CN114214336A

CN114214336A - 黑果枸杞LrNOR基因及其蛋白的应用

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Publication number: CN114214336A
Application number: CN202210165248.8A
Authority: CN
Inventors: 曾少华; 王瑛; 艾培炎
Original assignee: South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2042-02-23
Also published as: CN114214336B

Abstract

本发明公开了一种黑果枸杞LrNOR基因及其蛋白的应用。所述黑果枸杞LrNOR基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、或编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其可以调控黑果枸杞的果实成熟时间。在本发明中，通过CRIPSR‑Cas9技术对黑果枸杞LrNOR基因进行编辑，使黑果枸杞LrNOR基因突变后，转入黑果枸杞中，相对于野生型黑果枸杞34天果实成熟变色，LrNOR基因突变体植株47天果实才成熟变色，果实成熟时间大大滞后，因此，LrNOR基因可以调控果实的成熟时间，可以在1年内实现果实发育滞后的精准育种，具有极大的育种应用前景和经济价值。

Description

黑果枸杞LrNOR基因及其蛋白的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种黑果枸杞LrNOR基因、及其蛋白、基因编辑载体在调控果实成熟时间中的应用。

背景技术

黑果枸杞主要分布于我国西北干旱盐碱地区，是西北地区特有的先锋植物，具有显著的生态价值和经济价值，是重要的造林经济物种。但野生黑果枸杞种质资源匮乏，传统育种手段周期长，加之其遗传背景复杂，无法通过传统育种的方式获得。

基因组编辑技术的便利性使得其在植物领域迅速扩展开来，成为研究功能基因的利器。相较于模式植物而言，非模式植物的研究往往滞后于模式植物。在非模式植物中CRISPR/Cas9的应用，一方面可以加速孤儿作物的驯化，另一方面可以拓展对核心基因功能的研究。对非模式植物黑果枸杞而言，基因编辑技术的引入将极大的加快物种驯化过程，同时也为黑果枸杞功能基因的研究提供极大的便利。

黑果枸杞果实中富含花青素，Zheng测定了青藏高原三个产地黑果枸杞成熟果实的总花青素含量，结果均在500 mg/100g FW左右(Zheng et al., 2011)。且进一步的研究表明，随着果实发育时间的延长，花青素含量逐渐增加(Zheng et al., 2011 , Zeng etal., 2014)。

因此，从黑果枸杞中发掘研究可以使黑果枸杞果实成熟延迟的基因具有重要的意义。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种可以黑果枸杞LrNOR基因的应用，该基因可以调控黑果枸杞的果实成熟时间。

实现上述发明目的具体技术方案包括如下：

黑果枸杞LrNOR基因在调控黑果枸杞果实成熟时间中的应用，所述黑果枸杞LrNOR基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、或编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种黑果枸杞LrNOR蛋白在调控黑果枸杞果实成熟时间中的应用，所述黑果枸杞LrNOR蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了上述黑果枸杞LrNOR基因、或黑果枸杞LrNOR蛋白在黑果枸杞遗传育种中的应用。

本发明还提供了一种黑果枸杞LrNOR基因编辑载体，所述黑果枸杞LrNOR基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、或编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

在其中一些实施例中，所述黑果枸杞LrNOR基因编辑载体为pAGM4723::CR-LrNOR，所述黑果枸杞LrNOR基因编辑载体具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述黑果枸杞LrNOR基因编辑载体在调控黑果枸杞果实成熟时间中的应用。

本发明还提供了上述黑果枸杞LrNOR基因编辑载体在黑果枸杞遗传育种中的应用。

本发明还提供了一种转化有上述黑果枸杞LrNOR基因编辑载体的工程菌。

在其中一些实施例中，所述工程菌为转化有pAGM4723::CR-LrNOR的农杆

菌GV3101。

本发明还提供了上述工程菌在调控黑果枸杞果实成熟时间中的应用。

本发明还提供了上述工程菌在黑果枸杞遗传育种中的应用。

本发明还提供了一种延缓黑果枸杞果实成熟的方法。

实现上述发明目的的技术方案包括如下：

一种延缓黑果枸杞果实成熟的方法，所述方法包括以下步骤：利用CRISPR-Cas9系统对黑果枸杞LrNOR基因进行编辑，使黑果枸杞LrNOR基因的功能丧失；所述黑果枸杞LrNOR基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、或编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

在本发明中，通过分析LrNOR基因，获得了用于对LrNOR基因进行CRIPSR-Cas9基因编辑的两个sgRNA靶点序列，再获得了含有上述两个靶点序列的、对LrNOR基因进行了精确编辑的编辑载体，通过将编辑载体转入黑果枸杞中，得到LrNOR基因纯合突变体植株，相对于野生型34天果实成熟变色，LrNOR基因突变体植株47天果实才成熟变色，因此，LrNOR基因突变体植株的果实成熟时间大大滞后。本发明的黑果枸杞LrNOR基因可以调控果实的成熟时间，可以在1年内实现果实发育滞后的精准育种，具有极大的育种应用前景和经济价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中黑果枸杞LrNOR基因的结构，以及CRIPSR-Cas9基因编辑sgRNA靶点的位置信息；其中E1、E2、E3分别为1号外显子、2号外显子和3号外显子。

图2为本发明实施例1中构建的重组载体的结构示意图。

图3为本发明实施例2中T0代LrNOR基因编辑黑果枸杞植株的PCR检测电泳结果；其中，WT为未转化的野生型植株，LrNOR-11、LrNOR-13、LrNOR-15和LrNOR-16为T0代LrNOR基因编辑黑果枸杞植株。

图4为本发明实施例2中T0代LrNOR基因编辑黑果枸杞植株的测序结果；其中，WT为未转化的野生型植株，LrNOR-11、LrNOR-13、LrNOR-15和LrNOR-16为T0代LrNOR基因编辑黑果枸杞植株。

图5为本发明实施例3中连续观测T0代LrNOR基因编辑黑果枸杞植株花后47天的果实表型。

图6为本发明实施例3中T0代LrNOR基因编辑黑果枸杞植株的成熟果实发育尺寸。

图7为本发明实施例4中黑果枸杞转录因子LrNOR对ProLrACS1B和ProLrACO5的转录激活效应结果；其中（A）为双荧光素酶系统检测LrNOR对ProLrACS1B的转录激活效应；（B）为双荧光素酶系统检测LrNOR对ProLrACO5的转录激活效应。

图8为本发明实施例5中黑果枸杞转录因子LrNOR对ProLrACS1B和ProLrACO5的转录激活效应结果；其中（A）为酵母单杂交检测转录因子LrNOR对ProLrACS1B的结合情况；（B）为酵母单杂交检测转录因子LrNOR对ProLrACO5的结合情况。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第二版，J .萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行实验。

在本发明中，所述黑果枸杞的品种可以是黑果枸杞常规品种，也可为野生黑果枸杞种质资源。以下实施例中使用的是宁夏回族自治区中卫市中宁县的黑果枸杞，为野生种。

本发明中LrNOR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明中，首先提供了黑果枸杞LrNOR基因编辑载体pAGM4723::

