CN108048474B

CN108048474B - 一种酸性磷酸酶蛋白基因GmPAP1-like及其应用

Info

Publication number: CN108048474B
Application number: CN201711107169.7A
Authority: CN
Inventors: 梁翠月; 吴炜炜; 林雁; 陈倩倩
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-11-10
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2037-11-10
Also published as: CN108048474A

Abstract

本发明公开了一种大豆细胞壁酸性磷酸酶蛋白基因GmPAP1‑like及其应用。所述酸性磷酸酶蛋白基因GmPAP1‑like的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，酸性磷酸酶蛋白GmPAP1‑like的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的酸性磷酸酶蛋白GmPAP1‑like具有参与细胞外有机磷的活化和利用的功能，最终提高植株提高耐低磷的能力，具有较强的酸性磷酸酶酶活；在作物根中过量表达酸性磷酸酶蛋白基因，能显著增强转基因根的有机磷活化和利用能力，因此可通过基因转化增强大豆根对酸性土壤低磷胁迫的适应能力，在构建耐低磷胁迫转基因大豆方面具有很好的应用前景。

Description

一种酸性磷酸酶蛋白基因GmPAP1-like及其应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域。更具体地，涉及一种酸性磷酸酶蛋白基因GmPAP1-like及其应用。

背景技术

磷是植物的必需营养元素，它不仅是细胞结构的主要成分，而且还直接或间接地参与植物多种代谢过程，如膜和核苷酸的合成，光合作用，能量传递和信号转导等(Raghothama,1999；Vance et al.,2003；Plaxton and Lambers,2015)。然而，在酸性耕作土壤上，其中的有效磷含量往往难以满足作物生长的需求(Kochian et al.,2004；vonUexküll and Mutert 1995；Vance et al.,2003)。磷素利用率低已成为现代农林业产量的限制因子，传统农业都是通过多施磷肥来解决植物对磷素的需求，但累积在土壤中的磷不仅造成了土壤中磷素富集，还增加了对水体污染的风险。因此，如何让植物有效的利用土壤中的磷素,减少磷肥的施入，提高作物的产量是当前全球面临的主要问题，耐低磷基因型品种的筛选和培育成为替代传统方法提高磷素利用率，防治环境污染的首选方法。

经过长期自然进化和人工选择，植物形成了一系列形态、生理和分子的协同适应低磷胁迫的机制，如改变根系结构和形态，增加根系有机酸和磷酸酶的分泌，提高磷转运子的表达，以及与丛枝菌根真菌形成共生关系等(Chiou and Lin,2011；Wu et al.,2013；Liang et al.,2014；Plaxton and Lambers,2015)。植物根系细胞的细胞壁直接接触根际环境，是根系细胞感知和传递细胞外及细胞间信号的重要部位(Jamet et al.,2008；Zhuet al.,2012；Hoehenwarter et al.,2016；Zhu et al.,2016)。细胞壁的生物学功能依赖于细胞壁蛋白。虽然细胞壁蛋白的数量相对较少，但在维持植物细胞外基质中的生物学功能至关重要(Somerville et al.,2004；Bayer et al.,2006；Zhu et al.,2006)。利用蛋白质组学技术，多种植物包括拟南芥，苜蓿(Medicare sativa)，鹰嘴豆(Cicer)，玉米(Zeamays)，水稻(Oryza.sativa)和甘蔗(Saccharum officinarum)等都鉴定到了细胞壁蛋白(Bayer et al.,2006；Minic et al.,2007；Soares et al.,2007；Bhushan et al.,2006；Zhu et al.,2006,2007；Jung et al.,2008；Calderan-Rodrigues et al.，2014)。近年来，部分研究也揭示了细胞壁蛋白在植物适应低磷胁迫中的重要作用。例如，在大豆(Glycinemax L.)中鉴定了9个β-expansin成员。其中，GmEXPB2受低磷胁迫上调，并且该基因在根的生长发育中起重要作用，这表明细胞壁结构的改变对植物适应磷缺乏是至关重要的(Guoet al.,2011；Li et al.,2014)。另外，两个细胞壁定位的紫色酸性磷酸酶NtPAP12和AtPAP25被认为可能参与了细胞壁合成(Kaida et al.,2008,2009,2010；Del Vecchio etal.,2014)。除了参与细胞壁生物合成外，胞外的紫色酸性磷酸酶也参与了细胞外有机磷磷的循环再利用(Tran et al.,2010a,b；Tian and Liao,2015)。例如拟南芥的三个胞外酸性磷酸酶：AtPAP10，AtPAP12和AtPAP26；菜豆的PvPAP3，水稻OsPAP10和柱花草SgPAPs对ATP，ADP和dNTP等有机磷具有较高活性，因此认为这些胞外酸性磷酸酶参与细胞外有机磷的活化利用(Hurley et al.,2010；Tran et al.,2010b；Wang et al.,2011；Liang et al.,2010,2012；Robinson et al.,2012；Wang et al.,2014a；Liu et al.，2016；Lu et al.,2016)。

