CN113234655B - 利用木糖生产聚-3-羟基丁酸酯的重组细菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用木糖生产聚‑3‑羟基丁酸酯的重组细菌及其制备方法和应用。该重组细菌能够利用木糖生产聚‑3‑羟基丁酸酯。该重组细菌可为表达木糖异构酶、木糖转运蛋白酶、D‑塔格糖‑3‑差向异构酶、醛缩酶和岩藻糖激酶的重组细菌RB‑XTP‑DAK‑xylA、表达木糖异构酶和D‑塔格糖‑3‑差向异构酶、醛缩酶和岩藻糖激酶的重组细菌RB‑DAK‑xylA、表达木糖异构酶和木糖转运蛋白酶的重组细菌RB‑XTP‑xylA或表达木糖异构酶的重组细菌RB‑xylA。本发明的重组细菌能够利用木糖为碳源合成聚‑3‑羟基丁酸酯，对木糖的利用可以为降低生产聚‑3‑羟基丁酸酯原料的成本提供一个很好地选择。

Description

利用木糖生产聚-3-羟基丁酸酯的重组细菌及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及利用木糖生产聚-3-羟基丁酸酯的重组细菌及其制备方法和应用。

背景技术

Halomonas sp.TD01是从中国新疆盐湖中分离出来的嗜盐细菌，在高pH和高盐浓度下能良好生长。Halomonas sp.TD01可用作开放和连续发酵培养，降低发酵过程的复杂性，减少灭菌的能耗。2011年，研究人员报道了利用Halomonas sp.TD01来降低聚羟基脂肪酸酯的生产成本(Unsterile and continuous production of polyhydroxybutyrate byHalomonas TD01，Bioresource Technology,2011，102(17):8130-8136)。近十年来，人们开发了一系列对Halomonas sp.TD01进行遗传改造的分子生物学工具，以此为基础对其进行代谢工程改造，使得聚羟基脂肪酸酯的产量有了较大的提高，并且合成出多种不同单体组成和比例的聚酯材料，利用细胞形态工程还能够控制细胞的形态和生长速率，使得Halomonas sp.TD01成为生产聚羟基脂肪酸酯的明星宿主。

随着社会经济的发展和科学技术的进步，绿色、低碳、环保和可持续的发展理念已经成为国际社会的共识。石油和煤炭等化石资源的消耗一方面造成了大量二氧化碳排放，另一方面也伴随着严重的环境污染问题。白色垃圾污染问题愈演愈烈，2021年正式实施的“限塑令”给发展生物可降解材料带来了发展机遇。聚羟基脂肪酸酯是一种具有良好应用前景的生物可降解高分子材料，利用Halomonas sp.TD01转化生物可再生资源来生产聚羟基脂肪酸，成为目前科学界和产业界关注的热点。

已有的研究大多使用淀粉来源的葡萄糖为碳源来合成聚羟基脂肪酸酯，存在与人争粮、与粮争地的问题。木质纤维素是目前天然可利用的最丰富的可再生资源，木糖作为木质纤维素生物质中第二丰富的单糖在微生物发酵中的应用却存在不足，只有一小部分的微生物能够直接利用木糖，且转化为产品的效率较低。

Halomonas sp.TD01野生菌能够利用葡萄糖在细胞内合成聚-3-羟基丁酸酯(Poly-3-hydroxybutyrate，PHB)，但是细菌培养实验和基因组数据分析都表明，Halomonassp.TD01野生菌不能够摄取木糖作碳源生长。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，如何利用木糖生产聚-3-羟基丁酸酯。

为解决上述技术问题，本发明提供重组细菌，所述重组细菌能够利用木糖生产聚-3-羟基丁酸酯。

本发明所提供的重组细菌包含如下几种：重组细菌RB-XTP-DAK-xylA、重组细菌RB-DAK-xylA、重组细菌RB-XTP-xylA或重组细菌RB-xylA，

所述重组细菌RB-XTP-DAK-xylA为表达木糖异构酶、木糖转运蛋白酶、D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶和岩藻糖激酶的重组细菌；所述重组细菌RB-DAK-xylA为表达所述木糖异构酶和D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶和岩藻糖激酶的重组细菌；所述重组细菌RB-XTP-xylA为表达所述木糖异构酶和木糖转运蛋白酶的重组细菌；所述重组细菌RB-xylA为表达所述木糖异构酶的重组细菌。

其中，XTP表示木糖转运蛋白酶，本发明的具体实施方式中列举了4种木糖转运蛋白酶，所述4种木糖转运蛋白酶分别是名称为HEO0208、xylE、xylFGH和araE；DAK代表D-塔格糖-3-差向异构酶DTE、醛缩酶FucA和岩藻糖激酶FucK；xylA代表木糖异构酶。

上述木糖异构酶xylA可选自下述任一种蛋白质：

X1)由编码序列(CDS)是SEQ ID No.5的第236-1558位的核苷酸序列编码的蛋白质；

X2)将X1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与X1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有木糖异构酶活性的蛋白质；

X3)在X1)或X2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述木糖转运蛋白酶名称分别是HEO0208、xylE、xylFGH或araE的蛋白质，

所述HEO0208可选自下述任一种蛋白质：

B11)由编码序列(CDS)是SEQ ID No.1的第230-1636位的核苷酸序列编码的蛋白质；

B12)将B11)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B11)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有木糖转运蛋白酶活性的蛋白质；

B13)在B11)或B12)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述xylE选自下述任一种蛋白质：

B21)由编码序列(CDS)是SEQ ID No.2的第230-1705位的核苷酸序列编码的蛋白质；

B22)将B21)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B21)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有木糖转运蛋白酶活性的蛋白质；

B23)在B21)或B22)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述xylFGH选自下述任一种蛋白质：

B31)由编码序列(CDS)是SEQ ID No.3的第230-4000位的核苷酸序列编码的蛋白质；

B32)将B31)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B31)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有木糖转运蛋白酶活性的蛋白质；

B33)在B31)或B32)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述araE选自下述任一种蛋白质：

B41)由编码序列(CDS)是SEQ ID No.4的第230-1624位的核苷酸序列编码的蛋白质；

B42)将B41)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B41)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有木糖转运蛋白酶活性的蛋白质；

B43)在B41)或B42)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述D-塔格糖-3-差向异构酶选自下述任一种蛋白质：

D1)由编码序列(CDS)是SEQ ID No.6的第214-1086位的核苷酸序列编码的蛋白质；

D2)将D1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有D-塔格糖-3-差向异构酶活性的蛋白质；

D3)在D1)或D2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述醛缩酶选自下述任一种蛋白质：

A1)由编码序列(CDS)是SEQ ID No.6的第1126-1773位的核苷酸序列编码的蛋白质；

A2)将A1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有醛缩酶活性的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述岩藻糖激酶选自下述任一种蛋白质：

K1)由编码序列(CDS)是SEQ ID No.6的第1811-3259位的核苷酸序列编码的蛋白质；

K2)将K1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与K1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有岩藻糖激酶活性的蛋白质；

K3)在K1)或K2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

本发明还提供上述重组细菌的构建方法，所述重组细菌的构建方法为下述任一种：

P1、所述重组细菌RB-XTP-DAK-xylA的构建方法包括将所述木糖异构酶的编码基因、所述木糖转运蛋白酶的编码基因、所述D-塔格糖-3-差向异构酶的编码基因、所述醛缩酶的编码基因和所述岩藻糖激酶的编码基因导入受体菌得到表达所述木糖异构酶、所述木糖转运蛋白酶、所述D-塔格糖-3-差向异构酶、所述醛缩酶和所述岩藻糖激酶的重组细菌；

P2、所述重组细菌RB-DAK-xylA的构建方法包括将所述木糖异构酶的编码基因、所述D-塔格糖-3-差向异构酶的编码基因、所述醛缩酶的编码基因和所述岩藻糖激酶的编码基因导入所述受体菌，得到表达所述木糖异构酶、所述D-塔格糖-3-差向异构酶、所述醛缩酶和所述岩藻糖激酶的重组细菌；

P3、所述重组细菌RB-XTP-xylA的构建方法包括将所述木糖异构酶的编码基因和所述木糖转运蛋白酶的编码基因导入所述受体菌得到表达所述木糖异构酶和木糖转运蛋白酶的重组细菌；

P4、所述重组细菌RB-xylA的构建方法包括将所述木糖异构酶的编码基因导入所述受体菌得到表达所述木糖异构酶的重组细菌。

上述重组细菌受体菌可为下述任一种微生物：

M1)细菌；

M2)革兰氏阴性细菌；

M3)盐单胞菌属细菌；

M4)盐单胞菌Halomonas sp.TD01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.4353。

上述木糖异构酶的编码基因xylA基因可选自x1)-x3)任一种：

x1)核苷酸序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；

x2)编码链的编码序列是SEQ ID No.5的第236-1558位所示的DNA分子；

x3)与x1)或x2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码具有木糖异构酶功能的蛋白质的DNA分子；

上述木糖转运蛋白酶的编码基因名称分别是HEO0208基因、xylE基因、xylFGH基因或araE基因，

所述HEO0208基因可选自b11)-b13)中任一种：

b11)核苷酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；

b12)编码链的编码序列是SEQ ID No.1的第230-1636位所示的DNA分子；

b13)与b1)或b2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码具有木糖转运蛋白酶功能的蛋白质的DNA分子；

所述xylE基因可选自b21)-b23)中任一种：

b21)核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

b22)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的第230-1705位所示的DNA分子；

b23)与21)或b22)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码具有木糖转运蛋白酶功能的蛋白质的DNA分子。

所述xylFGH基因可选自b31)-b33)中任一种：

b31)核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；

b32)编码链的编码序列是SEQ ID No.3的第230-4000所示的DNA分子；

b33)与b31)或b32)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码具有木糖转运蛋白酶功能的蛋白质的DNA分子；

所述araE基因可选自b41)-b43)中任一种：

b41)核苷酸序列是SEQ ID No.4所示的DNA分子；

b42)编码链的编码序列是SEQ ID No.4的第230-1624位所示的DNA分子；

b43)与b41)或b42)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码具有木糖转运蛋白酶功能的蛋白质的DNA分子；

