CN114164222B

CN114164222B - 大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因及其在提高大蒜愈伤组织蒜氨酸含量中的应用

Info

Publication number: CN114164222B
Application number: CN202111483691.1A
Authority: CN
Inventors: 宛雯; 杨绪勤; 吴家莹; 徐春燕; 齐东东; 李�杰
Original assignee: Jiangsu Normal University
Current assignee: Jiangsu Normal University
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2041-12-07
Also published as: CN114164222A

Abstract

大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因及其在提高大蒜愈伤组织蒜氨酸含量中的应用，所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因在大蒜叶片夹伤后表达水平显著上升。暗示其在大蒜叶片抗逆胁迫过程中可能发挥重要作用。过表达AsPAP基因的大蒜愈伤细胞的蒜氨酸含量是对照的多倍，表明大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因可以提高大蒜细胞的蒜氨酸含量，在培育高品质大蒜方面具有潜在应用价值。

Description

大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因及其在提高大蒜愈伤组织蒜氨酸含量中的应用

技术领域：

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因及其在提高大蒜愈伤组织蒜氨酸含量中的应用。

背景技术：

大蒜(Allium sativum L.)属于多年生葱蒜属的地下鳞茎，是一种具有悠久历史的药食同源植物。大量研究结果表明，大蒜具有多种药理活性，主要有抗癌、抗肿瘤、消炎，抗病毒、清除自由基、保肝、降血压、降血糖、提高免疫力等作用(Lawson,L.d.1996)。我国是大蒜主要的生产、销售和出口国。我国大蒜种植区域分布广泛，但主要集中在山东、河南和江苏三个省份，占总种植面积的一半以上。

目前，美国药典和欧洲药典明确指出，大蒜的功效成分主要是大蒜素(Allicin)和阿霍烯 (Ajoene)等含硫化合物(Stoll A and Seeback E.,1949)。大蒜辣素具有杀菌、抗癌、抗衰老和保护心血管等作用(Elkayam et a1.,2003；Abdelmalik,2011；Peng et al.,2015)。大蒜细胞中并不存在大蒜辣素，而是以其活性成分的前体物质-蒜氨酸(Block.,1986)存在。大量研究结果显示，大蒜素主要由蒜氨酸(Alliin)经过蒜氨酸酶(Alliinase)催化裂解而形成。大蒜素的化学性质不稳定、不易储存；限制了其广泛应用。蒜氨酸化学名称为S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜 (S-allyl-L-cysteine sulfoxide),分子式为C₆H₁₁NO₃S；分子量为177.22；等电点为4.86；为白色针簇状结晶；极易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮和苯等有机溶剂中；0-4℃可稳定保存；新鲜蒜瓣中的蒜氨酸含量为0.5～2.0％，长于多糖结合，以稳定和无臭的形式存在于大蒜鳞芽细胞质中(Eric B.et al.,1986)。具有抗炎、杀菌、抗肿瘤、抗糖尿病、保肝等作用(孙明江,2009；Anwar and Younus,2017)，目前，对蒜氨酸一些生化结构特点，及生物学意义的研究报道比较多(Fillmore et al.,1995；Stolland Seebeck,2006；Morozova et al.,2014)。然而对于调控蒜氨酸合成分子调控机理的研究还不够深入。

酸性磷酸酶(Acid phosphatase)是一类最适PH低于7.0，且能催化磷酸单酯或酸酐裂解，并释放无机磷酸根离子的蛋白水解酶。增加酸性磷酸酶活性是植物中普遍存在的低磷胁迫适应机制(Zhang et al.,2011；George T.S.et al.,2008)。紫色酸性磷酸酶(Purple acid phospha- tase,PAP)家族是一类特殊的酸性磷酸酶，具有鲜明的特征，如酶提取液呈现紫色，酶活不受酒石酸抑制等。大量研究结果证实紫色磷酸酶在植物适应低磷胁迫过程中发挥着重要的作用(Wang L.and Liu D.,2018)。从菜豆中分离鉴定的KbPAP是植物中鉴定的第一个PAP 蛋白(Bhadouria J et al.,2017)。然而目前，关于大蒜PAP相关研究相对较少。

发明内容

本发明的第一个方面是提供一种大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因，其核苷酸序列为下列序列之一：

(1)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列经添加、替换、插入或缺失一个或几个核苷酸而成的同源序列；

(3)如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的等位基因或所述等位基因衍生物的核苷酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体含有权利要求1所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因的全序列或部分片段。

