CN113337635A

CN113337635A - 枸杞基因以及其编码蛋白质、重组载体、及其用途

Info

Publication number: CN113337635A
Application number: CN202110777052.XA
Authority: CN
Inventors: 刘宝龙; 张怀刚; 宗渊; 朱雪冰; 曹东; 席杏媛; 陈文杰; 沈裕虎
Original assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Priority date: 2018-06-12
Filing date: 2018-06-12
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2038-06-12
Also published as: CN108503699A; CN113337635B

Abstract

本发明公开了一种枸杞基因以及其编码蛋白质、重组载体、及其用途。所述枸杞基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。本发明还公开了含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或宿主细胞。本发明还公开了所述的基因在调控花青素合成中的应用，以及一种调控植物中花青素合成的方法。本发明选用黑枸杞LMH1号与红枸杞Ningqi7号果实转录组测序，分析预测出控制黑枸杞黑色果实性状的主效基因，对研究枸杞花青素合成机制提供了基础。也为基因工程手段改造植物从而提高花青素的含量提供了方向和靶点。

Description

枸杞基因以及其编码蛋白质、重组载体、及其用途

本申请为申请号为“201810601153.X”、发明名称为“枸杞基因以及其编码蛋白质、重组载体、及其用途”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及调控花青素合成与代谢的基因AN2，包括该基因的重组质粒、宿主及其应用。

背景技术

黑枸杞是我国西北荒漠地区一种特有的野生植物资源。在藏药经典著作《晶珠本草》中黑枸杞是一种传统的中草药，在中国已使用数千年历史，它可用于治疗心脏病、月经不调以及更年期等(J.Zheng等，2011)。黑枸杞植株具有抗旱性和耐盐性的特殊生理特点，能够防止土壤沙化缓解土壤盐渍化程度，这对边缘地区的生态系统和农业都非常重要(H.Zhang等，2007)。在黑枸杞的果实中花青素含量可以达到3.1％。矮牵牛花色素占到总花青素的95％，飞燕草色素和锦葵色素占剩余的5％。对于人类健康，花青素被认为具有抗炎、抗突变、抗癌和抗氧化等功效(C.S.Bowen-Forbes等，2010；L.S.Wang等，2008；G.Mazza.，2007)。药理实验证明，黑枸杞具有抗疲劳、降血糖和抗氧化等功效(W.Feng等，2010；J.H.Wang等，2007)。虽然对其化学成分和药理性质已经进行了研究，但是黑枸杞果实中花青素含量高的分子遗传机制尚不清楚。

花青素的生物合成途径在模式植物中已有几十年的研究。由于易于观察的特性，花青素合成代谢调控通路是研究得较为清楚的次生代谢通路(林泉，1998)。花青素的合成首先由苯丙氨酸经过三步酶促反应生成香豆酰CoA，1分子的香豆酰CoA和3分子丙二酰CoA在查尔酮合成酶(CHS)催化下生成查尔酮，查尔酮很少积累，在查尔酮异构酶(CHI)的催化下，很快异构化形成柚皮素(黄烷酮)。黄烷酮在类黄酮-3-羟化酶(F3H)催化下，C环位置3羟化形成二氢黄酮醇。二氢黄酮醇是其它两种酶B环羟化酶即F3'H和F3'5'H的底物。F3H、类黄酮-3'-羟化酶(F3'H)、类黄酮-3',5'-羟化酶(F3'5'H)同属P450超家族。由F3H、F3'H、F3'5'H三种羟化酶所催化反应的产物是合成花色素苷的直接前体。二氢黄酮醇被羟化的程度和位置不同，将决定最终合成的花色素苷的种类，从而决定花、种子、果实的颜色。从二氢黄酮醇转变成花色素苷的反应非常复杂，需要几个不同酶的作用(Johnson等，2001)。ANS是双加氧酶，催化从无色花色素到花色素的转变。不稳定的花色素形成后，进一步糖苷化形成稳定的花色素苷(Mato等，2001)。此外MYB、bHLH和WD40三个转录因子对花青素合成基因具有调控作用之间的关系(Koes等，2005)。一些MYB基因能够调控bHLH转录因子的表达，进而形成一个包含WD40蛋白的复合体。WD40是不是出现在这个启动DFR复合体中还存在些疑问。MYB能够直接结合到DNA上，而bHLH很可能是通过一个假想的结合蛋白与DNA结合。小的R3-MYB很可能能与bHLH蛋白结合，从而阻止其进入转录启动复合体，启动DFR的转录(Zhang等，2014)。

通过实时聚合酶链式反应，已经对黑枸杞中花青素的积累进行了比较分析，但这些与花青素合成相关的基因是从叶片转录组数据库中获得(S.Zeng等，2014)，这意味着某些在果实中特异表达的基因应该是被遗漏掉了。此外，宁夏枸杞和黑枸杞在茄科家族中属于不同种类。有必要评价宁夏枸杞和黑枸杞的果实中结构基因的结构差异及其调控因子，并比较它们的转录水平。

新一代高通量测序已被证明是一个低成本高效率的基因组测序工具，它可用于基因组测序、基因组重测序、miRNA表达谱分析和DNA甲基化分析。最近，新的转录组测序技术被广泛应用于缺乏参考基因组信息的非模式植物中。目前二代高通量转录组测序技术的发展，使得利用转录组数据从未知基因组的物种中分离和鉴定相关基因变得十分便捷和经济。