然而，研究绝非就从止步，更多更有效的相关活性分子的研究对于外源有机磷的活化和利用以及作物耐低磷胁迫能力改善，具有重要的意义和价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的与磷的活化和利用有关的分子，即本发明在大豆中首次鉴定到的细胞壁紫色酸性磷酸酶GmPAP1-like，其表达受磷的有效性调控，具有较强的酸性磷酸酶酶活；GmPAP1-like基因为低磷增强表达的基因。在作物根中过量表达该基因，能显著增强转基因根的有机磷活化和利用能力，因此可通过基因转化增强大豆根对酸性土壤低磷胁迫的适应能力。

本发明的目的是提供一种大豆细胞壁酸性磷酸酶蛋白基因GmPAP1-like。

本发明另一目的是提供一种大豆细胞壁酸性磷酸酶蛋白GmPAP1-like。

本发明的再一目的是提供所述酸性磷酸酶蛋白基因GmPAP1-like及其蛋白的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种大豆细胞壁酸性磷酸酶蛋白基因GmPAP1-like，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1由1851个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为第1-1851位碱基，编码具有序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列，所述氨基酸序列组成的蛋白质在本发明中称为大豆根系细胞壁紫色酸性磷酸酶蛋白基因GmPAP1-like蛋白。即一种大豆细胞壁酸性磷酸酶蛋白GmPAP1-like，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

同时，包括或具有选自如下的核苷酸序列也应包括在本发明的保护范围之内：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在低等严格条件、中等严格条件、优选高严格条件下杂交的核苷酸序列；

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、特别优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的核苷酸序列；

(4)与(1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但在序列上不同的核苷酸序列；

(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的氨基酸序列；

(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；

(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

另外，包含或具有选自如下的氨基酸序列也应包括在本发明的保护范围之内：

(1)SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列；

(2)由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；

(3)与SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、特别优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的氨基酸序列；

(4)(1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段；

(5)本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。

本发明提供的基因GmPAP1-like和蛋白质能够调控大豆在低磷条件下对磷的活化利用及吸收。

扩增上述GmPAP1-like基因全长或其任一片段的引物对也应属于本发明的保护范围之内。

所述酸性磷酸酶蛋白基因GmPAP1-like在制备转基因植物中的应用，以及基因GmPAP1-like或蛋白GmPAP1-like在制备促进植物适应低磷土壤的制剂中的应用，也都应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供含有上述GmPAP1-like基因的表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有GmPAP1-like基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体等，如pTF101s或其它衍生植物表达载体。

本发明还提供一种基因工程菌，其含有上述的表达载体。

所述表达载体在制备转基因植物，或制备促进植物适应低磷土壤的制剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

