CN110004182B - 一种微生物胞内大颗粒内含物的制备方法及其应用 - Google Patents
一种微生物胞内大颗粒内含物的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种微生物胞内大颗粒内含物的制备方法及其应用。本发明提供了一种提高微生物胞内内含物颗粒大小的方法，是单独抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达，或者抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达同时过表达微生物中分裂环抑制蛋白的编码基因。按照本发明所述方法可以在微生物胞内得到大颗粒(2‑15μm)内含物，所得大颗粒内含物有效降低固液分离所需的最小离心转速，有益于解决微生物内含物提取难度大、耗能高的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物胞内大颗粒内含物的制备方法及其应用。
背景技术
全球的塑料产量一直以来都在增加，近年来产量达到了每年3.3亿吨，中国占1.3亿吨。如此多的塑料累积在环境中带来了白色污染问题，不仅影响了陆地环境，更严重影响了海洋环境。为了解决白色污染问题，生物可降解塑料替代石油基不可降解塑料被认为是减轻塑料对环境负担的出路之一。
聚羟基脂肪酸酯PHA是一类生物聚酯的统称，是唯一完全由微生物合成的生物基材料。根据组成聚酯的单体的结构不同，PHA可以表现出多种力学、拉伸、弹性等材料性能，因此可应用于不同的场景。在众多种类的PHA之中，目前仅有聚3-羟基丁酸酯(PHB)，聚-3-羟基丁酸-3羟基己酸酯(PHBHHx)，聚-3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯(PHBV)和聚-3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯(P3HB4HB)实现了商业化。
传统的PHA生产是以罗氏真养菌(Ralstonia eutropha)、基因改造的大肠杆菌(E.coli)为生产菌种发酵而成，生产存在染菌几率高、能耗高、底物转化率不高、下游处理成本高等缺点，导致成本长期居高不下，严重阻碍了PHA的大规模应用。以嗜盐菌为底盘菌开发的PHA生产技术克服了传统PHA生产中存在的多个问题，首先嗜盐菌生长在高盐高碱环境下，而这种生长条件可以抑制绝大部分微生物的生长，反应在生产上就是无灭菌开放式发酵，不仅不会染菌，而且无需灭菌，大大降低了能耗和管理成本。其次，通过合成生物学技术开发的工程菌可以低成本碳源高效合成聚3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯(PHBV)、聚3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯(P3HB4HB)等多种性能优异的PHA产品，进一步加快了商业化应用速度。
PHA是微生物内含物，由于微生物胞内成分复杂，提取PHA难度相当大，在PHA发展的漫长历程中，研究者们对提取做了大量的研究。不论是有机溶剂抽提法、机械破碎法、次氯酸钠-表面活性剂法还是酶法，都包含了离心沉淀(固液分离)的步骤。满足固液分离的最低离心转速制约了提取成本的进一步降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物胞内大颗粒内含物的制备方法及其应用。
本发明首先提供了一种提高微生物胞内内含物颗粒大小的方法，为如下(a1)-(a8)中的至少一种：
(a1)抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
(a2)降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性；
(a3)抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达，同时过表达微生物中分裂环抑制蛋白的编码基因；
(a4)降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性，同时提高微生物中分裂环抑制蛋白的表达量和/或活性；
(a5)单独抑制微生物中分裂环蛋白的编码基因表达，或抑制微生物中分裂环蛋白的编码基因表达的同时抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
(a6)单独降低微生物中分裂环相关蛋白的表达量和/或活性，或降低微生物中分裂环相关蛋白的表达量和/或活性的同时抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
(a7)抑制微生物中细菌骨架蛋白的编码基因表达，或抑制微生物中细菌骨架蛋白的编码基因表达的同时抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
(a8)降低微生物中细菌骨架蛋白的表达量和/或活性，或降低微生物中细菌骨架蛋白的表达量和/或活性的同时降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性。
所述颗粒大小具体可表现为颗粒的轴向长度。
本发明还保护一种重组微生物，是将出发微生物进行如下(b1)-(b8)中的任一种改造得到的；
(b1)抑制出发微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
(b2)降低出发微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性；
(b3)抑制出发微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达，同时过表达出发微生物中分裂环抑制蛋白的编码基因；
(b4)降低出发微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性，同时提高出发微生物中分裂环抑制蛋白的表达量和/或活性；
(b5)单独抑制出发微生物中分裂环蛋白的编码基因表达，或抑制出发微生物中分裂环蛋白的编码基因表达的同时抑制出发微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
(b6)单独降低出发微生物中分裂环相关蛋白的表达量和/或活性，或降低出发微生物中分裂环相关蛋白的表达量和/或活性的同时抑制出发微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
(b7)抑制出发微生物中细菌骨架蛋白的编码基因表达，或抑制出发微生物中细菌骨架蛋白的编码基因表达的同时抑制出发微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
(b8)降低出发微生物中细菌骨架蛋白的表达量和/或活性，或降低出发微生物中细菌骨架蛋白的表达量和/或活性的同时降低出发微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性。
本发明还保护所述方法或所述重组微生物在制备微生物胞内内含物中的应用。
本发明还保护如下(c1)-(c8)任一种物质或多种物质的组合在制备微生物胞内内含物中的应用；
(c1)抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达的物质；
(c2)降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性的物质；
(c3)过表达微生物中分裂环抑制蛋白的编码基因的物质；
(c4)提高微生物中分裂环抑制蛋白的表达量和/或活性的物质；
(c5)抑制微生物中分裂环蛋白的编码基因表达的物质；
(c6)降低微生物中分裂环相关蛋白的表达量和/或活性的物质；
(c7)抑制微生物中细菌骨架蛋白的编码基因表达的物质；
(c8)降低微生物中细菌骨架蛋白的表达量和/或活性的物质。
本发明还保护制备微生物胞内内含物的方法，包括如下步骤：对微生物进行如下(d1)-(d8)中的任一种改造后，培养改造后的微生物，从中获得微生物胞内内含物；
(d1)抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
(d2)降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性；
(d3)抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达，同时过表达微生物中分裂环抑制蛋白的编码基因；
(d4)降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性，同时提高微生物中分裂环抑制蛋白的表达量和/或活性；
(d5)单独抑制微生物中分裂环蛋白的编码基因表达，或抑制微生物中分裂环蛋白的编码基因表达的同时抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
(d6)单独降低微生物中分裂环相关蛋白的表达量和/或活性，或降低微生物中分裂环相关蛋白的表达量和/或活性的同时抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
(d7)抑制微生物中细菌骨架蛋白的编码基因表达，或抑制微生物中细菌骨架蛋白的编码基因表达的同时抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
(d8)降低微生物中细菌骨架蛋白的表达量和/或活性，或降低微生物中细菌骨架蛋白的表达量和/或活性的同时降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性。
以上任一所述“抑制微生物(或出发微生物)中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达”或“降低微生物(或出发微生物)中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性”可以通过如下方式实现：利用CRISPR/Cas9敲除所述微生物(或出发微生物)基因组中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因。
以上任一所述“过表达微生物(或出发微生物)中分裂环抑制蛋白的编码基因”或“提高微生物(或出发微生物)中分裂环抑制蛋白的表达量和/或活性”可以通过如下(1)或(2)所述的方式实现：(1)向所述微生物中导入分裂环抑制蛋白的编码基因；(2)通过基因编辑将所述微生物基因组中分裂环抑制蛋白的编码基因前的启动子替换为组成型启动子。所述组成型启动子具体可为pMmP1启动子。
以上任一所述PHA颗粒表面结合蛋白为PhaP1蛋白、PhaP2蛋白和PhaP3蛋白中的一种或几种的组合。所述PHA颗粒表面结合蛋白具体可为PhaP1蛋白、PhaP1蛋白和PhaP2蛋白的组合或PhaP1蛋白和PhaP3蛋白的组合。
以上任一所述分裂环抑制蛋白为MinC蛋白和MinD蛋白中的一种或两种的组合。所述分裂环抑制蛋白具体可为MinC蛋白和MinD蛋白的组合。
以上任一所述分裂环蛋白为FtsZ家族蛋白。
以上任一所述细菌骨架蛋白为MreB家族蛋白。
所述“利用CRISPR/Cas9敲除所述微生物(或出发微生物)基因组中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因”具体可通过如下方式实现：首先将含有Cas9蛋白编码基因的质粒导入所述微生物(或出发微生物)，得到重组微生物甲，然后将含有gRNA序列及所述编码基因的上下游同源臂序列的质粒导入重组微生物甲，实现所述微生物(或出发微生物)基因组中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因的敲除。
所述Cas9蛋白编码基因的质粒具体可为质粒pQ08。
当需要敲除的编码基因为PhaP1蛋白的编码基因(phaP1基因)时，所述gRNA序列如序列表的序列2自5’端第17至36位所示，所述上游同源臂序列如序列表的序列5自5’端第1至500位所示，所述下游同源臂序列如序列表的序列5自5’端第505至1004位所示。所述含有gRNA序列及所述编码基因的上下游同源臂序列的质粒是将pHALORNA质粒的BbsI位点之间插入序列表的序列2所示的DNA分子，在BsaI位点之间插入序列表的序列5所示的DNA分子得到的重组质粒。
当需要敲除的编码基因为PhaP2蛋白的编码基因(phaP2基因)时，所述gRNA序列如序列表的序列3自5’端第17至36位所示，所述上游同源臂序列如序列表的序列6自5’端第1至500位所示，所述下游同源臂序列如序列表的序列6自5’端第505至1004位所示。所述含有gRNA序列及所述编码基因的上下游同源臂序列的质粒是将pHALORNA质粒的BbsI位点之间插入序列表的序列3所示的DNA分子，在BsaI位点之间插入序列表的序列6所示的DNA分子得到的重组质粒。