发明内容

有鉴于此，本发明公开了枸杞中调控花青素合成与代谢的主效基因、以及包括该基因的重组质粒、宿主及其应用。

根据本发明的一个方面，本发明涉及调控黑枸杞黑色果实性状的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列。

根据一个实施方式，本发明还提供了一种基因，其编码所述氨基酸序列。优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

根据本发明的一个方面，本发明涉及上述调控黑果枸杞黑色果实性状的基因在红果枸杞中等位基因，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列。

根据一个实施方式，本发明还提供了一种基因，其编码所述氨基酸序列。优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

根据一个实施方式，本发明还提供了含有所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或宿主细胞。优选地，所述宿主细胞不是人或动物的生殖细胞或胚胎干细胞。

根据本发明的一个方面，本发明提供了所述蛋白质或所述基因在调控花青素合成中的应用。

根据本发明的一个方面，本发明提供了调控植物中花青素合成的方法，包括将所述的基因转染到植物中，使所述基因在所述植物中进行表达。优选地，所述方法包括构建含所述基因的植物表达载体，用所述构建的表达载体转化植物细胞，以及将所述转化的植物细胞培育成转基因植株。

优选地，所述方法中用于筛选的引物为:

正向引物AN2cdsF的序列为TGTTCTTAATGCTACTGATGG，

反向引物AN2cdsR序列为ATGATGAATACTAGTGTTACTAT。

本发明选用黑枸杞LMH1号与红枸杞Ningqi7号果实转录组测序，分析预测出控制黑枸杞黑色果实性状的主效基因，对研究枸杞花青素合成机制提供了基础。也为基因工程手段改造植物从而提高花青素的含量提供了方向和靶点。

本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为转录组测序样本黑枸杞LMH1号与红枸杞Ningqi7号的果实；

图2为预测蛋白同源蛋白的物种分布。

图3为预测蛋白的维恩图。其中Black1和Black2属于LMH1号果实两个重复，Red1和Red2属于Ningqi7号果实两个重复。

图4为LMH1号与Ningqi7号之间差异表达基因分布图。这些基因分为3类，红色表示上调基因，即为基因表达量在LMH1号中比Ningqi7号高；蓝色表示下调基因，即为基因表达量在Ningqi7号中比LMH1号高；黑色表示两者之间没有差异表达的基因。

图5为DEGs的GO分类。所有基因被划分为三类：细胞成分、生物进化以及分子功能。

图6为本发明AN2和其他控制果实花青素合成主效基因氨基酸序列比对示意图。各缩写代表植物(GenBank登录号)分别为：甜椒CaAN2(CAE75745)；茄子SmAN2(AGK37072)；矮牵牛PhAN2(ADW94951)；番茄SlAN2(ACT36603)；马铃薯StMTF2(ABY40371)。黑线区域表示HTH_MYB结构域；橙线区域表示SANT结构域；蓝线区表示MYB-like DNA-binding结构域。方框表示主要差异氨基酸。

图7为为本发明AN2基因和其他物种中花青素合成代谢相关的MYB转录因子的系统发育树。

GenBank数据库中这些蛋白质(或翻译产物)的登录号如下：

Arabidopsis thaliana/AtPAP2：Q9XI60.1；Brassica oleracea/BoMYB2：ADP76651.1；Arabidopsis thaliana/AtPAP1：O81439.1；Arabidopsis thaliana/AtMYB113：Q9FNV9.1；Arabidopsis thaliana/AtMYB114：Q9FNV8.1；Nicotiana tabacum/NtAN2：ACO52472.1；Ipomoea nil/InMYB2：BAE94709.1；Ipomoea purpurea/IpMYB1：BAE94388.1；Petunia x hybrida/PhAN2：BAO51604.1；Solanum lycopersicum/SlAN2：NP_001265992.1；Solanum tuberosum/StMTF2：ABY40371.1；Solanummelongena/SmAN2：AGK37072.1；lanum tuberosum/StCAI：ABY40370.1；Solanum melongena/SmMYB1：AMK01805.1；SoSolanum lycopersicum/SlANT1：NP_001265992.1；Solanum tuberosum/StAN1：AFD31843.1；Gerbera hybrid cultivar/GhMYB10：CAD87010.1；Fragaria xananassa/FaMYB：ABX79947.1；Malus domestica/MdMYB110a：AFC88038.1；Pyruscommunis/PcMYB10：AGL81354.1；Malus domestica/MdMYB1：ABK58136.1；Malus domesticaMdMYB10a：ABB84753.1；Diplacus aurantiacus/MaMYB：ACA04006.1；Antirrhinummajus/VENOSA：ABB83828.1；Antirrhinum majus/ROSEA1：AKB94073.1；Antirrhinum majus/ROSEA2：ABB83827.1；Vitis vinifera/VvMYBA1：BAD18977.1；Medicago truncatula/MtLAP2：ACN79539.1；Morella rubra/MrMYB1：ADG21957.1；Epimedium sagittatum/EsMYBA1：AGT39060.1；Lilium hybrid division/LhMYB6：BAJ05399.1；Glycine max/GmMYB112：ABH02852.1；Capsicum annuum/CaAN2：CAE75745；Malus domestica/MdMYB6：ADE92933.1；