具体地，上述转基因植物为可耐低磷胁迫植物。

优选地，所述植物为双子叶植物。

更优选地，所述双子叶植物为大豆。

本发明还涉及细胞，其包含本发明的GmPAP1-like基因或重组载体。所述细胞可以是植物细胞，例如豆科植物细胞，或者微生物细胞，例如细菌或真菌细胞，例如酵母细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。

本发明还涉及植物或者植物部分，植物材料，植物种子，其包含本发明的细胞。所述植物可以是豆科植物，例如大豆，也可以是其它植物，例如单子叶植物如水稻，或者其他双子叶植物如烟草。还涉及来自所述植物的转基因种子。

本发明还涉及生产植物的方法，该方法包括：从本发明的植物细胞再生转基因植物，或者将本发明的植物与另一植物杂交。

本发明还涉及本发明的方法生产的植物。

本发明还涉及本发明的GmPAP1-like基因或重组载体在调控植物细胞壁酸性磷酸酶活性和在低磷条件下对有机磷的活化利用，包括制备转基因植物以及制备促进植物适应酸性土壤的制剂。

本发明还涉及调控植物适应低磷土壤的方法，该方法包括制备含有本发明的GmPAP1-like基因或重组载体的植物，例如，所述方法可以包括从本发明的植物细胞再生转基因植物或者将本发明的植物与另一植物杂交。

本发明所提供的一个优选实施方案是将上述基因GmPAP1-like导入大豆中，得到转基因大豆材料；所述转基因植株的有机磷利用能力等高于所述目的对照植株。

例如所述基因GmPAP1-like可以是通过所述重组表达载体导入受体植物的。

携带有本发明的基因GmPAP1-like的植物表达载体可通过例如农杆菌介导的下胚轴转化法转化到大豆细胞或组织中。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的蛋白GmPAP1-like显著影响了根表酸性磷酸酶的活性，具有参与细胞外有机磷的活化和利用，最终提高植株提高耐低磷的能力。这对阐明细胞壁紫色酸性磷酸酶在大豆适应低磷土壤的生物学功能有着重要意义。

2、本发明提供的基因GmPAP1-like不仅影响了根系表面的酸性磷酸酶活性，超量表达该基因还增加了转基因菜豆毛状根对核酸磷dNTP的活化和利用；因此，该基因的功能研究对于解析豆科作物适应低磷土壤的分子机理有着深远的研究意义。在作物根中过量表达酸性磷酸酶蛋白基因，能显著增强转基因根的有机磷活化和利用能力，因此可通过基因转化增强大豆根对酸性土壤低磷胁迫的适应能力，在构建耐低磷胁迫转基因大豆方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为磷的有效性对大豆干重和磷含量的影响。

图2为磷的有效性对大豆根系酸性磷酸酶活性的影响。

图3为磷的有效性对GmPAP1-like的蛋白累积和基因表达的影响。A为通过iTRAQ分析，鉴定到紫色酸性磷酸酶GmPAP1-like，其低磷处理下蛋白的累积量是高磷条件下的1.7倍。B为不同磷处理条件下，基因GmPAP1-like在大豆根系的表达模式分析，星号表示高低磷处理之间进行差异显著性比较的结果，*表示显著水平P<0.05时，差异显著。

图4为蛋白GmPAP1-like的亚细胞定位，以及GmPAP1-like表达对转基因菜豆毛状根表面酸性磷酸酶活性的影响。

图5为超量表达GmPAP1-like转基因菜豆毛状根对dNTP的活化利用。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1基因的获取

1、水培实验研究磷的有效性对大豆根的影响

选取大豆品种YC03-3作为植物材料。种子萌发后，选择长势基本一致的幼苗移植到含有5μM(-P)和250μM(+P)KH₂PO₄的大豆营养液处理。处理10天后分别收获大豆的地上部和地下部，并测定其干重，磷含量以及根系酸性磷酸酶活性。