当需要敲除的编码基因为PhaP3蛋白的编码基因(phaP3基因)时，所述gRNA序列如序列表的序列4自5’端第17至36位所示，所述上游同源臂序列如序列表的序列7自5’端第1至500位所示，所述下游同源臂序列如序列表的序列7自5’端第505至1004位所示。所述含有gRNA序列及所述编码基因的上下游同源臂序列的质粒是将pHALORNA质粒的BbsI位点之间插入序列表的序列4所示的DNA分子，在BsaI位点之间插入序列表的序列7所示的DNA分子得到的重组质粒。
当所述分裂环抑制蛋白为MinC蛋白和MinD蛋白的组合时，所述向所述微生物中导入分裂环抑制蛋白的编码基因具体可通过向所述微生物中导入过表达MinC蛋白的编码基因(minC基因)和MinD蛋白的编码基因(minD基因)的质粒实现。所述质粒具体可为将pSEVA321载体的XbaI和SpeI位点之间插入序列表的序列8所示的DNA分子得到的重组质粒。
所述“通过基因编辑将所述微生物基因组中分裂环抑制蛋白的编码基因前的启动子替换为组成型启动子”具体可通过如下方式实现：首先将含有Cas9蛋白编码基因的质粒导入所述微生物(或出发微生物)，得到重组微生物甲，然后将含有gRNA序列、上下游同源臂序列及启动子的质粒导入重组微生物甲，实现启动子的替换。当所述启动子为pMmP1启动子，所述编码基因为minC基因，或，minC基因和minD基因的组合时，所述gRNA如序列表的序列9自5’端第17至36位所示，所述上游同源臂如序列表的序列10自5’端第1至500位所示，所述下游同源臂如序列表的序列10自5’端第759至1258位所示，所述pMmP1启动子如序列表的序列10自5’端第501至758位所示。所述含有gRNA序列、上下游同源臂序列及启动子的质粒具体可为将pHALORNA质粒的BbsI位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分子，在BsaI位点之间插入序列表的序列10所示的DNA分子得到的重组质粒。
以上任一所述出发微生物可为盐单胞菌或聚磷菌。所述盐单胞菌具体可为盐单胞菌Halomonas TD01、盐单胞菌Halomonas TDH4或盐单胞菌Halomonas TD-MmP1。
以上任一所述微生物可为盐单胞菌或聚磷菌。所述盐单胞菌具体可为盐单胞菌Halomonas TD01、盐单胞菌Halomonas TDH4或盐单胞菌Halomonas TD-MmP1。
以上任一所述PhaP1蛋白的氨基酸序列为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)序列表的序列12所示的氨基酸序列；
(e2)将序列表的序列12所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(e3)与序列表的序列12所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
以上任一所述PhaP1蛋白的编码基因(phaP1基因)如下(e4)或(e5)或(e6):
(e4)序列表的序列11所示的DNA分子；
(e5)与(e4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码PhaP1蛋白的DNA分子；
(e6)在严格条件下与(e4)或(e5)限定的核苷酸序列杂交，且编码PhaP1蛋白的DNA分子。
以上任一所述MinC蛋白的氨基酸序列为如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)序列表的序列17所示的氨基酸序列；
(f2)将序列表的序列17所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(f3)与序列表的序列17所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
以上任一所述MinC蛋白的编码基因(minC基因)如下(f4)或(f5)或(f6):
(f4)序列表的序列序列8自5’端第255至1004位所示的DNA分子；
(f5)与(f4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码MinC蛋白的DNA分子；
(f6)在严格条件下与(f4)或(f5)限定的核苷酸序列杂交，且编码MinC蛋白的DNA分子。
以上任一所述MinD蛋白的氨基酸序列为如下(g1)或(g2)或(g3)：
(g1)序列表的序列18所示的氨基酸序列；
(g2)将序列表的序列18所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(g3)与序列表的序列18所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
以上任一所述MinD蛋白的编码基因(minD基因)如下(g4)或(g5)或(g6):
(g4)序列表的序列8自5’端第1005至1823位所示的DNA分子；
(g5)与(g4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码MinD蛋白的DNA分子；
(g6)在严格条件下与(g4)或(g5)限定的核苷酸序列杂交，且编码MinD蛋白的DNA分子。
以上任一所述PhaP2蛋白的氨基酸序列为如下(h1)或(h2)或(h3)：
(h1)序列表的序列14所示的氨基酸序列；
(h2)将序列表的序列14所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(h3)与序列表的序列14所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
以上任一所述PhaP2蛋白的编码基因(phaP2基因)如下(h4)或(h5)或(h6):
(h4)序列表的序列13所示的DNA分子；
(h5)与(h4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码PhaP2蛋白的DNA分子；
(h6)在严格条件下与(h4)或(h5)限定的核苷酸序列杂交，且编码PhaP2蛋白的DNA分子。
以上任一所述PhaP3蛋白的氨基酸序列为如下(i1)或(i2)或(i3)：
(i1)序列表的序列16所示的氨基酸序列；
(i2)将序列表的序列16所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(i3)与序列表的序列16所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
以上任一所述PhaP3蛋白的编码基因(phaP3基因)如下(i4)或(i5)或(i6):
(i4)序列表的序列15所示的DNA分子；
(i5)与(i4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码PhaP3蛋白的DNA分子；
(i6)在严格条件下与(i4)或(i5)限定的核苷酸序列杂交，且编码PhaP3蛋白的DNA分子。
以上任一所述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
以上任一所述微生物胞内内含物具体可为PHA。
所述PHA具体可以包括PHB或P(3HB-co-4HB)。
当所述微生物或出发微生物为盐单胞菌Halomonas TD01或盐单胞菌TD-MmP1时，所述PHA具体为PHB。当所述微生物或出发微生物为盐单胞菌Halomonas TDH4时，所述PHA具体为P(3HB-co-4HB)。
按照本发明所述方法可以在微生物胞内得到大颗粒(2-15μm)内含物，所得大颗粒内含物有效降低固液分离所需的最小离心转速，有益于解决微生物内含物提取难度大、耗能高的问题。
附图说明
图1为实施例1中透射电子显微镜观察结果及胞内PHB颗粒轴向长度统计结果。
图2为实施例2中透射电子显微镜观察结果。
图3为实施例3中透射电子显微镜观察结果。
图4为实施例3中菌液离心效果图。
图5为实施例4中透射电子显微镜观察结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pHALORNA质粒：序列表的序列1所示的环状质粒。
质粒pQ08：参考文献：Qin Q,Ling C,Zhao Y,et al.CRISPR/Cas9Editing Genomeof Extremophile,Halomonas,spp[J].Metabolic Engineering,2018:S1096717618300053.；公众可以从清华大学获得。
pSEVA321载体：参考文献：Silva-Rocha R,Martinez-Garcia E,Calles B,etal.The Standard European Vector Architecture(SEVA):a coherent platform forthe analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes[J].NucleicAcids Research,2013,41(D1):D666-D675.；公众可以从清华大学获得。
大肠杆菌S17-1：美国菌种保藏中心American Type Culture Collection，ATCC编号:47055。
盐单胞菌Halomonas TD01：参考文献：Cai L,Tan D,Aibaidula G,etal.Comparative genomics study of polyhydroxyalkanoates(PHA)and ectoinerelevant genes from Halomonas sp.TD01revealed extensive horizontal genetransfer events and co-evolutionary relationships[J].Microbial CellFactories,10,1(2011-11-01),2011,10(1):88-88.；公众可以从清华大学获得。
盐单胞菌Halomonas TDH4：参考文献：Shen R,Yin J,Jian-Wen Ye,etal.Promoter Engineering for Enhanced P(3HB-co-4HB)Production by Halomonasbluephagenesis[J].ACS Synthetic Biology,7(8):1897-1906.；公众可以从清华大学获得。
盐单胞菌Halomonas TD-MmP1：记载于申请号为201610171174.3的中国发明专利“一种诱导外源基因在革兰氏阴性菌中表达的系统及其应用”中，公众可以从清华大学获得。
60LB液体培养基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，60g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
60LB固体培养基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，60g/L NaCl，2％(w/v)琼脂，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
酵母提取物：英国OXID公司，产品目录号LP0021。
蛋白胨：英国OXID公司，产品目录号LP0042。
50MMG培养基：50g/L NaCl，30g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，2g/L NH4Cl，0.2g/LMgSO4，9.65g/L Na2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4，10mL/L微量元素溶液I和1mL/L微量元素溶液II。其中微量元素溶液I的组成为：5g/L柠檬酸铁铵，2g/L CaCl2，用1M HCl配制。微量元素溶液II的组成为：100mg/L ZnSO4·7H2O，30mg/L MnCl2·4H2O，300mg/L H3BO3，200mg/L CoCl2·6H2O，10mg/L CuSO4·5H2O，20mg/L NiCl2·6H2O，30mg/L NaMoO4·2H2O，用1M HCl配制。培养基的最终pH用5M NaOH溶液调至8.5-9.0。上述试剂购自国药集团化学试剂公司。
下述实施例中的基因敲出通过CRISPR/Cas9方法实现。第一步，将含有Cas9蛋白编码基因的质粒导入受体菌；第二步，将含有gRNA序列及拟敲除基因的上下游同源臂序列的质粒导入第一步得到的菌株；第三步，挑取第二步得到的菌株克隆进行验证。具体方法可参考文献：Qin Q,Ling C,Zhao Y,et al.CRISPR/Cas9Editing Genome of Extremophile,Halomonas,spp[J].Metabolic Engineering,2018:S1096717618300053.。
下述实施例中，phaP1基因序列如序列表的序列11所示，其编码序列表的序列12所示的蛋白质。phaP2基因序列如序列表的序列13所示，其编码序列表的序列14所示的蛋白质。phaP3基因序列如序列表的序列15所示，其编码序列表的序列16所示的蛋白质。minC基因序列如序列表的序列8自5’端第255至1004位所示，其编码序列表的序列17所示的蛋白质。minD基因序列如序列表的序列8自5’端第1005至1823位所示，所示，其编码序列表的序列18所示的蛋白质。
