600

atggaaaacg cgctaaccgc caataataac aaaattgatg ctgtagttgc ctcaaacgat 660

gccaccgcag gtggggcaat tcaggcatta agcgcgcaag gtttatcagg gaaagtagca 720

atctccggcc aggatgcgga tctcgcaggt attaaacgta ttgctgccgg tacgcaaact 780

atgacggtgt ataaacctat tacgttgttg gcaaatactg ccgcagaaat tgccgttgag 840

ttgggcaatg gtcaggaacc aaaagcagat accacactga ataatggcct gaaagatgtc 900

ccctcccgcc tcctgacacc gatcgatgtg aataaaaaca acatcaaaga tacggtaatt 960

aaagacggat tccacaaaga gagcgagctg taagcgttac gccccagcgc ggagcggggg 1020

cgtgatttct ctccatgccg cgtgaatgaa ttggcttagg tggagtcgtt atgccttatc 1080

tacttgaaat gaagaacatt accaaaacct tcggcagtgt gaaggcgatt gataacgtct 1140

gcttgcggtt gaatgctggc gaaatcgtct cactttgtgg ggaaaatggg tctggtaaat 1200

caacgctgat gaaagtgctg tgtggtattt atccccatgg ctcctacgaa ggcgaaatta 1260

tttttgcggg agaagagatt caggcgagtc acatccgcga taccgaacgc aaaggtatcg 1320

ccatcattca tcaggaattg gccctggtga aagaattgac cgtgctggaa aatatcttcc 1380

tgggtaacga aataacccac aatggcatta tggattatga cctgatgacg ctacgctgtc 1440

agaagctgct cgcacaggtc agtttatcca tttcacctga tacccgcgtt ggcgatttag 1500

ggcttgggca acaacaactg gttgaaattg ccaaggcact taataaacag gtgcgcttgt 1560

taattctcga tgaaccgaca gcctcattaa ctgagcagga aacgtcgatt ttactggata 1620

ttattcgcga tctacaacag cacggtatcg cctgtattta tatttcgcac aaactcaacg 1680

aagtcaaagc gatttccgat acgatttgcg ttattcgcga cggacagcac attggtacgc 1740

gtgatgctgc cggaatgagt gaagacgata ttatcaccat gatggtcggg cgagagttaa 1800

ccgcgcttta ccctaatgaa ccacatacca ccggagatga aatattacgt attgaacatc 1860

tgacggcatg gcatccggtt aatcgtcata ttaaacgagt taatgatgtc tcgttttccc 1920

tgaaacgtgg cgaaatattg ggtattgccg gactcgttgg tgccggacgt accgagacca 1980

ttcagtgcct gtttggtgtg tggcccggac aatgggaagg aaaaatttat attgatggca 2040

aacaggtaga tattcgtaac tgtcagcaag ccatcgccca ggggattgcg atggtccccg 2100

aagacagaaa gcgcgacggc atcgttccgg taatggcggt tggtaaaaat attaccctcg 2160

ccgcactcaa taaatttacc ggtggcatta gccagcttga tgacgcggca gagcaaaaat 2220

gtattctgga atcaatccag caactcaaag ttaaaacgtc gtcccccgac cttgctattg 2280

gacgtttgag cggcggcaat cagcaaaaag cgatcctcgc tcgctgtctg ttacttaacc 2340

cgcgcattct cattcttgat gaacccacca ggggtatcga tattggcgcg aaatacgaga 2400

tctacaaatt aattaaccaa ctcgtccagc agggtattgc cgttattgtc atctcttccg 2460

aattacctga agtgctcggc cttagcgatc gtgtactggt gatgcatgaa gggaaactaa 2520

aagccaacct gataaatcat aacctgactc aggagcaggt gatggaagcc gcattgagga 2580

gcgaacatca tgtcgaaaag caatccgtct gaagtgaaat tggccgtacc gacatccggt 2640

ggcttctccg ggctgaaatc actgaatttg caggtcttcg tgatgattgc agctatcatc 2700

gcaatcatgc tgttctttac ctggaccacc gatggtgcct acttaagcgc ccgtaacgtc 2760

tccaacctgt tacgccagac cgcgattacc ggcatcctcg cggtaggaat ggtgttcgtc 2820

ataatttctg ctgaaatcga cctttccgtc ggctcaatga tggggctgtt aggtggcgtc 2880

gcggcgattt gtgacgtctg gttaggctgg cctttgccac ttaccatcat tgtgacgctg 2940

gttctgggac tgcttctcgg tgcctggaac ggatggtggg tcgcgtaccg taaagtccct 3000

tcatttattg tcaccctcgc gggcatgttg gcatttcgcg gcatactcat tggcatcacc 3060

aacggcacga ctgtatcccc caccagcgcc gcgatgtcac aaattgggca aagctatctc 3120

cccgccagta ccggcttcat cattggcgcg cttggcttaa tggcttttgt tggttggcaa 3180

tggcgcggaa gaatgcgccg tcaggctttg ggtttacagt ctccggcctc taccgcagta 3240

gtcggtcgcc aggctttaac cgctatcatc gtattaggcg caatctggct gttgaatgat 3300

taccgtggcg ttcccactcc tgttctgctg ctgacgttgc tgttactcgg cggaatgttt 3360

atggcaacgc ggacggcatt tggacgacgc atttatgcca tcggcggcaa tctggaagca 3420

gcacgtctct ccgggattaa cgttgaacgc accaaacttg ccgtgttcgc gattaacgga 3480

ttaatggtag ccatcgccgg attaatcctt agttctcgac ttggcgctgg ttcaccttct 3540

gcgggaaata tcgccgaact ggacgcaatt gcagcatgcg tgattggcgg caccagcctg 3600

gctggcggtg tgggaagcgt tgccggagca gtaatggggg catttatcat ggcttcactg 3660

gataacggca tgagtatgat ggatgtaccg accttctggc agtatatcgt taaaggtgcg 3720

attctgttgc tggcagtatg gatggactcc gcaaccaaac gccgttcttg a 3771

<210> 3

<211> 2849

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgcaagcct attttgacca gctcgatcgc gttcgttatg aaggctcaaa atcctcaaac 60