(1)磷的有效性对大豆干重和磷含量的影响

将约0.1g的大豆干样品研磨成粉末并用H₂SO₄和H₂O₂进行消煮。然后将每个样品的上清液转移到容量瓶中，使用二级水定容至100mL。用流动分析仪(SKALAR,Holland)测量溶液中的磷含量。

结果如图1所示，其中A为磷的有效性对大豆地上部干重的影响，B为磷的有效性对大豆根系干重的影响；C为磷的有效性对大豆地上部磷含量的影响；D为磷的有效性对大豆根系磷含量的影响。图中柱子为试验各处理4个生物学重复的平均值和标准误差值。星号表示两种磷浓度处理之间进行差异显著性比较的结果，即*表示显著水平P<0.05时，差异显著；***表示显著水平P<0.001时，差异极显著。

结果表明，与磷充足条件下相比磷饥饿条件下植株的地上部干重减少了35％，而地下部干重则无明显差异；此外，缺磷大豆植株的全磷含量显著低于磷充足条件下的植株；因此说明，缺磷会显著影响大豆植株的地上部生物量和植株磷含量。

(2)磷的有效性对大豆根系酸性磷酸酶活性的影响

为了进一步确定缺磷对大豆根系的影响，本发明检测了不同磷两种处理条件下，大豆根系酸性磷酸酶活性的高低。

结果如图2所示，大豆根系酸性磷酸酶活性受低磷显著上调。其中A为磷有效性对大豆根系中的内部酸性磷酸酶活性的影响。每个值为试验各处理4个重复数据的平均值和标准误差值。星号表示两种磷浓度处理之间进行差异显著性比较的结果，即*表示显著水平P<0.05时，差异显著；B为通过BCIP染色，检测不同磷处理对大豆根表面酸性磷酸酶活性的影响，其标尺为2cm。

结果表明，低磷条件下大豆根系内部酸性磷酸酶活显著增加且与磷充足条件下相比其活性增加了6倍；与胞内酸性磷酸酶活一样，低磷显著增加了大豆根系胞外酸性磷酸酶活性，其表现为进行BCIP染色后根系表面蓝色相较于磷充足条件下颜色更深。以上结果表明，大豆根系酸性磷酸酶活性受低磷显著上调。

2、利用iTRAQ蛋白质组学鉴定大豆根系受低磷调控的细胞壁蛋白

(1)选取大豆品种YC03-3作为植物材料。种子萌发后，选择长势基本一致的幼苗移植到含有5μM(-P)和250μM(+P)KH₂PO₄的大豆营养液处理。10天后，收取大豆根系加入5mM醋酸缓冲液(pH4.6)研磨，将研磨后的混合物1000×g，4℃离心15分钟，弃上清。再分别用含有0.6M和1M蔗糖的5mM醋酸钠缓冲液(pH4.6)洗涤沉淀，最后再用3升5mM醋酸缓冲液(pH4.6)洗涤。将所得细胞壁碎片在液氮中研磨成粉末，冻干。再用含有0.2M CaCl₂的5mM醋酸缓冲液两次萃取，然后用含有2M LiCl的5mM醋酸缓冲液两次萃取，获得弱结合细胞壁蛋白质。将两次萃取的产物混合，使用Econo-

10DG脱盐柱(BIO-RAD，USA)脱盐，冻干，蛋白质经酶消化后用iTRAQ标记物标记，色谱分离后通过nanoLC-MS/MS进行分析。所鉴定的蛋白质差异倍数超1.5倍，且通过Mascot概率分析确定的p值<0.05(期望值)则被认为是差异积累的蛋白质。

(2)将鉴定到的蛋白在NCBI中查找，获得其CDS序列，利用其CDS序列设计定量PCR引物：

F:5’-CATGTTCTGTTCTTCTGGCTCC-3’(SEQ ID NO.3)

R:5’-TCATCGGACACCACTTGCTG-3’(SEQ ID NO.4)。

大豆看家基因TefS1基因(内参)的引物为：

TefS1F:5’-TGCAAAGGAGGCTGCTAACT-3’(SEQ ID NO.5)