图8为本发明AN2基因在模式植物Samsun烟草中过量表达。A为黑枸杞LrAN2过量表达烟草转基因系；B图为红枸杞LbAN2过量表达烟草转基因系。其中LrAN2诱导烟草变成全紫色，Lb烟草诱导烟草产生局部紫色；C图为阳性转基因株检测，中间为野生型烟草Samsun对照；D图为过量表达烟草转基因系对应植株花青素含量检测，表格中显示LrAN2基因诱导花青素合成的能力比LbAN2基因更强。

图9为过量表达烟草转基因株系之间各个组织部位比对图。

图10为本发明AN2基因的在黑枸杞和红枸杞不同组织器官中的表达谱。其中A图为黑枸杞中AN2在所有组织中的转录水平高于红枸杞。AN2转录水平在黑色果实中最高，而在根，茎和叶片中检测不到；B图为随着黑枸杞黑色果实的逐渐形成，AN2基因的转录水平也随之升高。‘Lr’和‘Lb’分别代表黑枸杞和红枸杞。

图11为黑枸杞与红枸杞中AN2基因的氨基酸比对图。存在两处不同的差异，第一个差异在黑枸杞中为组氨酸，在红枸杞中为赖氨酸；另一个差异在黑枸杞中为谷氨酸，在红枸杞中为丝氨酸。

图12为本发明AN2基因关联分析图。A图为AN2基因等位变异引物群体PCR检测；B图为154份红黑枸杞地理分布图。‘Lr’和‘Lb’分别代表黑枸杞和红枸杞。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

针对目前未发现和研究枸杞中花青素合成相关的关键基因，本发明人发现主要是因为当前与花青素合成相关的基因是从叶片转录组数据库中获得，遗漏了果实中特异表达的基因。为此，发明人首次采用新一代高通量测序对枸杞中花青素合成相关的关键基因进行了研究。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明通过黑枸杞LMH1号与红枸杞Ningqi7号果实转录组测序，分析预测出控制黑枸杞黑色果实性状的主效基因：

(1)转录组测序共得到192,869个单基因，平均长度为1064bp。

(2)利用NR、Nt、Swissprot、KEGG、COG、Interpro、GO以及其他蛋白质数据库分析，所得基因编码152,209种特殊蛋白质。

(3)黑枸杞与红枸杞都属于茄科家族，与马铃薯、烟草和番茄属于同一科，蛋白质分析表明LMH1号和Ningqi7号中预测的蛋白质与这些物种具有很高的同源性。

(4)维恩图分析表明部分基因的特异表达将导致不同果实的形成。

(5)通过基因的差异表达分析，与Ningqi7号相比，LMH1号果实中有733,070个基因表达上调，25,779个基因表达下调。

(6)所有测序基因可分为三类：细胞成分、生物进化以及分子功能。

(7)在花青素合成途径中，除了F3’H和3GT两个结构基因没有表达，其他的结构基因表达水平中LMH1号都比Ningqi7号高。其中MYB转录因子尤为特别，由此筛选出调控黑枸杞果实花青素合成可能性最高的候选基因，并将其命名为AN2。

本发明使用枸杞品种黑枸杞LMH1号和红枸杞Ningqi7号用于研究。黑枸杞有黑色果实，而红枸杞有红色果实。为解决上述问题，本发明人通过对LMH1号和Ningqi7号果实转录组分析，共得到192,869个单基因，平均长度为1064bp。利用NR、Nt、Swissprot、KEGG、COG、Interpro、GO以及其他蛋白质数据库分析，这些基因编码152,209种特殊蛋白质。与Ningqi7号相比，LMH1号果实中有733,070个基因表达上调，25,779个基因表达下调。在花青素合成途径中，除了F3’H和3GT两个结构基因没有表达，其他的结构基因表达水平中LMH1号都比Ningqi7号高。在LMH1号中与花青素合成相关的MYB和bHLH基因也有较高的转录，其中MYB转录因子尤为特别。在黑枸杞花青素生物合成途径中，具有较高转录水平的一类R2R3-MYB转录因子AN2，可以作为MYB转录因子的候选基因。AN2与其他MYB转录因子具有同源性。AN2具有MYB转录因子的结构域，通过构建系统发育树，发现AN2归属于调节花青素生物合成的分支。AN2在模式植物中表达，可以诱导花青素的合成。AN2转录本只在来源于黑枸杞的果实中表达，设计特异性AN2cdsF AN2cdsR引物，可作为AN2在枸杞中的筛选标记。

一、转录组测序分析

测序样品为黑枸杞LMH1号黑色果实和红枸杞Ningqi7号红色果实(图1)。

1、测序及序列组装

转录组测序能够高效快捷的获取生物组织的所有转录本。去除低质量的读数后总共获得60.57GB原始数据以及403.94Mb的读数。利用软件连接192,869个基因，总共得到205,220,696bp的序列片段。平均基因长度为1064bp，其中N50数值长度为1831bp(表1)。

表1测序、过滤和组装统计表

2、注释结果

利用NR、Nt、Swissprot、KEGG、COG、Interpro、GO以及其他蛋白质数据库序列比对分析，对192,869个基因进行蛋白注释。分别预测了101,079、133,750、63,305、72,719、40,270、62,303和18,541种蛋白质。去除重复蛋白后总共获得152,209个蛋白(表2)。