ccgttagcat tccgtcacta caatcccgac gaactggtgt tgggtaagcg tatggaagag 120

cacttgcgtt ttgccgcctg ctactggcac accttctgct ggaacggggc ggatatgttt 180

ggtgtggggg cgtttaatcg tccgtggcag cagcctggtg aggcactggc gttggcgaag 240

cgtaaagcag atgtcgcatt tgagtttttc cacaagttac atgtgccatt ttattgcttc 300

cacgatgtgg atgtttcccc tgagggcgcg tcgttaaaag agtacatcaa taattttgcg 360

caaatggttg atgtcctggc aggcaagcaa gaagagagcg gcgtgaagct gctgtgggga 420

acggccaact gctttacaaa ccctcgctac ggcgcgggtg cggcgacgaa cccagatcct 480

gaagtcttca gctgggcggc aacgcaagtt gttacagcga tggaagcaac ccataaattg 540

ggcggtgaaa actatgtcct gtggggcggt cgtgaaggtt acgaaacgct gttaaatacc 600

gacttgcgtc aggagcgtga acaactgggc cgctttatgc agatggtggt tgagcataaa 660

cataaaatcg gtttccaggg cacgttgctt atcgaaccga aaccgcaaga accgaccaaa 720

catcaatatg attacgatgc cgcgacggtc tatggcttcc tgaaacagtt tggtctggaa 780

aaagagatta aactgaacat tgaagctaac cacgcgacgc tggcaggtca ctctttccat 840

catgaaatag ccaccgccat tgcgcttggc ctgttcggtt ctgtcgacgc caaccgtggc 900

gatgcgcaac tgggctggga caccgaccag ttcccgaaca gtgtggaaga gaatgcgctg 960

gtgatgtatg aaattctcaa agcaggcggt ttcaccaccg gtggtctgaa cttcgatgcc 1020

aaagtacgtc gtcaaagtac tgataaatat gatctgtttt acggtcatat cggcgcgatg 1080

gatacgatgg cactggcgct gaaaattgca gcgcgcatga ttgaagatgg cgagctggat 1140

aaacgcatcg cgcagcgtta ttccggctgg aatagcgaat tgggccagca aatcctgaaa 1200

ggccaaatgt cactggcaga tttagccaaa tatgctcagg aacatcattt gtctccggtg 1260

catcagagtg gtcgccagga acaactggaa aatctggtaa accattatct gttcgacaaa 1320

taacggctaa ctgtgcagtc cgttggcccg gttatcggta gcgataccgg gcattttttt 1380

aaggaacgat cgatatgtat atcgggatag atcttggcac ctcgggcgta aaagttattt 1440

tgctcaacga gcagggtgag gtggttgctg cgcaaacgga aaagctgacc gtttcgcgcc 1500

cgcatccact ctggtcggaa caagacccgg aacagtggtg gcaggcaact gatcgcgcaa 1560

tgaaagctct gggcgatcag cattctctgc aggacgttaa agcattgggt attgccggcc 1620

agatgcacgg agcaaccttg ctggatgctc agcaacgggt gttacgccct gccattttgt 1680

ggaacgacgg gcgctgtgcg caagagtgca ctttgctgga agcgcgagtt ccgcaatcgc 1740

gggtgattac cggcaacctg atgatgcccg gatttactgc gcctaaattg ctatgggttc 1800

agcggcatga gccggagata ttccgtcaaa tcgacaaagt attattaccg aaagattact 1860

tgcgtctgcg tatgacgggg gagtttgcca gcgatatgtc tgacgcagct ggcaccatgt 1920

ggctggatgt cgcaaagcgt gactggagtg acgtcatgct gcaggcttgc gacttatctc 1980

gtgaccagat gcccgcatta tacgaaggca gcgaaattac tggtgctttg ttacctgaag 2040

ttgcgaaagc gtggggtatg gcgacggtgc cagttgtcgc aggcggtggc gacaatgcag 2100

ctggtgcagt tggtgtggga atggttgatg ctaatcaggc aatgttatcg ctggggacgt 2160

cgggggtcta ttttgctgtc agcgaagggt tcttaagcaa gccagaaagc gccgtacata 2220

gcttttgcca tgcgctaccg caacgttggc atttaatgtc tgtgatgctg agtgcagcgt 2280

cgtgtctgga ttgggccgcg aaattaaccg gcctgagcaa tgtcccagct ttaatcgctg 2340

cagctcaaca ggctgatgaa agtgccgagc cagtttggtt tctgccttat ctttccggcg 2400

agcgtacgcc acacaataat ccccaggcga agggggtttt ctttggtttg actcatcaac 2460

atggccccaa tgaactggcg cgagcagtgc tggaaggcgt gggttatgcg ctggcagatg 2520

gcatggatgt cgtgcatgcc tgcggtatta aaccgcaaag tgttacgttg attgggggcg 2580

gggcgcgtag tgagtactgg cgtcagatgc tggcggatat cagcggtcag cagctcgatt 2640

accgtacggg gggggatgtg gggccagcac tgggcgcagc aaggctggcg cagatcgcgg 2700

cgaatccaga gaaatcgctc attgaattgt tgccgcaact accgttagaa cagtcgcatc 2760

taccagatgc gcagcgttat gccgcttatc agccacgacg agaaacgttc cgtcgcctct 2820

atcagcaact tctgccatta atggcgtaa 2849

<210> 4

<211> 678

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atgaaacagt atttgattgc cccctcaatt ctgtcggctg attttgcccg cctgggtgaa 60

gataccgcaa aagccctggc agctggcgct gatgtcgtgc attttgacgt catggataac 120

cactatgttc ccaatctgac gattgggcca atggtgctga aatccttgcg taactatggc 180

attaccgccc ctatcgacgt acacctgatg gtgaaacccg tcgatcgcat tgtgcctgat 240

ttcgctgccg ctggtgccag catcattacc tttcatccag aagcctccga gcatgttgac 300

cgcacgctgc aactgattaa agaaaatggc tgtaaagcgg gtctggtatt taacccggcg 360

acacctctga gctatctgga ttacgtgatg gataagctgg atgtgatcct gctgatgtcc 420

gtcaaccctg gtttcggcgg tcagtctttc attcctcaaa cactggataa actgcgcgaa 480

gtacgtcgcc gtatcgacga gtctggcttt gacattcgac tagaagtgga cggtggcgtg 540

aaggtgaaca acattggcga aatcgctgcg gcgggcgcgg atatgttcgt cgccggttcg 600

gcaatcttcg accagccaga ctacaaaaaa gtcattgatg aaatgcgcag tgaactggca 660

aaggtaagtc atgaataa 678

<210> 5

<211> 1992

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atgtcctcac gtaaagagct tgccaatgct attcgtgcgc tgagcatgga cgcagtacag 60