TefS1R:5’-CAGCATCACCGTTCTTCAAA-3’(SEQ ID NO.6)。

(3)按照TRIzol一步法提取5μM(-P)和250μM(+P)KH₂PO₄处理后的大豆根系总RNA，然后反转录得到的cDNA作为模板，以上述引物进行定量PCR检测。

(4)结果如图3：A、通过iTRAQ分析，鉴定到紫色酸性磷酸酶GmPAP1-like，其低磷处理下蛋白的累积量是高磷条件下的1.7倍。B、不同磷处理条件下，基因GmPAP1-like在大豆根系的表达模式分析，星号表示高低磷处理之间进行差异显著性比较的结果，*表示显著水平P<0.05时，差异显著。

3、经过分析，获得紫色酸性磷酸酶GmPAP1-like及其编码基因的序列，酸性磷酸酶蛋白基因GmPAP1-like的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，酸性磷酸酶蛋白GmPAP1-like的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2载体的构建

1、构建过量表达载体：

以大豆YC03-3根系cDNA为模板，用引物对ORF-F和ORF-R扩增GmPAP1-like ORF1851bp片段，PCR片段回收测序无误后，通过XbaI对片段及目的载体进行单酶切后，将GmPAP1-like基因连接到目的载体PTF101s，获得过表达载体PTF101s-GmPAP1-like。

上游特异引物ORF-F(SEQ ID NO.7)

5’-CCGGGGATCCTCTAGAATGATGATGAGTGGGATGG-3’

下游特异引物ORF-R(SEQ ID NO.8)：

5’-GCAGGTCGACTCTAGATCAAGATGCTAGTGTTGTAGCTG-3’

2、构建亚细胞定位分析表达载体：

按照常规方法，提取大豆根部RNA，并将其反转录成cDNA，以该cDNA为模板，用引物F-F和F-R扩增GmPAP1-like开放阅读框片段，PCR片段回收测序无误后，将GmPAP1-like基因连接到目的载体pEGAD，得到载体pEGAD-GmPAP1-like。

F-F上游特异引物

5’-CTCTAGCGCTACCGGTATGATGATGAGTGGGATGG-3’(SEQ ID NO.9)

F-R下游特异引物

5’-CATGGTGGCGACCGGTGCAGATGCTAGTGTTGTAGCTGGAC-3’(SEQ ID NO.10)

实施例3转基因材料的研究

1、转基因材料的获得与检测

(1)转基因菜豆毛状根的获得

将构建好的过表达载体PTF101s-GmPAP1-like和载体pEGAD-GmPAP1-like分别转化至发根农杆菌K599中，采用农杆菌介导的菜豆毛状根转化，后续的表型鉴定均使用此株系。

空载体对照：按照上述方法，将过表达载体PTF101s空载用同样的方法进行菜豆毛状根转化，获得转PTF101s空载对照株系(CK)。

(2)转基因菜豆毛状根的检测

菜豆毛状根形成后采适量样品提取RNA，反转录成cDNA后，进一步用定量PCR检测过表达的效果。定量PCR确认得到有效的不同转基因材料。

2、蛋白GmPAP1-like的亚细胞定位

通过菜豆毛状根转化法，分别将含有GmPAP1-like的pEGAD载体和pEGAD空载体导入菜豆毛状根，获得转基因材料。通过共聚焦显微镜(TCS SP2；Leica)和荧光显微镜(LEICADM5000B,Germany)观察菜豆毛状根的GFP荧光信号。

结果如图4中A图所示，上一行为CaMV 35S启动子驱动GFP的空载对照：其中左边第一个图为GFP荧光信号；中间第二个图为明场；右边第三个图为GFP荧光与明场的融合；下一行图片为GmPAP1-like-GFP在菜豆毛状根的亚细胞定位，其中左边第一个图为GmPAP1-like-GFP荧光信号；中间第二个图为明场；右边第三个图为GmPAP1-like-GFP荧光与明场的融合。图中标尺为2μm。