表2注释分类

数值

总数

Nr

Nt

Swissprot

KEGG

COG

Interpro

GO

总计

数目

192,869

101,079

133,750

63,305

72,719

40,270

62,303

18,541

152,209

百分比

100％

52.41％

69.35％

32.82％

37.70％

20.88％

32.30％

9.61％

78.92％

本测序材料黑枸杞和红枸杞与土豆、烟草和番茄都属于茄科家族，数据所预测的蛋白质与这些物种都具有很高的同源性。其中，所有预测蛋白中27.31％预测蛋白与马铃薯蛋白同源性最高；有18.83％预测蛋白与樟子花蛋白同源性最高；16.4％预测蛋白与茸毛烟草蛋白同源性最高；12.12％预测蛋白与番茄蛋白同源性最高；其余25.35％预测蛋白与其他物种蛋白具有密切的遗传关系。(图2)

在Black1(LMH1)、Black2(LMH1)、Red1(Ningqi7)和Red2(Ningqi7)测序样品中常见的蛋白有52,143种，约占所有蛋白的1/3。在黑枸杞中有25,891个特异基因，在红枸杞中特异表达的基因有16,636个(图3)。正是由于这些基因的特异表达造成了不同果实的形成。

3、差异表达基因分析

根据映射到参考转录体上的读数计算出FPKM值来确定可能的差异表达单基因，用于鉴定LMH1号和Ningqi7号之间基因的差异表达。通过FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1表达水平的比较，在LMH1号与Ningqi7号中一共有58,849个差异表达基因。(图4)将Ningqi7号作为参考，有33,070个上调基因，即为这些基因在LMH1号中表达量更高；有25,779个下调基因，即为这些基因在Ningqi7号中表达量更高。

4、差异表达基因的GO功能分类

GO分析将58,849个差异基因划分为53个亚类。其中有20,520个DEGs参与生物过程；19,734个DEGs与细胞成分有关；10,358个基因按分子功能分组。在生物过程范畴内，绝大多数基因与代谢过程(5,125DEGs)、细胞成分(4,952DEGs)与单一组织过程(3,310DEGs)相关。在细胞成分类别中，大多数差异表达基因富集于亚类细胞过程(4,353DEGs)、细胞组分(4,316DEGs)与细胞器(3,198DEGs)。在分子功能范畴内，差异表达基因的最大比例位于‘装订’(4,374DEGs)和’催化活性’(4182DEGs)(图5)。

5、花青素生物合成相关基因的表达

在LMH1号与Ningqi7号转录组数据中，有31个基因与花青素的生物合成相关。通过BlastX分析，筛选出13个基因与花青素合成相关。只有PAL、C4H、C4L、CHS、CHI、F3H、F3’5’H、DFR、LDOX、MYB转录因子和bHLH转录因子具有同源基因(表3)。但在转录组数据库中未发现与F3’H和3GT同源的基因。分析结果后发现，LMH1号所有结构基因表达量都比Ningqi7号高，说明LMH1号中的花青素生物合成被激活。在LMH1号中，所有MYB转录因子的转录强度都比Ningqi7号强，其中基因编号为CL10341.Contig的Log2比率值最高。在bHLH转录因子中，两个基因在LMH1号中的表达水平高于Ningqi7号，两个基因在Ningqi7号中的表达水平高于LMH1号。

表3花青素生物合成途径中结构基因和调控基因的表达差异

备注：Black代表黑枸杞LMH1号，Red代表红枸杞Ningqi7号

黑枸杞果实中控制黑色果实性状的主效基因LrAN2，该基因来源于枸杞品种黑枸杞LMH1号果实中MYB转录因子，它具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到774位所示的核苷酸。LrAN2基因包括HTH_MYB、SANT和类MYB结构域及行使功能。

154个来自于国内不同地区不同颜色枸杞群体系用于关联分析黑色果实性状和AN2等位变异，用于确定AN2等位基因在自然种群中的分布，包括：72个黑枸杞和72个红枸杞。

二、AN2的分子特性

1、总DNA、总RNA和cDNA的准备

根据Yan等人(Yan等，2002)的方法，从1颗开花后34天大的果实中分离DNA。根据Ahmed等的方法(Ahmed等，2003)收集并准备根、叶和茎样本。使用Tiangen RNAprep纯植物试剂盒(Tiangen公司，中国北京)从约0.5g果实提取总RNA。使用Thermo RevertAid FirstStrand cDNA试剂盒(Thermo-Fisher Scientific，Shanghai，China)从总RNA获得cDNA。

2、设计引物分离AN2转录本

使用Primer5软件(Premier Biosoft，美国加利佛尼亚州帕洛阿尔托)设计引物。本研究中使用的所有引物列于表4中。

表4所用的引物名称及序列

编号	引物	序列(5’-3’)
			1	AN2cdsF	TGTTCTTAATGCTACTGATGG
2	AN2cdsR	ATGATGAATACTAGTGTTACTAT
			3	AN2attb1	AAAAAGCAGGCTTCATGATGAATACTAGTGTTAC
4	AN2attb2	AGAAAGCTGGGTCCTAATTCAGTAGATTCCATA
			5	Attb1 adapter	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
6	Attb2 adapter	GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT
			7	TublinF	CCATACCAGCATCACCATTCTTC
8	TublinR	GTCACACTTCCCACATTGCC
			9	AN2-RT-F	ATGATGAATACTAGTGTTACTATTA
10	AN2-RT-R	AGTCTACAACTCTTCCTG
			11	AN2spf	ACTAGTCATTATGCATAGAAAGTTG
12	AN2spr	CGTTTGCTGTTCTTCCCG