aaagccaaat ccggtcaccc gggtgcccct atgggtatgg ctgacattgc cgaagtcctg 120

tggcgtgatt tcctgaaaca caacccgcag aatccgtcct gggctgaccg tgaccgcttc 180

gtgctgtcca acggccacgg ctccatgctg atctacagcc tgctgcacct caccggttac 240

gatctgccga tggaagaact gaaaaacttc cgtcagctgc actctaaaac tccgggtcac 300

ccggaagtgg gttacaccgc tggtgtggaa accaccaccg gtccgctggg tcagggtatt 360

gccaacgcag tcggtatggc gattgcagaa aaaacgctgg cggcgcagtt taaccgtccg 420

ggccacgaca ttgtcgacca ctacacctac gccttcatgg gcgacggctg catgatggaa 480

ggcatctccc acgaagtttg ctctctggcg ggtacgctga agctgggtaa actgattgca 540

ttctacgatg acaacggtat ttctatcgat ggtcacgttg aaggctggtt caccgacgac 600

accgcaatgc gtttcgaagc ttacggctgg cacgttattc gcgacatcga cggtcatgac 660

gcggcatcta tcaaacgcgc agtagaagaa gcgcgcgcag tgactgacaa accttccctg 720

ctgatgtgca aaaccatcat cggtttcggt tccccgaaca aagccggtac ccacgactcc 780

cacggtgcgc cgctgggcga cgctgaaatt gccctgaccc gcgaacaact gggctggaaa 840

tatgcgccgt tcgaaatccc gtctgaaatc tatgctcagt gggatgcgaa agaagcaggc 900

caggcgaaag aatccgcatg gaacgagaaa ttcgctgctt acgcgaaagc ttatccgcag 960

gaagccgctg aatttacccg ccgtatgaaa ggcgaaatgc cgtctgactt cgacgctaaa 1020

gcgaaagagt tcatcgctaa actgcaggct aatccggcga aaatcgccag ccgtaaagcg 1080

tctcagaatg ctatcgaagc gttcggtccg ctgttgccgg aattcctcgg cggttctgct 1140

gacctggcgc cgtctaacct gaccctgtgg tctggttcta aagcaatcaa cgaagatgct 1200

gcgggtaact acatccacta cggtgttcgc gagttcggta tgaccgcgat tgctaacggt 1260

atctccctgc acggtggctt cctgccgtac acctccacct tcctgatgtt cgtggaatac 1320

gcacgtaacg ccgtacgtat ggctgcgctg atgaaacagc gtcaggtgat ggtttacacc 1380

cacgactcca tcggtctggg cgaagacggc ccgactcacc agccggttga gcaggtcgct 1440

tctctgcgcg taaccccgaa catgtctaca tggcgtccgt gtgaccaggt tgaatccgcg 1500

gtcgcgtgga aatacggtgt tgagcgtcag gacggcccga ccgcactgat cctctcccgt 1560

cagaacctgg cgcagcagga acgaactgaa gagcaactgg caaacatcgc gcgcggtggt 1620

tatgtgctga aagactgcgc cggtcagccg gaactgattt tcatcgctac cggttcagaa 1680

gttgaactgg ctgttgctgc ctacgaaaaa ctgactgccg aaggcgtgaa agcgcgcgtg 1740

gtgtccatgc cgtctaccga cgcatttgac aagcaggatg ctgcttaccg tgaatccgta 1800

ctgccgaaag cggttactgc acgcgttgct gtagaagcgg gtattgctga ctactggtac 1860

aagtatgttg gcctgaacgg tgctatcgtc ggtatgacca ccttcggtga atctgctccg 1920

gcagagctgc tgtttgaaga gttcggcttc actgttgata acgttgttgc gaaagcaaaa 1980

gaactgctgt aa 1992

<210> 6

<211> 660

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atgacgcagg atgaattgaa aaaagcagta ggatgggcgg cacttcagta tgttcagccc 60

ggcaccattg ttggtgtagg tacaggttcc accgccgcac actttattga cgcgctcggt 120

acaatgaaag gccagattga aggggccgtt tccagttcag atgcttccac tgaaaaactg 180

aaaagcctcg gcattcacgt ttttgatctc aacgaagtcg acagccttgg catctacgtt 240

gatggcgcag atgaaatcaa cggccacatg caaatgatca aaggcggcgg cgcggcgctg 300

acccgtgaaa aaatcattgc ttcggttgca gaaaaattta tctgtattgc agacgcttcc 360

aagcaggttg atattctggg taaattcccg ctgccagtag aagttatccc gatggcacgt 420

agtgcagtgg cgcgtcagct ggtgaaactg ggcggtcgtc cggaataccg tcagggcgtg 480

gtgaccgata atggcaacgt gatcctcgac gtccacggca tggaaatcct tgacccgata 540

gcgatggaaa acgccataaa tgcgattcct ggcgtggtga ctgttggctt gtttgctaac 600

cgtggcgcgg acgttgcgct gattggcaca cctgacggtg tcaaaaccat tgtgaaatga 660

<210> 7

<211> 954

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atgacggaca aattgacctc ccttcgtcag tacaccaccg tagtggccga cactggggac 60