结果表明，融合蛋白的荧光信号均集中在细胞壁中，说明该蛋白定位在细胞壁。

3、过表达GmPAP1-like基因对转基因菜豆毛状根酸性磷酸酶活性的影响

选取过量表达GmPAP1-like的菜豆转基因毛状根，利用BCIP法测定其根表面的酸性磷酸酶活性。即将过量表达GmPAP1-like和空载体的转基因材料分别置于含有0.02％(w/v)5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯(BCIP；Sigma，USA)的固体MS培养基上，然后在25℃条件下温育2小时，毛状根表面的蓝色深浅度表示根系相关的酸性磷酸酶活性的大小。图像由单反相机(佳能，日本)拍摄。另外，利用p-NPP水解法进一步测定转基因菜豆毛状根表面的酸性磷酸酶酶活性，即将转基因豆毛状根在含有2mMρ-NPP(pH5.0)的45mM乙酸钠缓冲液中孵育20分钟，加入1mL的1MNaOH终止反应，然后测定405nm处的吸光度。根系表面的酸性磷酸酶活性表示为单位重量根系每分钟水解ρ-NPP的量。

结果如图4中B和C图所示，图B为BCIP染色法观察空载毛状根对照系(CK1)和过表达GmPAP1-like毛状根系(OX1)表面酸性磷酸酶活性，标尺为5mm。图C为转基因菜豆毛状根表面酸性磷酸酶的活性，CK1，CK2和CK3代表三个空载对照转基因毛状根，OX1，OX2和OX3代表超量表达GmPAP1-like基因的三个转基因毛状根系。图中每个柱子为4个生物学重复的平均值和标准误差值。星号表示过量和对照株系之间进行差异显著性比较的结果,*表示显著水平P<0.05时，差异显著。

结果表明，当以BCIP作为底物时GmPAP1-like超量表达株系根表颜色比对照更深，并且当以ρ-NPP为底物时，超量表达GmPAP1-like三个转基因株系的胞外酸性磷酸酶活分别为对照组的2.1、1.8和2倍；以上结果说明，超量表达GmPAP1-like显著增加了转基因菜豆毛根胞外酸性磷酸酶活性。

4、不同磷源对转基因菜豆毛状根的生长及其磷含量的影响

通过菜豆毛状根转化体系获得超量表达GmPAP1-like的转基因菜豆毛状根材料。通过qRT-PCR验证了转基因毛状根GmPAP1-like的表达量。将检测后的转基因菜豆毛状根转移到含有1.2mM KH₂PO₄和0.4mM dNTP作为唯一磷源的固体MS培养基中培养。每个处理设四个重复，处理后14天收样，测定转基因毛状根的鲜重及磷含量。利用毛状根鲜重进一步用来计算其相对生长量，即相对生长量(％)＝100×(dNTP处理毛状根鲜重的增加量/KH₂PO₄处理毛状根鲜重的增加量)。

结果如图5所示，A为不同磷源供给条件下转基因菜豆毛状根的表型，标尺为1cm；B为GmPAP1-like基因在转基因菜豆毛状根中的表达水平；C为转基因菜豆毛状根的相对生长率(％)；D为转基因菜豆毛状根的磷含量。其中CK1，CK2和CK3分别代表三个空载对照系，OX1,OX2和OX3分别为三个GmPAP1-like超量表达转基因毛状根系。图中柱子为各处理4个重复数据的平均值和标准误差。星号表示同一指标在过量表达系与对照系之间的显著性比较：*表示显著水平P<0.05时，差异显著。