实施例1、通过敲除PHA颗粒表面结合蛋白获得大颗粒内含物
一、phaP1基因敲除菌株的构建
1、将pHALORNA质粒的BbsI位点之间插入序列表的序列2所示的DNA分子，在BsaI位点之间插入序列表的序列5所示的DNA分子，得到phaP1基因敲除质粒pHALORNA-phaP1(已经测序验证)。序列表的序列2中，自5’端第17至36位为gRNA；序列表的序列5中，自5’端第1至500位为phaP1上游同源臂，第505至1004位为phaP1下游同源臂。
2、将质粒pQ08导入大肠杆菌S17-1，得到重组菌S17-1/pQ08，再通过接合转化方法将质粒转入盐单胞菌Halomonas TD01，得到重组菌Halomonas TD01/pQ08，具体步骤如下：
(1)将重组菌S17-1/pQ08和盐单胞菌Halomonas TD01分别接种于含有25μg/mL氯霉素的LB培养基和60LB液体培养基中培养至菌液OD＝3，将两种菌液各取1mL分别以2000×g离心2min，弃上清，分别以1mL LB液体培养基重悬，以2000×g离心2min，弃上清，分别以50μL LB液体培养基重悬混合。
(2)将步骤(1)得到的菌体混合液均匀涂布于含有25μg/mL氯霉素的60LB固体培养基上，37℃培养48h，获得阳性菌株。
3、将步骤1制备的质粒pHALORNA-phaP1导入大肠杆菌S17-1，得到重组菌S17-1/pHALORNA-phaP1，再通过接合转化方法将质粒转入步骤2制备的重组菌Halomonas TD01/pQ08，得到重组菌Halomonas TD01 ΔphaP1，具体步骤如下：
(1)将重组菌S17-1/pHALORNA-phaP1和重组菌Halomonas TD01/pQ08分别接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基和含有25μg/mL氯霉素的60LB液体培养基中培养至菌液OD＝3，将两种菌液各取1mL分别以2000×g离心2min，弃上清，分别以1mL LB液体培养基重悬，以2000×g离心2min，弃上清，分别以50μL LB液体培养基重悬混合。
(2)将步骤(1)得到的菌体混合液均匀涂布于含有25μg/mL氯霉素和100μg/mL壮观霉素的60LB固体培养基上，37℃培养48h，得到阳性菌株。
4、将步骤3得到的重组菌Halomonas TD01ΔphaP1用引物(CTTGGCCGATAAGTGCGGAC和TGCAGCTTGGAAACATTTACTCAAC)进行菌落PCR验证，采用盐单胞菌Halomonas TD01作为对照。结果对照菌得到的条带大小为1.6kb，重组菌Halomonas TD01ΔphaP1得到的条带大小为1.1kb。
5、将步骤4鉴定正确的重组敲除菌Halomonas TD01ΔphaP1在60LB液体培养基中培养传代丢失质粒，得到phaP1基因敲除菌株Halomonas TD01ΔphaP1。传代丢失质粒的过程如下：在37℃下，于60LB液体培养基中培养24h，然后取菌液稀释1000倍后取10μL涂布在60LB固体培养基上，37℃培养12h，挑取单克隆，分别在60LB、60LB+25μg/mL氯霉素和60LB+100μg/mL壮观霉素的固体培养基上划线，37℃培养12h，比较三块固体培养基上的菌落划线，在无抗培养基上生长而在有抗培养基上不生长的菌落即为质粒丢失了的菌落。如果没有，不断重复这个过程。
对盐单胞菌Halomonas TD01(野生型)和敲除菌株Halomonas TD01ΔphaP1进行测序，测序结果表明，敲除菌株和野生型的区别仅在于缺失染色体上的phaP1基因。
二、phaP1基因和phaP2基因双敲除菌株的构建
1、将pHALORNA质粒的BbsI位点之间插入序列表的序列3所示的DNA分子，在BsaI位点之间插入序列表的序列6所示的DNA分子，得到phaP2基因敲除质粒pHALORNA-phaP2(已经测序验证)。序列表的序列3中，自5’端第17至36位为gRNA；序列表的序列6中，自5’端第1至500位为phaP2上游同源臂，第505至1004位为phaP2下游同源臂。
2、采用质粒pHALORNA-phaP2替代质粒pHALORNA-phaP1，将菌种Halomonas TD01ΔphaP1替代菌种Halomonas TD01，按照步骤一中的2和3进行操作，得到重组菌HalomonasTD01ΔphaP1ΔphaP2。
3、将步骤2得到的重组菌Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP2用引物(CTGCCTGGGCCGCATTTTC和AGCCTCTGATGCAGACAAGC)进行菌落PCR验证，采用盐单胞菌Halomonas TD01作为对照。结果对照菌得到的条带大小为1.5kb，重组菌Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP2得到的条带大小为1.1kb。
4、将步骤3鉴定正确的重组敲除菌Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP2按照步骤一中的5进行操作，传代丢失质粒，得到phaP1基因和phaP2基因双敲除菌株Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP2。
对盐单胞菌Halomonas TD01(野生型)和敲除菌株Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP2进行测序，测序结果表明，敲除菌株和野生型的区别仅在于缺失了染色体上的phaP1和phaP2基因。
三、phaP1基因和phaP3基因双敲除菌株的构建
1、将pHALORNA质粒的BbsI位点之间插入序列表的序列4所示的DNA分子，在BsaI位点之间插入序列表的序列7所示的DNA分子，得到phaP3基因敲除质粒pHALORNA-phaP3(已经测序验证)。序列表的序列4中，自5’端第17至36位为gRNA；序列表的序列7中，自5’端第1至462位为phaP3上游同源臂，第463至912位为phaP3下游同源臂。
2、采用质粒pHALORNA-phaP3替代质粒pHALORNA-phaP1，将菌种Halomonas TD01ΔphaP1替代菌种Halomonas TD01，按照步骤一中的2和3进行操作，得到重组菌HalomonasTD01ΔphaP1ΔphaP3。
3、将步骤2得到的重组菌Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP3用引物(GATGTTAGCGTTGATACGCC和TAAAACGCCAAGTTGCGCTT)进行菌落PCR验证，采用盐单胞菌Halomonas TD01作为对照。结果对照菌得到的条带大小为1.7kb，重组菌Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP3得到的条带大小为1.3kb。
4、将步骤3鉴定正确的重组敲除菌Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP3在60LB按照步骤一中的5进行操作，传代丢失质粒，得到phaP1基因和phaP3基因双敲除菌株HalomonasTD01ΔphaP1ΔphaP3。
对盐单胞菌Halomonas TD01(野生型)和敲除菌株Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP3进行测序，测序结果表明，敲除菌株和野生型的区别仅在于缺失了染色体上的phaP1和phaP3基因。
四、敲除菌株的表征检测
待测菌株：Halomonas TD01、Halomonas TD01ΔphaP1、Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP2、Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP3。
将待测菌株接种于60LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h后按5％接种至50mL50MMG培养基，200rpm，37℃培养。培养48小时后，收集菌液，取出1mL备样进行透射电子显微镜观察，剩余菌液用以检测细胞干重和PHA含量。
透射电子显微镜观察方法如下：取1mL菌液放入1.5mL离心管，10000rpm离心1min收集菌体。用磷酸盐缓冲液洗涤两遍，之后用200μL 2.5％戊二醛固定菌体。样品用树脂包埋后，使用超薄切片机(Leica EM UC6)进行切片。用柠檬酸铅对切片进行染色后，再进行醋酸双氧铀染色。最后用透射电子显微镜(日立H-7650B)来观察菌体中PHA的颗粒形态。
测细胞干重和PHA含量方法如下：用量筒量取30mL菌液放入50mL离心管，10000rpm离心10min收集菌体。用去离子水重悬细胞洗涤一次，10000rpm离心10min，弃掉上清。将菌体在-80℃冷冻1h后，进行真空冷冻干燥12h以上至完全去除水分。称量取样前、冻干后离心管重量，其差值为细胞干重CDW。称取30至60mg冷冻干燥后的菌体，精确称重后置于酯化管中，加入2mL酯化液(500mL酯化液配制方法：485mL无水甲醇，0.5g苯甲酸，15mL浓硫酸)和2ml氯仿。称取10mg左右的PHA标准样品(Sigma-Aldrich，货号：363502)，同样方式处理备做酯化。酯化管加盖密封后100度反应4小时。反应结束后待酯化管冷却至室温，加入1ml去离子水，漩涡震荡至充分混合，静置分层。水相和有机相完全分离后，取下层有机相用于气相色谱法(GC)分析。
GC分析PHA组成及含量：使用岛津公司的GC-2014型气相色谱仪。色谱仪的配置为：HP-5型毛细管色谱柱，氢火焰离子化检测器FID，SPL分流进样口；高纯氮气作为载气，氢气为燃气，空气为助燃气；使用AOC-20S型自动进样器，色谱纯丙酮和氯仿为洗涤液。GC分析程序的设置为：进样口温度240度，检测器温度250度，柱温起始温度为80度，维持1.5分钟；以30度/分钟的速率升至140度并维持0分钟；以40度/分钟的速率升至240度并维持2分钟；总计时间为8分钟。GC结果采用内标归一法根据峰面积进行定量计算PHA组成及含量。
透射电子显微镜观察结果见图1。图1中，A是Halomonas TD01，B是Halomonas TD01ΔphaP1，C是Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP2，D是Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP3。其中，Halomonas TD01ΔphaP1，Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP2，Halomonas TD01ΔphaP1ΔphaP3的胞内积累了单个大PHB颗粒，轴向长度达1-2μm，而对照组Halomonas TD01的胞内PHB颗粒绝大多数的轴向长度不超过1μm。
细胞干重CDW及PHA组成及含量结果见表1。表1中每组数据来自于15个平行样(5个生物平行×3个技术平行)。结果表明，Halomonas TD01ΔphaP1在PHB含量上相对野生型对照没有减少的迹象。
表1细胞干重CDW及PHB含量统计结果
实施例2、通过敲除PHA颗粒表面结合蛋白和过表达minCD基因获得大颗粒内含物
一、重组菌株的获得
1、将实施例1的盐单胞菌Halomonas TD01替换为盐单胞菌Halomonas TD-MmP1，按照实施例1步骤一进行操作，得到敲除了phaP1基因的敲除菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1。
盐单胞菌TD-MmP1的染色体上插入了可诱导MmP1 RNA聚合酶编码基因。
对盐单胞菌Halomonas TD-MmP1和敲除菌株Halomonas TD-MmP1ΔphaP1进行测序，测序结果表明，两者区别仅在于缺失染色体上的phaP1基因。
2、构建pMmP1启动子诱导过表达minCD基因簇(minC基因和minD基因)的质粒pMmP1-minCD，经过测序，质粒pMmP1-minCD为在pSEVA321载体的XbaI和SpeI位点之间插入序列表的序列8所示的DNA分子得到的重组质粒。序列表的序列8中，自5’端第1至254位为pMmP1启动子，第255至1004位为minC基因，第1005至1823位为minD基因，第1824至2137位为终止子序列。
3、将步骤2得到的重组质粒pMmP1-minCD导入大肠杆菌S17-1，得到重组菌S17-1/pMmP1-minCD，再通过接合转化方法将质粒转入盐单胞菌Halomonas TD-MmP1，得到重组菌Halomonas TD-MmP1/pMmP1-minCD，具体步骤如下：
(1)将重组菌S17-1/pMmP1-minCD和盐单胞菌Halomonas TD-MmP1分别接种于含有25μg/mL氯霉素LB液体培养基和60LB液体培养基中培养至菌液OD＝3，将两种菌液各取1mL分别以2000×g离心2min，弃上清，分别以1mL LB液体培养基重悬，以2000×g离心2min，弃上清，分别以50μL LB液体培养基重悬混合。