atcgcggcaa tgaagctgta tcaaccgcag gatgccacaa ccaacccttc tctcattctt 120

aacgcagcgc agattccgga ataccgtaag ttgattgatg atgctgtcgc ctgggcgaaa 180

cagcagagca acgatcgcgc gcagcagatc gtggacgcga ccgacaaact ggcagtaaat 240

attggtctgg aaatcctgaa actggttccg ggccgtatct caactgaagt tgatgcgcgt 300

ctttcctatg acaccgaagc gtcaattgcg aaagcaaaac gcctgatcaa actctacaac 360

gatgctggta ttagcaacga tcgtattctg atcaaactgg cttctacctg gcagggtatc 420

cgtgctgcag aacagctgga aaaagaaggc atcaactgta acctgaccct gctgttctcc 480

ttcgctcagg ctcgtgcttg tgcggaagcg ggcgtgttcc tgatctcgcc gtttgttggc 540

cgtattcttg actggtacaa agcgaatacc gataagaaag agtacgctcc ggcagaagat 600

ccgggcgtgg tttctgtatc tgaaatctac cagtactaca aagagcacgg ttatgaaacc 660

gtggttatgg gcgcaagctt ccgtaacatc ggcgaaattc tggaactggc aggctgcgac 720

cgtctgacca tcgcaccggc actgctgaaa gagctggcgg agagcgaagg ggctatcgaa 780

cgtaaactgt cttacaccgg cgaagtgaaa gcgcgtccgg cgcgtatcac tgagtccgag 840

ttcctgtggc agcacaacca ggatccaatg gcagtagata aactggcgga aggtatccgt 900

aagtttgcta ttgaccagga aaaactggaa aaaatgatcg gcgatctgct gtaa 954

<210> 8

<211> 966

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

atgacaaagt atgcattagt cggtgatgtg ggcggcacca acgcacgtct tgctctgtgt 60

gatattgcca gtggtgaaat ctcgcaggct aagacctatt cagggcttga ttaccccagc 120

ctcgaagcgg tcattcgcgt ttatcttgaa gaacataagg tcgaggtgaa agacggctgt 180

attgccatcg cttgcccaat taccggtgac tgggtggcga tgaccaacca tacctgggcg 240

ttctcaattg ccgaaatgaa aaagaatctc ggttttagcc atctggaaat tattaacgat 300

tttaccgctg tatcgatggc gatcccgatg ctgaaaaaag agcatctgat tcagtttggt 360

ggcgcagaac cggtcgaagg taagcctatt gcggtttacg gtgccggaac ggggcttggg 420

gttgcgcatc tggtccatgt cgataagcgt tgggtaagct tgccaggcga aggcggtcac 480

gttgattttg cgccgaatag tgaagaagag gccattatcc tcgaaatatt gcgtgcggaa 540

attggtcatg tttcggcgga gcgcgtgctt tctggccctg ggctggtgaa tttgtatcgc 600

gcaattgtga aagctgacaa ccgcctgcca gaaaatctca agccaaaaga tattaccgaa 660

cgcgcgctgg ctgacagctg caccgattgc cgccgcgcat tgtcgctgtt ttgcgtcatt 720

atgggccgtt ttggcggcaa tctggcgctc aatctcggga catttggcgg cgtgtttatt 780

gcgggcggta tcgtgccgcg cttccttgag ttcttcaaag cctccggttt ccgtgccgca 840

tttgaagata aagggcgctt taaagaatat gtccatgata ttccggtgta tctcatcgtc 900

catgacaatc cgggccttct cggttccggt gcacatttac gccagacctt aggtcacatt 960

ctgtaa 966

<210> 9

<211> 102

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

gacauuccgc guuauauggc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

<210> 10

<211> 552

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

cctggctgcc atctttactg gcgttgtgct gtccttcatt tggccgccga ttggttctgc 60

aatccagacc ttctctcagt gggctgctta ccagaacccg gtagttgcgt ttggcattta 120

cggtttcatc gaacgttgcc tggtaccgtt tggtctgcac cacatctgga acgtaccttt 180

ccagatgcag attggtgaat acaccaacgc agcaggtcag gttttccacg gcgacattcc 240

gcgttatatg gcgggtgacc cgactgcggg taaactgtct ggtggcttcc tgttcaaaat 300

gtacggtctg ccagctgccg caattgctat ctggcactct gctaaaccag aaaaccgcgc 360

gaaagtgggc ggtattatga tctccgcggc gctgacctcg ttcctgaccg gtatcaccga 420

gccgatcgag ttctccttca tgttcgttgc gccgatcctg tacatcatcc acgcgattct 480

ggcaggcctg gcattcccaa tctgtattct tctggggatg cgtgacggta cgtcgttctc 540

gcacggtctg at 552

<210> 11

<211> 902

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

actctcaatt atgtttaaga atgcatttgc taacctgcaa aaggtcggta aatcgctgat 60

gctgccggta tccgtactgc ctatcgcagg tattctgctg ggcgtcggtt ccgcgaattt 120

cagctggctg cccgccgttg tatcgcatgt tatggcagaa gcaggcggtt ccgtctttgc 180

aaacatgcca ctgatttttg cgatcggtgt cgccctcggc tttaccaata acgatggcgt 240

atccgcgctg gccgcagttg ttgcctatgg catcatggtt aaaaccatgg ccgtggttgc 300

gccactggta ctgcatttac ctgctgaaga aatcgcctct aaacacctgg cggatactgg 360

cgtactcgga gggattatct ccggtgcgat cgcagcgtac atgtttaacc gtttctaccg 420

tattaagctg cctgagtatc ttggcttctt tgccggtaaa cgctttgtgc cgatcatttc 480

tggcgacttc atcgttctgt ctggtaacag cagcaaactg tggctgttcc cgatcgtcgg 540

tatcggttat gcgattgttt actacaccat cttccgcgtg ctgattaaag cactggatct 600

gaaaacgccg ggtcgtgaag acgcgactga agatgcaaaa gcgacaggta ccagcgaaat 660

ggcaccggct ctggttgctg catttggtgg taaagaaaac attactaacc tcgacgcatg 720

tattacccgt ctgcgcgtca gcgttgctga tgtgtctaaa gtggatcagg ccggcctgaa 780

gaaactgggc gcagcgggcg tagtggttgc tggttctggt gttcaggcga ttttcggtac 840

taaatccgat aacctgaaaa ccgagatgga tgagtacatc cgtaaccact aatccgtaag 900

ac 902

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt g 41

<210> 13

<211> 102

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

acgauugauu uuuugcgucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

<210> 14

<211> 251

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

ctgtagtgac catgaccgtc actgcacaaa tgcttaacgg tcatcaaagt tgccacggcg 60

ggcagctatt ttcactggct gatactgcct ttgcctacgc ctgcaatagc caggggctgg 120

cagccgtcgc ttctgcctgc acgattgatt ttttgcgtcc aggctttgcc ggagacacct 180

taactgctac tgcgcaggta cgtcatcagg gcaagcaaac cggtgtttac gacatcgaaa 240

ttgttaacca a 251

<210> 15

<211> 3870

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

gggctgcatt tttttaaccc ggcaccggtg atgaagttgg tggaggtggt cagtgggctg 60

gcaacggcgg cggaagttgt tgagcagttg tgtgaactaa cgttgagttg gggtaagcag 120

cctgtgcgct gtcattcgac tcctggattt atcgttaacc gtgttgcgcg tccttattat 180

tccgaggcct ggcgggcact ggaagagcag gttgctgcac cagaagtgat tgacgctgca 240

cttcgcgatg gcgctggttt cccgatgggg ccgctggaat taaccgatct gattggtcag 300

gacgtcaatt ttgctgtcac ctgttcggtg tttaacgctt tctggcagga gcgtcgtttt 360

ttaccttcgc tggtgcaaca ggaactggtg attggtggac ggttgggcaa gaaaagtggg 420

ctgggcgtgt acgactggcg cgcggaacgt gaggcagttg ttggcctgga agcggtaagc 480

gacagtttta gcccaatgaa agtagaaaag aaaagtgacg gtgtcacgga aattgacgat 540

gttttattga ttgagacaca aggcgagacg gcacaggcgc tggcaatacg actggcacgc 600

ccggtggtag tgatcgataa aatggcgggc aaggtggtga ccattgctgc tgcagcggtg 660

aacccggact cagcgacccg caaggccatt tattacctgc aacagcaggg caaaacagtg 720

ctgcaaattg cagattaccc aggaatgctg atttggcgaa cggtagcaat gatcatcaat 780

gaagcccttg atgcgcttca aaaaggcgtg gcctctgaac aggatatcga taccgccatg 840

cgtcttgggg tgaattatcc atatggccca cttgcctggg gagcgcaact tggctggcag 900

cgaatattaa ggctccttga aaatctacag catcactatg gcgaagaacg ctatcgccca 960

tgttcattgc tgcgccaacg ggcgcttctg gagagcggtt atgagtcata aggcctggca 1020

aaatgcccat gcaatgtatg agaacgatgc ctgcgccaaa gcgcttggca tcgacattat 1080

ctcaatggat gaaggctttg tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt 1140