进一步的，所述表达载体是含有所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因的植物双元表达载体。

本发明还提供了一种转基因细胞系，所述转基因细胞系含有权利要求1所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因的全序列或部分片段。

本发明还提供了一种工程菌，所述工程菌含有权利要求1所述大蒜紫色酸性磷酸酶 AsPAP基因的全序列或部分片段。

本发明的第二个方面是提供上述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因在提高大蒜蒜氨酸含量中的应用

进一步的，所述应用是提高大蒜愈伤组织细胞蒜氨酸合成能力。

本发明还提供了所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因在大蒜种质资源改良中的应用。

本发明还提供了用于PCR扩增权利要求1所述所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因的引物，其序列如SEQ ID No.1和2所示。

本发明还提供了一种生产高品质大蒜的方法，在转基因大蒜中表达权利要求1所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因。

相比于现有技术，本发明的有益效果为；

本发明基于前期大蒜叶片夹伤实验转录组测序分析结果，鉴定到一个紫色酸性磷酸酶 AsPAP基因，该基因在大蒜叶片夹伤后表达水平显著上升。暗示其在大蒜叶片抗逆胁迫过程中可能发挥重要作用。基于转录组测序AsPAP基因序列信息，设计特异性引物，以大蒜叶片经过总RNA提取获得总RNA，经反转录获得的cDNA，以该cDNA为模板，通过PCR 方法，成功克隆到AsPAP基因。以克隆到的AsPAP基因构建植物双元表达载体，转化邳州紫皮大蒜愈伤细胞。通过荧光显微镜观测AsPAP蛋白C端融合的GFP蛋白标签。观察目标基因是否成功转化并在大蒜愈伤细胞中表达了。收集转化有空载体和过表达AsPAP基因的大蒜愈伤细胞，提取其氨基酸，利用氨基酸分析仪分析其蒜氨酸含量。发现过表达AsPAP 基因的大蒜愈伤细胞的蒜氨酸含量是对照的多倍。上述结果表明，大蒜紫色酸性磷酸酶 AsPAP基因可以提高大蒜细胞的蒜氨酸含量。本发明提出一种能够提高大蒜蒜氨酸含量的新型PAP基因，通过转基因方法可以提高大蒜愈伤组织细胞的蒜氨酸合成能力，进而为提高大蒜品质提供有效途径。

邳州紫皮大蒜可从江苏省徐州市邳州市当地种植户购买到或从各地经销商购买。邳州紫皮大蒜植株、愈伤细胞、pHB-GFP真核表达载体可以以邳州紫皮大蒜为原材料通过通用的方法制备。此外，这些材料也可联系本申请人索取。

附图说明

图1AsPAP基因的进化树分析。

图2AsPAP基因在夹伤胁迫条件下随时间变化的表达情况分析(以大蒜actin基因为内参基因)。

图3pHB-AsPAP-GFP图谱(仅显示基因克隆附近序列信息)。

图4AsPAP-GFP过表达愈伤组织细胞荧光显微镜检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行具体描述。下述实施例中的实验方法，如果没有特殊的说明，均为常规实验方法。下述实施例中所使用的实验材料和试剂，除非特殊说明，均为自常规生化试剂供应商处购买。

邳州紫皮大蒜材料，采集自江苏省徐州市邳州市，植株生长于江苏师范大学重点实验室温室；

邳州紫皮大蒜愈伤细胞：生长于江苏师范大学重点实验室组织培养室；

菌种和载体：大肠杆菌TOP10感受态细胞、农杆菌GV3101感受态细胞，购于全式金公司。pHB-GFP真核表达载体，为本实验室保存。

主要试剂：总RNA提取试剂盒采用植物总RNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒和胶回收试剂盒购自艾德莱有限公司。反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒、Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶和2x Taq Master Mix酶购自于Vazyme公司。其他试剂为分析纯试剂，购自于上海生物工程有限公司。

培养基：

LB固体培养基；

愈伤培养基(1L)：MS，4.42g；蔗糖，30g；2,4-D，1.5mg；NAA，0.5mg。调节pH 值为5.8，加入琼脂，8g。湿热高压灭菌，121℃，15分钟。