上述D-塔格糖-3-差向异构酶的编码基因DTE基因可为d1)或d2)中任一种

d1)编码链的编码序列是SEQ ID No.6的第214-1086位所示的DNA分子；

d2)与d1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码具有D-塔格糖-3-差向异构酶功能的蛋白质的DNA分子；

上述醛缩酶的编码基因FucA基因为a1)或a2)中任一种：

a1)编码链的编码序列是SEQ ID No.6的第1126-1773位所示的DNA分子；

a2)与a1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码具有醛缩酶功能的蛋白质的DNA分子；

上述岩藻糖激酶的编码基因FucK基因为k1)或k2)中任一种：

k1)编码链的编码序列是SEQ ID No.6的第1811-3259位所示的DNA分子；

k2)与k1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码具有岩藻糖激酶功能的蛋白质的DNA分子。

上述DNA分子中，所述DNA的“同一性”或是“序列同一性的百分比”是通过在比较窗口比较两个最优比对的序列来确定的，其中最优比对提供最高级别的配对并且能够在检验或参照的序列当中引入核苷酸添加。同一性百分比是通过计算测试序列和参考序列在整条序列中的每一个位置上一致的核苷酸的百分比来确定的。最佳的序列比对和百分比同一性可以手工测定，或是更优选的通过计算机的运算法则，其包括但不限于TBLASTN，FASTA，GAP，BESTFIT，和CLUSTALW(Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215(3)：403-10；Pearsonand Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-8；Thompson，et al.，1994，Nucleic Acids Res.22(22)：4673-80；Devereux et al.，1984，Nuc.Acids.Res.12：387-395；Higgins，et al.，1996，Methods Enzymol.266：383-402)。优选的，设置在默认的参数的NCBI Blast Server(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)用于搜索多个数据库来寻找同源的序列。

上述DNA分子中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

P1和P2中，所述D-塔格糖-3-差向异构酶的编码基因、所述醛缩酶的编码基因和所述岩藻糖激酶的编码基因通过核苷酸序列是SEQ ID No.6的表达盒导入。

P1和P3中，所述木糖转运蛋白酶的编码基因分别通过核苷酸序列是SEQ ID No.1-4的表达盒导入。

P2和P4中，所述木糖异构酶的编码基因通过核苷酸序列是SEQ ID No.5的表达盒导入。

本发明还提供上述重组细菌在生产聚-3-羟基丁酸酯中的应用。

上述应用包含使用上述重组细菌和木糖生产聚-3-羟基丁酸酯。

上述应用中，木糖可作为所述重组细菌的唯一碳源。

本发明还提供一种生产聚-3-羟基丁酸酯的方法，所述方法包括使用上述重组细菌和木糖产生聚-3-羟基丁酸酯。

本发明的实验结果证明：通过向盐单胞菌Halomonas sp.TD01引入木糖异构酶或引入木糖异构酶和木糖转运蛋白，得到的重组细菌TD01/pSEVA341S-xylA和TD01/pSEVA341S-HEO0208/xylE/xylFGH/araE-xylA能够利用木糖作为碳源生产聚-3-羟基丁酸酯。

在表达木糖异构酶的基础上,进一步表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激的重组细菌TD01/pSEVA341S-DAK-xylA细胞干重和PHB产量都有了明显提高。在表达木糖异构酶和木糖转运蛋白的基础上，进一步表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶的重组细菌TD01/pSEVA341S-DAK-HEO0208/xylE/xylFGH/araE-xylA细胞干重和PHB产量都有了明显提高。这说明重组细菌的木糖代谢途径较为高效，表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶、木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌能够利用木糖作为碳源生产聚-3-羟基丁酸酯，且聚酯产量在摇瓶中具有显著成效。

本发明构建了能够利用木糖为碳源合成聚-3-羟基丁酸酯的重组细菌，对木糖的利用可以为降低生产聚-3-羟基丁酸酯原料的成本提供一个很好地选择，进一步改造也可利用重组细菌合成聚-3-羟基丁酸酯以外的其他高分子材料和平台化合物。

附图说明

图1为pSEVA341S-HEO0208/xylE/xylFGH/araE载体图谱。

图2为pSEVA341S-HEO0208/xylE/xylFGH/araE-xylA载体图谱。

图3为pSEVA341S-xylA载体图谱。

图4为pSEVA341S-DAK-HEO0208/xylE/xylFGH/araE-xylA载体图谱。

图5为pSEVA341S-DAK-xylA载体图谱。

图6为表达不同木糖转运蛋白的重组细菌发酵生物量变化图。

图7为表达不同木糖转运蛋白的重组细菌发酵木糖消耗图。

图8为表达木糖异构酶的重组细菌以及表达木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌发酵生物量变化图。

图9为表达木糖异构酶的重组细菌以及表达木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌发酵木糖消耗图。

图10为表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶和木糖异构酶的重组细菌以及表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶、木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌发酵生物量变化图。

图11为表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶和木糖异构酶的重组细菌以及表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶、木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌发酵木糖消耗图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。聚羟基脂肪酸酯标品购于Sigma-Aldrich，货号为403121，产品名称为聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)，其中3-羟基丁酸单体含量为88mol％，3-羟基戊酸单体含量为12mol％。下述实施例中涉及分子生物学操作所用的酶均购于NEB(New England Biolabs)公司；质粒提取、DNA片段回收所用的试剂盒购自北京博迈德；实施例中涉及的DNA合成和测序工作由华大基因完成。质粒pSEVA341S由DNA序列通过基因合成的方法获得。

下述实施例中的60LB-Amp-Spec液体培养基的组成为：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、60g/L NaCl、0.1g/L氨苄青霉素，0.1g/L大观霉素，其余为水；下述实施例中的60LB-Amp-Spec固体培养基为60LB-Amp-Spec液体培养基基础上添加15g琼脂/L。

下述实施例中的60MMX-Amp-Spec液体培养基的组成为：每升培养基含10g/L木糖、60g/L NaCl、0.5g/L酵母提取物、1g/L NH4Cl、0.2g/L MgSO4、9.65g/LNa2HPO4·12H2O、1.5g/L KH2PO4、0.1g/L氨苄青霉素、0.1g/L大观霉素、10mL微量元素溶液I，1mL微量元素溶液II，余量为水。其中木糖的浓度可以按照需要调整。所述微量元素溶液I的组成如下：每升微量元素溶液含5g/L Fe(III)-NH4-Citrate、2g/L CaCl2、1M HCl，其余为水。所述微量元素溶液II的组成如下：每升微量元素溶液含0.1g/L ZnSO4·7H2O、0.03g/L MnCl2·4H2O、0.3g/L H3BO3、0.2g/L CoCl2·6H2O、0.01g/L CuSO4·5H2O、0.02g/L NiCl2·6H2O、0.03g/L NaMoO4·2H2O，其余为水。

下述实施例中木糖转运蛋白酶(Xylose transport protease)总代号为XTP，下述实施例中共列举了4种木糖转运蛋白酶，分别是HEO0208、xylE、xylFGH和araE；下述实施例中木糖异构酶代号为xylA，D-塔格糖-3-差向异构酶代号为DTE、醛缩酶代号为FucA、岩藻糖激酶代号为FucK，DTE、FucA、FucK三种酶总代号为DAK。

下述实施例所用的盐单胞菌(Halomonas sp.TD01)，已于2010年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4353，已被2012年10月10日公告的授权公告号为CN 102120973 B的中国发明专利申请公开。

盐单胞菌Halomonas sp.TD01不表达如下蛋白质：木糖异构酶、木糖转运蛋白酶、D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶和岩藻糖激酶。

实施例1、构建表达不同木糖转运蛋白XTP的重组细菌

1.1、重组表达载体pSEVA341S-HEO0208、pSEVA341S-xylE、pSEVA341S-xylFGH和pSEVA341S-araE的构建

(1)人工合成序列表中序列1-4所示的DNA，其中序列1-4第23-203位核苷酸为启动子序列(Pdc)，序列1第230-1636位核苷酸为HEO0208基因的编码序列，序列2第230-1705位核苷酸为xylE基因的编码序列，序列3第230-4000位核苷酸为xylFGH基因的编码序列，序列4第230-1624位核苷酸为araE基因的编码序列。

(2)用Hind III和BamH I双酶切序列1-4，分别回收大小约为1.6kb、1.7kb、4kb和1.6kb的基因片段。

(3)用Hind III和BamH I双酶切载体pSEVA341S(其核苷酸序列是序列7)，回收大小约为5kb的载体片段。

(4)将步骤(2)得到的DNA片段分别与步骤(3)得到的载体片段连接，得到重组表达载体pSEVA341S-HEO0208、pSEVA341S-xylE、pSEVA341S-xylFGH和pSEVA341S-araE(图1)。

重组表达载体pSEVA341S-HEO0208是用核苷酸序列是序列1的第7-1636位的DNA替换pSEVA341S的Hind III识别位点间和BamH I识别位点间的片段(Hind III识别位点间和BamH I识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质HEO0208的重组表达载体。pSEVA341S-HEO0208含有核苷酸序列是序列1的HEO0208基因表达盒，序列1的第230-1636位是HEO0208基因的编码链的编码序列(CDS)。

重组表达载体pSEVA341S-xylE是用核苷酸序列是序列2的第7-1705位的DNA替换pSEVA341S的Hind III识别位点间和BamH I识别位点间的片段(Hind III识别位点间和BamH I识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质xylE的重组表达载体。pSEVA341S-xylE含有核苷酸序列是序列2的xylE基因表达盒，序列2的第230-1705位是xylE基因的编码链的编码序列(CDS)。

重组表达载体pSEVA341S-xylFGH是用核苷酸序列是序列3的第7-4000位的DNA替换pSEVA341S的Hind III识别位点间和BamH I识别位点间的片段(Hind III识别位点间和BamH I识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质xylFGH的重组表达载体。pSEVA341S-xylFGH含有核苷酸序列是序列3的xylFGH基因表达盒，序列3的第230-4000位是xylFGH基因的编码链的编码序列(CDS)。