引物AN2cdsF和AN2cdsR用来扩增cDNA从而分离红黑枸杞中AN2转录本。使用GeneAmp PCRSystem 9700(Thermo-Fisher Scientific)利用高保真Phushion DNA聚合酶(Thermo-Fisher Scientific)进行PCR扩增。PCR扩增程序：98℃变性2分钟；35个循环：98℃15秒，64℃30秒，72℃30秒；随后在72℃最终延伸10分钟。使用Tiangen TIANgel Midi纯化试剂盒(Tiangen公司)从1.0％琼脂糖凝胶中纯化PCR产物。将PCR产物克隆到pGEM-T Easy质粒载体(Promega Corporation，美国威斯康辛州麦迪逊)中。然后将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α细胞中。随机挑取64个单菌落，用引物AN2cdsF和AN2cdsR扩增各菌体，得到大小一致的片段。

通过商业公司(华大基因，中国深圳)对5个阳性克隆进行测序，确定转录本序列。

基于枸杞果实的转录组分析，从黑枸杞和红枸杞中分离在黑色果实具有高转录水平的MYB基因AN2。AN2在黑枸杞和红枸杞中的编码区序列为774bp。

3、AN2转录本结构域分析及系统树构建

在网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)上预测保守的功能域。AN2的CDS为774bp，编码257个氨基酸(SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2)。AN2包含完整的包括HTH_MYB、SANT和类MYB结构域。与其它茄科物种控制果实花青素合成主效基因相比，AN2在HTH_MYB与SANT结构域完全一致；AN2在类MYB结构域存在差异区段“TAPHQQERKYNNALKITENTILRPRPRTFTSSSAKNVSF”和“HNNEILNICEKPTG”(图6)。AN2比其他基因转录本更类似于甜椒中调控花青素合成代谢的MYB转录因子CaAN2。HTH_MYB结构域是与MYB转录因子蛋白质—蛋白质相互作用的结构域，SANT结构域是DNA结合域，类MYB结构域与RNA聚合酶II相互作用，启动转录(Atchley等，2000)。三个结构域对于MYB蛋白质行使其转录功能十分重要。

使用MEGA 6.0(Tamura等，2007)通过邻接法构建MYB转录本的氨基酸序列系统发生树。在系统发育树中，AN2与调节花青素合成代谢的蛋白质明显聚为一群(图7)，表明AN2很有可能具有调控花青素合成代谢的功能。

三、AN2的过量表达可以诱导花青素合成

使用Gateway克隆试剂盒(Thermo-Fisher Scientific)构建转基因表达载体PJAM1502：AN2，其中载体PJAM1502携带35S启动子。具体步骤如下：

设计带有ATTB接头的引物AN2attb1和AN2attb2。

从连接有AN2转录本的pGEM-T Easy载体上扩增；然后以该PCR产物为模板，使用attb1 adapter和attb2 adapter进行PCR扩增；扩增产物进行琼脂糖电泳、回收、测定浓度。

根据Gateway克隆试剂盒说明书进行BP反应构建入门载体pDONR207：其中AN2步骤如下：

BP反应：

⑴200-400ng PCR回收产物；100ng pDONR207载体；1μl BP ClonaseⅡ；加水至5μl；25℃水浴12-16h。

⑵向反应体系中加入0.5μl Proteinase K(2μg/μl)，37℃水浴15min。

⑶将重组质粒转化进DH5α，阳性克隆筛选并测序，然后提取质粒备用(TIANpureMini Plasmid Kit(Tiangen)试剂盒)。

⑷转基因表达载体的构建：

根据Gateway克隆试剂盒说明书进行LR反应构建瞬时表达载体PJAM1502：AN2步骤如下：

LR反应：⑴300ngp DONR207重组质粒；100ng PJAM1502转基因表达载体；1μl LRClonaseⅡ；加水至5μl；25℃水浴12～16h。⑵向反应体系中加入0.5μl Proteinase K(2μg/μl)，37℃水浴15min。⑶重组质粒转化DH5α，阳性克隆筛选并测序，然后提取质粒备用。

⑸过表达AN2转基因烟草的获得：

根据Nature Protocols(2006)的方法，通过农杆菌介导将重组载体侵染到烟草(Samsun)中，步骤如下：

农杆菌制备：⑴吸取过表达载体质粒PJAM1502：AN2 5μl，加入农杆菌品种LBA4404，冰浴5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min，加入200μl无抗生素LB培养液，在28℃，200rpm条件下恒温培育2h；⑵吸取100μl培养液均匀涂布于含卡那霉素和利福平抗性的LB固体培养皿表面，放入28℃恒温培养箱48h；⑶挑取单板进行阳性克隆筛选，然后摇菌备用。