实施例1.大蒜抗逆相关紫色酸性磷酸酶AsPAP基因的生物信息学分析

项目组前期研究中，以邳州紫皮大蒜为试材，采用二代高通量测序RNA-seq方法进行夹伤胁迫应答转录组分析，发现一个差异表达基因表达蛋白具有紫色酸性磷酸酶特征，位于大蒜5号染色体，将该基因命名为AsPAP。以NCBI中Allium sativum的全基因组序列为参考，截取该参考序列(chr5：63515838--63538926)前后各3000bp(chr5：63512838--63541926) 共29089bp的核苷酸序列作为研究对象，利用相关数据库及生物信息学软件对AsPAP基因进行分析，主要内容如下：

(1)CD-search搜索AsPAP蛋白保守结构域；

(2)Protparam分析AsPAP蛋白的基本理化性质；

(3)Clustal W软件进行AsPAP蛋白同源比对，MEGA xxx软件构建系统进化树；

(4)Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)进行亚细胞定位预测；

(5)PlantCARE分析AsPAP基因侧翼序列顺式作用元件。

1.基因的结构

截取NCBI数据库中Allium sativum中AsPAP基因参考序列(chr5：63515838--63538926)。该基因全长23088bp，包含4内含子；5外显子，其中外显子1全长152bp，外显子2全长671bp，外显子3全长192bp；外显子4全长86bp；外显子5全长228bp。

2.基因编码氨基酸序列分析

该基因包含一个全长1329bp的完整开放阅读框，编码442个氨基酸。

3.基因编码蛋白保守结构域分析

利用NCBI中的CD-search搜索AsPAP基因编码蛋白的保守结构域。结果表明，AsPAP蛋白含有PLN02533超家族特征序列，位于24aa-425aa。AsPAP蛋白属于紫色酸性磷酸酶蛋白家族成员，在植物生长发育及胁迫响应过程中发挥调控作用，其结构高度保守。分析结果显示AsPAP蛋白是一个潜在的紫色酸性磷酸酶蛋白。

4.基因编码蛋白理化性质分析

利用ExPaSy ProtParam对AsPAP蛋白进行基本的理化性质预测和分析。结果表明：AsPAP蛋白包含442个氨基酸，相对分子质量为50.21KD，理论等电点为5.83,为酸性蛋白。一共6948个原子，包含C(2266)、H(3395)、N(601)、O(675)和S(11)，理论半衰期为 30h，不稳定参数为38.94，属于稳定蛋白。带正电荷氨基酸(Arg+Lys)42个，带负电荷氨基酸(Asp+Glu)54个。

5.蛋白序列比对

为了全面分析AsPAP编码蛋白的结构特征，本研究根据NCBI网站上的蛋白序列，选择了来源于不同植物的12条PAP蛋白，利用Clustal W软件进行同源序列比对。比对结果显示，AsPAP蛋白包含一个典型的PLN02533保守结构域。AsPAP与来源于Cocos nucifera 的KAG1368290.1蛋白同源性最高，该蛋白属于PAP基因家族。

6.亚细胞定位预测

已有文献报道，来源于不同植物的PAP证实能定位于细胞质、细胞壁、细胞核、液泡、线粒体、叶绿体、质外体等多位置。其中以定位在细胞壁和质外体的最多。使用Plant-mPLoc 数据库对AsPAP基因编码蛋白进行亚细胞定位预测。预测结果显示，该蛋白最可能定位于细胞壁和细胞核。具有多向定位的特点，暗示其在大蒜生命活动中可能发挥多样化的生物学功能。

7.AsPAP基因侧翼序列分析

利用PlantCARE在线软件分析AsPAP起始密码子上游1500bp的侧翼序列。结果显示， AsPAP启动子中具有ABRE和ARE等核心元件，还具有很多与生物胁迫和非生物胁迫相关的元件，如：与激素响应相关的CGTCA-motif元件，参与低温响应的LTR元件等。基于序列分析推测，该启动子为一个胁迫诱导型启动子。

表1 AsPAP基因启动子结构预测结果

实施例2 AsPAP基因的表达特征分析

夹伤胁迫条件下的AsPAP基因的表达情况

以邳州大白蒜品种PZ1蒜瓣为种子，于温室种植，待其长至二叶期、使用无菌镊子夹伤大蒜叶片后，分别于夹伤后0h,3h,6h和12h取叶片组织。每个处理三个重复。采用植物RNA提取试剂盒提取植物总RNA，使用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。Real-time PCR方法分析AsPAP基因表达水平。结果如图2所示，大蒜叶片夹伤胁迫下，AsPAP基因的表达显著上调，在3h后达到最高，约提高2.76倍，随后表达下降。