重组表达载体pSEVA341S-araE是用核苷酸序列是序列4的第7-1624位的DNA替换pSEVA341S的Hind III识别位点间和BamH I识别位点间的片段(Hind III识别位点间和BamH I识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质araE的重组表达载体。pSEVA341S-araE含有核苷酸序列是序列4的araE基因表达盒，序列4的第230-1624位是araE基因的编码链的编码序列(CDS)。

1.2、表达不同木糖转运蛋白XTP的重组细菌的构建

将上述步骤1得到的重组表达载体pSEVA341S-HEO0208、pSEVA341S-xylE、pSEVA341S-xylFGH和pSEVA341S-araE通过接合转化到盐单胞菌Halomonas sp.TD01中，并涂布于60LB-Amp-Spec固体培养基，37℃培养36-48h，通过菌落PCR验证将正确的菌株保存甘油管存放在-80℃冰箱中，得到表达不同木糖转运蛋白的重组细菌。

将pSEVA341S-HEO0208导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-HEO0208。所述TD01/pSEVA341S-HEO0208含有序列1第7-1636位的DNA分子，表达蛋白质HEO0208。

将pSEVA341S-xylE导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-xylE。所述TD01/pSEVA341S-xylE含有序列2第7-1705位的DNA分子，表达蛋白质xylE；

将pSEVA341S-xylFGH导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-xylFGH。所述TD01/pSEVA341S-xylFGH含有序列3第7-4000位的DNA分子，表达蛋白质xylFGH；

将pSEVA341S-araE导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-araE。所述TD01/pSEVA341S-araE含有序列4第7-1624位的DNA分子，表达蛋白质araE。

实施例2、构建表达木糖异构酶的重组细菌以及表达木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌

2.1、重组表达载体pSEVA341S-HEO0208-xylA、pSEVA341S-xylE-xylA、pSEVA341S-xylFGH-xylA和pSEVA341S-araE-xylA的构建

(1)人工合成序列表中序列5所示的DNA，其中序列5第23-203位核苷酸为启动子序列(Pdc)，第236-1558位核苷酸为xylA基因的编码链的编码序列。

(2)用BamHI和AvrII双酶切步骤(1)中合成的DNA序列，回收大小约为1.3kb的基因片段。

(3)用BamHI和AvrII分别双酶切实施例1中的载体pSEVA341S-HEO0208、pSEVA341S-xylE、pSEVA341S-xylFGH、pSEVA341S-araE，回收大小约为6.6kb、6.7kb、9kb和6.6kb的载体片段。

(4)将步骤(2)得到的DNA片段分别与步骤(3)得到的载体片段连接，得到重组表达载体pSEVA341S-HEO0208-xylA、pSEVA341S-xylE-xylA、pSEVA341S-xylFGH-xylA和pSEVA341S-araE-xylA(图2)。

重组表达载体pSEVA341S-HEO0208-xylA是用核苷酸序列是序列5的第210-1558位的DNA替换pSEVA341S-HEO0208的BamHI识别位点间和AvrII识别位点间的片段(BamH I识别位点间和AvrII识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S-HEO0208的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质HEO0208和蛋白质xylA的重组表达载体。pSEVA341S-HEO0208-xylA含有表达HEO0208基因和xylA基因的表达盒，其中：启动子序列(Pdc)是序列1第23-203位，HEO0208基因的编码链的编码序列(CDS)是序列1的第230-1636位；xylA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列5的第236-1558位。

重组表达载体pSEVA341S-xylE-xylA是用核苷酸序列是序列5的第210-1558位的DNA替换pSEVA341S-xylE的BamHI识别位点间和AvrII识别位点间的片段(BamH I识别位点间和AvrII识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S-xylE的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质xylE和蛋白质xylA的重组表达载体。pSEVA341S-xylE-xylA含有表达xylE基因和xylA基因的表达盒，其中：启动子序列(Pdc)是序列2第23-203位，xylE基因的编码链的编码序列(CDS)是序列2的第230-1705位；xylA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列5的第236-1558位。

重组表达载体pSEVA341S-xylFGH-xylA是用核苷酸序列是序列5的第210-1558位的DNA替换pSEVA341S-xylFGH的BamHI识别位点间和AvrII识别位点间的片段(BamH I识别位点间和AvrII识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S-xylFGH的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质xylFGH和蛋白质xylA的重组表达载体。pSEVA341S-xylFGH-xylA含有表达xylFGH基因和xylA基因的表达盒，其中：启动子序列(Pdc)是序列3第23-203位，xylFGH基因的编码链的编码序列(CDS)是序列3的第230-4000位；xylA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列5的第236-1558位。

重组表达载体pSEVA341S-araE-xylA是用核苷酸序列是序列5的第210-1558位的DNA替换pSEVA341S-araE的BamHI识别位点间和AvrII识别位点间的片段(BamH I识别位点间和AvrII识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S-araE的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质araE和蛋白质xylA的重组表达载体。pSEVA341S-araE-xylA含有表达araE基因和xylA基因的表达盒，其中：启动子序列(Pdc)是序列4第23-203位，araE基因的编码链的编码序列(CDS)是序列4的第230-1624位；xylA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列5的第236-1558位。

2.2重组表达载体pSEVA341S-xylA的构建

用Hind III和AvrII双酶切序列5，回收大小约为1.5kb的基因片段；用Hind III和AvrII双酶切pSEVA341S，回收大小约为5kb的载体片段；将上述两个DNA片段连接，得到重组表达载体pSEVA341S-xylA(图3)

重组表达载体pSEVA341S-xylA是用核苷酸序列是序列5的第7-1558位的DNA替换pSEVA341S的Hind III识别位点间和AvrII识别位点间的片段(Hind III识别位点间和AvrII识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质xylA的重组表达载体。pSEVA341S-xylA含有核苷酸序列是序列5的xylA基因表达盒，其中：启动子序列(Pdc)是序列5第23-203位，xylA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列5的第236-1558位。

2.3、表达木糖异构酶的重组细菌以及表达木糖异构酶和木糖转运蛋白的重组细菌的构建

将上述步骤2.1和2.2得到的重组表达载体pSEVA341S-HEO0208-xylA、pSEVA341S-xylE-xylA、pSEVA341S-xylFGH-xylA、pSEVA341S-araE-xylA和pSEVA341S-xylA通过接合转化到Halomonas sp.TD01中，并涂布于60LB-Amp-Spec固体培养基，37℃培养36-48h，通过菌落PCR验证将正确的菌株保存甘油管存放在-80℃冰箱中，得到表达木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌。

将pSEVA341S-HEO0208-xylA导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-HEO0208-xylA。所述TD01/pSEVA341S-HEO0208-xylA含有序列1的第7-1636位和序列5的第210-1558位的DNA分子，表达蛋白质HEO0208和蛋白质xylA；

将pSEVA341S-xylE-xylA导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-xylE-xylA。所述TD01/pSEVA341S-xylE-xylA含有序列2第7-1705位和序列5第210-1558位的DNA分子，表达蛋白质xylE和蛋白质xylA；

将pSEVA341S-xylFGH-xylA导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-xylFGH-xylA。所述TD01/pSEVA341S-xylFGH-xylA含有序列3的第7-4000位和序列5的第210-1558位的DNA分子，表达蛋白质xylFGH和蛋白质xylA；

将pSEVA341S-araE-xylA导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-araE-xylA。所述TD01/pSEVA341S-araE-xylA含有序列4的第7-1624位和序列5的第210-1558位的DNA分子，表达蛋白质araE和蛋白质xylA；

将pSEVA341S-xylA导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-xylA。所述TD01/pSEVA341S-xylA含有序列5的第7-1558的DNA分子，表达蛋白质xylA。

实施例3、构建表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶和木糖异构酶的重组细菌以及表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶、木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌

3.1、pSEVA341S-DAK-HEO0208-xylA、pSEVA341S-DAK-xylE-xylA、pSEVA341S-DAK-xylFGH-xylA、pSEVA341S-DAK-araE-xylA和pSEVA341S-DAK-xylA的构建

(1)人工合成序列表中序列6所示的DNA序列，其中第7-187位核苷酸为启动子序列(Pdc)；第214-1086位核苷酸为DTE基因序列；第1126-1773位核苷酸为FucA基因序列；第1811-3259位核苷酸为FucK基因序列，DTE、FucA和FucK统称为DAK；

(2)用HindIII和XbaI双酶切步骤(1)中合成的DNA序列，回收大小约为3.4kb的基因片段；

(3)用HindIII和XbaI分别双酶切载体pSEVA341S-HEO0208-xylA、pSEVA341S-xylE-xylA、pSEVA341S-xylFGH-xylA、pSEVA341S-araE-xylA、pSEVA341S-xylA，回收大小约为7.9kb、8kb、10.3kb、7.9kb、6.5kb的载体片段。

(4)将步骤(2)得到的DNA片段与步骤(3)得到的载体片段连接，得到重组表达载体pSEVA341S-DAK-HEO0208-xylA、pSEVA341S-DAK-xylE-xylA、pSEVA341S-DAK-xylFGH-xylA、pSEVA341S-DAK-araE-xylA(图4)和pSEVA341S-DAK-xylA(图5)。

重组表达载体pSEVA341S-DAK-HEO0208-xylA是用核苷酸序列是序列6的第7-3435位的DNA替换pSEVA341S-HEO0208-xylA的HindIII识别位点间和XbaI识别位点间的片段(HindIII识别位点间和XbaI识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S-HEO0208-xylA的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质DTE、蛋白质FucA、蛋白质FucK、蛋白质HEO0208和蛋白质xylA的重组表达载体。pSEVA341S-DAK-HEO0208-xylA含有表达DTE基因、FucA基因、FucK基因、HEO0208基因和xylA基因的表达盒，其中：启动子序列1(Pdc)是序列6第7-187位，DTE基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第214-1086位；FucA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第1126-1773位；FucK基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第1811-3259位；启动子序列2(Pdc)是序列1第23-203位；HEO0208基因的编码链的编码序列(CDS)是序列1的第230-1636位；xylA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列5的第236-1558位。