CR-LrNOR，该载体具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。所述黑果枸杞LrNOR基因编辑载体是利用CRISPR/Cas9系统对黑果枸杞LrNOR基因进行编辑而得，CRISPR/Cas9系统中包括Cas9蛋白的编码基因、以及两个sgRNA的编码基因，分别为sgRNA1(SEQ ID No.3)和sgRNA2(SEQ ID No.4)，sgRNA1特异性靶向LrNOR基因的第1外显子，sgRNA2也特异性靶向LrNOR基因的第1外显子。

在黑果枸杞LrNOR基因编辑载体pAGM4723::CR-LrNOR中，sgRNA1的编码基因位于第7260-7354位，sgRNA2的编码基因位于第7496-7590位，Cas9蛋白的编码基因位于第2753-6856。

在本发明中，还提供了转化有上述黑果枸杞LrNOR基因编辑载体的工程菌，所述工程菌为转化有重组载体pAGM4723::CR-LrNOR的农杆菌GV3101。

以下实施例中使用的pGreen II 62-SK、pGreen II 0800、pGADT7、pAbAi、pICH86966::AtU6p::sgRNA_PDS、pICSL01009::AtU6p、pICH47751、pICH47761、pAGM4723、pICH41780、pICH47742::2x35S-5’UTR-hCas9(STOP)-NOST和pICH47732::NOSp-NPTII-OCST载体、pGreen II 0800-LUC均可从Addgene载体库(http://www.addgen.org/)购买。

以下实施例中使用的PCR Buffer KOD-Plus、KOD-Plus-DNA聚合酶为东洋纺(上海)生物科技有限公司产品；限制性内切酶、T4连接酶、DNA连接试剂盒为NEB公司产品；PCR产物纯化试剂盒和植物基因组DNA提取试剂盒均为广州美基生物科技有限公司的产品；MS培养基购自北京珍永伟科技发展有限公司，货号为M519；GV3101感受态购自上海唯地生物技术有限公司（货号AC1001S）；引物为北京擎科生物科技有限公司合成；测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；其余试剂均为分析纯试剂。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下结合具体实施例和附图来详细说明本发明。

实施例1 CRIPSR-Cas9基因编辑载体pAGM4723::CR-LrNOR的构建、并转化农杆菌

本实施例首先构建得到了CRIPSR-Cas9基因编辑载体pAGM4723::

CR-LrNOR，再接着将基因编辑载体pAGM4723::CR-LrNOR转化至农杆菌GV3101中，得到重组农杆菌pAGM4723::CR-LrNOR/GV3101，具体包括以下步骤：

一、获得LrNOR基因CRIPSR-Cas9基因编辑靶点序列

从黑果枸杞基因组信息中获得LrNOR的基因组信息，对LrNOR基因(序列为SEQ IDNo.1)的结构进行分析，分析结果如图1所示。

从图1可知，LrNOR基因有3个外显子(分别标注为E1、E2和E3)和2个内含子。将外显子1(E1)的序列提交到CRISPR-GE在线靶点分析数据库(http://

skl.scau.edu.cn/targetdesign/)，PAM序列设定为NGG，进行CRIPSR-Cas9靶点设计。最终选定了两个sgRNA靶点(如图1所示)，具体序列如下：

LrNOR基因sgRNA靶点1(SEQ ID No.3)：

5'-GGGAGCACGGATTCATCAAC-3'

LrNOR基因sgRNA靶点2(SEQ ID No.4)：

5'-AGTTGACAGTGCTCCGATTC-3'

二、构建LrNOR基因的CRIPSR-Cas9基因编辑载体

1、sgRNA扩增引物的设计

根据选定的靶点序列，设计构建sgRNA扩增引物，具体为：

LrNOR-g1(SEQ ID No.5)：5'-TGTGGTCTCAATTGGGGAGCACGGATTCATCAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'

GGTCTC为BsaI酶切位点，下划线为靶点1序列。

LrNOR-g2(SEQ ID No.6)：5'-TGTGGTCTCAATTGAGTTGACAGTGCTCCGATTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'

GGTCTC为BsaI酶切位点，下划线为靶点2序列。

sgRNA-R(SEQ ID No.7)：

5’-TGTGGTCTCAAGCGTAATGCCAACTTTGTAC-3’

GTCTC为BsaI酶切位点。

2、CRIPSR-Cas9基因编辑载体pAGM4723::CR-LrNOR的构建

a、重组质粒pICH47751::LrNOR-sgRNA1的构建

以pICH86966::AtU6p::sgRNA_PDS为模板，以LrNOR-g1(SEQ ID No.5)和sgRNA-R(SEQ ID No.7)为引物，进行PCR扩增。

PCR反应体系为：10×PCR Buffer KOD-Plus 5μL、25mM MgSO₄ 2μL、正向引物LrNOR-g1 1.5μL、反向引物sgRNA-R 1.5μL、2mM dNTPs 5μL、模板10~200 ng、KOD-Plus-DNA聚合酶1μL、加双蒸水至50μL。

PCR反应程序为：94℃变性120秒；98℃变性10秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒，共32个循环；4℃保温。

扩增获得两侧带均带有BsaI酶切位点的sgRNA1(靶点1)核苷酸片段；采用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR扩增产物，将纯化后的PCR扩增产物用BsaI酶切，再与经同样酶切的pICH47751载体和pICSL01009::AtU6p载体，在DNA连接试剂盒作用下进行连接，获得重组质粒pICH47751::LrNOR-sgRNA1。

b、重组质粒pICH47761::LrNOR-sgRNA2的构建

以pICH86966::AtU6p::sgRNA_PDS为模板，以LrNOR-g2(SEQ ID No.6)和sgRNA-R(SEQ ID No.7)为引物，进行PCR扩增。

PCR反应体系为：10×PCR Buffer KOD-Plus 5μL、25mM MgSO₄ 2μL、正向引物LrNOR-g2 1.5μL、反向引物sgRNA-R 1.5μL、2mM dNTPs 5μL、模板10~200 ng、KOD-Plus-DNA聚合酶1μL、加双蒸水至50μL。

扩增获得两侧带均带有BsaI酶切位点的sgRNA2(靶点2)核苷酸片段；纯化后的PCR扩增产物用BsaI酶切，再与经同样酶切的pICH47761载体和pICSL01009::AtU6p载体，在DNA连接试剂盒作用下连接，获得重组质粒pICH47761::LrNOR-sgRNA2。

c、CRIPSR-Cas9基因编辑载体pAGM4723::CR-LrNOR的构建

根据文献“Soyk S,Muller NA,Park SJ,Schmalenbach I,Jiang K,Hayama R,etal.Variation in the flowering gene SELF PRUNING 5G promotes day-neutralityand early yield in tomato.Nature Genetics.2017；49（1）:162-168”中所述方法，利用Golden Gate克隆技术对pICH47751::LrNOR-sgRNA1、pICH47761::LrNOR-

sgRNA2、pICH47732::NOSp-NPTII-OCST、pICH47742::2x35S-5'UTR-hCas9

(STOP)-NOST、pICH41780和pAGM4723进行重组，获得CRIPSR-Cas9基因编辑重组载体pAGM4723::CR-LrNOR(其中CR是CRISPR的缩写，表示基因编辑)