实施例3 AsPAP基因全长cDNA克隆以及植物双元表达载体的构建

以大蒜幼苗为材料，提取总RNA，反转录获得cDNA。

以转录组测序结果预测的AsPAP基因，全长序列为模板设计扩增全长表达阅读框序列，引物序列为

AsPAP-F(SEQ ID NO.1):

ATCACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTATGGATCTTCGATTAATCATCATACT

AsPAP-R(SEQ ID NO.2):

CTCGCCCTTGCTCACCATAAGCTTGGACACCACAGTCAGAATCTTTCT

以cDNA为模板，AsPAP-F和AsPAP-R为引物，扩增AsPAP包含完整的表达阅读框序列。使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，切胶回收目标片段大小序列。将目标片段使用一步法基因克隆试剂盒克隆到pHB-GFP的Hind III位点。采用菌落PCR方法筛选获得阳性转化子，提取质粒，通过Hind III酶切鉴定，选择正确转化子质粒，命名为pHB-AsPAP-GFP(图3)，送生工生物有限公司进行测序，AsPAP基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4。

电泳检测结果显示，扩增产物大小与目的基因片段大小一致，约为1.3kb。将克隆的 AsPAP测序结果与转录组测序组装的对应unigene基因序列进行比对，AsAsPAP基因核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示)与AsPAP unigene序列相似度为99.85％，出现2个碱基突变(G146A和T376A)，导致2个氨基酸改变(G49D和C126S)，根据氨基酸类型分析，这两种氨基酸的改变整体上没有影响AsAPA蛋白的氨基酸组成。

实施例5 AsPAP基因对大蒜愈伤的遗传转化

1.大蒜愈伤的制备

(1)冲洗：蒜瓣剥皮后，水洗干净，再流水冲洗30min。

(2)蒜瓣灭菌：75％乙醇，1min，无菌水冲洗5次；1％生汞，15min，用无菌水冲洗 7次。

(3)用无菌镊子夹取消毒后的蒜瓣放置到无菌的滤纸，剥取蒜瓣内嫩芽；用无菌手术刀将该嫩芽切成约2mm大小，放置于愈伤培养基上。22℃，避光培养，每2周于新鲜配置愈伤培养基上传代培养。

2.含有PHB-AsPAP-GFP载体的GV3101细胞的制备

将PHB-AsPAP-GFP载体和PHB-GFP(空载体，设为对照)，按照化学转化方法分别转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，采用菌落PCR鉴定获得阳性克隆，含有目标载体 PHB-AsPAP-GFP的GV3101克隆，命名为GV3101(AsPAP-GFP)。含有空载体PHB-GFP 的GV3101克隆，命名为GV3101(GFP)。

2.大蒜愈伤的转化

愈伤转化前，

(1)分别接种GV3101(AsPAP-GFP)和GV3101(GFP)于5ml LB(含有50mg/ml卡那霉素和50mg/ml利福平)液体培养基中,28℃,200rpm,培养过夜。

(2)按照1：100的比例将过夜培养菌液转接入50ml LB(含有50mg/ml卡那霉素和50mg/ml利福平)液体培养基中，28℃，200rpm，培养过夜。

(3)4℃4000rpm,离心5min收集菌体，并重悬于50ml的LB(含有50mg/ml卡那霉素、50mg/ml利福平和0.100μM乙酰丁香酮)液体培养基中,28℃，200rpm，诱导培养 4h。

(4)4℃4000rpm,离心5min收集菌体，用MS(含有0.4μM乙酰丁香酮)的液体培养基重悬菌体，使菌液OD₆₀₀值位于0.5-1.0之间。

(5)无菌超净台中，将上述制备的菌液加入大蒜愈伤细胞中，避光，静置侵染30-40min，去除侵染液，并将侵染后的愈伤细胞转移至无菌滤纸上，以吸去多余菌液。随后，转移愈伤细胞于愈伤培养基上。25℃，避光培养6天后，收集大蒜愈伤组织细胞。

3.荧光显微镜观察检测愈伤转化结果

由于AsPAP过表达蛋白C端融合有GFP蛋白标签，可以通过检测GFP信号来观测转化是否成功，以及目标蛋白是否成功表达。取转化有PHB-AsPAP-GFP载体的大蒜愈伤组织细胞，于荧光电子显微镜下观察，结果如图4所示，AsPAP-GFP在愈伤细胞中有较高表达，表达有AsPAP-GFP的细胞在荧光显微镜下较未转化愈伤细胞有更强的荧光信号。说明 AsPAP-GFP基因成功转化进入愈伤细胞，且在愈伤细胞中成功表达。