重组表达载体pSEVA341S-DAK-xylE-xylA是用核苷酸序列是序列6的第7-3435位的DNA替换pSEVA341S-xylE-xylA的HindIII识别位点间和XbaI识别位点间的片段(HindIII识别位点间和XbaI识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S-xylE-xylA的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质DTE、蛋白质FucA、蛋白质FucK、蛋白质xylE和蛋白质xylA的重组表达载体。pSEVA341S-DAK-xylE-xylA含有表达DTE基因、FucA基因、FucK基因、xylE基因和xylA基因的表达盒，其中：启动子序列1(Pdc)是序列6第7-187位，DTE基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第214-1086位；FucA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第1126-1773位；FucK基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第1811-3259位；启动子序列2(Pdc)是序列2第23-203位；xylE基因的编码链的编码序列(CDS)是序列2的第230-1705位；xylA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列5的第236-1558位。

重组表达载体pSEVA341S-DAK-xylFGH-xylA是用核苷酸序列是序列6的第7-3435位的DNA替换pSEVA341S-xylFGH-xylA的HindIII识别位点间和XbaI识别位点间的片段(HindIII识别位点间和XbaI识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S-xylFGH-xylA的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质DTE、蛋白质FucA、蛋白质FucK、蛋白质xylFGH和蛋白质xylA的重组表达载体。pSEVA341S-DAK-xylFGH-xylA含有表达DTE基因、FucA基因、FucK基因、xylFGH基因和xylA基因的表达盒，其中：启动子序列1(Pdc)是序列6第7-187位，DTE基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第214-1086位；FucA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第1126-1773位；FucK基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第1811-3259位；启动子序列2(Pdc)是序列3第23-203位；xylFGH基因的编码链的编码序列(CDS)是序列3的第230-4000位；xylA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列5的第236-1558位。

重组表达载体pSEVA341S-DAK-araE-xylA是用核苷酸序列是序列6的第7-3435位的DNA替换pSEVA341S-araE-xylA的HindIII识别位点间和XbaI识别位点间的片段(HindIII识别位点间和XbaI识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S-araE-xylA的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质DTE、蛋白质FucA、蛋白质FucK、蛋白质araE和蛋白质xylA的重组表达载体。pSEVA341S-DAK-araE-xylA含有表达DTE基因、FucA基因、FucK基因、araE基因和xylA基因的表达盒，其中：启动子序列1(Pdc)是序列6第7-187位，DTE基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第214-1086位；FucA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第1126-1773位；FucK基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第1811-3259位；启动子序列2(Pdc)是序列4第23-203位；araE基因的编码链的编码序列(CDS)是序列4的第230-1624位；xylA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列5的第236-1558位。

重组表达载体pSEVA341S-DAK-xylA是用核苷酸序列是序列6的第7-3435位的DNA替换pSEVA341S-xylA的HindIII识别位点间和XbaI识别位点间的片段(HindIII识别位点间和XbaI识别位点间的小片段)，保持pSEVA341S-xylA的其它核苷酸序列不变，得到的表达蛋白质DTE、蛋白质FucA、蛋白质FucK、蛋白质araE和蛋白质xylA的重组表达载体。pSEVA341S-DAK-xylA含有表达DTE基因、FucA基因、FucK基因和xylA基因的表达盒，其中：启动子序列1(Pdc)是序列6第7-187位，DTE基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第214-1086位；FucA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第1126-1773位；FucK基因的编码链的编码序列(CDS)是序列6的第1811-3259位；启动子序列2(Pdc)是序列5第7-187位；xylA基因的编码链的编码序列(CDS)是序列5的第236-1558位。

3.2、表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶和木糖异构酶的重组细菌以及表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶、木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌的构建

将上述步骤1得到的重组表达载体pSEVA341S-DAK-HEO0208-xylA、pSEVA341S-DAK-xylE-xylA、pSEVA341S-DAK-xylFGH-xylA、pSEVA341S-DAK-araE-xylA和pSEVA341S-DAK-xylA通过接合转化到盐单胞菌Halomonas sp.TD01中，并涂布于60LB-Amp-Spec固体培养基，37℃培养36-48h，通过菌落PCR验证将正确的菌株保存甘油管存放在-80℃冰箱中，得到表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶、木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌。

将pSEVA341S-DAK-HEO0208-xylA导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-DAK-HEO0208-xylA，所述TD01/pSEVA341S-DAK-HEO0208-xylA含有序列1的第7-1636位、序列5的第210-1558位和序列6的第7-3435位的DNA分子，表达蛋白质HEO0208、蛋白质xylA、所述蛋白质DTE、蛋白质FucA和蛋白质FucK。

将pSEVA341S-DAK-xylE-xylA导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-DAK-xylE-xylA，所述TD01/pSEVA341S-DAK-xylE-xylA含有序列2的第7-1705位、序列5的第210-1558位和序列6的第7-3435位的DNA分子，表达蛋白质xylE、蛋白质xylA、所述蛋白质DTE、蛋白质FucA和蛋白质FucK。

将pSEVA341S-DAK-xylFGH-xylA导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-DAK-xylFGH-xylA，所述TD01/pSEVA341S-DAK-xylFGH-xylA含有序列3的第7-4000位、序列5的第210-1558位和序列6的第7-3435位的DNA分子，表达蛋白质xylFGH、蛋白质xylA、蛋白质DTE、所述蛋白质FucA和蛋白质FucK。

将pSEVA341S-DAK-araE-xylA导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-DAK-araE-xylA。所述TD01/pSEVA341S-DAK-araE-xylA含有序列4的第7-1624位、序列5的第210-1558位和序列6第7-3435位的DNA分子，表达蛋白质araE、蛋白质xylA、蛋白质DTE、蛋白质FucA和蛋白质FucK。

将pSEVA341S-DAK-xylA导入盐单胞菌Halomonas sp.TD01得到的重组细菌命名为TD01/pSEVA341S-DAK-xylA，所述TD01/pSEVA341S-DAK-xylA含有序列5的第210-1558位和序列6第7-3435位的DNA分子，表达蛋白质xylA、蛋白质DTE、蛋白质FucA和蛋白质FucK。

实施例4、表达不同木糖转运蛋白XTP的重组细菌利用木糖的摇瓶实验

4.1、发酵培养

(1)将实施例1得到的重组细菌TD01/pSEVA341S-HEO0208/xylE/xylFGH/araE在60LB-Amp-Spec液体培养基中培养，培养条件为37℃摇床、200rpm、16h，制备发酵种子液。

(2)按体积比4％的接种量将种子液接种到60MMX-Amp-Spec液体培养基中，37℃摇床、200rpm、48h，每隔12h收集适量发酵液进行生物量和木糖的测定。

(3)生物量测定

取发酵液用去离子水进行适当稀释之后，用紫外可见分光光度计测定其在600nm波长下的吸光值。

(4)通过高效液相色谱对木糖的消耗进行定量检测。具体条件如下：

仪器：岛津公司Essentia LC系列HPLC仪，配有DGU-20A脱气机，LC-16送液泵，SIL-16型自动进样器，RID-20A检测器。

色谱条件：Bio-RadHPX-87H(7.8×300mm)；流速0.60mL/min；柱温55℃；流动相为5mM硫酸水溶液。

检测方法：

取0、4、8、12、16、20g/L的木糖标准品水溶液(Sigma-Aldrich，产品编号X1500)，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测，用不同浓度的木糖标准溶液的色谱峰面积为纵坐标，不同浓度浓度为横坐标，绘制标准曲线。木糖的出峰时间为12.213min。

取2mL的发酵液，于12000rpm离心10min，将其发酵上清液转移到新离心管内，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测。将待测样品发酵上清液的木糖色谱峰面积代入上述标准曲线中，计算得到待测样品发酵上清液的残留木糖含量。

图6和图7为表达不同木糖转运蛋白的重组细菌发酵过程中生物量变化情况以及木糖消耗情况。结果显示，前12h细胞OD600nm有略微增长，达到0.6左右后不再变化；整个过程的木糖浓度没有明显变化。这说明仅表达木糖转运蛋白仍然不能使重组细菌利用木糖为碳源生长。

4.2、检测细菌胞内积累的聚合物含量

通过气相色谱法(Gas chromatography，GC)对细菌胞内的聚合物进行定量检测，测定细胞的生物量和胞内聚合物含量。具体方法如下：

4.2.1、测定细胞的生物量

发酵结束后，取约40mL发酵液，10000rpm离心10min，弃上清液后用去离子水重悬菌体进行洗涤，再次10000rpm离心10min收集菌体，将装有洗涤后菌体沉淀的离心管置于-20℃冷冻2h，再放入冷冻真空干燥机中冻干8-12h，得到冷冻干燥产物。

下述实施例中细胞干重以每升发酵液中的细胞干重计量。细胞干重的单位为g/L。细胞干重(cell dry weight，简称CDW)＝(进行冷冻干燥后的离心管的重量-原空离心管的重量)/发酵液取量；进行冷冻干燥后的离心管的重量和原空离心管的重量，单位均为g；发酵液取量单位为L。

4.2.2、测定胞内聚合物含量

采用气相色谱法测定菌体中聚-3-羟基丁酸酯的含量，具体步骤为：

取4.2.1所得冷冻干燥产物进行酯化反应，然后通过测定酯化反应后产物含量来计算；

酯化反应：取30-40mg冷冻干燥产物于酯化管中，加入2mL氯仿和2mL酯化液(该酯化液为在500mL甲醇中加入15mL浓硫酸与0.5g苯甲酸而得)混匀，加盖密闭，100℃高温中酯化4h；冷却至室温后，加入1mL去离子水，用旋涡振荡器充分振荡混匀，静置分层；待氯仿相与水完全分离后，取氯仿相1μL进行气相色谱分析。

取约20mg的聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)，采用同样的方法进行酯化反应后作为标品。

气相色谱分析参数：使用HP 6890型气相色谱仪，色谱柱为HP-5毛细管柱，柱长30m，内径320μm，固定相为25nm厚的苯基甲基聚硅氧烷；检测器为火焰离子化检测器(Flameionization detector，FID)；用高纯氮气作为载气，氢气作为燃气，空气为助燃气；