，重组载体结构图如图2所示，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

CRIPSR-Cas9基因编辑重组载体pAGM4723::CR-LrNOR依次包括T-DNA区的LB识别序列、启动抗性筛选基因NPTII表达的NOS启动子、抗性筛选基因NPTII、终止抗性筛选基因NPTII表达的终止子、启动Cas9蛋白的表达的35S启动子、Cas9蛋白的编码基因、Cas9蛋白的编码基因表达的终止子，拟南芥U6启动子（ATU6）、sgRNA1的编码基因、拟南芥U6启动子（ATU6）、sgRNA2的编码基因、T-DNA区的RB识别序列。其中，sgRNA1的编码基因如SEQ IDNo.8的第7260-7354位所示；sgRNA2的编码基因如SEQ ID No.8的第7496-7590位所示。

三、将基因编辑载体pAGM4723::CR-LrNOR转化农杆菌

取1μg步骤二制备的基因编辑载体pAGM4723::CR-LrNOR置于100μL GV3101感受态中，液氮中速冻5分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1mL LB培养基，28℃培养4小时；涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的LB平板上，28℃黑暗培养2天；挑单菌落，接种于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。

对菌液进行PCR鉴定，以Cas9-F(5'-CCGACGCTAACCTCGATAAG-3'，SEQ ID No.9)和Cas9-R(5'-CGAGCTGAGAGAGGTCGATT-3'，SEQ ID No.10)为引物，进行PCR扩增(PCR反应体系和反应程序同步骤二)，得到大小为757bp的扩增片段，即为阳性重组菌，将该重组菌命名为pAGM4723::CR-LrNOR/GV3101，-80℃冻存备用。

实施例2 T0代LrNOR基因编辑黑果枸杞植株的获得及鉴定

本实施例获得了T0代LrNOR基因编辑黑果枸杞植株，并进行了鉴定，具体方法如下：

1、将实施例1的重组菌pAGM4723::CR-LrNOR/GV3101转化黑果枸杞叶盘外植体（转化方法参考中国科学院大学，薛定磊硕士学位论文），然后在含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.4mg/L 1-萘乙酸的MS固体培养基(pH为5.8)中，于25℃、暗处理条件下共培养48小时；再转入含有0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.4mg/L 1-萘乙酸、200mg/L头孢霉素和50mg/L卡那霉素的MS固体培养基(pH为5.8)中，于25℃、光周期16h/d、光照强度3000lux条件下培养至长出再生芽；待再生芽长至2~3cm时切下再生芽，转入含有200mg/L头孢霉素和50mg/L卡那霉素的MS固体培养基(pH为5.8)中，在25℃、光周期16h/d、光照强度3000lux条件下培养至生根，即为T0代再生植株。

2、采用植物基因组DNA提取试剂盒提取上述T0代再生植株DNA，以DNA为模板，CR-LrNOR-F(SEQ ID No.11)和CR-LrNOR-R(SEQ ID No.12)为引物，进行PCR扩增。

PCR反应体系为：10×PCR Buffer KOD-Plus 5μL、25mM MgSO₄ 2μL、正向引物CR-LrNOR-F 1.5μL、反向引物CR-LrNOR-R 1.5μL、2mM dNTPs 5μL、模板10~200ng、KOD-Plus-DNA酶1μL、加双蒸水至50μL。

引物序列如下：

CR-LrNOR-F(SEQ ID No.11)：

5'-ATTCCGTGGTCCCTTATACCATATA-3'

CR-LrNOR-R(SEQ ID No.12)：

5'-AGAAGTAAGTGGAGTAGGCATAGCA-3'

3、对PCR产物进行测序，结果表明：LrNOR-11、LrNOR-13、LrNOR-15和LrNOR-16为LrNOR基因编辑黑果枸杞植株。

与野生型WT基因组信息相比，靶点1(sgRNA1识别的靶序列)、靶点2(sgRNA2识别的靶序列)或两靶点间DNA片段出现核苷酸缺失或插入，即为LrNOR基因被编辑的植株。由于黑果枸杞是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，纯合突变体指的是该植株的两条同源染色体的LrNOR基因发生了相同的突变。

PCR产物测序结果如图3所示。从图3中可以看出：和野生型LrNOR基因相比，四个基因编辑植株中的LrNOR基因发生了不同程度的碱基缺失或替换，且保持野生型LrNOR基因的其他序列不变，其中，LrNOR-11出现107bp的核酸片段的缺失，在另一条等位基因上出现了-20bp /+1bp的InDel；LrNOR-13出现107bp的核酸片段的缺失，在另一条等位基因上出现了-20bp的缺失；LrNOR-16出现-106bp/+1bp的核酸片段的InDel，在另一条等位基因上出现了+1/-2bp的InDel；LrNOR-15出现-5bp/+1bp的InDel的基因型。说明LrNOR-11、LrNOR-13、LrNOR-15和LrNOR-16均为LrNOR基因纯合突变植株。

4、对测序结果为阳性的PCR产物进行电泳检测，结果也证明，LrNOR-11、LrNOR-13、LrNOR-15和LrNOR-16的PCR产物明显小于野生型的条带，为LrNOR基因编辑黑果枸杞植株(图4)。

实施例3 LrNOR基因编辑黑果枸杞植株的果实成熟时间的研究

连续观测实施例2获得的LrNOR基因编辑黑果枸杞植株LrNOR-15和LrNOR-16开花后果实的表型，结果如图5所示。

从图5可以看出：野生型黑果枸杞植株在花后34天果实开始转色，37天果实即成熟；而LrNOR基因编辑黑果枸杞植株LrNOR-15在花后37天果实开始转色，直至45天果实才完全成熟；LrNOR基因编辑黑果枸杞植株LrNOR-16在花后39天果实开始转色，直至47天果实才完全成熟；说明LrNOR基因编辑黑果枸杞植株的果实发育时长明显增加，果实成熟时间明显被推迟。

使用游标卡尺测量果实发育过程中果实的尺寸，绘制果实大小的变化图，结果如图6所示，从图6可以看出，野生型黑果枸杞植株在花后0~32天果实大小变化不明显，34天果实开始转色时，果实突然变大，随着果实的成熟，果实大小逐渐增加。LrNOR基因编辑黑果枸杞植株LrNOR-13、LrNOR-15和LrNOR-16的果实自从开花后至果实转色和成熟，大小基本都保持不变。

实施例4烟草双荧光素酶验证LrNOR转录激活LrACS1B和LrACO5启动子

本实施例利用烟草双荧光酶验证：LrNOR转录激活了乙烯合成通路基因LrACS1B和LrACO5启动子，包括以下步骤：

1、pGreen II 62-SK_LrNOR重组载体构建

62-SK_LrNOR-F(SEQ ID No.13)：5'-TCCCCCGGGATGGGGAGCACGGATTCA-3'