转基因侵染：⑴取烟草无菌苗幼嫩叶片，放入75％乙醇浸泡1min,转入2％次氯酸钠12min，无菌水清洗3～5遍，均匀切成1cm×1cm左右大小。⑵农杆菌摇菌48h，测量OD值为0.8，将叶片浸泡农杆菌8min，滤纸吸净，放入共培养基暗处理2d,转入分化培养基7d，转入含卡那霉素分化培养基14d，幼苗切下转入生根培养基直至生根。利用引物An2cdsF和AN2cdsR用来对阳性苗进行筛选检测(图8)。

在所述基因在调控花青素合成中的应用中，从枸杞品种黑枸杞和红枸杞中分离得到的AN2基因作为重组载体中的一部分，该重组载体作为宿主细胞中的一部分，其中宿主细胞是指除人或动物的生殖细胞或胚胎干细胞以外的细胞。此外，从枸杞品种黑枸杞和红枸杞中分离得到的AN2基因的转录本基因作为宿主细胞中的一部分。

构杞果实中控制黑色果实性状的主效基因AN2基因在培育转染植株方面的应用包括：构建该AN2基因及其转录本基因的植物表达载体，并利用该表达载体转化植物细胞，提高目标基因表达。

四、不同组织中AN2的转录水平

1、不同组织中AN2的转录水平

以Tubulin标准化各组织cDNA含量，引物AN2-RT-F和AN2-RT-R用来测定AN2在枸杞不同组织中的表达水平。AN2在黑枸杞有明显表达，但在红枸杞、根、茎和叶中能检测到AN2的微量表达。AN2的转录水平在黑色果实中最高(图10)。同一组织中，黑枸杞中的AN2表达水平明显高于红枸杞。

3、黑枸杞和红枸杞中AN2转录水平差异的原因

为了解释黑枸杞和红枸杞中AN2转录的差异，将AN2基因编码区序列转化为氨基酸序列进行比对。发现LrAN2与LbAN2存在两个氨基酸差异，在黑枸杞中分别为组氨酸和谷氨酸，而在红枸杞中分别为赖氨酸和丝氨酸，单个或多个氨基酸差异可能是导致黑枸杞中LrAN2转录水平高的原因。(图11)

五、自然群体中AN2等位变异和黑色果实性状的分布。

设计跨越插入片段的特异引物AN2spf和AN2spr来区分来自黑枸杞和红枸杞的AN2等位变异(LrAN2和LbAN2)(参见表3)。AN2基因在黑枸杞与红枸杞基因组中大小分别为1405bp和1417bp。通过序列比对发现在861bp-876bp处红枸杞插入15个碱基“ATATATATTTTTTTT”。以此差异设计特异性引物用于区分黑枸杞与红枸杞品系之间的差异。(图12)检查所有154个品系：72个黑枸杞品系，72个红枸杞品系。所有含有LrAN2的品系具有黑色果实性状，所有具有红色果实的品系携带Lb AN2。

最后应说明的是：以上所述实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 中国科学院西北高原生物研究所

<120> 枸杞基因以及其编码蛋白质、重组载体、及其用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 257

<212> PRT

<213> Lycium(Lycium cestroides)

<400> 1

Met Met Ala Thr Ser Val Thr Ile Thr Leu Ser Ser Gly Val Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Thr Thr Gly Gly Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Cys Ile Gly

20 25 30

Leu Thr Gly Gly Gly Leu Thr His Gly Val Pro Ile Ala Ala Gly Leu

35 40 45

Ala Ala Cys Ala Leu Ser Cys Ala Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala

50 55 60

Pro His Ile Leu Ala Gly Ala Pro Ser Ser Gly Gly Val Ala Leu Ile

65 70 75 80

Leu Ala Leu His Leu Leu Leu Gly Ala Ala Thr Ser Leu Ile Ala Gly

85 90 95

Ala Leu Pro Gly Ala Thr Ala Ala Ala Val Leu Ala Thr Thr Ala Thr

100 105 110

His Leu Gly Ala Leu Leu Thr Ala Pro His Ala Gly Gly Ala Leu Thr

115 120 125

Ala Ala Ala Leu Leu Ile Thr Gly Ala Thr Ile Leu Ala Pro Ala Pro

130 135 140

Ala Thr Pro Thr Ser Ser Ser Ala Leu Ala Val Ser Pro Cys Ser Ala

145 150 155 160

Leu Ser Ile Thr Ala Thr Val Ala Leu Ala Ala His Ala Ala Gly Ile

165 170 175

Leu Ala Ile Cys Gly Leu Pro Thr Gly Gly Thr Thr Ser Val Ala Gly

180 185 190

Gly Val Gly Thr Thr Thr Ser Leu Leu Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly

195 200 205

Gly Gly Ala Gly Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Gly Ala Met Leu Gly

210 215 220

Ser Leu Leu His Gly Gly Ile Ser Pro Pro Met Gly Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Ala Thr Ala Ala Pro Ser Ala Ala Ile Ala Leu Thr Ala Leu Leu

245 250 255

Ala

<210> 2

<211> 257

<212> PRT

<213> Lycium cestroides

<400> 2

Met Met Ala Thr Ser Val Thr Ile Thr Leu Ser Ser Gly Val Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Thr Thr Gly Gly Gly Ala His Leu Leu Ala Leu Cys Ile Gly

20 25 30

Leu Thr Gly Gly Gly Leu Thr His Gly Val Pro Ile Ala Ala Gly Leu

35 40 45

Ala Ala Cys Ala Leu Ser Cys Ala Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala

50 55 60

Pro His Ile Leu Ala Gly Ala Pro Ser Ser Gly Gly Val Ala Leu Ile

65 70 75 80

Leu Ala Leu His Leu Leu Leu Gly Ala Ala Thr Ser Leu Ile Ala Gly

85 90 95

Ala Leu Pro Gly Ala Thr Ala Ala Ala Val Leu Ala Thr Thr Ala Thr

100 105 110

His Leu Gly Ala Leu Leu Thr Ala Pro His Gly Gly Gly Ala Leu Thr

115 120 125

Ala Ala Ala Leu Leu Ile Thr Gly Ala Thr Ile Leu Ala Pro Ala Pro

130 135 140

Ala Thr Pro Thr Ser Ser Ser Ala Leu Ala Val Ser Pro Cys Ser Ala

145 150 155 160

Leu Ser Ile Thr Ala Thr Val Ala Leu Ala Ala His Ala Ala Gly Ile

165 170 175

Leu Ala Ile Cys Gly Leu Pro Thr Gly Gly Thr Thr Ser Val Ala Gly

180 185 190

Gly Val Gly Thr Thr Thr Ser Leu Leu Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly

195 200 205

Gly Gly Ala Gly Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Gly Ala Met Leu Gly

210 215 220

Ser Leu Leu His Gly Gly Ile Ser Pro Pro Met Gly Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Ala Thr Ala Ala Pro Ser Ala Ala Ile Ala Leu Thr Ala Leu Leu

245 250 255

Ala

<210> 3

<211> 774

<212> DNA

<213> 红枸杞(Lycium cestroides)

<400> 3

atgatgaata ctagtgttac tattactaaa tcatctggag tgaggaaagg tgcatggact 60

gaagaagaag atcttctttt gagaaaatgc attcaaaagt acggtgaagg aaaatggcat 120

caagttccca ttagagctgg tctaaataga tgcaggaaga gttgtagact gaggtggctg 180

aattatctaa ggccacatat aaagagaggt gacttctctt ctgaggaagt tgatcttatc 240

ttgaggcttc ataagctctt aggcaacaga tggtcactca tcgcgggtag acttccggga 300

agaacagcaa acgatgtcaa aaactactgg aacacacacc tacagaggaa gttaactgct 360

cctcatcgac aagagagaaa gtacaataat gctctcaaga tcacagaaaa caccatacta 420

agacctcgac ctcgaacctt cacatcaagt agtgcaaaaa atgtttcttt ttgcagcaac 480

aaaagtatca caaacacagt agataaaaac gcacacaaca atgaaatact aaatatttgt 540

gagaagccaa caggtgaaac gacgtcggta gacgagggag ttcaatggtg gacaagttta 600

ctggaaaatt gcaatgaaac tgaggaagaa gcagaagcat ttgggagctt tgatgaagaa 660

aatatgttac aaagtttgtt gcatgaggaa atttcaccac ccatgcaaca aggacaaagt 720

ggtaattggg atgacttttc cgctgatatt gacctatgga atctacttaa ttag 774

<210> 4

<211> 774

<212> DNA

<213> 黑枸杞(Lycium cestroides)

<400> 4

atgatgaata ctagtgttac tattactaaa tcatctggag tgaggaaagg tgcatggact 60

gaagaagaag atcatctttt gagaaaatgc attcaaaagt acggtgaagg aaaatggcat 120

caagttccca ttagagctgg tctaaataga tgcaggaaga gttgtagact gaggtggctg 180

aattatctaa ggccacatat aaagagaggt gacttctctt ctgaggaagt tgaccttatc 240

ttgaggcttc ataagctctt aggcaacaga tggtcactca ttgcgggtag acttccggga 300

agaacagcaa acgatgtcaa aaactactgg aacacacacc tacagaggaa gttaactgct 360

cctcatcaac aagagagaaa gtacaataat gccctcaaga tcacagaaaa caccatacta 420

agacctcgac ctcgaacctt cacatcaagt agtgcaaaga atgtttcttt ttgcagcaac 480

aaaagtatca caaacactgt agataaaaac gcacacaaca atgaaatact aaatatttgt 540

gagaagccaa caggtgaaac gacgtcggta gacgagggag ttcaatggtg gacaagttta 600

ctggaaaatt gcaatgaaac tgaggaagaa gcagaagcat ttgggagctt tgatgaagaa 660

aatatgttac aaagtttgtt gcatgaggaa atttcaccac ccatgcaaca aggacaaagt 720

ggtaattggg atgacttttc cgctgatatt gacctatgga atctactgaa ttag 774

<210> 5

<211> 1417

<212> DNA

<213> 红枸杞(Lycium cestroides)