结果表明，当以dNTP为唯一磷源时，对照系的鲜重要显著低于以KH₂PO₄为磷源时的鲜重，但是，三个超量表达株系在不同磷源供给条件下的鲜重无明显差异，即如图5C所示，超量表达GmPAP1-like菜豆离体毛根转基因株系的相对生长率显著高于对照系；并且在dNTP处理下，超量表达GmPAP1-like菜豆离体毛根转基因株系磷含量与对照系相比分别增加了46％、47％和40％；因此说明，超量表达GmPAP1-like增加了转基因菜豆毛根对外源dNTP的活化利用。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种酸性磷酸酶蛋白基因 GmPAP1-like及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1851

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

atgatgatga gtgggatggg gaactcaaga gtgttaattt tctctttgct tgttcttgca 60

acctttcagc aagtggtgtc cgatgagcac caacccctct caaaagttgc cattcataaa 120

acaacacttg ctcttgatga acgtgcttat atcaaagcca ctcctagtgt ccttggcttg 180

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gcatcaactg taccttatat gacagcaagt ggcaatcatg aacgtgactg gccagatact 1140

ggatcatttt atgggacctt ggattctggt ggtgaatgtg gtgtaccggc tcaaaccacg 1200

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attgaaaatt gcctagcaac ggttgacaga caaaaacagc catggctgat atttcttgca 1380

catagggtac ttggttattc ttctgcaggg ttctatgctg cagaaggctc atttgaagaa 1440

ccaatgggaa gggaggatct tcaatatctc tggcagaagt ataaggttga catagcaatg 1500

tatggacatg tccataacta tgaaaggact tgccctgtgt atcagaatat ctgcaccaac 1560

aaagagaaga acaattacaa gggctccttg gatggtacaa tacatgtagt ggttggagga 1620

ggaggagcat cccttgctga atttgccccc ataaacacca catggagtat atttaaagac 1680

catgactttg gatttgtcaa gcttacagca tttgaccatt caaacttctt gtttgagtac 1740

aagaaaagca gtgatggaca agtctatgac tcattcagaa tatcaaggga gtacagggac 1800

atcttagctt gcactgttga tagttgtcca gctacaacac tagcatcttg a 1851

<210> 2

<211> 616

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

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Met Met Met Ser Gly Met Gly Asn Ser Arg Val Leu Ile Phe Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Leu Ala Thr Phe Gln Gln Val Val Ser Asp Glu His Gln Pro

20 25 30

Leu Ser Lys Val Ala Ile His Lys Thr Thr Leu Ala Leu Asp Glu Arg

35 40 45

Ala Tyr Ile Lys Ala Thr Pro Ser Val Leu Gly Leu Lys Gly Gln Asn

50 55 60

Thr Glu Trp Val Thr Leu Gln Tyr Ser Asn Pro Lys Pro Thr Ile Asp

65 70 75 80

Asp Trp Ile Gly Val Phe Ser Pro Ala Asn Phe Asn Ala Ser Thr Cys

85 90 95

Pro Ala Glu Asn Ile Trp Val Asn Pro Pro Phe Leu Cys Ser Ala Pro

100 105 110

Ile Lys Tyr Gln Tyr Ala Asn Phe Ser Ser His Gly Tyr Lys Asn Thr

115 120 125

Gly Lys Gly Ser Leu Lys Leu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ser Asp Phe