62-SK_LrNOR-R(SEQ ID No.14)：

5'-CGGGGTACCAGAGTACCAATTCATACCGGTAACTTGATTA-3'

以黑果枸杞成熟果实RNA反转录的cDNA为模板，利用引物对62-SK_LrNOR-F(SEQID No.13)和62-SK_LrNOR-R(SEQ ID No.14)，通过PCR扩增获得去除终止密码子的转录因子LrNOR，PCR反应体系及反应程序与实施例1步骤二中一致。

将Effecter载体(效应载体)pGreen II 62-SK和转录因子LrNOR在SmaI和KpnI位点双酶切，采用T4 DNA连接酶(NEB公司，货号：M0202V)连接pGreen II 62-SK和转录因子LrNOR，获得pGreen II 62-SK-LrNOR重组载体，具体操作方法详见说明书，通过测序鉴定阳性克隆。

2、pGreen II 0800-proLrACO5和pGreen II 0800-proLrACS1B重组载体构建

根据黑果枸杞基因组数据，利用软件Plantpan(http://plantpan.itps.ncku.edu.tw/

promoter.php)分析ProLrACS1B和ProLrACO5基因，进一步挖掘LrACS1B和LrACO5基因的启动子序列。设计引物，分别如SEQ ID No.15~SEQ ID No.18所示。

0800-ProLrACO5-F(SEQ ID No.15)：

5'-CGGGGTACCGAATGTGCCTAGCTTCTTTCGCTCT -3'

0800-ProLrACO5-R(SEQ ID No.16)：

5'-GGCCTAGAGTTATTGGGTGCTTTGGGATGA-3'

0800-ProLrACS1B-F(SEQ ID No.17)：

5'-CGGGGTACCAAAGTCCCCACGAAATCCTCT-3'

0800-ProLrACS1B-R(SEQ ID No.18)：

5'-GGCCTCGAGGCTGCTGCTTTTGGTTATTGCTTGA-3'

以黑果枸杞果实DNA为模板，分别利用引物对0800-ProLrACO5-F(SEQ ID No.15)和0800-ProLrACO5-R(SEQ ID No.16)，引物对0800-ProLrACS1B-F(SEQ ID No.17)和0800-ProLrACS1B-R(SEQ ID No.18)，PCR扩增获得含KpnI和XhoI双酶切位点的ProLrACO5和ProLrACS1B(即LrACO5和LrACS1B的启动子)，PCR反应体系及反应程序与实施例1步骤二一致。

将Reporter载体(报告载体)pGreen II 0800-LUC、上述扩增得到的ProLrACO5和ProLrACS1B在KpnI和XhoI位点双酶切，采用T4 DNA连接酶试剂盒(NEB公司，货号：M0202V)连接酶切后的pGreen II 0800-LUC和ProLrACS1B、酶切后的pGreen II 0800-LUC和ProLrACO5，分别获得重组载体pGreen II 0800-proLrACS1B和pGreen II 0800-proLrACO5，具体操作方法详见说明书，阳性克隆通过测序鉴定。

3、重组质粒转化到农杆菌GV3101(pSoup-pl9)

采用热激法将重组载体pGreen II 62-SK、pGreen II 62-SK-LrNOR、pGreen II0800-proLrACS1B和pGreen II 0800-proLrACO5转化到农杆菌GV3101(pSoup-pl9)（上海唯地生物技术有限公司，货号：AC1003S）中，具体方法与实施例1步骤三中一致，通过测序鉴定阳性克隆。

4、农杆菌侵染烟草叶片及LUC/REN荧光检测

配制渗透缓冲液(0.2mM乙酰丁香酮，10mM MgCl₂，10mM MES，pH 5.7)。将含有重组载体pGreen II 62-SK、pGreen II 62-SK-LrNOR、pGreen II 0800-

proLrACS1B和pGreen II 0800-proLrACO5的GV3101(pSoup-pl9)农杆菌分别用上述渗透缓冲液悬浮后调整至OD= 0.3，28°C避光静置活化2h。

选取长势良好的烟草叶片，用lmL注射器，按启动子(含有重组载体pGreen II0800-proLrACS1B和pGreen II 0800-proLrACO5的GV3101)与转录因子(含有重组载体pGreen II 62-SK-LrNOR的GV3101)1:9的比例，混合后共同转化本氏烟草叶片，每个叶片为一个重复，需做3个重复以上并做好标记，设置对照（含有重组载体pGreen II 0800-proLrACS1B和pGreen II 0800-proLrACO5的GV3101与含pGreen II 62-SK的GV3101，按1:9的比例混合转化本氏烟草叶片作为对照）。在25°C组培室，16h光照/ 8h黑暗培养间中培养3天后，采用Dual-Luciferase® Reporter Assay System(Promega公司，货号：E1910)检测烟草叶片中的两种荧光素酶(LUC与REN)的比值，具体操作方法详见Dual-Luciferase®Reporter Assay System。

烟草叶片双荧光素酶测试结果如图7所示，图7结果表明：与对照(即以pGreen II62-SK分别与pGreen II 0800-proLrACS1B和pGreen II 0800-proLrACO5混合后转化的烟草叶片)相比，pGreen II 62-SK-LrNOR分别与pGreen II 0800-proLrACS1B和pGreen II0800-proLrACO5混合后转化的烟草叶片中，烟草叶片中的两种荧光素酶(LUC与REN)的比值明显提高，证明LrNOR能够显著激活proLrACS1B和proLrACO5。

实施例5 酵母单杂交Y1H验证LrNOR与proLrACS1B和proLrACO5结合

1、pGADT7-LrNOR重组载体构建

AD-LrNOR-F(SEQ ID No.19)：

5'-CGGAATTCATGGGGAGCACGGATTCA-3'

AD-LrNOR-R(SEQ ID No.20)：

5'-GGCCTCGAGCTAAGAGTACCAATTCATACCGGTA-3'

以黑果枸杞成熟果实RNA反转录的cDNA为模板，利用引物对AD-LrNOR-F(SEQ IDNo.19)和AD-LrNOR-R(SEQ ID No.20)，PCR扩增获得转录因子AD-LrNOR，PCR反应体系及反应程序与实施例1步骤二一致。

利用EcoRI和XhoI酶，对pGADT7载体(NCBI登陆号:U89961)和转录因子AD-LrNOR进行双酶切，采用T4 DNA连接酶试剂盒(NEB公司，货号：M0202V)连接pGADT7和转录因子AD-LrNOR，获得pGADT7-LrNOR重组载体，具体方法详见说明书，通过测序鉴定阳性克隆。

2、pAbAi-proLrACS1B和pAbAi-proLrACO5重组载体构建

利用KpnI和XhoI酶，对pAbAi载体、实施例4获得的proLrACS1B和proLrACO5进行双酶切，采用T4 DNA连接酶试剂盒(NEB公司，货号：M0202V)获得pAbAi-proLrACS1B和pAbAi-proLrACO5重组载体，具体操作方法详见说明书，通过测序鉴定阳性克隆。