实施例5 AsPAP基因对大蒜愈伤的蒜氨酸含量的影响

将过表达有AsPAP-GFP和对照GFP的大蒜愈伤细胞，分别提取其蒜氨酸，提取方法如下：

(1)分别液氮研磨过表达有AsPAP-GFP和对照GFP的大蒜愈伤细胞。

(2)分别称取0.5g粉末加入4％的磺基水杨酸溶液500mL；涡旋震荡2min，室温静置提取30min。

(3)7000rpm，离心20min，收集上清即为提取样本。

将提取获得的样本使用氨基酸分析仪，按照仪器使用说明书进行氨基酸含量测定。

使用不同浓度蒜氨酸标准品(购自solarbio)拟合蒜氨酸标准曲线。并根据标准曲线以及测定样本的蒜氨酸峰面积，计算转化有空载体和AsPAP过表达的大蒜愈伤细胞的蒜氨酸含量。结果表明。对照相比较(转化有空载体的大蒜愈伤)，过表达AsPAP蛋白的大蒜愈伤细胞蒜氨酸含量为0.063±0.028mg/g.DW；较对照0.015±0.005mg/g.DW有4.2倍的提高，表明AsPAP基因的过表达，可以提高转基因大蒜愈伤细胞的蒜氨酸含量。

上述研究结果表明，转化AsPAP基因可以促进大蒜愈伤细胞的蒜氨酸积累。本发明为通过基因遗传改造方法获得大蒜新品系提供候选基因，进而为大蒜品质的提高提供了有效的途径。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因及其在提高大蒜愈伤组织蒜氨酸含量中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcaccagtc tctctctcaa gcttatggat cttcgattaa tcatcatact 50

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcgcccttg ctcaccataa gcttggacac cacagtcaga atctttct 48

<210> 3

<211> 1329

<212> DNA

<213> 大蒜(Allium sativum L.)

<400> 3

atggatcttc gattaatcat catactccaa cttttacttc caatttcttc cgtaatcgga 60

agtaattacg gatatggtga ggcgtacgtg cgacctaagc ctcgcaaaac cctaacttgg 120

ccgtgggagt ctaagcattc tgatgaccct caacaggttc acatatcatt ggctggggac 180

aaacatatga ggatcacata ctcaactgat gacgaatcat ctccttcact catcgaatac 240

ggaacaagtc ctggaaatta cacttcgtca tctgaaggag aaacgacatc ctacacatat 300

gtgctttaca aatcaggcta catacaccat gtagttatcg ggcctctaga tcacgacacc 360

atatactatt accgaagtgg gggaacaaat ccagagtttc agttaaaaac ccctccttca 420

acctttccaa taacctttgc agtagcaggt gacttaggcc aaacagagtg gactaaatcc 480

actcttgatc acataaaatt atgtgaatat gatttgaatt tgattcctgg tgatttgtct 540

tatgctgatt atcagcagcg gttttgggat tcttttggtg cgttggtaca accagttgct 600

agtgctaggc cttttatggt gactcaagga aatcacgaga aggagaagat attgttcttt 660

gagtcacctt ttcgagcgtt taattcaagg tggaagatgc cttatgaaga gagtggatca 720

aattcgaact tgtattactc ttttgaaact gcaggtgttc atgttatcat gcttggttct 780

tacaccgagt acgataagaa ttcggagcag tatgcttggc ttaaggagga tctgtctaag 840

gttgatagaa aaagaacgcc atggctgata gcattatttc atgtaccatg gtacaacagc 900

aattatgcac atcaaggaga aggagatgcc atgaaagcta cgatggagcc gttgctttat 960

gatgctggag tcgatatctt atttgcaggt catgttcatg cttatgaaag atcggagcgc 1020

gtttataaca atgcattgga taagtgtggt gctgtgcata ttacgattgg tgatggaggc 1080

aatagggaag gactggctca aaggtatcac aaacctaagc cagaatggtc agtgtttaga 1140

gaagcaagct ttggccacgg cgaactgaag attgtgaacg caacacatgc attttggagt 1200

tggcatagaa atgaagacga cgagcctttg aaatctgatc aggtttggat tagttcattg 1260

gcaagcacag gatgcattgg tggtggtgaa aggcgcgagt ctagaaagat tctgactgtg 1320

gtgtcctag 1329

<210> 4

<211> 442

<212> PRT

<213> 大蒜(Allium sativum L.)