气相色谱分析的条件如下：

(1)柱温：80℃开始，停留1.5min；30℃/min的速率升温到140℃，停留0min；40℃/min的速率升温到220℃，停留1min。总计时间为6.5min。

(2)柱压：10psi开始，停留1.5min；2.5psi/min的速率升压到20psi，停留0.5min。(psi为压力单位，即磅/平方英寸，1psi＝6.89476kPa)

(3)进样口：温度为200℃，使用分流模式，分流比为30。

(4)检测器：温度为220℃，氢气流量30mL/min，空气流量400mL/min。

使用安捷伦公司的微量进样器，进样量为1μL，采用内标法对聚合物进行定量分析，根据峰面积定量。

气相色谱检测时，将冷冻干燥产物样品与聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)标品进行对比。采用上述步骤进行酯化反应和气相色谱检测，冷冻干燥产物酯化样品中含有出峰位置与标品中的3-羟基丁酸酯化标品有位置相同的信号，即表明菌体中积累的聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯。

聚-3-羟基丁酸酯产量算法为：PHB产量＝(样品中PHB峰面积/样品中内标峰面积)×[(标品中内标峰面积/标品中PHB峰面积)×(标品质量×0.866)]/样品酯化质量×细胞干重。

聚合物含量定义为聚合物占细胞干重的比值，聚合物含量＝聚合物产量/细胞干重×100％。

经过检测，各重组细菌中均没有检测到聚-3-羟基丁酸酯的积累，这与其不能利用木糖的结论一致。

实施例5、表达木糖异构酶的重组细菌以及表达木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌利用木糖的摇瓶实验

5.1、发酵培养

(1)将实施例2得到的重组细菌TD01/pSEVA341S-HEO0208/xylE/xylFGH/araE-xylA和重组细菌TD01/pSEVA341S-xylA在60LB-Amp-Spec液体培养基中培养，培养条件为37℃摇床、200rpm、16h，制备发酵种子液。

(2)按体积比4％的接种量将种子液接种到60MMX-Amp-Spec液体培养基中，37℃摇床、200rpm、48h，每隔12h收集适量发酵液进行生物量和木糖的测定。

(3)生物量测定

同实施例4第4.1小节中的(3)所示。

(4)通过高效液相色谱对木糖的消耗进行定量检测。

同实施4第4.1小节中的(4)所示。

图8和图9为表达木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的Halomonas sp.TD01重组细菌发酵过程中生物量变化情况以及木糖消耗情况。结果显示，菌株在12h以后生物量明显增加，最终OD600nm大都在2-3之间，能够利用3-5g/L的木糖。这说明，引入木糖异构酶和木糖转运蛋白的重组细菌能够利用木糖作为碳源生长，但是仅表达木糖异构酶的重组细菌也能够利用木糖作为碳源生长。

5.2、检测细菌胞内积累的聚合物含量

同实施实例4第4.2小节所示。

经过检测，各重组细菌中获得的细胞干重、PHB含量和产量如表1所示。

表1、表达木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌PHB合成情况

五种菌株的细胞干重大都在0.90-0.95g/L之间，PHB含量在35-42％之间，PHB最高产量为0.39g/L。通过引入引入木糖异构酶或引入木糖异构酶和木糖转运蛋白，重组细菌TD01/pSEVA341S-xylA和TD01/pSEVA341S-HEO0208/xylE/xylFGH/araE-xylA能够利用木糖作为碳源生产聚-3-羟基丁酸酯。

实施例6、表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶和木糖异构酶的重组细菌以及表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶、木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌在利用木糖生产聚-3-羟基丁酸酯中的应用

6.1、发酵培养

(1)将实施例2得到的重组细菌TD01/pSEVA341S-HEO0208-xylA、实施例3得到的重组细菌TD01/pSEVA341S-DAK-HEO0208/xylE/xylFGH/araE-xylA和重组细菌TD01/pSEVA341S-DAK-xylA在60LB-Amp-Spec液体培养基中培养，培养条件为37℃摇床、200rpm、16h，制备发酵种子液。

(2)按体积比4％的接种量将种子液接种到60MMX-Amp-Spec液体培养基中，37℃摇床、200rpm、48h，每隔12h收集适量发酵液进行生物量和木糖的测定。

(3)生物量测定

同实施例4第4.1小节中的(3)所示。

(4)通过高效液相色谱对木糖的消耗进行定量检测。

同实施4第4.1小节中的(4)所示。

图10和图11为表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶、木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌发酵过程中生物量变化情况以及木糖消耗情况。结果显示，仅表达木糖转运蛋白和木糖异构酶的TD01/pSEVA341S-HEO0208-xylA经过48h发酵OD600nm能够达到2.4，木糖消耗约4g/L；进一步引入D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶，生长状况有明显改善，最好的为TD01/pSEVA341S-DAK-HEO0208-xylA，经过48h发酵OD600nm能够达到5.5，木糖消耗大约7.5g/L，细胞生长和木糖消耗都实现了明显提升。不同木糖转运蛋白的表达效果略有差异，且不含有木糖转运蛋白的菌株Halomonas sp.TD01(pSEVA341S-DAK-xylA)相比于其他四个含有木糖转运蛋白的菌株长势都要弱，因此木糖转运蛋白对促进盐单胞菌Halomonas sp.TD01的木糖利用有明显效果。

6.2、检测细菌胞内积累的聚合物含量

同实施实例4.2所示。

经过检测，各重组细菌中获得的细胞干重、PHB含量和产量如表2所示。

表2：表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶、木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的重组细菌PHB合成情况

在表达木糖异构酶的基础上,进一步表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶，细胞干重和PHB产量都有了明显提高，TD01/pSEVA341S-DAK-xylA的PHB产量为0.87g/L。

在表达木糖异构酶和木糖转运蛋白的基础上，进一步表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶，细胞干重和PHB产量都有了明显提高，TD01/pSEVA341S-DAK-HEO0208/xylE/xylFGH/araE-xylA的PHB产量依次为0.87g/L、0.67g/L、0.69g/L、0.52g/L。这说明重组细菌的木糖代谢途径较为高效，表达D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶、岩藻糖激酶、木糖异构酶和不同木糖转运蛋白的Halomonas sp.TD01重组细菌能够利用木糖作为碳源生产聚-3-羟基丁酸酯，且聚酯产量在摇瓶中具有显著成效。

为了尽可能探索并构建Halomonas sp.TD01中高效代谢木糖生产PHB的途径，我们另在四种木糖转运蛋白和木糖异构酶的基础上引入了木酮糖激酶，重新构建了四种重组菌株；但实验结果显示木酮糖激酶的引入对菌株的生长并没有起到积极作用，最终PHB产量最高仅有0.17g/L,远低于本节最高0.87g/L的PHB产量。经过对大量可能性途径的探索我们最终得到了在Halomonas sp.TD01表达木糖异构酶、木糖转运蛋白、D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶和岩藻糖激酶是最为合适的木糖代谢产PHB的途径。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 利用木糖生产聚-3-羟基丁酸酯的重组细菌及其制备方法和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagcttgcgg ccgcttctag agcgctcatg atcgcggcat gtcctgatat ttttcctcta 60

aaaaagataa aaagtctttt cgcttcggca gaagaggttc atcatgaaca aaaattcggc 120

atttttaaaa atgcctatag ctaaatccgg aacgacactt tagaggtttc tgggtcatcc 180

tgattcagac atagtgtttt gaatactaga gaaagaggag aaataccata tgacggatcg 240

caaaccgctc agtcgttctg cctatatact catcatctgc tgtattgctg ccatcggtgg 300

ctttctcttc ggcttcgata gtggcgtcat caacggcacg gtcgatggtc tccaatcctc 360

tttcaattcc gacagtgtcg gtaccggctt caacgtggca tccatgctgc tgggctgtgc 420

cgtcggtgcc ttctttgccg gtcgcctggc ggaccgcttt ggccgccgta cggtattgat 480

cgtttcggcg attttcttcc tggtgagtgc ctgggggtcg ggaatcgccg gtgattcgat 540

ggaattcgtg gtttatcgcg tcctcggtgg catggcagtg ggggccgcca gtgtgatgac 600

gccggcctat atcagtgaag tggcgccctc gaggtatcgc ggtcgcctgg ccaccatcca 660

gcaggtggcc atcatcggcg gcttgttcat ggcctttctg agcaactacg tgctggccta 720

tgtctcgagt tcggcggtcg ccgagctgtg gttcggcttt gccacctggc gctggatgtt 780

ctggatcgaa ctgctgcccg cgtcggtatt cctggtggcg ctgttgttca tccccgagag 840

cccgcgatac ttgatcagca gtggtcgaca gtcggaagct cgccgggtgc tgggcctggt 900

gatgccggag caagaggtcg gcgacaagct cgatgagatc cacaccaccc tggatcgtga 960

tcacaagccg cgattgagcg atgtggtcaa ccgcgcgacc ggcaaggtgc atggcattgt 1020

ctgggtcggt atcggcctgg cggtgttcca gcagctggta ggcatcaatg tggtgttcta 1080

ttacggcgcg gtgctgtggc aatcggtagg cttctcggag ggtgatgccc tgctgatcaa 1140

cgtgatctcc ggggccgtga gcatcggcgc ctgcctgctg gcaatcgctt tgatcgacaa 1200

gatcggccgc aagcccctgc tgtgggtcgg ctcggtggga atggccatta ccctggcctg 1260

cctagtcttt gccttttcca cggcaaccct ggtcgacggg aatctgcaac tcagcgacga 1320

catgggcgtg tttgccctgc tggccgccaa tatctacgta ttcagcttca acgtctcctg 1380

ggggccggtg atgtgggtga tgctgggcga gatgttcccc aatcagatgc gtggttcggg 1440

actcgccatc gccgggctgt tccagtggct ggccaacttc ggcatcacca tgaccttccc 1500

gatcatgctg gcatccatcg gcctggcggg tgcctatggc ttctatgcct tgtgtgccgc 1560

gctgtcggcc ttctttgtgc tgcgctgggt tcaggaaacg cgaggcaagg aactcgagga 1620

aatggcgtat gagtgaggat cc 1642

<210> 2

<211> 1711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagcttgcgg ccgcttctag agcgctcatg atcgcggcat gtcctgatat ttttcctcta 60