3、Y1H Gold酵母转化及结合验证

向每管加入pAbAi-proLrACS1B或pAbAi-proLrACO5各100 ng，再加入5 ul灭活的Carrier DNA（北京酷来搏科技有限公司，货号：YT0003-1ml），随后加入100 ul制备的Y1HGold酵母感受态细胞（上海唯地生物技术有限公司，货号：YC1001S）；每管加入600 ul 1×TE/LiAc/PEG 3350 buffer（上海康朗生物科技有限公司，货号：KL-25-04450），在30℃水浴锅孵育30分钟。孵育完，每管加入20 ul DMSO，在42℃水浴锅中孵育15分钟，每隔5分钟轻轻弹动Ep管使菌液混匀；在冰上放置1分钟冷却；在台式离心机12000 g离心15 s收集酵母，弃上清，加入500 ul 1×TE/LiAc buffer（上海康朗生物科技有限公司，货号：KL-80934R-100）重悬；在台式离心机12000 g离心15 s收集酵母，弃上清，用100 ul 1×TE/LiAcbuffer重悬，全部加到SD/-Ura（成都远诺天成科技有限公司，货号：YGM003A-3）平板上涂板，并在30℃培养箱培养3天。

将上述转化有pAbAi-proLrACS1B和pAbAi-proLrACO5的Y1H Gold酵母菌株制备感受态，重复上述步骤，分别转化pGADT7(作为阴性对照)和步骤1获得的pGADT7-LrNOR，倒置培养3d。

将上述得到的单克隆，在SD-Leu（北京酷来搏科技有限公司，货号：S6090-40g）添加金担子素（北京酷来搏科技有限公司，货号：CA2332-1mg）的培养基上点菌斑，28°C倒置培养3d，观察能否正常生长。结果如图8所示。

图8中的(A)结果表明，同时转化有AD-LrNOR(即pGADT7-LrNOR)和pAbAi-proLrACS1B的Y1H Gold酵母菌株，可以正常地在含50 ng/mL金担子素的缺陷型平板(SD/-Ura)上生长，可以正常地在含50 ng/mL和75 ng/mL金担子素的缺陷型平板(SD-Leu)上生长，而转化空载体AD(即pGADT7)和pAbAi-proLrACS1B的Y1H Gold酵母菌株，却受到了抗生素金担子素的抑制，不能正常生长。

图8中的(B)结果表明，同时转化有AD-LrNOR(即pGADT7-LrNOR)和pAbAi-proLrACO5的Y1H Gold酵母菌株，可以正常地在75 ng/mL金担子素的缺陷型平板(SD-Leu和SD/-Ura)上生长，而转化空载体AD(即pGADT7)和pAbAi-proLrACO5的Y1H Gold酵母菌株，却受到了抗生素金担子素的抑制，不能正常生长。

该实施例的结果表明：LrNOR能与LrACS1B和LrACO5启动子结合。

由以上结果可知，本发明的黑果枸杞LrNOR基因具有结合并激活与乙烯合成相关基因LrACS1B和LrACO5的启动子的功能，LrNOR基因突变体由于蛋白功能缺失不能正常合成乙烯，从而延缓了黑果枸杞果实正常成熟进程，进而增加货架期，有重要的应用价值。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 黑果枸杞LrNOR基因及其蛋白的应用

<130> 1

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2675

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggggagca cggattcatc aaccggggca cgtcatcagc ctcagctccc tccagggttc 60