130 135 140

Ser Phe Ala Leu Phe Thr Gly Gly Leu Thr Asn Pro Lys Leu Val Ala

145 150 155 160

Val Ser Asn Lys Val Ser Phe Ile Asn Pro Asn Ala Pro Val Tyr Pro

165 170 175

Arg Leu Ala Gln Gly Lys Thr Trp Asp Glu Ile Thr Val Thr Trp Thr

180 185 190

Ser Gly Tyr Gly Ile Ser Asp Ala Glu Pro Phe Val Glu Trp Gly Pro

195 200 205

Lys Gly Gly Asn Leu Val Lys Ser Pro Ala Gly Thr Leu Thr Phe Asp

210 215 220

His Asn Thr Met Cys Gly Ala Pro Ala Arg Thr Val Gly Trp Arg Asp

225 230 235 240

Pro Gly Tyr Ile His Thr Ser Phe Leu Lys Glu Leu Trp Pro Asn Gln

245 250 255

Glu Tyr Lys Tyr Lys Leu Gly His Arg Leu Phe Asn Gly Thr Ile Ile

260 265 270

Trp Ser Gln Glu Tyr Gln Phe Lys Ala Ser Pro Phe Pro Gly Gln Asn

275 280 285

Ser Leu Gln Arg Val Val Ile Phe Gly Asp Leu Gly Lys Ala Glu Ala

290 295 300

Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Asn Asn Phe Gln Pro Gly Ser Leu Asn Thr

305 310 315 320

Thr Lys Gln Ile Val Gln Asp Leu Lys Asp Ile Asp Ile Val Phe His

325 330 335

Ile Gly Asp Leu Cys Tyr Ala Ser Gly Tyr Leu Ser Gln Trp Asp Gln

340 345 350

Phe Thr Ala Gln Ile Glu Pro Ile Ala Ser Thr Val Pro Tyr Met Thr

355 360 365

Ala Ser Gly Asn His Glu Arg Asp Trp Pro Asp Thr Gly Ser Phe Tyr

370 375 380

Gly Thr Leu Asp Ser Gly Gly Glu Cys Gly Val Pro Ala Gln Thr Thr

385 390 395 400

Phe Tyr Val Pro Ala Glu Asn Arg Glu Lys Phe Trp Tyr Ser Val Asp

405 410 415

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420 425 430

Lys Gly Ser Glu Gln Tyr Lys Phe Ile Glu Asn Cys Leu Ala Thr Val

435 440 445

Asp Arg Gln Lys Gln Pro Trp Leu Ile Phe Leu Ala His Arg Val Leu

450 455 460

Gly Tyr Ser Ser Ala Gly Phe Tyr Ala Ala Glu Gly Ser Phe Glu Glu

465 470 475 480

Pro Met Gly Arg Glu Asp Leu Gln Tyr Leu Trp Gln Lys Tyr Lys Val

485 490 495

Asp Ile Ala Met Tyr Gly His Val His Asn Tyr Glu Arg Thr Cys Pro

500 505 510

Val Tyr Gln Asn Ile Cys Thr Asn Lys Glu Lys Asn Asn Tyr Lys Gly

515 520 525

Ser Leu Asp Gly Thr Ile His Val Val Val Gly Gly Gly Gly Ala Ser

530 535 540

Leu Ala Glu Phe Ala Pro Ile Asn Thr Thr Trp Ser Ile Phe Lys Asp

545 550 555 560

His Asp Phe Gly Phe Val Lys Leu Thr Ala Phe Asp His Ser Asn Phe

565 570 575

Leu Phe Glu Tyr Lys Lys Ser Ser Asp Gly Gln Val Tyr Asp Ser Phe

580 585 590

Arg Ile Ser Arg Glu Tyr Arg Asp Ile Leu Ala Cys Thr Val Asp Ser

595 600 605

Cys Pro Ala Thr Thr Leu Ala Ser

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<212> DNA

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<212> DNA

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<213> 大豆(Glycine max)

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<212> DNA

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ctctagcgct accggtatga tgatgagtgg gatgg 35

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<212> DNA

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<400> 10

catggtggcg accggtgcag atgctagtgt tgtagctgga c 41

Claims

1.酸性磷酸酶蛋白基因 GmPAP1-like在制备可耐低磷胁迫的转基因大豆中的应用，其特征在于，所述酸性磷酸酶蛋白基因 GmPAP1-like的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有酸性磷酸酶蛋白基因 GmPAP1-like的表达载体在制备可耐低磷胁迫的转基因大豆中的应用，所述酸性磷酸酶蛋白基因 GmPAP1-like的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。