gctcgagtca gaatggtcta aggcaggtct gaatgaatac ccagtataat tccagttata 1200

tattttcgat taccttagtc gctacattag gtggtttatt atttggctac gacaccgccg 1260

ttatttccgg tactgttgag tcactcaata ccgtctttgt tgctccacaa aacttaagtg 1320

aatccgctgc caactccctg ttagggtttt gcgtggccag cgctctgatt ggttgcatca 1380

tcggcggtgc cctcggtggt tattgcagta accgcttcgg tcgtcgtgat tcacttaaga 1440

ttgctgctgt cctgtttttt atttctggtg taggttctgc ctggccagaa cttggtttta 1500

cctctataaa cccggacaac actgtgcctg tttatctggc aggttatgtc ccggaatttg 1560

ttatttatcg cattattggc ggtattggcg ttggtttagc ctcaatgctc tcgccaatgt 1620

atattgcgga actggctcca gctcatattc gcgggaaact ggtctctttt aaccagtttg 1680

cgattatttt cgggcaactt ttagtttact gcgtaaacta ttttattgcc cgttccggtg 1740

atgccagctg gctgaatact gacggctggc gttatatgtt tgcctcggaa tgtatccctg 1800

cactgctgtt cttaatgctg ctgtataccg tgccagaaag tcctcgctgg ctgatgtcgc 1860

gcggcaagca agaacaggcg gaaggtatcc tgcgcaaaat tatgggcaac acgcttgcaa 1920

ctcaggcagt acaggaaatt aaacactccc tggatcatgg ccgcaaaacc ggtggtcgtc 1980

tgctgatgtt tggcgtgggc gtgattgtaa tcggcgtaat gctctccatc ttccagcaat 2040

ttgtcggcat caatgtggtg ctgtactacg cgccggaagt gttcaaaacg ctgggggcca 2100

gcacggatat cgcgctgttg cagaccatta ttgtcggagt tatcaacctc accttcaccg 2160

ttctggcaat tatgacggtg gataaatttg gtcgtaagcc actgcaaatt atcggcgcac 2220

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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tgccagcgat gttatgttga cgcgctgtga gctgaccagc gaggcgaagg cggcagaagc 4620

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ctggtagata tggagatcct gtatgtactc cctcactctg aaacgacacc gcactctttt 4260