aaaaagataa aaagtctttt cgcttcggca gaagaggttc atcatgaaca aaaattcggc 120

atttttaaaa atgcctatag ctaaatccgg aacgacactt tagaggtttc tgggtcatcc 180

tgattcagac atagtgtttt gaatactaga gaaagaggag aaataccata tgaataccca 240

gtataattcc agttatatat tttcgattac cttagtcgct acattaggtg gtttattatt 300

tggctacgac accgccgtta tttccggtac tgttgagtca ctcaataccg tctttgttgc 360

tccacaaaac ttaagtgaat ccgctgccaa ctccctgtta gggttttgcg tggccagcgc 420

tctgattggt tgcatcatcg gcggtgccct cggtggttat tgcagtaacc gcttcggtcg 480

tcgtgattca cttaagattg ctgctgtcct gttttttatt tctggtgtag gttctgcctg 540

gccagaactt ggttttacct ctataaaccc ggacaacaca gtgcctgttt atctggcagg 600

ttatgtcccg gaatttgtta tttatcgcat tattggcggt attggcgttg gtttagcctc 660

aatgctctcg ccaatgtata ttgcggaact ggctccagct catattcgcg ggaaactggt 720

ctcttttaac cagtttgcga ttattttcgg gcaactttta gtttactgcg taaactattt 780

tattgcccgt tccggtgatg ccagctggct gaatactgac ggctggcgtt atatgtttgc 840

ctcggaatgt atccctgcac tgctgttctt aatgctgctg tataccgtgc cagaaagtcc 900

tcgctggctg atgtcgcgcg gcaagcaaga acaggcggaa ggtatcctgc gcaaaattat 960

gggcaacacg cttgcaactc aggcagtaca ggaaattaaa cactccctgg atcatggccg 1020

caaaaccggt ggtcgtctgc tgatgtttgg cgtgggcgtg attgtaatcg gcgtaatgct 1080

ctccatcttc cagcaatttg tcggcatcaa tgtggtgctg tactacgcgc cggaagtgtt 1140

caaaacgctg ggggccagca cggatatcgc gctgttgcag accattattg tcggagttat 1200

caacctcacc ttcaccgttc tggcaattat gacggtggat aaatttggtc gtaagccact 1260

gcaaattatc ggcgcactcg gaatggcaat cggtatgttt agcctcggta ccgcgtttta 1320

cactcaggca ccgggtattg tggcgctact gtcgatgctg ttctatgttg ccgcctttgc 1380

catgtcctgg ggtccggtat gctgggtact gctgtcggaa atcttcccga atgctattcg 1440

tggtaaagcg ctggcaatcg cggtggcggc ccagtggctg gcgaactact tcgtctcctg 1500

gaccttcccg atgatggaca aaaactcctg gctggtggcc catttccaca acggtttctc 1560

ctactggatt tacggttgta tgggcgttct ggcagcactg tttatgtgga aatttgtccc 1620

ggaaaccaaa ggtaaaaccc ttgaggagct ggaagcgctc tgggaaccgg aaacgaagaa 1680

aacacaacaa actgctacgc tgtaaggatc c 1711

<210> 3

<211> 4006

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcttgcgg ccgcttctag agcgctcatg atcgcggcat gtcctgatat ttttcctcta 60

aaaaagataa aaagtctttt cgcttcggca gaagaggttc atcatgaaca aaaattcggc 120

atttttaaaa atgcctatag ctaaatccgg aacgacactt tagaggtttc tgggtcatcc 180

tgattcagac atagtgtttt gaatactaga gaaagaggag aaataccata tgaaaataaa 240

gaacattcta ctcacccttt gcacctcact cctgcttacc aacgttgctg cacacgccaa 300

agaagtcaaa ataggtatgg cgattgatga tctccgtctt gaacgctggc aaaaagatcg 360

agatatcttt gtgaaaaagg cagaatctct cggcgcgaaa gtatttgtac agtctgcaaa 420

tggcaatgaa gaaacacaaa tgtcgcagat tgaaaacatg ataaaccggg gtgtcgatgt 480

tcttgtcatt attccgtata acggtcaggt attaagtaac gttgtaaaag aagccaaaca 540

agaaggcatt aaagtattag cttacgaccg tatgattaac gatgcggata tcgattttta 600

tatttctttc gataacgaaa aagtcggtga actgcaggca aaagccctgg tcgatattgt 660

tccgcaaggt aattacttcc tgatgggcgg ctcgccggta gataacaacg ccaagctgtt 720

ccgcgccgga caaatgaaag tgttaaaacc ttacgttgat tccggaaaaa ttaaagtcgt 780

tggtgaccaa tgggttgatg gctggttacc ggaaaacgca ttgaaaatta tggaaaacgc 840

gctaaccgcc aataataaca aaattgatgc tgtagttgcc tcaaacgatg ccaccgcagg 900

tggggcaatt caggcattaa gcgcgcaagg tttatcaggg aaagtagcaa tctccggcca 960

ggatgcggat ctcgcaggta ttaaacgtat tgctgccggt acgcaaacta tgacggtgta 1020

taaacctatt acgttgttgg caaatactgc cgcagaaatt gccgttgagt tgggcaatgg 1080

tcaggaacca aaagcagata ccacactgaa taatggcctg aaagatgtcc cctcccgcct 1140

cctgacaccg atcgatgtga ataaaaacaa catcaaagat acggtaatta aagacggatt 1200

ccacaaagag agcgagctgt aagcgttacg ccccagcgcg gagcgggggc gtgatttctc 1260

tccatgccgc gtgaatgaat tggcttaggt ggagtcgtta tgccttatct acttgaaatg 1320

aagaacatta ccaaaacctt cggcagtgtg aaggcgattg ataacgtctg cttgcggttg 1380

aatgctggcg aaatcgtctc actttgtggg gaaaatgggt ctggtaaatc aacgctgatg 1440

aaagtgctgt gtggtattta tccccatggc tcctacgaag gcgaaattat ttttgcggga 1500

gaagagattc aggcgagtca catccgcgat accgaacgca aaggtatcgc catcattcat 1560

caggaattgg ccctggtgaa agaattgacc gtgctggaaa atatcttcct gggtaacgaa 1620

ataacccaca atggcattat ggattatgac ctgatgacgc tacgctgtca gaagctgctc 1680

gcacaggtca gtttatccat ttcacctgat acccgcgttg gcgatttagg gcttgggcaa 1740

caacaactgg ttgaaattgc caaggcactt aataaacagg tgcgcttgtt aattctcgat 1800

gaaccgacag cctcattaac tgagcaggaa acgtcgattt tactggatat tattcgcgat 1860

ctacaacagc acggtatcgc ctgtatttat atttcgcaca aactcaacga agtcaaagcg 1920

atttccgata cgatttgcgt tattcgcgac ggacagcaca ttggtacgcg tgatgctgcc 1980

ggaatgagtg aagacgatat tatcaccatg atggtcgggc gagagttaac cgcgctttac 2040

cctaatgaac cacataccac cggagatgaa atattacgta ttgaacatct gacggcatgg 2100

catccggtta atcgtcatat taaacgagtt aatgatgtct cgttttccct gaaacgtggc 2160

gaaatattgg gtattgccgg actcgttggt gccggacgta ccgagaccat tcagtgcctg 2220

tttggtgtgt ggcccggaca atgggaagga aaaatttata ttgatggcaa acaggtagat 2280

attcgtaact gtcagcaagc catcgcccag gggattgcga tggtccccga agacagaaag 2340

cgcgacggca tcgttccggt aatggcggtt ggtaaaaata ttaccctcgc cgcactcaat 2400

aaatttaccg gtggcattag ccagcttgat gacgcggcag agcaaaaatg tattctggaa 2460

tcaatccagc aactcaaagt taaaacgtcg tcccccgacc ttgctattgg acgtttgagc 2520

ggcggcaatc agcaaaaagc gatcctcgct cgctgtctgt tacttaaccc gcgcattctc 2580

attcttgatg aacccaccag gggtatcgat attggcgcga aatacgagat ctacaaatta 2640

attaaccaac tcgtccagca gggtattgcc gttattgtca tctcttccga attacctgaa 2700

gtgctcggcc ttagcgatcg tgtactggtg atgcatgaag ggaaactaaa agccaacctg 2760

ataaatcata acctgactca ggagcaggtg atggaagccg cattgaggag cgaacatcat 2820

gtcgaaaagc aatccgtctg aagtgaaatt ggccgtaccg acatccggtg gcttctccgg 2880

gctgaaatca ctgaatttgc aggtcttcgt gatgattgca gctatcatcg caatcatgct 2940

gttctttacc tggaccaccg atggtgccta cttaagcgcc cgtaacgtct ccaacctgtt 3000

acgccagacc gcgattaccg gcatcctcgc ggtaggaatg gtgttcgtca taatttctgc 3060

tgaaatcgac ctttccgtcg gctcaatgat ggggctgtta ggtggcgtcg cggcgatttg 3120

tgacgtctgg ttaggctggc ctttgccact taccatcatt gtgacgctgg ttctgggact 3180

gcttctcggt gcctggaacg gatggtgggt cgcgtaccgt aaagtccctt catttattgt 3240

caccctcgcg ggcatgttgg catttcgcgg catactcatt ggcatcacca acggcacgac 3300

tgtatccccc accagcgccg cgatgtcaca aattgggcaa agctatctcc ccgccagtac 3360

cggcttcatc attggcgcgc ttggcttaat ggcttttgtt ggttggcaat ggcgcggaag 3420

aatgcgccgt caggctttgg gtttacagtc tccggcctct accgcagtag tcggtcgcca 3480

ggctttaacc gctatcatcg tattaggcgc aatctggctg ttgaatgatt accgtggcgt 3540

tcccactcct gttctgctgc tgacgttgct gttactcggc ggaatgttta tggcaacgcg 3600

gacggcattt ggacgacgca tttatgccat cggcggcaat ctggaagcag cacgtctctc 3660

cgggattaac gttgaacgca ccaaacttgc cgtgttcgcg attaacggat taatggtagc 3720

catcgccgga ttaatcctta gttctcgact tggcgctggt tcaccttctg cgggaaatat 3780

cgccgaactg gacgcaattg cagcatgcgt gattggcggc accagcctgg ctggcggtgt 3840

gggaagcgtt gccggagcag taatgggggc atttatcatg gcttcactgg ataacggcat 3900

gagtatgatg gatgtaccga ccttctggca gtatatcgtt aaaggtgcga ttctgttgct 3960

ggcagtatgg atggactccg caaccaaacg ccgttcttga ggatcc 4006

<210> 4

<211> 1630

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcttgcgg ccgcttctag agcgctcatg atcgcggcat gtcctgatat ttttcctcta 60