<400> 5

atgatgaata ctagtgttac tattactaaa tcatctggag tgaggaaagg tgcatggact 60

gaagaagaag atcttctttt gagaaaatgc attcaaaagt acggtgaagg aaaatggcat 120

caagttccca ttagagctgg taataataat tctgatacta tactctctag aagagaagta 180

cgattgagta taacttatat tattccacta gataagagta tgtgcatatg tctgatatat 240

gtgaatatgt gcaggtctaa atagatgcag gaagagttgt agactgaggt ggctgaatta 300

tctaaggcca catataaaga gaggtgactt ctcttctgag gaagttgatc ttatcttgag 360

gcttcataag ctcttaggca acaggcaagt tcattttcaa acactttact aatatagagg 420

tggatttaaa attactatgt tataggaagg catgatatct ttaacactac ttataagatt 480

taaagataac tacggttagg tctctttatg acaccatcct tatataacaa ctccttacta 540

taacaatcaa gtttttctcg gaatcgattt tttatgttat attttacctc tctataataa 600

ccttttacct ataacaacaa caaccatctt ataacggctc tttgtaaaat tacccctcta 660

ttaaaagtat cttcattttt ggtaatatat taattaacca tatttataga aataaaatct 720

ttaagattat taccaataat aagtctaaga gattttgaac agatatttta caaaccaaag 780

aaataccata tcatgtttaa aatactagtc attatgcata gaaagttgtc tttgatgtta 840

tgtattttta tatatatata tatatttttt tttttttttt gcttaattag atggtcactc 900

atcgcgggta gacttccggg aagaacagca aacgatgtca aaaactactg gaacacacac 960

ctacagagga agttaactgc tcctcatcga caagagagaa agtacaataa tgccctcaag 1020

atcacagaaa acaccatact aagacctcga cctcgaacct tcacatcaag tagtgcaaag 1080

aatgtttctt tttgcagcaa caaaagtatc acaaacacag tagataaaaa cgcacacaac 1140

aatgaaatac taaatatttg tgagaagcca acaggtgaaa cgacgtcggt agacgaggga 1200

gttcaatggt ggacaagttt actggaaaat tgcaatgaaa ctgaggaaga agcagaagca 1260

tttgggagct ttgatgaaga aaatatgtta caaagtttgt tgcatgagga aatttcacca 1320

cccatgcaac aaggacaaag tggtaattgg gatgactttt ccgctgatat tgacctatgg 1380

aatctactta attagcttca tccatcagta gcattaa 1417

<210> 6

<211> 1405

<212> DNA

<213> 黑枸杞(Lycium cestroides)

<400> 6

atgatgaata ctagtgttac tattactaaa tcatctggag tgaggaaagg tgcatggact 60

gaagaagaag atcatctttt gagaaaatgc attcaaaagt acggtgaagg aaaatggcat 120

caagttccca ttagagctgg taataataat tctgatacta tactctctag aagagaagta 180

cgattgagta taacttatat tattccacta gataagagta tgtgcatgtg tctgatatat 240

gtgaatatgt gcaggtctaa atagatgcag gaagagttgt agactgaggt ggctgaatta 300

tctaaggcca catataaaga gaggtgactt ctcttctgag gaagttgacc ttatcttgag 360

gcttcataag ctcttaggca acaggcaagt tcattttcaa acactttact aatatagagg 420

tggatttaaa attactatgt tataggaagg catgatatct ttaacactac ttataagatt 480

taaagataac tacagttagg tctctctata acactatcct tatataacaa cttcttactc 540

taacaatcaa atttttctcg gaatcaattt tttatgttat attttacctc tctataataa 600

cattttacct ataacagcaa aaactatttt ctaacagctc tttgtaaaat taccactcta 660

ttaaaagtat cttcattttt tgtaatatat taattaacca tatttataga aatagaatcc 720

ctaagattat tatcaataat aagtctaaga gattttgaac agatattttt acaaaccaaa 780

gaaataccat atcatgttta aaatctacta gtcattatgc atagaaagtt gtctttgatg 840

ttatgtattt ttttatatat ttttttttgc ttaattagat ggtcactcat tgcgggtaga 900

cttccgggaa gaacagcaaa cgatgtcaaa aactactgga acacacacct acagaggaag 960

ttaactgctc ctcatcaaca agagagaaag tacaataatg ccctcaagat cacagaaaac 1020

accatactaa gacctcgacc tcgaaccttc acatcaagta gtgcaaagaa tgtttctttt 1080

tgcagcaaca aaagtatcac aaacactgtg gataaaaacg cacacaacaa tgaaatacta 1140

aatatttgtg agaagccaac aggtgaaacg acgtcggtag acgagggagt tcaatggtgg 1200

acaagtttac tggaaaattg caatgaaact gaggaagaag cagaagcatt tgggagcttt 1260

gatgaagaaa atatgttaca aagtttgttg catgaggaaa tttcaccacc catgcaacaa 1320

ggacaaagtg gtaattggga tgacttttcc gctgatattg acctatggaa tctactgaat 1380

tagcttcatc catcagtagc attaa 1405

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgttcttaat gctactgatg g 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgatgaata ctagtgttac tat 23

Claims

1.一种区分枸杞品系的方法，其特征在于，所述枸杞品系包括黑枸杞和红枸杞，所述方法为：检测枸杞品系AN2基因长度及861bp-876bp处碱基序列；

所述枸杞品系AN2基因长度为1417bp且861bp-876bp处碱基序列为ATATATATTTTTTTT时，判定所述枸杞品系为红枸杞；

所述枸杞品系AN2基因长度为1405bp时，判定所述枸杞品系为黑枸杞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测枸杞品系AN2基因长度及861bp-876bp处碱基序列所用的特异引物为：

AN2spf：ACTAGTCATTATGCATAGAAAGTTG，和，

AN2spr：CGTTTGCTGTTCTTCCCG。