(2)将步骤(1)得到的菌体混合液均匀涂布于含有25μg/mL氯霉素的60LB固体培养基上，37℃培养48h，获得阳性菌株，Halomonas TD-MmP1/pMmP1-minCD，用引物(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA和CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)进行菌落PCR验证，采用盐单胞菌Halomonas TD-MmP1作为对照。结果对照菌得到的条带大小为0，重组菌Halomonas TD-MmP1/pMmP1-minCD得到的条带大小为2.3kb。
4、采用重组敲除菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1替代盐单胞菌Halomonas TD-MmP1，按照步骤3进行操作，得到重组菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1/pMmP1-minCD。用引物(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA和CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)进行菌落PCR验证，采用盐单胞菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1作为对照。结果对照菌得到的条带大小为0，重组菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1/pMmP1-minCD得到的条带大小为2.3kb。
二、重组菌的表征检测
待测菌株：Halomonas TD-MmP1、Halomonas TD-MmP1/pMmP1-minCD、HalomonasTD-MmP1ΔphaP1和Halomonas TD-MmP1ΔphaP1/pMmP1-minCD。
将待测菌株接种于60LB液体培养基中(Halomonas TD-MmP1/pMmP1-minCD和Halomonas TD-MmP1ΔphaP1/pMmP1-minCD两组需添加25μg/mL氯霉素)，200rpm，37℃培养12小时后按5％接种至50mL 50MMG培养基(Halomonas TD-MmP1/pMmP1-minCD和HalomonasTD-MmP1ΔphaP1/pMmP1-minCD两组需添加25μg/mL氯霉素)，200rpm，37℃培养，在接种后3-4h加入10mg/L IPTG诱导MmP1RNA聚合酶启动转录。培养48小时后，收集菌液，取出1mL备样进行透射电子显微镜观察，剩余菌液用以检测细胞干重和PHA含量。检测方法同实施例1的步骤四。
透射电子显微镜观察结果见图2。图2中，A是Halomonas TD-MmP1，B是HalomonasTD-MmP1/pMmP1-minCD，C是Halomonas TD-MmP1ΔphaP1，D是Halomonas TD-MmP1ΔphaP1/pMmP1-minCD。其中，Halomonas TD-MmP1ΔphaP1/pMmP1-minCD胞内积累了大PHB颗粒，轴向长度达2-10μm；Halomonas TD-MmP1ΔphaP1胞内积累的PHB颗粒，轴向长度达1-2μm；Halomonas TD-MmP1和Halomonas TD-MmP1/pMmP1-minCD胞内积累的PHB颗粒，轴向长度不超过1μm。
此处，如不导入搭载minCD基因的质粒，而用类似前述方法敲除或遏制ftsZ家族基因或mreB家族基因，也能实现大PHA颗粒的效果。
细胞干重CDW及PHA组成及含量结果见表2。表2中每组数据来自于15个平行样(5个生物平行×3个技术平行)。结果表明，Halomonas TD-MmP1ΔphaP1/pMmP1-minCD在PHB含量上相对对照组没有减少的迹象。
表2细胞干重CDW及PHB含量统计结果
实施例3、合成P(3HB-co-4HB)的盐单胞菌phaP1敲除株的构建及相关表征
一、重组菌株的获得
1、将实施例1的盐单胞菌Halomonas TD01替换为盐单胞菌Halomonas TDH4，按照步骤一进行操作，得到敲除了phaP1基因的重组敲除菌Halomonas TDH4ΔphaP1。
盐单胞菌Halomonas TDH4的染色体上插入了pMmP1启动子诱导的罗氏真养菌phaCAB操纵子和克氏梭状芽胞杆菌4-羟基丁酸辅酶A转移酶编码基因orfZ，盐单胞菌TDH4可以利用葡萄糖和γ-丁内酯为底物合成P(3HB-co-4HB)。
对盐单胞菌Halomonas TDH4和敲除菌株Halomonas TDH4ΔphaP1进行测序，测序结果表明，两者区别仅在于缺失染色体上的phaP1基因。
2、将实施例2步骤一中的2得到的重组质粒pMmP1-minCD导入大肠杆菌S17-1，得到重组菌S17-1/pMmP1-minCD，再通过接合转化方法将质粒转入重组敲除菌Halomonas TDH4ΔphaP1，得到重组菌Halomonas TDH4ΔphaP1/pMmP1-minCD，具体步骤如下：
(1)将重组菌S17-1/pMmP1-minCD和盐单胞菌Halomonas TDH4ΔphaP1分别接种于含有25μg/mL氯霉素的LB液体培养基和60LB液体培养基中培养至菌液OD＝3，将两种菌液各取1mL分别以2000×g离心2min，弃上清，分别以1mL LB液体培养基重悬，以2000×g离心2min，弃上清，分别以50μL LB液体培养基重悬混合。
(2)将步骤(1)得到的菌体混合液均匀涂布于含有25μg/mL氯霉素的60LB固体培养基上，37℃培养48h，获得阳性菌株，Halomonas TD-MmP1/pMmP1-minCD，用引物(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA和CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)进行菌落PCR验证，采用盐单胞菌Halomonas TD-MmP1作为对照。结果对照菌得到的条带大小为0，重组菌Halomonas TD-MmP1/pMmP1-minCD得到的条带大小为2.3kb。
二、重组菌株的表征监测
待测菌株：Halomonas TDH4，Halomonas TDH4ΔphaP1和Halomonas TDH4ΔphaP1/pMmP1-minCD。
将待测菌株接种于60LB液体培养基中(Halomonas TDH4ΔphaP1/pMmP1-minCD的培养基中添加25μg/mL氯霉素)，200rpm，37℃培养12小时后按5％接种至50mL 50MMG培养基(Halomonas TDH4ΔphaP1/pMmP1-minCD的培养基中添加25μg/mL氯霉素)，200rpm，37℃培养，在接种后3-4h加入10mg/L IPTG诱导MmP1RNA聚合酶启动转录，在接种后9-10h加入5g/Lγ-丁内酯(MACKLIN/麦克林，货号：H811082)。培养48小时后，收集菌液，取出1mL备样进行透射电子显微镜观察，剩余菌液用以检测细胞干重和PHA含量。检测方法同实施例1的步骤四。
透射电子显微镜观察结果见图3。图3中，A是Halomonas TDH4，B是Halomonas TDH4ΔphaP1，C是Halomonas TDH4ΔphaP1/pMmP1-minCD。其中，Halomonas TDH4ΔphaP1/pMmP1-minCD胞内积累了大P(3HB-co-4HB)颗粒，轴向长度达2-5μm，Halomonas TDH4胞内P(3HB-co-4HB)颗粒轴向长度不超过1μm，Halomonas TDH4ΔphaP1胞内P(3HB-co-4HB)颗粒轴向长度不超过2μm。
细胞干重CDW及PHA组成及含量结果见表3。表3中每组数据来自于15个平行样(5个生物平行×3个技术平行)。结果表明，TDH4ΔphaP1在细胞干重上相对对照组没有减少的迹象，在P(3HB-co-4HB)含量上略有提高。TDH4ΔphaP1/pMmP1-minCD在P(3HB-co-4HB)含量上没有减少的迹象。
表3细胞干重CDW及P(3HB-co-4HB)含量统计结果
将2mL TDH4和TDH4ΔphaP1的48h培养菌液装入2mL离心管，使用3000×g进行离心，观察现象见图4。TDH4ΔphaP1内有单个大颗粒PHA(轴向长度约1-2μm)，以3000×g的低转速离心3分钟，初步实现固液分离，离心5分钟，基本上可以实现固液分离，而对照组TDH4胞内积累多个小颗粒(轴向长度约0.1-0.5μm)以3000×g离心无法实现固液分离。
实施例4、染色体重组实现形态延长的盐单胞菌phap敲除株的构建及相关表征
一、重组菌株的构建
1、将pHALORNA质粒的BbsI位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分子，在BsaI位点之间插入序列表的序列10所示的DNA分子，得到minC基因上游启动子替换质粒pHALORNA-minC(已经测序验证)。序列表的序列9中，自5’端第17至36位为gRNA；序列表的序列10中，第1至500位为上游同源臂，第501至758位为pMmP1启动子，第759至1258位为下游同源臂。
使用质粒pHALORNA-minC进行基因编辑，可替换染色体上minC基因前的启动子为可诱导型启动子pMmP1。
2、将质粒pQ08导入大肠杆菌S17-1，得到重组菌S17-1/pQ08，再通过接合转化方法将质粒转入Halomonas TD-MmP1ΔphaP1，得到重组菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1/pQ08，具体步骤如下：
(1)将重组菌S17-1/pQ08和盐单胞菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1分别接种于含有25μg/mL氯霉素的LB液体培养基和60LB液体培养基中，培养至菌液OD＝3，将两种菌液各取1mL分别以2000×g离心2min，弃上清，分别以1mL LB液体培养基重悬，以2000×g离心2min，弃上清，分别以50μL LB液体培养基重悬混合。
(2)将步骤(1)得到的菌体混合液均匀涂布于含有25μg/mL氯霉素的60LB固体培养基上，37℃培养48h，获得阳性菌株。
3、将步骤1制备的质粒pHALORNA-minC导入大肠杆菌S17-1，得到重组菌S17-1/pHALORNA-minC，再通过接合转化方法将质粒转入步骤2制备的重组菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1/pQ08，得到重组菌Halomonas TD01ΔphaP1，具体步骤如下：
(1)将重组菌S17-1/pHALORNA-minC和重组菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1/pQ08分别接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基和含有25μg/mL氯霉素的60LB液体培养基中培养至菌液OD＝3，将两种菌液各取1mL分别以2000×g离心2min，弃上清，分别以1mL LB液体培养基重悬，以2000×g离心2min，弃上清，分别以50μL LB液体培养基重悬混合。
(2)将步骤(1)得到的菌体混合液均匀涂布于含有25μg/mL氯霉素和100μg/mL壮观霉素的60LB固体培养基上，37℃培养48h，得到阳性菌株。
4、将步骤3得到的重组菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1 pMmP1 minC用引物(ATCATTTCGCAGCTGGGTGA和ATGAATACCCGCTAACGCTC)进行菌落PCR验证，采用盐单胞菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1作为对照。结果对照菌得到的条带大小为1.3kb，重组菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1 pMmP1 minC得到的条带大小为1.4kb，经测序验证。
5、将步骤4鉴定正确的重组菌Halomonas TD-MmP1ΔphaP1 pMmP1 minC在60LB液体培养基中培养传代丢失质粒，得到Halomonas TD-MmP1ΔphaP1 pMmP1 minC。传代丢失质粒的过程如下：在37℃下，于60LB液体培养基中培养24h，然后取菌液稀释1000倍后取10μL涂布在60LB固体培养基上，37℃培养12h，挑取单克隆，分别在60LB、60LB+25μg/mL氯霉素和60LB+100μg/mL壮观霉素的固体培养基上划线，37℃培养12h，比较三块固体培养基上的菌落划线，在无抗培养基上生长而在有抗培养基上不生长的菌落即为质粒丢失了的菌落。如果没有，不断重复这个过程。