aaaaagataa aaagtctttt cgcttcggca gaagaggttc atcatgaaca aaaattcggc 120

atttttaaaa atgcctatag ctaaatccgg aacgacactt tagaggtttc tgggtcatcc 180

tgattcagac atagtgtttt gaatactaga gaaagaggag aaataccata tgaagaatac 240

tccaactcaa ttagaaccaa atgttcctgt aacaagaagc cattcaatgg gatttgtcat 300

tttgatctca tgtgcggcgg ggcttggcgg cttattgtat ggctatgaca cggcagtgat 360

ttctggcgcc atcggttttc tgaaagattt atacagcctg agtccgttta tggagggact 420

tgtcatttca agcattatga ttggaggagt tgtgggcgtc gggatatccg gatttttaag 480

tgacagattc ggccggagaa aaattttaat gacagccgct ttgttatttg cgatatcagc 540

aatcgtttca gcgctttctc aagacgtgtc caccttaatc attgcaagga ttatcggggg 600

gctgggaatc gggatgggct catcgctctc tgttacgtat attacagaag cggcaccgcc 660

cgctatacgc ggaagtttat cttcgttata tcagctcttt acgatactgg gtatttccgc 720

aacatacttt attaatctag ctgtgcagcg gtccggaaca tacgaatggg gcgtgcacac 780

cggctggaga tggatgcttg cttatggaat ggtgccatcc gtcatttttt tccttgtcct 840

gctcgtcgtc ccggaaagtc cgagatggct ggcgaaagcg ggcaaaacaa atgaagcatt 900

aaagatcctg acacgtatta atggagaaac tgttgcaaaa gaagaattaa agaacattga 960

gaactcttta aaaatagaac aaatggggtc gctctcccag ctgtttaagc cgggtctcag 1020

aaaggcgctt gtcattggaa tcctgctggc gctgtttaac caagtcatcg gcatgaacgc 1080

gattacttac tacgggccgg aaatctttaa aatgatggga ttcgggcaaa acgccggatt 1140

tgtgacgact tgtatcgtcg gggttgtaga agttattttt accgttattg cggtgttgct 1200

gattgataaa gtcggacgaa aaaaactgat gtccatcggt tctgctttta tggctatttt 1260

tatgatttta atcgggacgt cgttttattt tgagttaaca agcgggatca tgatgatcgt 1320

ccttatatta ggttttgtcg ctgctttctg tgtctcggtc ggaccgatca catggattat 1380

gatttctgaa atcttcccga accatctgcg tgcgcgggcc gcgggcattg cgaccatctt 1440

tttatgggga gcaaactggg cgatcggaca gtttgtgcca atgatgatcg attctttcgg 1500

gctcgcctat acattttgga tctttgcggt gattaacatc ctttgtttcc tgtttgtcgt 1560

tacgatctgt ccagaaacga agaacaaatc gctcgaggaa attgaaaagc tctggataaa 1620

atgaggatcc 1630

<210> 5

<211> 1564

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagcttgcgg ccgcttctag agcgctcatg atcgcggcat gtcctgatat ttttcctcta 60

aaaaagataa aaagtctttt cgcttcggca gaagaggttc atcatgaaca aaaattcggc 120

atttttaaaa atgcctatag ctaaatccgg aacgacactt tagaggtttc tgggtcatcc 180

tgattcagac atagtgtttt gaaggatcct actagagaaa gaggagaaat actagatgca 240

agcctatttt gaccagctcg atcgcgttcg ttatgaaggc tcaaaatcct caaacccgtt 300

agcattccgt cactacaatc ccgacgaact ggtgttgggt aagcgtatgg aagagcactt 360

gcgttttgcc gcctgctact ggcacacctt ctgctggaac ggggcggata tgtttggtgt 420

gggggcgttt aatcgtccgt ggcagcagcc tggtgaggca ctggcgttgg cgaagcgtaa 480

agcagatgtc gcatttgagt ttttccacaa gttacatgtg ccattttatt gcttccacga 540

tgtggatgtt tcccctgagg gcgcgtcgtt aaaagagtac atcaataatt ttgcgcaaat 600

ggttgatgtc ctggcaggca agcaagaaga gagcggcgtg aagctgctgt ggggaaccgc 660

caactgcttt acaaaccctc gctacggcgc gggtgcggcg acgaacccag atcctgaagt 720

cttcagctgg gcggcaacgc aagttgttac agcgatggaa gcaacccata aattgggcgg 780

tgaaaactat gtcctgtggg gcggtcgtga aggttacgaa acgctgttaa ataccgactt 840

gcgtcaggag cgtgaacaac tgggccgctt tatgcagatg gtggttgagc ataaacataa 900

aatcggtttc cagggcacgt tgcttatcga accgaaaccg caagaaccga ccaaacatca 960

atatgattac gatgccgcga cggtctatgg cttcctgaaa cagtttggtc tggaaaaaga 1020

gattaaactg aacattgaag ctaaccacgc gacgctggca ggtcactctt tccatcatga 1080

aatagccacc gccattgcgc ttggcctgtt cggttctgtc gacgccaacc gtggcgatgc 1140

gcaactgggc tgggacaccg accagttccc gaacagtgtg gaagagaatg cgctggtgat 1200

gtatgaaatt ctcaaagcag gcggtttcac caccggtggt ctgaacttcg atgccaaagt 1260

acgtcgtcaa agtactgata aatatgatct gttttacggt catatcggcg cgatggatac 1320

gatggcactg gcgctgaaaa ttgcagcgcg catgattgaa gatggcgagc tggataaacg 1380

catcgcgcag cgttattccg gctggaatag cgaattgggc cagcaaatcc tgaaaggcca 1440

aatgtcactg gcagatttag ccaaatatgc tcaggaacat aatttgtctc cggtgcatca 1500

gagtggtcgc caggagcaac tggaaaatct ggtaaatcat tatctgttcg acaaataacc 1560

tagg 1564

<210> 6

<211> 3441

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcttcgct catgatcgcg gcatgtcctg atatttttcc tctaaaaaag ataaaaagtc 60