cgattccacc caaccgatga agaactcgtc gtccactacc tgaacaagaa agttgacagt 120

gctccgattc cggttgatat tattgctgaa gttgatcttt ataagtttga tccatgggaa 180

ctccctggta ctattttact actgctatgc ctactccact tacttctttt tcatatctat 240

aacctataga taaagaaaaa gaacaggaat tagcgataga agatttctgt ggctaaattg 300

caaaaactcg taattactcc tatttaacta tggattatca aaatcatgtt agctatgagg 360

aacttagtag cttattctct ttttcttata ataagttttt ttttcttttt ctttttcctt 420

ttcaatcttc atgttgtcat aaagtttcta tgaccaactt ccagagggtt gaacccaaaa 480

taggaattaa caatggccaa gtacttctgt cgctaaactg caaaaatatc atgactaata 540

attctattta atggtgaatt atcaaaaaat catgttagct atgatctatt tagtggcgaa 600

gttctttttt tgtatagtct taatataata tcttttttct ttcttttcaa tcttcatgtt 660

gccacaaagt ttctatgacc aacttgcata ggcttggact caaaagttaa catcgatgag 720

tttaacttat atacatttaa caatataaat aatgagttct caaaagatat ttatagatat 780

ttttattaaa gtgaatttgt aaattattat gtttcttaaa atatatttac aggtaacctt 840

gattaaaagt gaatttttaa acaaaatagg ttacatgtgt aaattattat gttttttaaa 900

agatatttac aagtaacctt aattaaaagt gaatttgtaa acaaaataga ttacttgttg 960

caacacgtaa aagcgacgtg atagtgtatg actttttgcc agtttttaca aattagaatt 1020

ctaaacgtat atgtggaatt cctcgaaaag tagtactcaa aaattttaag ttttgtactc 1080

atattttctt aaaaaattta gaatcttgaa ttttaaattc tgaatccttc tctatcaatt 1140

atgatgcagc taaggcaata tttggagaac aagaatggta ttttttcagt cctagggata 1200

ggaaataccc gaatggggcg aggccgaacc gggcagctac atcgggttat tggaaggcta 1260

ccggaactga caagccggtg tttaccgccg gtggaactca aaaagttggg gtcaaaaaag 1320

ctctcgtgtt ttatggtgga aaacctccta aaggagtgaa aactaattgg atcatgcatg 1380

aatatagact tgcagaaaat aaaacaaata ataagcccct tggttgtgat attgttgcca 1440

acaaaaaagg atctctgagg gtaagtcctt tttttaaaaa ataactattt atatcttgac 1500

ttaattcaag tttcaaattt ttaatttgat gaaagaattt atgaggcacc gttcgaattt 1560

tgagagtcaa cactagtttt ttcttttgtc aggatttttt catacgcctc ttagatattt 1620

tgaattaaat gtgacttata gaacttttta cgtattctcc aaatatgtaa attttatttc 1680

aaaaaattta aaattttatg ttcgaattca cggtcaaaac taaagatttt gactctcgaa 1740

atttcaatgg tgtcatatat aaatcgggac aaaggaagta tcaatgcaat ttaatcggtt 1800

atagtaaggt tatgagtatg gtaaattatt ttacactatc tgctcaataa tactggttac 1860

agtaagttat caataatact gtaaaaacaa ggatttctga tggacagaaa tgtgctcgtg 1920

ggcacggcat ttcaacagat tcatctgtcg gaaatctcgc ctattctagt tgtgtattag 1980

tactttattt tgcatgctac tatatgaggc ttgatgtaaa gtgttaccct gatttttttt 2040

ttttactttc agtgcatata acataaaact cgaatgaatg taggtaatgt ttgactgact 2100

agttagtctt acttttttag actatactat atgttctttt ttgttttgtt ttgcagttag 2160

atgattgggt tttatgccgg atttacaaga agaacaacac acaaaggcca atagatgaca 2220

tgaatgacat gatgggacca ataccaccat tattttttca acaaaaacaa gaaggaatta 2280

aagcttcaaa ctatggtgca ttgctcgaaa atgaatcgaa catgtacgaa ggcattatga 2340

acaacacgag cgatatgatc aacaataatg gatccatttc acagttatcg tcaaagagac 2400

tgctccctgc aggtttgtac tggaatatcg aagacgggga taattctccg tctacaaaaa 2460

ggttcttagt ggagaacggg gacgatggac ttaacatgac taatgtgcat acaaatcatg 2520

atcagaacag ctccatcgcc agtttcttga gccagcttcc tcaaaatcct tcgattcaac 2580

agcaacaaca acaagcattg ggatctctta gtgatggagt tgtctttcga cagccttata 2640

ataatcaagt taccggtatg aattggtact cttag 2675

<210> 2

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Ser Thr Asp Ser Ser Thr Gly Ala Arg His Gln Pro Gln Leu

1 5 10 15

Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Val His

20 25 30

Tyr Leu Asn Lys Lys Val Asp Ser Ala Pro Ile Pro Val Asp Ile Ile

35 40 45

Ala Glu Val Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Glu Leu Pro Ala Lys

50 55 60

Ala Ile Phe Gly Glu Gln Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg

65 70 75 80

Lys Tyr Pro Asn Gly Ala Arg Pro Asn Arg Ala Ala Thr Ser Gly Tyr

85 90 95

Trp Lys Ala Thr Gly Thr Asp Lys Pro Val Phe Thr Ala Gly Gly Thr

100 105 110

Gln Lys Val Gly Val Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Gly Gly Lys Pro

115 120 125

Pro Lys Gly Val Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala

130 135 140

Glu Asn Lys Thr Asn Asn Lys Pro Leu Gly Cys Asp Ile Val Ala Asn

145 150 155 160

Lys Lys Gly Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr

165 170 175

Lys Lys Asn Asn Thr Gln Arg Pro Ile Asp Asp Met Asn Asp Met Met

180 185 190

Gly Pro Ile Pro Pro Leu Phe Phe Gln Gln Lys Gln Glu Gly Ile Lys

195 200 205

Ala Ser Asn Tyr Gly Ala Leu Leu Glu Asn Glu Ser Asn Met Tyr Glu

210 215 220

Gly Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Met Ile Asn Asn Asn Gly Ser Ile

225 230 235 240

Ser Gln Leu Ser Ser Lys Arg Leu Leu Pro Ala Gly Leu Tyr Trp Asn

245 250 255

Ile Glu Asp Gly Asp Asn Ser Pro Ser Thr Lys Arg Phe Leu Val Glu

260 265 270

Asn Gly Asp Asp Gly Leu Asn Met Thr Asn Val His Thr Asn His Asp

275 280 285

Gln Asn Ser Ser Ile Ala Ser Phe Leu Ser Gln Leu Pro Gln Asn Pro

290 295 300

Ser Ile Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala Leu Gly Ser Leu Ser Asp Gly

305 310 315 320

Val Val Phe Arg Gln Pro Tyr Asn Asn Gln Val Thr Gly Met Asn Trp

325 330 335

Tyr Ser

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggagcacgg attcatcaac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agttgacagt gctccgattc 20

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtggtctca attggggagc acggattcat caacgtttta gagctagaaa tagcaag 57

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtggtctca attgagttga cagtgctccg attcgtttta gagctagaaa tagcaag 57

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtggtctca agcgtaatgc caactttgta c 31

<210> 8

<211> 12482

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgccgaatt cggatccgga gcggagaatt aagggagtca cgttatgacc cccgccgatg 60

acgcgggaca agccgtttta cgtttggaac tgacagaacc gcaacgttga aggagccact 120

gagccgcggg tttctggagt ttaatgagct aagcacatac gtcagaaacc attattgcgc 180

gttcaaaagt cgcctaaggt cactatcagc tagcaaatat ttcttgtcaa aaatgctcca 240

ctgacgttcc ataaattccc ctcggtatcc aattagagtc tcatattcac tctcctattt 300

ttacaacaat taccaacaac aacaaacaac aaacaacatt acaattacat ttacaattac 360

catggttgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt 420

cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc 480

agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact 540

gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt 600

gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca 660

ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat 720

gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg 780

catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga 840

agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga 900

cggcgaggat ctcgtcgtga ctcatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa 960

tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga 1020

catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt 1080

cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct 1140

tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgctagag tcctgcttta atgagatatg 1200

cgagacgcct atgatcgcat gatatttgct ttcaattctg ttgtgcacgt tgtaaaaaac 1260

ctgagcatgt gtagctcaga tccttaccgc cggtttcggt tcattctaat gaatatatca 1320

cccgttacta tcgtattttt atgaataata ttctccgttc aatttactga ttgtacccta 1380

ctacttatat gtacaatatt aaaatgaaaa caatatattg tgctgaatag gtttatagcg 1440

acatctatga tagagcgcca caataacaaa caattgcgtt ttattattac aaatccaatt 1500

ttaaaaaaag cggcagaacc ggtcaaacct aaaagactga ttacataaat cttattcaaa 1560

tttcaaaagt gccccagggg ctagtatcta cgacacaccg agcggcgaac taataacgct 1620

cactgaaggg aactccggtt ccccgccggc gcgcatgggt gagattcctt gaagttgagt 1680

attggccgtc cgctctaccg aaagttacgg gcaccattca acccggtcca gcacggcggc 1740

cgggtaaccg acttgctgcc ccgagaatta tgcagcattt ttttggtgta tgtgggcccc 1800

aaatgaagtg caggtcaaac cttgacagtg acgacaaatc gttgggcggg tccagggcga 1860

attttgcgac aacatgtcga ggctcagccg ctgcaagaat tcaagcttgg aggtcaacat 1920

ggtggagcac gacactctgg tctactccaa aaatgtcaaa gatacagtct cagaagatca 1980

aagggctatt gagacttttc aacaaaggat aatttcggga aacctcctcg gattccattg 2040

cccagctatc tgtcacttca tcgaaaggac agtagaaaag gaaggtggct cctacaaatg 2100

ccatcattgc gataaaggaa aggctatcat tcaagatctc tctgccgaca gtggtcccaa 2160

agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gaggttccaa ccacgtctac 2220

aaagcaagtg gattgatgtg ataacatggt ggagcacgac actctggtct actccaaaaa 2280

tgtcaaagat acagtctcag aagatcaaag ggctattgag acttttcaac aaaggataat 2340

ttcgggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cacttcatcg aaaggacagt 2400

agaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ctatcattca 2460

agatctctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga 2520

aaaagaagag gttccaacca cgtctacaaa gcaagtggat tgatgtgaca tctccactga 2580

cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag 2640

ttcatttcat ttggagagga cacgctcgag tataagagct catttttaca acaattacca 2700

acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tacatttaca attatcgata caatggacaa 2760

gaagtactcc attgggctcg atatcggcac aaacagcgtc ggctgggccg tcattacgga 2820

cgagtacaag gtgccgagca aaaaattcaa agttctgggc aataccgatc gccacagcat 2880

aaagaagaac ctcattggcg ccctcctgtt cgactccggg gagacggccg aagccacgcg 2940

gctcaaaaga acagcacggc gcagatatac ccgcagaaag aatcggatct gctacctgca 3000

ggagatcttt agtaatgaga tggctaaggt ggatgactct ttcttccata ggctggagga 3060

gtcctttttg gtggaggagg ataaaaagca cgagcgccac ccaatctttg gcaatatcgt 3120

ggacgaggtg gcgtaccatg aaaagtaccc aaccatatat catctgagga agaagcttgt 3180

agacagtact gataaggctg acttgcggtt gatctatctc gcgctggcgc atatgatcaa 3240

atttcgggga cacttcctca tcgaggggga cctgaaccca gacaacagcg atgtcgacaa 3300

actctttatc caactggttc agacttacaa tcagcttttc gaagagaacc cgatcaacgc 3360

atccggagtt gacgccaaag caatcctgag cgctaggctg tccaaatccc ggcggctcga 3420

aaacctcatc gcacagctcc ctggggagaa gaagaacggc ctgtttggta atcttatcgc 3480

cctgtcactc gggctgaccc ccaactttaa atctaacttc gacctggccg aagatgccaa 3540

gcttcaactg agcaaagaca cctacgatga tgatctcgac aatctgctgg cccagatcgg 3600

cgaccagtac gcagaccttt ttttggcggc aaagaacctg tcagacgcca ttctgctgag 3660

tgatattctg cgagtgaaca cggagatcac caaagctccg ctgagcgcta gtatgatcaa 3720

gcgctatgat gagcaccacc aagacttgac tttgctgaag gcccttgtca gacagcaact 3780

gcctgagaag tacaaggaaa ttttcttcga tcagtctaaa aatggctacg ccggatacat 3840

tgacggcgga gcaagccagg aggaatttta caaatttatt aagcccatct tggaaaaaat 3900

ggacggcacc gaggagctgc tggtaaagct taacagagaa gatctgttgc gcaaacagcg 3960

cactttcgac aatggaagca tcccccacca gattcacctg ggcgaactgc acgctatcct 4020

caggcggcaa gaggatttct accccttttt gaaagataac agggaaaaga ttgagaaaat 4080

cctcacattt cggataccct actatgtagg ccccctcgcc cggggaaatt ccagattcgc 4140

gtggatgact cgcaaatcag aagagactat cactccctgg aacttcgagg aagtcgtgga 4200

taagggggcc tctgcccagt ccttcatcga aaggatgact aactttgata aaaatctgcc 4260

taacgaaaag gtgcttccta aacactctct gctgtacgag tacttcacag tttataacga 4320

gctcaccaag gtcaaatacg tcacagaagg gatgagaaag ccagcattcc tgtctggaga 4380

gcagaagaaa gctatcgtgg acctcctctt caagacgaac cggaaagtta ccgtgaaaca 4440

gctcaaagaa gattatttca aaaagattga atgtttcgac tctgttgaaa tcagcggagt 4500

ggaggatcgc ttcaacgcat ccctgggaac gtatcacgat ctcctgaaaa tcattaaaga 4560

caaggacttc ctggacaatg aggagaacga ggacattctt gaggacattg tcctcaccct 4620

tacgttgttt gaagataggg agatgattga agaacgcttg aaaacttacg ctcatctctt 4680

cgacgacaaa gtcatgaaac agctcaagag gcgccgatat acaggatggg ggcggctgtc 4740

aagaaaactg atcaatggga tccgagacaa gcagagtgga aagacaatcc tggattttct 4800

taagtccgat ggatttgcca accggaactt catgcagttg atccatgatg actctctcac 4860

ctttaaggag gacatccaga aagcacaagt ttctggccag ggggacagtc tccacgagca 4920

catcgctaat cttgcaggta gcccagctat caaaaaggga atactgcaga ccgttaaggt 4980

cgtggatgaa ctcgtcaaag taatgggaag gcataagccc gagaatatcg ttatcgagat 5040

ggcccgagag aaccaaacta cccagaaggg acagaagaac agtagggaaa ggatgaagag 5100

gattgaagag ggtataaaag aactggggtc ccaaatcctt aaggaacacc cagttgaaaa 5160

cacccagctt cagaatgaga agctctacct gtactacctg cagaacggca gggacatgta 5220

cgtggatcag gaactggaca tcaatcggct ctccgactac gacgtggatc atatcgtgcc 5280

ccagtctttt ctcaaagatg attctattga taataaagtg ttgacaagat ccgataaaaa 5340

tagagggaag agtgataacg tcccctcaga agaagttgtc aagaaaatga aaaattattg 5400

gcggcagctg ctgaacgcca aactgatcac acaacggaag ttcgataatc tgactaaggc 5460

tgaacgaggt ggcctgtctg agttggataa agccggcttc atcaaaaggc agcttgttga 5520

gacacgccag atcaccaagc acgtggccca aattctcgat tcacgcatga acaccaagta 5580

cgatgaaaat gacaaactga ttcgagaggt gaaagttatt actctgaagt ctaagctggt 5640

ttcagatttc agaaaggact ttcagtttta taaggtgaga gagatcaaca attaccacca 5700

tgcgcatgat gcctacctga atgcagtggt aggcactgca cttatcaaaa aatatcccaa 5760

gcttgaatct gaatttgttt acggagacta taaagtgtac gatgttagga aaatgatcgc 5820

aaagtctgag caggaaatag gcaaggccac cgctaagtac ttcttttaca gcaatattat 5880

gaattttttc aagaccgaga ttacactggc caatggagag attcggaagc gaccacttat 5940

cgaaacaaac ggagaaacag gagaaatcgt gtgggacaag ggtagggatt tcgcgacagt 6000

ccggaaggtc ctgtccatgc cgcaggtgaa catcgttaaa aagaccgaag tacagaccgg 6060

aggcttctcc aaggaaagta tcctcccgaa aaggaacagc gacaagctga tcgcacgcaa 6120

aaaagattgg gaccccaaga aatacggcgg attcgattct cctacagtcg cttacagtgt 6180

actggttgtg gccaaagtgg agaaagggaa gtctaaaaaa ctcaaaagcg tcaaggaact 6240

gctgggcatc acaatcatgg agcgatcaag cttcgaaaaa aaccccatcg actttctcga 6300

ggcgaaagga tataaagagg tcaaaaaaga cctcatcatt aagcttccca agtactctct 6360

ctttgagctt gaaaacggcc ggaaacgaat gctcgctagt gcgggcgagc tgcagaaagg 6420

taacgagctg gcactgccct ctaaatacgt taatttcttg tatctggcca gccactatga 6480

aaagctcaaa ggatctcccg aagataatga gcagaagcag ctgttcgtgg aacaacacaa 6540

acactacctt gatgagatca tcgagcaaat aagcgaattc tccaaaagag tgatcctcgc 6600

cgacgctaac ctcgataagg tgctttctgc ttacaataag cacagggata agcccatcag 6660

ggagcaggca gaaaacatta tccacttgtt tactctgacc aacttgggcg cgcctgcagc 6720

cttcaagtac ttcgacacca ccatagacag aaagcggtac acctctacaa aggaggtcct 6780

ggacgccaca ctgattcatc agtcaattac ggggctctat gaaacaagaa tcgacctctc 6840

tcagctcggt ggagacagca gggctgaccc caagaagaag aggaaggtgt gagcttgtca 6900

agcagatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 6960

tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 7020

atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 7080

atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 7140

atctatgtta ctagatcgac gctactagaa ttcgagctcg gagtgatcaa aagtcccaca 7200

tcgatcaggt gatatatagc agcttagttt atataatgat agagtcgaca tagcgattgg 7260

gagcacggat tcatcaacgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg 7320

ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt tctagaccca gctttcttgt 7380

acaaagttgg cattacgctt tacgaattcc catggggagt gatcaaaagt cccacatcga 7440

tcaggtgata tatagcagct tagtttatat aatgatagag tcgacatagc gattagttga 7500

cagtgctccg attcgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat 7560

caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttcta gacccagctt tcttgtacaa 7620

agttggcatt acgctcagag aggatgcaca tgtgaccgag ggacacgaag tgatccgttt 7680

aaactatcag tgtttgacag gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat 7740

tagaataatc ggatatttaa aagggcgtga aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt 7800

gccagccgtg cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg 7860

gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt 7920

tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca 7980

aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc 8040

aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg 8100

ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa 8160

ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc 8220

cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg 8280

atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc 8340

accgccgacc tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa 8400

gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag 8460

gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac 8520

ccaggcactg ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc 8580

cgcgaggtcc aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta 8640

aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca 8700

gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc 8760

agttgccggc ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca 8820

ttaccgagct gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa 8880

atgagtagat gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc 8940

accgacgccg tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc 9000

tgggttgtct gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga 9060

cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga 9120

gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg 9180

tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc 9240

cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc 9300

gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg 9360

tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca 9420

cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact 9480

gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa 9540

gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga 9600

tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt 9660

tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga 9720

agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga 9780

gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct 9840

gacggttcac cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct 9900

ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg 9960

cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc 10020

aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt 10080

catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca 10140

gatgctaggg caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaagcttct ttcctgtgga 10200

tagcacgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa 10260

cccaaagccg tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa 10320

aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc 10380

ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc cgaacagctg caaaaagcgc ctacccttcg 10440

gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc 10500

aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc 10560

actcgaccgc cggcgcccac atcaaggctc cgagtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 10620

ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 10680

taatattgaa aaaggaagag tatggctaaa atgagaatat caccggaatt gaaaaaactg 10740

atcgaaaaat accgctgcgt aaaagatacg gaaggaatgt ctcctgctaa ggtatataag 10800

ctggtgggag aaaatgaaaa cctatattta aaaatgacgg acagccggta taaagggacc 10860

acctatgatg tggaacggga aaaggacatg atgctatggc tggaaggaaa gctgcctgtt 10920

ccaaaggtcc tgcactttga acggcatgat ggctggagca atctgctcat gagtgaggcc 10980

gatggcgtcc tttgctcgga agagtatgaa gatgaacaaa gccctgaaaa gattatcgag 11040

ctgtatgcgg agtgcatcag gctctttcac tccatcgaca tatcggattg tccctatacg 11100

aatagcttag acagccgctt agccgaattg gattacttac tgaataacga tctggccgat 11160

gtggattgcg aaaactggga agaggacact ccatttaaag atccgcgcga gctgtatgat 11220

tttttaaaga cggaaaagcc cgaagaggaa cttgtctttt cccacggcga cctgggagac 11280

agcaacatct ttgtgaaaga tggcaaagta agtggcttta ttgatcttgg gagaagcggc 11340

agggcggaca agtggtatga cattgccttc tgcgtccggt cgctcaggga ggatatcggg 11400

gaagaacagt atgtcgagct attttttgac ttactgggga tcaagcctga ttgggagaaa 11460

ataaaatatt atattttact ggatgaattg ttttagctgt cagaccaagt ttactcatat 11520

atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 11580

tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 11640

cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 11700

ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 11760

actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 11820

gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 11880

ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 11940

gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 12000

acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 12060

tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 12120

gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 12180

cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 12240

cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctgct cggatctgtt 12300

ggaccggaca gtagtcatgg ttgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag 12360

ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt 12420

gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta atgtactggg gttgaacact 12480

ct 12482

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgacgctaa cctcgataag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgagctgaga gaggtcgatt 20

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

attccgtggt cccttatacc atata 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agaagtaagt ggagtaggca tagca 25

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcccccggga tggggagcac ggattca 27

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cggggtacca gagtaccaat tcataccggt aacttgatta 40

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggggtaccg aatgtgccta gcttctttcg ctct 34

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggcctagagt tattgggtgc tttgggatga 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cggggtacca aagtccccac gaaatcctct 30

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggcctcgagg ctgctgcttt tggttattgc ttga 34

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cggaattcat ggggagcacg gattca 26

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggcctcgagc taagagtacc aattcatacc ggta 34

Claims

1.黑果枸杞LrNOR基因在调控黑果枸杞果实成熟时间中的应用，所述黑果枸杞LrNOR基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、或编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.黑果枸杞LrNOR基因在黑果枸杞遗传育种中的应用，所述黑果枸杞LrNOR基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、或编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.黑果枸杞LrNOR蛋白在调控黑果枸杞果实成熟时间中的应用，所述黑果枸杞LrNOR蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

4.黑果枸杞LrNOR蛋白在黑果枸杞遗传育种中的应用，所述黑果枸杞LrNOR蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

5.一种黑果枸杞LrNOR基因编辑载体，其特征在于，所述黑果枸杞LrNOR基因编辑载体具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。

6.权利要求5所述的黑果枸杞LrNOR基因编辑载体在调控黑果枸杞果实成熟时间中的应用。

7.权利要求5所述的黑果枸杞LrNOR基因编辑载体在黑果枸杞遗传育种中的应用。

8.一种转化有权利要求5所述的黑果枸杞LrNOR基因编辑载体的工程菌。

9.权利要求8所述的工程菌在调控黑果枸杞果实成熟时间、或黑果枸杞遗传育种中的应用。

10.一种延缓黑果枸杞果实成熟的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：利用CRISPR-Cas9系统对黑果枸杞LrNOR基因进行编辑，使黑果枸杞LrNOR基因的功能丧失；所述黑果枸杞LrNOR基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、或编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。