对Halomonas TD-MmP1ΔphaP1和Halomonas TD-MmP1ΔphaP1 pMmP1 minC进行测序，测序结果表明，两者区别仅在于缺失染色体上的minC基因前的启动子不同，前者为天然启动子，后者为pMmP1。
二、重组菌株的表征检测
待测菌株：Halomonas TD-MmP1ΔphaP1和Halomonas TD-MmP1ΔphaP1 pMmP1minC。
将待测菌株接种于60LB液体培养基中，200rpm，37℃培养12小时后按5％接种至50mL50MMG培养基，200rpm，37℃培养，在接种后3-4h加入10mg/L IPTG诱导MmP1RNA聚合酶启动转录。培养48小时后，收集菌液，取出1mL备样进行透射电子显微镜观察，剩余菌液用以检测细胞干重和PHA含量。检测方法同实施例1的步骤八。
透射电子显微镜观察结果见图5。图5中，A是Halomonas TD-MmP1ΔphaP1，B是Halomonas TD-MmP1ΔphaP1 pMmP1 minC。其中，Halomonas TD-MmP1ΔphaP1 pMmP1 minC胞内积累了大PHA颗粒，轴向长度达4-5μm，对照组为1-2μm。
细胞干重CDW及PHA组成及含量结果见表4。表4中每组数据来自于15个平行样(5个生物平行×3个技术平行)。结果表明，Halomonas TD-MmP1ΔphaP1 pMmP1 minC在PHB含量上相对于对照组Halomonas TD-MmP1ΔphaP1有显著提升，在细胞干重方面有小幅提高。
表4细胞干重CDW及P(3HB-co-4HB)含量统计结果
除了上述方法，用类似实施例2中的方法，对聚磷菌进行外源基因导入搭载minCD基因的质粒，或者通过敲除或遏制ftsZ家族同源基因或mreB家族同源基因，也可实现聚磷菌的形态延伸，聚合更大的团聚的聚磷酸。
序列表
<110> 清华大学
<120> 一种微生物胞内大颗粒内含物的制备方法及其应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4727
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcggataac aatttcacac aggagctctt cagagtgaac tcgagtaggg ataacagggt 60
aatagatcta agcttctgca ggtcgactct agagaattca aaaaaagcac cgactcggtg 120
ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac ttgctatttc tagctctaaa 180
acctgtcttc gctggaagac tgactagtat tatacctagg actgagctag ctgtcaagga 240
tccagcatat gcggtgagac caaaaggtct caagtctcgt gaagagcgga tgaatgtcag 300
ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag 360
tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt 420
gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt 480
cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg 540
atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 600
gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 660
ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 720
gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 780
cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 840
gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 900
tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 960
gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 1020
tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 1080
catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 1140
ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 1200
ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 1260
tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 1320
tcgccttctt gacgagttct tctgagaacc ttgaccgaac gcagcggtgg taacggcgca 1380
gtggcggttt tcatggcttg ttatgactgt ttttttgggg tacagtctat gcctcgggca 1440
tccaagcagc aagcgcgtta cgccgtgggt cgatgtttga tgttatggag cagcaacgat 1500
gttacgcagc agggcagtcg ccctaaaaca aagttaaaca tcatgaggga agcggtgatc 1560
gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg 1620
acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt 1680
gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg 1740
atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta 1800
gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa 1860
ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga gccagccacg 1920
atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta 1980
ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta 2040
aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta 2100
gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat 2160
gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa 2220
gctagacagg cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg 2280
gaagaatttg tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataaactagt 2340
aaataataaa aaagccggat taataatctg gctttttata ttctctgcat aaccctgctt 2400
cggggtcatt atagcgattt tttcggtata tccatccttt ttcgcacgat atacaggatt 2460
ttgccaaagg gttcgtgtag actttccttg gtgtatccaa cggcgtcagc cgggcaggat 2520
aggtgaagta ggcccacccg cgagcgggtg ttccttcttc actgtccctt attcgcacct 2580
ggcggtgctc aacgggaatc ctgctctgcg aggctggccg taggccggcc gataatctca 2640
tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 2700
tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 2760
aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 2820
aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt 2880
taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 2940
taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 3000
agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 3060
tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 3120
cgcttcccga agggagaaag gcggacaggc atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 3180
agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 3240
gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 3300
aaaacgccag caacgcggcc gtgaaaggca ggccggtccg tggtggccac ggcctctagg 3360
ccagatccag cggcatctgg gttagtcgag cgcgggccgc ttcccatgtc tcaccagggc 3420
gagcctgttt cgcgatctca gcatctgaaa tcttcccggc cttgcgcttc gctggggcct 3480
tacccaccgc cttggcgggc ttcttcggtc caaaactgaa caacagatgt gtgaccttgc 3540
gcccggtctt tcgctgcgcc cactccacct gtagcgggct gtgctcgttg atctgcgtca 3600
cggctggatc aagcactcgc aacttgaagt ccttgatcga gggataccgg ccttccagtt 3660
gaaaccactt tcgcagctgg tcaatttcta tttcgcgctg gccgatgctg tcccattgca 3720
tgagcagctc gtaaagcctg atcgcgtggg tgctgtccat cttggccacg tcagccaagg 3780
cgtatttggt gaactgtttg gtgagttccg tcaggtacgg cagcatgtct ttggtgaacc 3840
tgagttctac acggccctca ccctcccggt agatgattgt ttgcacccag ccggtaatca 3900
tcacactcgg tcttttcccc ttgccattgg gctcttgggt taaccggact tcccgccgtt 3960
tcaggcgcag ggccgcttct ttgagctggt tgtaggaaga ttcgataggg acacccgcca 4020
tcgtcgctat gtcctccgcc gtcactgaat acatcacttc atcggtgaca ggctcgctcc 4080
tcttcacctg gctaatacag gccagaacga tccgctgttc ctgaacactg aggcgatacg 4140
cggcctcgac cagggcattg cttttgtaaa ccattggggg tgaggccacg ttcgacattc 4200
cttgtgtata aggggacact gtatctgcgt cccacaatac aacaaatccg tccctttaca 4260
acaacaaatc cgtcccttct taacaacaaa tccgtccctt aatggcaaca aatccgtccc 4320
tttttaaact ctacaggcca cggattacgt ggcctgtaga cgtcctaaaa ggtttaaaag 4380