tttctccctc gcccctccgg ggagagggcc ggggtgaggg gaaaaggccg cactgctcac 4320

caattttctg ctatcctgcc cccgcactaa gggggcagta tgctaaacat cgtactttac 4380

gaaccagaaa ttccgccaaa tactggcaac atcatccgtc tttgcgctaa taccggcttt 4440

cgtctgcata tcatcgaacc gatgggattt gcctgggacg ataagcgcct gcgccgcgcg 4500

gggctggact atcacgagtt taccgccgtt acgcgtcatc atgactatcg cgcgttcctc 4560

gaagcagaaa atccccagcg cctgttcgcc ctcaccacga aaggtacacc tgctcacagc 4620

gccgtaagct atcaggatgg cgattatctg atgttcggcc cggaaacacg cggcctgcca 4680

gcgagcattc ttgatgccct gcccgctgaa caaaaaattc gcattccgat ggtgccggac 4740

agccgcagca tgaatctgtc caatgcggtg tcggtagtgg tgtatgaagc ctggcggcag 4800

ttggggtatc cgggagcggt attgagagat tagttactgt aggccggata gatgattaca 4860

tcgcatccgg cacgatcaca ggacattaga tcccatcccc atactcaaat gtatggttaa 4920

taccgttgaa atgctggtcc atatccattg atggcttatc gctgtctggt ttaccgacaa 4980

tacgagccgg aacgccagcg gcggtggtat gcggcggcac cggttgcagc accacggaac 5040

ctgcgccaat cttcgcgccg cgcccaactt caatattgcc gaggattttc gcgcccgcgc 5100

caatcatcac accttcacga attttcgggt gacggtcacc accagattta cccgtaccgc 5160

ca 5162

<210> 22

<211> 102

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

gagaucauug cuccgcucuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

<210> 23

<211> 537

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

tgaaatctct ggtttccgac gacaagaagg ataccggaac tattgagatc attgctccgc 60

tctctggcga gatcgtcaat atcgaagacg tgccggatgt cgtttttgcg gaaaaaatcg 120

ttggtgatgg tattgctatc aaaccaacgg gtaacaaaat ggtcgcgcca gtagacggca 180

ccattggtaa aatctttgaa accaaccacg cattctctat cgaatctgat agcggcgttg 240

aactgttcgt ccacttcggt atcgacaccg ttgaactgaa aggcgaaggc ttcaagcgta 300

ttgctgaaga aggtcagcgc gtgaaagttg gcgatactgt cattgaattt gatctgccgc 360

tgctggaaga gaaagccaag tctaccctga ctccggttgt tatctccaac atggacgaaa 420

tcaaagaact gatcaaactg tccggtagcg taaccgtggg tgaaaccccg gttatccgca 480

tcaagaagta attcttgccg cagtgaaaaa tggcgcccat cggcgccatt tttttat 537

<210> 24

<211> 4134

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

aattgaaatc ggcgtaatgg tggaaacacc ggctgccgca acaattgcac gtcatttagc 60

caaagaagtt gatttcttta gtatcggcac caatgattta acgcagtaca ctctggcagt 120

tgaccgtggt aatgatatga tttcacacct ttaccagcca atgtcaccgt ccgtgctgaa 180

cttgatcaag caagttattg atgcttctca tgctgaaggc aaatggactg gcatgtgtgg 240

tgagcttgct ggcgatgaac gtgctacact tctgttgctg gggatgggtc tggacgaatt 300

ctctatgagc gccatttcta tcccgcgcat taagaagatt atccgtaaca cgaacttcga 360

agatgcgaag gtgttagcag agcaggctct tgctcaaccg acaacggacg agttaatgac 420

gctggttaac aagttcattg aagaaaaaac aatctgctaa tccacgagat gcggcccaat 480

ttactgctta ggagaagatc atgggtttgt tcgataaact gttgacaatt aatcatcggc 540

tcgtataatg tgtggaattg ctcgagttct caaggagaag cggatgaaac agtatttgat 600

tgccccctca attctgtcgg ctgattttgc ccgcctgggt gaagataccg caaaagccct 660

ggcagctggc gctgatgtcg tgcattttga cgtcatggat aaccactatg ttcccaatct 720

gacgattggg ccaatggtgc tgaaatcctt gcgtaactat ggcattaccg cccctatcga 780

cgtacacctg atggtgaaac ccgtcgatcg cattgtgcct gatttcgctg ccgctggtgc 840

cagcatcatt acctttcatc cagaagcctc cgagcatgtt gaccgcacgc tgcaactgat 900

taaagaaaat ggctgtaaag cgggtctggt atttaacccg gcgacacctc tgagctatct 960

ggattacgtg atggataagc tggatgtgat cctgctgatg tccgtcaacc ctggtttcgg 1020

cggtcagtct ttcattcctc aaacactgga taaactgcgc gaagtacgtc gccgtatcga 1080

cgagtctggc tttgacattc gactagaagt ggacggtggc gtgaaggtga acaacattgg 1140

cgaaatcgct gcggcgggcg cggatatgtt cgtcgccggt tcggcaatct tcgaccagcc 1200

agactacaaa aaagtcattg atgaaatgcg cagtgaactg gcaaaggtaa gtcatgaata 1260

aaagggcgtg cccttcatca tccgatctgg agtcaaaatg tcctcacgta aagagcttgc 1320

caatgctatt cgtgcgctga gcatggacgc agtacagaaa gccaaatccg gtcacccggg 1380

tgcccctatg ggtatggctg acattgccga agtcctgtgg cgtgatttcc tgaaacacaa 1440

cccgcagaat ccgtcctggg ctgaccgtga ccgcttcgtg ctgtccaacg gccacggctc 1500

catgctgatc tacagcctgc tgcacctcac cggttacgat ctgccgatgg aagaactgaa 1560

aaacttccgt cagctgcact ctaaaactcc gggtcacccg gaagtgggtt acaccgctgg 1620

tgtggaaacc accaccggtc cgctgggtca gggtattgcc aacgcagtcg gtatggcgat 1680

tgcagaaaaa acgctggcgg cgcagtttaa ccgtccgggc cacgacattg tcgaccacta 1740

cacctacgcc ttcatgggcg acggctgcat gatggaaggc atctcccacg aagtttgctc 1800

tctggcgggt acgctgaagc tgggtaaact gattgcattc tacgatgaca acggtatttc 1860

tatcgatggt cacgttgaag gctggttcac cgacgacacc gcaatgcgtt tcgaagctta 1920

cggctggcac gttattcgcg acatcgacgg tcatgacgcg gcatctatca aacgcgcagt 1980

agaagaagcg cgcgcagtga ctgacaaacc ttccctgctg atgtgcaaaa ccatcatcgg 2040

tttcggttcc ccgaacaaag ccggtaccca cgactcccac ggtgcgccgc tgggcgacgc 2100

tgaaattgcc ctgacccgcg aacaactggg ctggaaatat gcgccgttcg aaatcccgtc 2160

tgaaatctat gctcagtggg atgcgaaaga agcaggccag gcgaaagaat ccgcatggaa 2220