ttttcgcttc ggcagaagag gttcatcatg aacaaaaatt cggcattttt aaaaatgcct 120

atagctaaat ccggaacgac actttagagg tttctgggtc atcctgattc agacatagtg 180

ttttgaatac tagagaaaga ggagaaatac catatggaca aagttggtat gttctacacc 240

tactggagca ccgaatggat ggttgacttc ccagcgaccg ccaaacgtat tgcgggcctg 300

ggtttcgatc tgatggaaat ctctctgggc gagttccata acctgtctga tgctaaaaag 360

cgtgagctga aagcggtagc agacgatctg ggtctgactg taatgtgctg tatcggtctg 420

aagtctgaat atgacttcgc aagcccggac aagtccgttc gtgacgctgg cacggaatac 480

gtcaaacgtc tgctggatga ctgtcacctg ctgggcgcac cagtgtttgc tggtctgacc 540

ttctgtgctt ggccgcagag ccctccgctg gacatgaagg acaaacgtcc gtatgttgac 600

cgtgctatcg agagcgttcg tcgtgttatc aaagtggcgg aagactacgg catcatttat 660

gcactggaag tggtcaatcg tttcgagcag tggctgtgca acgatgcgaa agaagcaatc 720

gctttcgcgg atgctgttga ctccccggct tgcaaagtac aactggacac ttttcacatg 780

aacatcgaag aaacttcttt ccgtgatgcg attctggcct gcaaaggcaa aatgggccac 840

tttcacctgg gtgaagcaaa ccgtctgccg ccgggtgaag gtcgtctgcc gtgggatgaa 900

atctttggtg ccctgaaaga aatcggttac gacggcacca ttgtgatgga accgttcatg 960

cgtaaaggcg gttctgtgtc ccgtgcggtg ggtgtttggc gtgatatgtc caacggtgca 1020

accgacgaag agatggatga acgtgcgcgt cgttctctgc aattcgtccg tgataaactg 1080

gcctaagaat tcgtttaggc cggccttaaa taaggaggaa taacgatgga acgaaataaa 1140

cttgctcgtc agattattga cacttgcctg gaaatgaccc gcctgggact gaaccagggg 1200

acagcgggga acgtcagtgt acgttatcag gatgggatgc tgattacgcc tacaggcatt 1260

ccatatgaaa aactgacgga gtcgcatatt gtctttattg atggcaacgg taaacatgag 1320

gaaggaaagc tcccctcaag cgaatggcgt ttccatatgg cagcctatca aagcagaccg 1380

gatgccaacg cggttgttca caatcatgcc gttcattgca cggcagtttc cattcttaac 1440

cgatcgatcc ccgctattca ctacatgatt gcggcggctg gcggtaattc tattccttgc 1500

gcgccttatg cgacctttgg aacacgcgaa ctttctgaac atgttgcgct ggctctcaaa 1560

aatcgtaagg caactttgtt acaacatcat gggcttatcg cttgtgaggt gaatctggaa 1620

aaagcgttat ggctggcgca tgaagttgaa gtgctggcgc aactttacct gacgaccctg 1680

gcgattacgg acccggtgcc agtgctgagc gatgaagaga ttgccgtagt gctggagaaa 1740

ttcaaaacct atgggttacg aattgaagag taagaattcg tttagagctc ttaaataagg 1800

aggaataacc atgttatccg gctatattgc aggagcgatt atgaaacaag aagttatcct 1860

ggtactcgac tgtggcgcga ccaatgtcag ggccatcgcg gttaatcggc agggcaaaat 1920

tgttgcccgc gcctcaacgc ctaatgccag cgatatcgcg atggaaaaca acacctggca 1980

ccagtggtct ttagacgcca ttttgcaacg ctttgctgat tgctgtcggc aaatcaatag 2040

tgaactgact gaatgccaca tccgcggtat cgccgtcacc acctttggtg tggatggcgc 2100

tctggtagat aagcaaggca atctgctcta tccgattatt agctggaaat gtccgcgaac 2160

agcagcggtt atggacaata ttgaacggtt aatctccgca cagcggttgc aggctatttc 2220

tggcgtcgga gcctttagtt tcaatacgtt atataagttg gtgtggttga aagaaaatca2280

tccacaactg ctggaacgcg cgcacgcctg gctctttatt tcgtcgctga ttaaccaccg 2340

tttaaccggc gaattcacta ctgatatcac gatggccgga accagccaga tgctggatat 2400

ccagcaacgc gatttcagtc cgcaaatttt acaagccacc ggtattccac gccgactctt 2460

ccctcgtctg gtggaagcgg gtgaacagat tggtacgcta cagaacagcg ccgcagcaat 2520

gctcggctta cccgttggca taccggtgat ttccgcaggt cacgataccc agttcgccct 2580

ttttggcgct ggtgctgaac aaaatgaacc cgtgctctct tccggtacat gggaaatttt 2640

aatggttcgc agcgcccagg ttgatacttc gctgttaagt cagtacgccg gttccacctg 2700

cgaactggat agccaggcag ggttgtataa cccaggtatg caatggctgg catccggcgt 2760

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agaagctcgt ctgatcgcgc ctggcgcgga tggcgtaaaa atgcagtgtg atttattgtc 2880

gtgtcagaac gctggctggc aaggagtgac gcttaatacc acgcgggggc atttctatcg 2940

cgcggcgctg gaagggttaa ctgcgcaatt acagcgcaat ctacagatgc tggaaaaaat 3000

cgggcacttt aaggcctctg aattattgtt agtcggtgga ggaagtcgca acacattgtg 3060

gaatcagatt aaagccaata tgcttgatat tccggtaaaa gttctcgacg acgccgaaac 3120

gaccgtcgca ggagctgcgc tgttcggttg gtatggcgta ggggaattta acagcccgga 3180

agaagcccgc gcacagattc attatcagta ccgttatttc tacccgcaaa ctgaacctga 3240

atttatagag gaagtgtgag gtaccgagct cgaattcgcg cggccgcggc ctaggcggcc 3300

tcctgtgtga aattgttatc cgctttaatt aaaggcatca aataaaacga aaggctcagt 3360

cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga 3420

caaatccgcc gcccttctag a 3441

<210> 7

<211> 5093

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tagatgctcc ggatttgact tttgtccttt tccgctgcat aaccctgctt cggggtcatt 60

atagcgattt tttcggtata tccatccttt ttcgcacgat atacaggatt ttgccaaagg 120

gttcgtgtag actttccttg gtgtatccaa cggcgtcagc cgggcaggat aggtgaagta 180

ggcccacccg cgagcgggtg ttccttcttc actgtccctt attcgcacct ggcggtgctc 240

aacgggaatc ctgctctgcg aggctggccg taggccggcc gataatctca tgaccaaaat 300

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 360

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 420

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 480

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca 540

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 600

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 660

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 720

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 780

agggagaaag gcggacaggc atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 840

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 900

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 960

caacgcggcc gtgaaaggca ggccggtccg tggtggccac ggcctctagg ccagatccag 1020

cggcatctgg gttagtcgag cgcgggccgc ttcccatgtc tcaccagggc gagcctgttt 1080

cgcgatctca gcatctgaaa tcttcccggc cttgcgcttc gctggggcct tacccaccgc 1140

cttggcgggc ttcttcggtc caaaactgaa caacagatgt gtgaccttgc gcccggtctt 1200

tcgctgcgcc cactccacct gtagcgggct gtgctcgttg atctgcgtca cggctggatc 1260

aagcactcgc aacttgaagt ccttgatcga gggataccgg ccttccagtt gaaaccactt 1320

tcgcagctgg tcaatttcta tttcgcgctg gccgatgctg tcccattgca tgagcagctc 1380

gtaaagcctg atcgcgtggg tgctgtccat cttggccacg tcagccaagg cgtatttggt 1440

gaactgtttg gtgagttccg tcaggtacgg cagcatgtct ttggtgaacc tgagttctac 1500

acggccctca ccctcccggt agatgattgt ttgcacccag ccggtaatca tcacactcgg 1560

tcttttcccc ttgccattgg gctcttgggt taaccggact tcccgccgtt tcaggcgcag 1620

ggccgcttct ttgagctggt tgtaggaaga ttcgataggg acacccgcca tcgtcgctat 1680

gtcctccgcc gtcactgaat acatcacttc atcggtgaca ggctcgctcc tcttcacctg 1740

gctaatacag gccagaacga tccgctgttc ctgaacactg aggcgatacg cggcctcgac 1800

cagggcattg cttttgtaaa ccattggggg tgaggccacg ttcgacattc cttgtgtata 1860

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cgtcccttct taacaacaaa tccgtccctt aatggcaaca aatccgtccc tttttaaact 1980

ctacaggcca cggattacgt ggcctgtaga cgtcctaaaa ggtttaaaag ggaaaaggaa 2040

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cccctgaagg ggcgggggag gcgtctgggc aatccccgtt ttaccagtcc cctatcgccg 2160

cctgagaggg cgcaggaagc gagtaatcag ggtatcgagg cggattcacc cttggcgtcc 2220

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gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc 2340

gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctt taattaaagc ggataacaat ttcacacagg 2400

aggccgccta ggccgcggcc gcgcgaattc gagctcggta cccggggatc ctctagagtc 2460

gacctgcagg catgcaagct tgcggccgcg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgactagtc 2520

ttggactcct gttgatagat ccagtaatga cctcagaact ccatctggat ttgttcagaa 2580

cgctcggttg ccgccgggcg ttttttattg gtgagaatcc aggggtcccc aataattacg 2640

atttaaattg gcgaaaatga gccgtgacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag 2700

gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 2760

cgcggaaccc ccatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 2820

caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 2880

ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca 2940

gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 3000

gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 3060

atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg 3120

caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 3180

gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 3240

accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 3300

ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 3360

gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca 3420

acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 3480

atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 3540

ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 3600

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cttccgatct cctgaagcca gggcagatcc gtgcacagca ccttgccgta gaagaacagc 3840

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cggatgaagg cacgaaccca gtggacataa gcctgttcgg ttcgtaagct gtaatgcaag 4020

tagcgtatgc gctcacgcaa ctggtccaga accttgaccg aacgcagcgg tggtaacggc 4080

gcagtggcgg ttttcatggc ttgttatgac tgtttttttg gggtacagtc tatgcctcgg 4140

gcatccaagc agcaagcgcg ttacgccgtg ggtcgatgtt tgatgttatg gagcagcaac 4200

gatgttacgc agcagggcag tcgccctaaa acaaagttaa acatcatgag ggaagcggtg 4260

atcgccgaag tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa 4320

ccgacgttgc tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac 4380

agtgatattg atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct 4440

ttgatcaacg accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct 4500

gtagaagtca ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc 4560

gaactgcaat ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc 4620

acgatcgaca ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg 4680

gtaggtccag cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg 4740

ctaaatgaaa ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat 4800

gtagtgctta cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag 4860

gatgtcgctg ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt 4920

gaagctagac aggcttatct tggacaagaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag 4980

ttggaagaat ttgtccacta cgtgaaaggc gagatcacca aggtagtcgg caaataatgt 5040

ctaacaattc gttcaagccg acgccgcttc gcggcgcggc ttaactcaag cgt 5093

Claims (5)

1.一种重组细菌，其特征在于，所述重组细菌为表达木糖异构酶、木糖转运蛋白酶、D-塔格糖-3-差向异构酶、醛缩酶和岩藻糖激酶的重组细菌；

所述木糖异构酶为由编码序列是SEQ ID No.5的第236-1558位的核苷酸序列编码的蛋白质；

所述木糖转运蛋白酶名称分别是HEO0208、xylE、xylFGH或araE的蛋白质，

所述HEO0208为由编码序列是SEQ ID No.1的第230-1636位的核苷酸序列编码的蛋白质；

所述xylE为由编码序列是SEQ ID No.2的第230-1705位的核苷酸序列编码的蛋白质；

所述xylFGH为由编码序列是SEQ ID No.3的第230-4000位的核苷酸序列编码的蛋白质；

所述araE为由编码序列是SEQ ID No.4的第230-1624位的核苷酸序列编码的蛋白质；

所述D-塔格糖-3-差向异构酶为由编码序列是SEQ ID No.6的第214-1086位的核苷酸序列编码的蛋白质；

所述醛缩酶为由编码序列是SEQ ID No.6的第1126-1773位的核苷酸序列编码的蛋白质；

所述岩藻糖激酶为由编码序列是SEQ ID No.6的第1811-3259位的核苷酸序列编码的蛋白质；

所述重组细菌的构建方法包括将所述木糖异构酶的编码基因、所述木糖转运蛋白酶的编码基因、所述D-塔格糖-3-差向异构酶的编码基因、所述醛缩酶的编码基因和所述岩藻糖激酶的编码基因导入受体菌得到表达所述木糖异构酶、所述木糖转运蛋白酶、所述D-塔格糖-3-差向异构酶、所述醛缩酶和所述岩藻糖激酶的重组细菌；

所述受体菌为盐单胞菌Halomonas sp. TD01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.4353。

2.权利要求1中所述的重组细菌的构建方法。

3.权利要求1所述的重组细菌在生产聚-3-羟基丁酸酯中的应用。

4.一种生产聚-3-羟基丁酸酯的方法，其特征在于：所述方法使用权利要求1所述的重组细菌和木糖产生聚-3-羟基丁酸酯。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述木糖为唯一碳源。