ggaaaaggaa gaaaagggtg gaaacgcaaa aaacgcacca ctacgtggcc ccgttggggc 4440
cgcatttgtg cccctgaagg ggcgggggag gcgtctgggc aatccccgtt ttaccagtcc 4500
cctatcgccg cctgagaggg cgcaggaagc gagtaatcag ggtatcgagg cggattcacc 4560
cttggcgtcc aaccagcggc accagcggcg cctgagaggg gcgcgcccag ctgtctaggg 4620
cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc 4680
ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctt taattaa 4727
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agccgaagac tgtagtgcaa gagagtcaga aaatgggttt ctgtcttctg ta 52
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agccgaagac tgtagtgctc atcagctgac gcatttgttt ctgtcttctg ta 52
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agccgaagac tgtagtcatt aatttctgtc gcgctggttt ctgtcttctg ta 52
<210> 5
<211> 1004
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agaaaattga atacgctatc ggacgttacg ttcgcgagac gcatcgcttg tatagtgtgc 60
tagatcaacg cctatcccag cagcattacg tgggcggcga tcgttactcc attgcagata 120
tggcgattta tccatgggtt gtgccatggg agaagcagcg ccaaacgcta gaagagtttc 180
ctgacttaga acgatggttt gatgaaatag cgcaacgccc tgctgtccga aaagcttatt 240
ctttgatcga agatgtcaac ccgcaggcgg ggggcgaaat ggatgagcat gcacgtaaat 300
acttgtttgg caatcgctaa gtagtcactg gttggttgat ggggttgttg ttgtcggtgg 360
ctagtcgcaa tgttatgaaa aaatcatgtt gcgctgcaca aaaagcactg ctagctttgt 420
tgttagtaaa ggcaaccgcc tgatcatcga ccgctcatcg atgcgtgtcg aatcgctagc 480
tcacttaagg agattatgtg aaggacgcta ttaattgata gataaaatgc cgcaccgtca 540
tcatcaggtg cggcattttt ttgtttacac gcatctgaaa gcgttgtgga gcgctatctc 600
gccaggtaca aaaaagagtg gctgtatgcg gtaagtggct tttcgcggtg atgtgccaat 660
tacggcagct gctgctcagc ccgtacgttt agcctaaagc gggcgatacg gataatctcc 720
ttaatggccg tttcacgctc ttcagctaaa ccattgtgta agcgtacttc aaacgctgcc 780
aagatggcgt ggcgatcaag tccctttacg gcaatgacga aggggaagcc aaatttttct 840
ttgtaagcgg cattaagttt ttcgaagcgg gcaaactctt caggcgtaca ctgatctaac 900
ccagcgcctg cttgttcgcg ggtagagtct tgagtcagct cgcccgacat cgccgctttg 960
cctgctaagt cagggtgagc ctgtataaca gcgatttgct gttc 1004
<210> 6
<211> 1004
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atccgcgcga cagcatgaat aaatgccgtg ggcattggtg tatgcgagac aggaaagttg 60
ttgatagccc gttgggtttg agcgccataa agcgcatttg caggcacatc gagctcaccc 120
atgctatccc gttcaatacg tgtatccatc cttgcactcc ttttttaaag acgacttagc 180
taacgtcgct cacatcacta acatcacatt tcccaatgat tattttagtg ataacggtta 240
tctatacgct taagcctagc cctagcggcg cgttaggtaa attcgagtgc atcatcgact 300
cacacagcta catccacacg atctttaaat tcactccaca gaaatgttgc actgcacaaa 360
accccctgtt atgctgcaac gcaagataac tagatatcag ctgcggtggg tgcttaacaa 420
aaccgttgct gatcaaccaa cactaacggc accgtcaatc aatgggccga ttagtgggca 480
atggaacagg agtgtttacc aaggtctgtt gcagttattg acttgctgtc attaaaaagc 540
ccctgccagt gatctggcag gggctttttg tcaattgcgc tttaccaatt gagagcggac 600
ttgacgaaag gaatggtcaa tttccgctta gcggataatg acgcttgatc tagcgtctcg 660
agtgcacgac acaaatcccc caactcccgc ggcccacggt gcataatata gcgccctacg 720
tcatcgggca gctgcattcc tcgtacgttg gcgcgaagct ttagcgccgc taggcgttcg 780
ttatcatcca atggatgcag atgaaacgta actccccagg tcaatcgtga tgccaagtca 840
ggcaatgcaa catctaactg gcgtggagac gtattggcgg caatcactaa ggctttgcct 900
gcatcacgca gccgattaaa ggcgtgaaac agcgcctctt cccaacgctt acgccctatc 960
acatattcaa gatcatcaat ggcgaccaga tccaggcgtt caat 1004
<210> 7
<211> 912
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atctggggtg gatggctatg accccatgaa tctaatgcga ccttttctgc agcagccaat 60
gatgcagcag ggagtctcgc aagggctggc taatttcggc acgtatcaac agatgatgtt 120
ggatatgttg cgcaaagcgg gaacctcagg cggcagtgct gaacaggata gcgacacgag 180
ccaagacgag tcccaagaag cagctaaacc aaagccagca gcatcaggta aaagcgcatc 240
aagtgcgaga agctccaaag cgaaagcgac agcttcttcg cgttctcgcg ctaaagggta 300
gaaatgtaat gtgaaatgtg tagcgttgtt gagcgtgctg ctaaggatgt tgcaaagcag 360
cattgcagcg tttactcttt ttgcagtgca gcaattttgc catgtgatga gccactccag 420
gctcatgcca aggaacgaga gacaggagca gacactatgc aacctctgcc acgaaaagtg 480
aacagcctgc gaaagcgact agccagtctt cacgtaaaag ctaaacgcaa ctatgttcgc 540
ggcgccttga aggcgccgcg ttcttttgga tgatgtgcct gggcagataa tgccaagcag 600
gtgagggaga gtgagtatgc tgtcagggtg gaaaatgccg tctcaaggtg tttctcaaga 660
agagcttgaa gcatggaaag tgcagctaag cgatgttggt gaacagtata aaggcctgct 720
tgaggatttg ctgtcacgga tggttcctag tgaagctgct gactccgttc aaagtgatat 780
gcgagaaagc ttcgaagccg ccgcgcaatc gctgatgagt aaccctaacc tgctgtggca 840
aactcagtcg cgattgctac aagatcagtg gctgctttgg caacagggtg tgcgcgctat 900
gtctggcgag ca 912
<210> 8
<211> 2137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctagagctcg gtaccaaatt ccagaaaaga ggccgcgaaa gcggcctttt ttcgttttgg 60
tcctactaga tgcctccaca ccgctcgtca catcctgccc atgagttaat tatatttgtg 120
gcattatagg gagaattgtg agcgctcaca attagctgtc accggatgtg ctttccggtc 180
tgatgagtcc gtgaggacga aacagcctct acaaataatt ttgtttaata ctagagaaag 240
aggagaaata ctagatgagc ctcaacgcca atagtgccga cattgccttc accttcaaag 300
gtggcatgct gccaatgacc gtcatggaat tgagcagcgc tgacccggaa catatacgaa 360
gtcagctagc tggcaagttg tcgcaatccc ccgcgttctt tcagcataca ccggttgtgc 420
tgagcgtgga aaaactcgat gaacctcact tggcgcttga gcgcatttgc gcggtctgtc 480
gcgatcataa attattcccg gtagccgtac gtggcggagc tgaacctgta cgccaatctg 540
cctgggcatt agggctaggc tgggttgcgc ctgttgaaga agggcggact aggctgttag 600
agagcgttgg tcctgccgcg atctctgatg acgccataga ggaggtggaa cctgccgagc 660
aggaagtggt ggcggtggca acacgcttat ttcgcggtac ggttcgctct ggccaacagg 720
tgagcgcatc agaaggcgat ctagtggtga ttggggcagt aaatgcgggc gctgaagtgt 780
tggcggccgg tagtatccat gtatacggag cactccgtgg acgagcgtta gcgggtattc 840
atggaaatac tcaggcgggt atttactgtc gggaattaga agcagagctt ctctccgtgg 900
cagggaatta caaacgctta gaagatattg attctcagtt gcttggtcgc gctacagagg 960
tgcatttcgc tcaagagcag ctggaaatta agccgctggg ataattggcc aaaattattg 1020
tagtgacctc cggtaaaggg ggggttggta agaccactag cgctgccgcc atttcaacag 1080
gcctcgccct gcgtggtaaa aaaacagtcg tcattgattt cgatgttggt ctacgtaacc 1140