cgagaaattc gctgcttacg cgaaagctta tccgcaggaa gccgctgaat ttacccgccg 2280

tatgaaaggc gaaatgccgt ctgacttcga cgctaaagcg aaagagttca tcgctaaact 2340

gcaggctaat ccggcgaaaa tcgccagccg taaagcgtct cagaatgcta tcgaagcgtt 2400

cggtccgctg ttgccggaat tcctcggcgg ttctgctgac ctggcgccgt ctaacctgac 2460

cctgtggtct ggttctaaag caatcaacga agatgctgcg ggtaactaca tccactacgg 2520

tgttcgcgag ttcggtatga ccgcgattgc taacggtatc tccctgcacg gtggcttcct 2580

gccgtacacc tccaccttcc tgatgttcgt ggaatacgca cgtaacgccg tacgtatggc 2640

tgcgctgatg aaacagcgtc aggtgatggt ttacacccac gactccatcg gtctgggcga 2700

agacggcccg actcaccagc cggttgagca ggtcgcttct ctgcgcgtaa ccccgaacat 2760

gtctacatgg cgtccgtgtg accaggttga atccgcggtc gcgtggaaat acggtgttga 2820

gcgtcaggac ggcccgaccg cactgatcct ctcccgtcag aacctggcgc agcaggaacg 2880

aactgaagag caactggcaa acatcgcgcg cggtggttat gtgctgaaag actgcgccgg 2940

tcagccggaa ctgattttca tcgctaccgg ttcagaagtt gaactggctg ttgctgccta 3000

cgaaaaactg actgccgaag gcgtgaaagc gcgcgtggtg tccatgccgt ctaccgacgc 3060

atttgacaag caggatgctg cttaccgtga atccgtactg ccgaaagcgg ttactgcacg 3120

cgttgctgta gaagcgggta ttgctgacta ctggtacaag tatgttggcc tgaacggtgc 3180

tatcgtcggt atgaccacct tcggtgaatc tgctccggca gagctgctgt ttgaagagtt 3240

cggcttcact gttgataacg ttgttgcgaa agcaaaagaa ctgctgtaat tagcatttcg 3300

ggtaaaaagg tcgcttcggc gacctttttt attaccttga tatgtccgtt tgcggacaag 3360

caatagataa ggcgtgttgt agatcacaaa tatttatatg caataaatat caattatgta 3420

atatgcatca cgatatgcgt attgacattt gttgttatat ctataactca atgttatata 3480

agaaattaat aattcactgt tttcaaaaca ccggtttccc tgctcaattg ctttcattaa 3540

accgcacgag tattttattt ttaccgccgg acggtacccg cttccgccag cggcggcaaa 3600

atcaattcat cgctctcatg ctgctgggtg tagcgcatca cttccagtac gcgcaacccc 3660

gctcggtgca ctgcatcggt taacgccttc cctttcagca agccactgat gagctgagca 3720

caaaacaggt cgccagtccc tttcaggtcg gtttttaccc gtgaatggga aatgacattc 3780

acgctgtcgg cagtgaccac cacaacctgc atctcctgat tttcttcatt accggaggcg 3840

ctggtaacca ccacccattt taatgtgtct gaaagcagac tttttgcggc agcaatggca 3900

ctgtcgagat cgcggcaatt tttaccggtc aggatttcca actcaaagat attgggggta 3960

attccctgcg ccagcggcag taaatattgt cgatacgctt cgggaaggtc aggtttgaca 4020

taaattccgc tattcaatat cgccaatcac cggatcgacc atgatcaata ggtcaggatg 4080

gtctttgcgt agcgcagtca gccactcggc aaggattttg atttgcgatg ccgt 4134

<210> 25

<211> 102

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

aguuguugcc uauggcauca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

<210> 26

<211> 882

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

atgtttaaga atgcatttgc taacctgcaa aaggtcggta aatcgctgat gctgccggta 60

tccgtactgc ctatcgcagg tattctgctg ggcgtcggtt ccgcgaattt cagctggctg 120

cccgccgttg tatcgcatgt tatggcagaa gcaggcggtt ccgtctttgc aaacatgcca 180

ctgatttttg cgatcggtgt cgccctcggc tttaccaata acgatggcgt atccgcgctg 240

gccgcagttg ttgcctatgg catcatggtt aaaaccatgg ccgtggttgc gccactggta 300

ctgcatttac ctgctgaaga aatcgcctct aaacacctgg cggatactgg cgtactcgga 360

gggattatct ccggtgcgat cgcagcgtac atgtttaacc gtttctaccg tattaagctg 420

cctgagtatc ttggcttctt tgccggtaaa cgctttgtgc cgatcatttc tggcgacttc 480

atcgttctgt ctggtaacag cagcaaactg tggctgttcc cgatcgtcgg tatcggttat 540

gcgattgttt actacaccat cttccgcgtg ctgattaaag cactggatct gaaaacgccg 600

ggtcgtgaag acgcgactga agatgcaaaa gcgacaggta ccagcgaaat ggcaccggct 660

ctggttgctg catttggtgg taaagaaaac attactaacc tcgacgcatg tattacccgt 720

ctgcgcgtca gcgttgctga tgtgtctaaa gtggatcagg ccggcctgaa gaaactgggc 780

gcagcgggcg tagtggttgc tggttctggt gttcaggcga ttttcggtac taaatccgat 840

aacctgaaaa ccgagatgga tgagtacatc cgtaaccact aa 882

<210> 27

<211> 3397

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

attattatta cacgccggaa actaaagtac gtcagcaaga gtccttcatc catcatatcc 60

agattggtcg tgaactgaac aagccggtta tcgtccatac ccgtgacgcc cgtgccgata 120

cgctggcaat tctgcgcgaa gaaaaagtga cggattgcgg tggcgtacta cactgtttta 180

cagaggacag agaaacggcg ggtaaattac tggatctcgg attttacatc tccttttccg 240

gcattgtgac cttccgtaat gcggagcaac tgcgcgatgc tgcgcgttat gtccccctgg 300

atcggttact ggtggaaact gactcacctt accttgcgcc ggtaccgcat cgaggaaaag 360

agaatcaacc tgcgatggtt cgtgacgttg cagaatacat ggctgtgttg aaaggtgttg 420

ccgttgaaga actggcgcag gtaaccaccg ataacttcgc ccgtctgttt cacatcgacg 480

cttcccgcct tcaatccatc cgttgaatga gtttttttaa agctcgtaat taatggctaa 540

aacgagtaaa gttcaccgcc gaaaattggg cggtgaataa ccacgtttga aatattgtga 600

catatgtttt gtcaaaatgt gcaacttctc caatgatctg aagttgaaac gtgatagccg 660

tcaaacaaat tggcactgaa ttattttact ctgtgtaata aataaagggc gcttagatgc 720

cctgtacacg gcgaggctct ccccccttgc cacgcgtgag aacgtaaaaa aagcacccat 780

actcaggagc actctcaatt tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt 840