<400> 4

Met Asp Leu Arg Leu Ile Ile Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Ile Ser

1 5 10 15

Ser Val Ile Gly Ser Asn Tyr Gly Tyr Gly Glu Ala Tyr Val Arg Pro

20 25 30

Lys Pro Arg Lys Thr Leu Thr Trp Pro Trp Glu Ser Lys His Ser Asp

35 40 45

Gly Pro Gln Gln Val His Ile Ser Leu Ala Gly Asp Lys His Met Arg

50 55 60

Ile Thr Tyr Ser Thr Asp Asp Glu Ser Ser Pro Ser Leu Ile Glu Tyr

65 70 75 80

Gly Thr Ser Pro Gly Asn Tyr Thr Ser Ser Ser Glu Gly Glu Thr Thr

85 90 95

Ser Tyr Thr Tyr Val Leu Tyr Lys Ser Gly Tyr Ile His His Val Val

100 105 110

Ile Gly Pro Leu Asp His Asp Thr Ile Tyr Tyr Tyr Arg Cys Gly Gly

115 120 125

Thr Asn Pro Glu Phe Gln Leu Lys Thr Pro Pro Ser Thr Phe Pro Ile

130 135 140

Thr Phe Ala Val Ala Gly Asp Leu Gly Gln Thr Glu Trp Thr Lys Ser

145 150 155 160

Thr Leu Asp His Ile Lys Leu Cys Glu Tyr Asp Leu Asn Leu Ile Pro

165 170 175

Gly Asp Leu Ser Tyr Ala Asp Tyr Gln Gln Arg Phe Trp Asp Ser Phe

180 185 190

Gly Ala Leu Val Gln Pro Val Ala Ser Ala Arg Pro Phe Met Val Thr

195 200 205

Gln Gly Asn His Glu Lys Glu Lys Ile Leu Phe Phe Glu Ser Pro Phe

210 215 220

Arg Ala Phe Asn Ser Arg Trp Lys Met Pro Tyr Glu Glu Ser Gly Ser

225 230 235 240

Asn Ser Asn Leu Tyr Tyr Ser Phe Glu Thr Ala Gly Val His Val Ile

245 250 255

Met Leu Gly Ser Tyr Thr Glu Tyr Asp Lys Asn Ser Glu Gln Tyr Ala

260 265 270

Trp Leu Lys Glu Asp Leu Ser Lys Val Asp Arg Lys Arg Thr Pro Trp

275 280 285

Leu Ile Ala Leu Phe His Val Pro Trp Tyr Asn Ser Asn Tyr Ala His

290 295 300

Gln Gly Glu Gly Asp Ala Met Lys Ala Thr Met Glu Pro Leu Leu Tyr

305 310 315 320

Asp Ala Gly Val Asp Ile Leu Phe Ala Gly His Val His Ala Tyr Glu

325 330 335

Arg Ser Glu Arg Val Tyr Asn Asn Ala Leu Asp Lys Cys Gly Ala Val

340 345 350

His Ile Thr Ile Gly Asp Gly Gly Asn Arg Glu Gly Leu Ala Gln Arg

355 360 365

Tyr His Lys Pro Lys Pro Glu Trp Ser Val Phe Arg Glu Ala Ser Phe

370 375 380

Gly His Gly Glu Leu Lys Ile Val Asn Ala Thr His Ala Phe Trp Ser

385 390 395 400

Trp His Arg Asn Glu Asp Asp Glu Pro Leu Lys Ser Asp Gln Val Trp

405 410 415

Ile Ser Ser Leu Ala Ser Thr Gly Cys Ile Gly Gly Gly Glu Arg Arg

420 425 430

Glu Ser Arg Lys Ile Leu Thr Val Val Ser

435 440

Claims

1.大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有权利要求1所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是含有所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因的植物双元表达载体。

4.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌含有权利要求1所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因。

5.权利要求1所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因在提高大蒜蒜氨酸含量中的应用。

6.权利要求1所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因在提高大蒜愈伤组织细胞蒜氨酸合成能力中的应用。

7.用于PCR扩增权利要求1所述大蒜紫色酸性磷酸酶AsPAP基因的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。