tcgacttgat catgggctgt gagcgccgcg ttgtttatga cttggtaaac gttatccaag 1200
gggaagcagg gcttaatcag gcgctgattc gcgataaacg cgttgaaacc ctatttattc 1260
tcccagcctc tcaaacgcgt gataaagatg cactaacgca ggaaggcgta gagcgaatac 1320
tcgagcagct caaacaagat tttgatttta tcttgtgtga ctcccccgca ggcattgagc 1380
gaggtgccca gctcgctatg tacttcgctg atgaggcgat tgttgtcacg aatcctgaag 1440
tttcctcagt gcgtgactct gaccgcattt tggggctact tggttccaag acgcggcgcg 1500
ctgaacaaag cctggatccg gttaaagagc atttgctgat tacgcgctat aacccttctc 1560
gcgtaacgtc tggggatatg ctgaccctgg atgacattcg tgaaatcttg tctattgatc 1620
tgcttggcct catccctgaa tccgaagcgg tgctacgtgc atctaaccaa ggcgttcctg 1680
ttactcacga tgcagcgagc gatgcaggtc aggcgtattc agatactgta tcgcgcctgt 1740
taggtgaaga tatgcctctg cgcttccatg aagtacagcg taagggattg ttgaaccgta 1800
tgttcggggg tggtcggcga tgatgataag ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt 1860
cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc 1920
acactggctc accttcgggt gggcctttct gcgtttatat actagagctg ctaacaaagc 1980
ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg 2040
ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga ggaactatat ccggattact 2100
agaggtcatg cttgccatct gttttcttgc aagatta 2137
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agccgaagac tgtagtcctg aacatgacat ggagttgttt ctgtcttctg ta 52
<210> 10
<211> 1258
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttaacagtt ttttgagact ctcttcgctt tcaatccgct gagctgcttg atggcgcact 60
gccgccacac cgttatggca ggcttggtga acgaggtcgc tttcatcggt taactgctct 120
aacgcggtga gtcgcaggtt tagattgtcg ccctgaagcg caatggcgtt gagcagccga 180
ggctccgcta gctccgcgac aatagcctgt cgctgctgca gggcggtgtg tccctgtgtg 240
ccacataaac gctgacaaac cgcgttaaac caagcctcgt tttgacgatg ctctggaagc 300
gcgttgacaa gccccgttaa atcatcaagg gcctgcaagg cagcaagctg gatgttactt 360
tcgttatcct gtgctaattg ctttagcgct tgttgctgtt ctggttgttg agggtcaagc 420
tggtcgagtg ccttgagacg cacctcggga tcagggtgct gccaccgagg agcgaacagg 480
cgtcttaaca gtccgtgcat gcttctagag ctcggtacca aattccagaa aagaggccgc 540
gaaagcggcc ttttttcgtt ttggtcctac tagatgcctc cacaccgctc gtcacatcct 600
gcccatgagt taattatatt tgtggcatta tagggagaat tgtgagcgct cacaattagc 660
tgtcaccgga tgtgctttcc ggtctgatga gtccgtgagg acgaaacagc ctctacaaat 720
aattttgttt aatactagag aaagaggaga aatactagat gagcctcaac gccaatagtg 780
ccgacattgc cttcaccttc aaaggtggca tgctgccaat gaccgtcatg gaattgagca 840
gcgctgaccc ggaacatata cgaagtcagc tagctggcaa gttgtcgcaa tcccccgcgt 900
tctttcagca tacaccggtt gtgctgagcg tggaaaaact cgatgaacct cacttggcgc 960
ttgagcgcat ttgcgcggtc tgtcgcgatc ataaattatt cccggtagcc gtacgtggcg 1020
gagctgaacc tgtacgccaa tctgcctggg cattagggct aggctgggtt gcgcctgttg 1080
aagaagggcg gactaggctg ttagagagcg ttggtcctgc cgcgatctct gatgacgcca 1140
tagaggaggt ggaacctgcc gagcaggaag tggtggcggt ggcaacacgc ttatttcgcg 1200
gtacggttcg ctctggccaa caggtgagcg catcagaagg cgatctagtg gtgattgg 1258
<210> 11
<211> 357
<212> DNA
<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)
<400> 11
atgaacaagg ccgcagagaa atccacccag cagtttgagt ctgtctttgt atcgccaatg 60
cgttcttata ccttggcagc gcttgactac tatcagcagg ttgttagcgc gcaaatggat 120
gcagcacgtg cttactcaga tatgactatt gcccaggcac gtacatggtt agacgtgaaa 180
gatgccgaca gcttcaaaaa agccatggaa agtcagcaaa aaacagcgtc tgacctaatg 240
gagcgcatga aaggagactc tgaaaaagtc acctctatta gccaaaactt tatgcaagag 300
agtcagaaaa tggcggaaga gaccactaaa aaagcagtgg aaactgctaa gcaataa 357
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)
<400> 12
Met Asn Lys Ala Ala Glu Lys Ser Thr Gln Gln Phe Glu Ser Val Phe
1 5 10 15
Val Ser Pro Met Arg Ser Tyr Thr Leu Ala Ala Leu Asp Tyr Tyr Gln
20 25 30
Gln Val Val Ser Ala Gln Met Asp Ala Ala Arg Ala Tyr Ser Asp Met
35 40 45
Thr Ile Ala Gln Ala Arg Thr Trp Leu Asp Val Lys Asp Ala Asp Ser
50 55 60
Phe Lys Lys Ala Met Glu Ser Gln Gln Lys Thr Ala Ser Asp Leu Met
65 70 75 80
Glu Arg Met Lys Gly Asp Ser Glu Lys Val Thr Ser Ile Ser Gln Asn
85 90 95
Phe Met Gln Glu Ser Gln Lys Met Ala Glu Glu Thr Thr Lys Lys Ala
100 105 110
Val Glu Thr Ala Lys Gln
115
<210> 13
<211> 375
<212> DNA
<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)
<400> 13
atgcaaacat ttaacaccaa cgaaatgacc cagcagttcg acaacatgtt catggcacct 60
gtgcgtgcat acatgacgct aagcatcgat tactctgaaa aaatgcttaa cgcacagctt 120
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aaaggccaaa aactgacaga agataatgta aagcaagcac aagctgctgc tagcaaaatg 360
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<210> 14
<211> 124
<212> PRT
<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)
<400> 14
Met Gln Thr Phe Asn Thr Asn Glu Met Thr Gln Gln Phe Asp Asn Met
1 5 10 15
Phe Met Ala Pro Val Arg Ala Tyr Met Thr Leu Ser Ile Asp Tyr Ser
20 25 30
Glu Lys Met Leu Asn Ala Gln Leu Asp Ala Asn Lys Ser Tyr Val Asp
35 40 45
Thr Gly Ile Ala Gln Met Arg Gln Leu Met Ser Val Lys Asp Ala Asn
50 55 60
Gly Leu Arg Ser Tyr Met Glu Gly Gln Gln Lys Val Ala Lys Glu Leu
65 70 75 80
Ala Glu Arg Val Lys Gly Asp Ala Asp Lys Ala Val Ala Leu Gln Gln
85 90 95
Asp Phe Leu Gln Lys Gly Gln Lys Leu Thr Glu Asp Asn Val Lys Gln
100 105 110
Ala Gln Ala Ala Ala Ser Lys Met Ser Lys Thr Ala
115 120
<210> 15
<211> 411
<212> DNA
<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)
<400> 15
atgcaagata aaatgatgga cgcctttagt acccaaactc gccaaatgtt tgagccaatg 60
cgtaaaatga actcgctaat gctcaacaac atggaaaaaa tgactcagta tcagctggaa 120
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<210> 16
<211> 136
<212> PRT
<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)
<400> 16
Met Gln Asp Lys Met Met Asp Ala Phe Ser Thr Gln Thr Arg Gln Met
1 5 10 15
Phe Glu Pro Met Arg Lys Met Asn Ser Leu Met Leu Asn Asn Met Glu
20 25 30
Lys Met Thr Gln Tyr Gln Leu Glu Ala Met Lys Arg Tyr Ser Gln Met
35 40 45
Gly Thr Glu Arg Ile Arg Ser Ala Thr Glu Ile Asn Asp Ala Glu Ser
50 55 60
Leu Arg Asp Phe Ser Thr Lys Gln Ala Glu Met Met Asn Glu Leu Ser