gctcgagtca taccacaggc gaaacgatca tgacgcagga tgaattgaaa aaagcagtag 900

gatgggcggc acttcagtat gttcagcccg gcaccattgt tggtgtaggt acaggttcca 960

ccgccgcaca ctttattgac gcgctcggta caatgaaagg ccagattgaa ggggccgttt 1020

ccagttcaga tgcttccact gaaaaactga aaagcctcgg cattcacgtt tttgatctca 1080

acgaagtcga cagccttggc atctacgttg atggcgcaga tgaaatcaac ggccacatgc 1140

aaatgatcaa aggcggcggc gcggcgctga cccgtgaaaa aatcattgct tcggttgcag 1200

aaaaatttat ctgtattgca gacgcttcca agcaggttga tattctgggt aaattcccgc 1260

tgccagtaga agttatcccg atggcacgta gtgcagtggc gcgtcagctg gtgaaactgg 1320

gcggtcgtcc ggaataccgt cagggcgtgg tgaccgataa tggcaacgtg atcctcgacg 1380

tccacggcat ggaaatcctt gacccgatag cgatggaaaa cgccataaat gcgattcctg 1440

gcgtggtgac tgttggcttg tttgctaacc gtggcgcgga cgttgcgctg attggcacac 1500

ctgacggtgt caaaaccatt gtgaaatgat aaagagaaat actatcatga cggacaaatt 1560

gacctccctt cgtcagtaca ccaccgtagt ggccgacact ggggacatcg cggcaatgaa 1620

gctgtatcaa ccgcaggatg ccacaaccaa cccttctctc attcttaacg cagcgcagat 1680

tccggaatac cgtaagttga ttgatgatgc tgtcgcctgg gcgaaacagc agagcaacga 1740

tcgcgcgcag cagatcgtgg acgcgaccga caaactggca gtaaatattg gtctggaaat 1800

cctgaaactg gttccgggcc gtatctcaac tgaagttgat gcgcgtcttt cctatgacac 1860

cgaagcgtca attgcgaaag caaaacgcct gatcaaactc tacaacgatg ctggtattag 1920

caacgatcgt attctgatca aactggcttc tacctggcag ggtatccgtg ctgcagaaca 1980

gctggaaaaa gaaggcatca actgtaacct gaccctgctg ttctccttcg ctcaggctcg 2040

tgcttgtgcg gaagcgggcg tgttcctgat ctcgccgttt gttggccgta ttcttgactg 2100

gtacaaagcg aataccgata agaaagagta cgctccggca gaagatccgg gcgtggtttc 2160

tgtatctgaa atctaccagt actacaaaga gcacggttat gaaaccgtgg ttatgggcgc 2220

aagcttccgt aacatcggcg aaattctgga actggcaggc tgcgaccgtc tgaccatcgc 2280

accggcactg ctgaaagagc tggcggagag cgaaggggct atcgaacgta aactgtctta 2340

caccggcgaa gtgaaagcgc gtccggcgcg tatcactgag tccgagttcc tgtggcagca 2400

caaccaggat ccaatggcag tagataaact ggcggaaggt atccgtaagt ttgctattga 2460

ccaggaaaaa ctggaaaaaa tgatcggcga tctgctgtaa tcattcttag cgtgaccggg 2520

aagtcggtca cgctacctct tctgaagcct gtctgtcact cccttcgcag tgtatcattc 2580

tgtttaacga gactgtttcc gtaagacgtt ggggagacta aggcagccag atggctgcct 2640

tttttacagg tgttattcag aattgatacg tgccggtaat gctgaaatta cgcggtgtgc 2700

cgtagacgat agaaccttcc acgttggtat cgtaggtttt gtcgaacagg ttattgacgt 2760

tcccctgtaa cgagaagttt ttcgtcacct ggtagcgggt gaagagatcc accagcgcgt 2820

agctaccttg ctcggcgcgg aaggtgccat acggcgtcac ggtgtcggta tacacgcgat 2880

tttgccagtt aacaccaccg ccgaccgtca actctggcat gacaggcaac cgatagctgg 2940

tgaacatttt aaccgtggtg cgtggcagat taggattaac ggcgtttcct tcgttatcct 3000

ctgcaatata gcgcgttgcg ccaaatgtca gctgccagtt gtcggtaatt gcgccgttga 3060

gttcaaattc caccccttta ctgactgtcc catccaccgc tttataggcg gtttcgccgt 3120

tgctgccggg gataggtgta ccggtggact gagcgacatt atcctgctca atacggaaga 3180

tggctaacgt ggtggtcaga cggctattca tccagtccga tttcagaccc agctcgtagt 3240

tgttaccggt gattggagcc agatatttgc ctgaactgtc acgatcattt tgcggctgga 3300

aaatagaggt atagctggcg taggtcgacc agttgtcatt gatgtcaaac accagaccag 3360

cgtaaggcgt ggtgtggttt ttctccatgc tgtaagt 3397

<210> 28

<211> 102

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 28

ggcgaugacc aaccauaccu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

<210> 29

<211> 966

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 29

atgacaaagt atgcattagt cggtgatgtg ggcggcacca acgcacgtct tgctctgtgt 60

gatattgcca gtggtgaaat ctcgcaggct aagacctatt cagggcttga ttaccccagc 120

ctcgaagcgg tcattcgcgt ttatcttgaa gaacataagg tcgaggtgaa agacggctgt 180

attgccatcg cttgcccaat taccggtgac tgggtggcga tgaccaacca tacctgggcg 240

ttctcaattg ccgaaatgaa aaagaatctc ggttttagcc atctggaaat tattaacgat 300

tttaccgctg tatcgatggc gatcccgatg ctgaaaaaag agcatctgat tcagtttggt 360

ggcgcagaac cggtcgaagg taagcctatt gcggtttacg gtgccggaac ggggcttggg 420

gttgcgcatc tggtccatgt cgataagcgt tgggtaagct tgccaggcga aggcggtcac 480

gttgattttg cgccgaatag tgaagaagag gccattatcc tcgaaatatt gcgtgcggaa 540

attggtcatg tttcggcgga gcgcgtgctt tctggccctg ggctggtgaa tttgtatcgc 600

gcaattgtga aagctgacaa ccgcctgcca gaaaatctca agccaaaaga tattaccgaa 660

cgcgcgctgg ctgacagctg caccgattgc cgccgcgcat tgtcgctgtt ttgcgtcatt 720

atgggccgtt ttggcggcaa tctggcgctc aatctcggga catttggcgg cgtgtttatt 780

gcgggcggta tcgtgccgcg cttccttgag ttcttcaaag cctccggttt ccgtgccgca 840

tttgaagata aagggcgctt taaagaatat gtccatgata ttccggtgta tctcatcgtc 900

catgacaatc cgggccttct cggttccggt gcacatttac gccagacctt aggtcacatt 960

ctgtaa 966

<210> 30

<211> 1000

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 30

cgcagagggc ggaaccggtg cgccgatcag cggttcacag gcggggtctg gtccggcatg 60

accctggctg aaacggataa ccaaccccac cgcaataccc gttagcgtta atacaccgat 120

gatccagagg ggtgaatcct gggctatccc cagagttccc ggcagtcgtt gccagagcaa 180

attctgtaat accgaggcga ttttcatcac cacaatcaga ataagactgg acgcaatccc 240

aattgccacg gcggggagcg ataataacaa catggttctg gctcgcggat ggagcatgtt 300

ctattcctta tgcggggtca gatacttagt ttgcccagct tgcaaaaagg catcgctgca 360

attggtgctg aaacgataaa gtaattgtgt gacccagatc gatatttaca gggagcctgc 420

ctttccggcg ttgttgttat gcccccaggt atttacagtg tgagaaagaa ttattttgac 480

tttagcggag cagttgaaga atccttcctt ttatatcggg aggtaactct cccgataatc 540

ttttaaatca tacagtttat tcaatttttc tttgtgtccc ctcacaaggt cgacctgcgt 600

cacacttccg tacagcggga ttaattctcc agtaaatgca ttatttgtct ggtaacggcg 660

atttgttttg cacgttcata atttcactcg tcaactatca ctgaacgagg aattaacgat 720

gagtaagaaa ctgattgcct tatgtgcctg cccgatgggc ctggctcaca cctttatggc 780

cgctcaggcg ctggaagaag cggcggtaga agccggttat gaagtgaaaa ttgaaaccca 840

gggcgcggac ggtatccaga atcgcctgac ggcgcaggat atcgccgaag cgaccatcat 900

catccactcc gtggcagtta ccccggaaga taacgaacgt ttcgaatcac gcgacgttta 960

tgaaatcact ttgcaggacg caattaaaaa cgctgcgggc 1000

Claims (11)

1.一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：提高生产丁醇的出发菌中木糖转运和代谢相关基因xylE、xylFGH、xylA、xylB、rpe、tktA、rpiA、talB的表达和/或活性，且抑制所述出发菌中的glk基因表达得到的菌；

所述提高生产丁醇的出发菌中木糖转运和代谢相关基因xylE、xylFGH、xylA、xylB、rpe、tktA、rpiA、talB的表达和/或活性为增加所述出发菌的基因组中xylE、xylFGH、xylA、 xylB、rpe、tktA、rpiA和talB的拷贝数；

所述增加出发菌的基因组中xylE、xylFGH、xylA、xylB、rpe、tktA、rpiA和talB的拷贝数为将含有xylE基因和其启动子的同源片段替换出发菌中的paaI基因，且将含有xylFGH基因和其启动子的同源片段替换出发菌中的ykgF基因，且将含有xylA、xylB基因和其启动子的同源片段替换出发菌中的lldD基因，且将含有rpe与tktA形成的融合基因和其启动子的同源片段替换出发菌中的crr基因，且将含有rpiA与talB形成的融合基因的同源片段和其启动子替换出发菌中的ptsG基因；

且，所述抑制出发菌中的glk基因表达为敲除或抑制出发菌中的glk基因；

所述出发菌为以葡萄糖为碳源生产丁醇的大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述各基因的启动子均为组成型启动子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述组成型启动子具体为miniPtac启动子，其核苷酸序列为序列表中序列12。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：

所述敲除和替换均采用基因组定点编辑和同源重组的方式进行。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于：

所述基因组定点编辑为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑。

6.由权利要求1-5中任一所述方法制备的重组菌。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌的保藏号为CGMCC No.17141。

8.权利要求6或7所述重组菌在以木糖为碳源生产丁醇中的应用。

9.一种菌剂，包括权利要求6或7所述重组菌和以葡萄糖为碳源生产丁醇的大肠杆菌。

10.权利要求9所述菌剂在利用木糖和葡萄糖生产丁醇中的应用；

或，权利要求9所述菌剂在发酵生物质或其水解液生产丁醇中的应用。

11.一种生产丁醇的方法，包括如下步骤：以木糖为碳源发酵权利要求6或7所述重组菌或权利要求9所述菌剂；

或，一种生产丁醇的方法，包括如下步骤：以木糖和葡萄糖为碳源发酵权利要求9所述菌剂；

或，一种生产丁醇的方法，包括如下步骤：以生物质或其水解液为碳源发酵权利要求9所述菌剂。

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