65 70 75 80
Gln Gln Met Gln Glu Asp Ala Arg Val Met Gly Glu Met Ser Leu Gln
85 90 95
Phe Lys Ser Glu Met Glu Lys Leu Phe Ser Glu Ala Gly Gln Lys Met
100 105 110
Gly Glu Gln Ala Thr Ser Ala Thr Lys Ser Glu Gln Pro Ala Lys Ala
115 120 125
Thr Ser Gln Ser Ser Arg Lys Ser
130 135
<210> 17
<211> 249
<212> PRT
<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)
<400> 17
Met Ser Leu Asn Ala Asn Ser Ala Asp Ile Ala Phe Thr Phe Lys Gly
1 5 10 15
Gly Met Leu Pro Met Thr Val Met Glu Leu Ser Ser Ala Asp Pro Glu
20 25 30
His Ile Arg Ser Gln Leu Ala Gly Lys Leu Ser Gln Ser Pro Ala Phe
35 40 45
Phe Gln His Thr Pro Val Val Leu Ser Val Glu Lys Leu Asp Glu Pro
50 55 60
His Leu Ala Leu Glu Arg Ile Cys Ala Val Cys Arg Asp His Lys Leu
65 70 75 80
Phe Pro Val Ala Val Arg Gly Gly Ala Glu Pro Val Arg Gln Ser Ala
85 90 95
Trp Ala Leu Gly Leu Gly Trp Val Ala Pro Val Glu Glu Gly Arg Thr
100 105 110
Arg Leu Leu Glu Ser Val Gly Pro Ala Ala Ile Ser Asp Asp Ala Ile
115 120 125
Glu Glu Val Glu Pro Ala Glu Gln Glu Val Val Ala Val Ala Thr Arg
130 135 140
Leu Phe Arg Gly Thr Val Arg Ser Gly Gln Gln Val Ser Ala Ser Glu
145 150 155 160
Gly Asp Leu Val Val Ile Gly Ala Val Asn Ala Gly Ala Glu Val Leu
165 170 175
Ala Ala Gly Ser Ile His Val Tyr Gly Ala Leu Arg Gly Arg Ala Leu
180 185 190
Ala Gly Ile His Gly Asn Thr Gln Ala Gly Ile Tyr Cys Arg Glu Leu
195 200 205
Glu Ala Glu Leu Leu Ser Val Ala Gly Asn Tyr Lys Arg Leu Glu Asp
210 215 220
Ile Asp Ser Gln Leu Leu Gly Arg Ala Thr Glu Val His Phe Ala Gln
225 230 235 240
Glu Gln Leu Glu Ile Lys Pro Leu Gly
245
<210> 18
<211> 272
<212> PRT
<213> 盐单胞菌(Halomonas sp.)
<400> 18
Met Ala Lys Ile Ile Val Val Thr Ser Gly Lys Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ile Ser Thr Gly Leu Ala Leu Arg Gly Lys
20 25 30
Lys Thr Val Val Ile Asp Phe Asp Val Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu
35 40 45
Ile Met Gly Cys Glu Arg Arg Val Val Tyr Asp Leu Val Asn Val Ile
50 55 60
Gln Gly Glu Ala Gly Leu Asn Gln Ala Leu Ile Arg Asp Lys Arg Val
65 70 75 80
Glu Thr Leu Phe Ile Leu Pro Ala Ser Gln Thr Arg Asp Lys Asp Ala
85 90 95
Leu Thr Gln Glu Gly Val Glu Arg Ile Leu Glu Gln Leu Lys Gln Asp
100 105 110
Phe Asp Phe Ile Leu Cys Asp Ser Pro Ala Gly Ile Glu Arg Gly Ala
115 120 125
Gln Leu Ala Met Tyr Phe Ala Asp Glu Ala Ile Val Val Thr Asn Pro
130 135 140
Glu Val Ser Ser Val Arg Asp Ser Asp Arg Ile Leu Gly Leu Leu Gly
145 150 155 160
Ser Lys Thr Arg Arg Ala Glu Gln Ser Leu Asp Pro Val Lys Glu His
165 170 175
Leu Leu Ile Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Arg Val Thr Ser Gly Asp Met
180 185 190
Leu Thr Leu Asp Asp Ile Arg Glu Ile Leu Ser Ile Asp Leu Leu Gly
195 200 205
Leu Ile Pro Glu Ser Glu Ala Val Leu Arg Ala Ser Asn Gln Gly Val
210 215 220
Pro Val Thr His Asp Ala Ala Ser Asp Ala Gly Gln Ala Tyr Ser Asp
225 230 235 240
Thr Val Ser Arg Leu Leu Gly Glu Asp Met Pro Leu Arg Phe His Glu
245 250 255
Val Gln Arg Lys Gly Leu Leu Asn Arg Met Phe Gly Gly Gly Arg Arg
260 265 270
Claims (13)
1.提高微生物胞内内含物颗粒大小的方法，为如下（a1）-（a4）中的至少一种：
（a1）抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
（a2）降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性；
（a3）抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达，同时过表达微生物中分裂环抑制蛋白的编码基因；
（a4）降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性，同时提高微生物中分裂环抑制蛋白的表达量和/或活性；
所述（a1）或（a2）中，所述PHA颗粒表面结合蛋白为PhaP1蛋白、PhaP1蛋白和PhaP2蛋白的组合或PhaP1蛋白和PhaP3蛋白的组合；
所述（a3）或（a4）中，所述PHA颗粒表面结合蛋白为PhaP1蛋白，所述分裂环抑制蛋白为MinCD蛋白或MinC蛋白；
所述微生物为盐单胞菌（Halomonas sp.）。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述“抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达”或“降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性”可以通过如下方式实现：利用CRISPR/Cas9敲除所述微生物基因组中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因；
所述“过表达微生物中分裂环抑制蛋白的编码基因”或“提高微生物中分裂环抑制蛋白的表达量和/或活性”可以通过如下（1）或（2）所述的方式实现：（1）向所述微生物中导入分裂环抑制蛋白的编码基因；（2）通过基因编辑将所述微生物基因组中分裂环抑制蛋白的编码基因前的启动子替换为组成型启动子。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述微生物胞内内含物为PHA。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PHA包括PHB或P(3HB-co-4HB)。
5.重组微生物，是将出发微生物进行如下（b1）-（b4）中的任一种改造得到的；
（b1）抑制出发微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
（b2）降低出发微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性；
（b3）抑制出发微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达，同时过表达出发微生物中分裂环抑制蛋白的编码基因；
（b4）降低出发微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性，同时提高出发微生物中分裂环抑制蛋白的表达量和/或活性；
所述（b1）或（b2）中，所述PHA颗粒表面结合蛋白为PhaP1蛋白、PhaP1蛋白和PhaP2蛋白的组合或PhaP1蛋白和PhaP3蛋白的组合；
所述（b3）或（b4）中，所述PHA颗粒表面结合蛋白为PhaP1蛋白，所述分裂环抑制蛋白为MinCD蛋白或MinC蛋白；
所述微生物为盐单胞菌。
6.权利要求1至4任一所述的方法在制备微生物胞内内含物中的应用，所述微生物为盐单胞菌。
7.权利要求5所述的重组微生物在制备微生物胞内内含物中的应用，所述微生物为盐单胞菌。
8.（c1）或（c2）或（c1）和（c3）的组合或（c2）和（c4）的组合在制备微生物胞内内含物中的应用；
（c1）抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达的物质；
（c2）降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性的物质；
（c3）过表达微生物中分裂环抑制蛋白的编码基因的物质；
（c4）提高微生物中分裂环抑制蛋白的表达量和/或活性的物质；
所述（c1）或（c2）中所述PHA颗粒表面结合蛋白为PhaP1蛋白、PhaP1蛋白和PhaP2蛋白的组合或PhaP1蛋白和PhaP3蛋白的组合；
所述（c3）或（c4）中，所述PHA颗粒表面结合蛋白为PhaP1蛋白，所述分裂环抑制蛋白为MinCD蛋白或MinC蛋白；
所述微生物为盐单胞菌。
9.权利要求6至8任一所述的应用，其特征在于：所述微生物胞内内含物为PHA。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述PHA包括PHB或P(3HB-co-4HB)。
11.制备微生物胞内内含物的方法，包括如下步骤：对微生物进行如下（d1）-（d4）中的任一种改造后，培养改造后的微生物，从中获得微生物胞内内含物；
（d1）抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达；
（d2）降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性；
（d3）抑制微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的编码基因表达，同时过表达微生物中分裂环抑制蛋白的编码基因；
（d4）降低微生物中PHA颗粒表面结合蛋白的表达量和/或活性，同时提高微生物中分裂环抑制蛋白的表达量和/或活性；
所述（d1）或（d2）中，所述PHA颗粒表面结合蛋白为PhaP1蛋白、PhaP1蛋白和PhaP2蛋白的组合或PhaP1蛋白和PhaP3蛋白的组合；
所述（d3）或（d4）中，所述PHA颗粒表面结合蛋白为PhaP1蛋白，所述分裂环抑制蛋白为MinCD蛋白或MinC蛋白；
所述微生物为盐单胞菌。
12.权利要求11所述的方法，其特征在于：所述微生物胞内内含物为PHA。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：所述PHA包括PHB或P(3HB-co-4HB)。
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