CN109136228B - 长链非编码rna-nkila在骨组织损伤修复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了长链非编码RNA‑NKILA在骨组织损伤修复中应用。实验证明，过表达NKILA能够显著促进间充质干细胞中的钙离子沉积，显著增强间充质干细胞中的碱性磷酸酶活性，并能显著提高间充质干细胞中成骨分化标志物RUNX2、SP7、SPP1基因的表达量。

Description

长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复中的应用

技术领域

本发明属于干细胞生物工程技术领域，更具体的说，涉及长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复中的应用。

背景技术

骨骼损伤修复和再生，一直以来都是医学界的一大难题。对于运动性的骨骼损伤，医学界常常采用自体骨移植、同种异体骨移植、带血供的游离骨移植以及生物材料替代等传统方法进行治疗，但这些方法存在来源少、并发症多、免疫排斥以及医源性感染等诸多问题，治疗效果并理想。随着骨组织工程技术的不断发展，人们逐渐开始运用组织工程的方法，来解决骨组织损伤修复的问题。间充质干细胞作为一类具有良好增值能力以及多向分化潜能的种子细胞，走进了人们的视野。研究发现，间充质干细胞可以从骨髓、脂肪等多种组织中分离获取；在特定的条件下，间充质干细胞还可以分化成软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞等多种细胞；此外，间充质干细胞还具有很低的免疫原性。这些特有的特性使得间充质干细胞成为了临床上骨组织损伤修复和再生的种子细胞。大量研究证据表明：间充质干细胞的成骨分化，在分子水平上受到多种调控因子的影响，其中包括一些重要的转录调控因子，例如RUNX2和SP7等，它们能够通过调节成骨分化相关基因的表达来调控干细胞的成骨分化，此外，还有很多非编码RNA也参与了干细胞成骨分化的调控作用。

长链非编码RNA是一类非编码蛋白并且长度一般来说大于200个核苷酸的小分子RNA，其表达量往往偏低并且具有组织特异性。由于长链非编码RNA的低表达量，人们往往忽略了这类RNA分子在生物学功能上的重要性。近年来，由于高通量测序技术的发展和应用，人们发现长链非编码RNA在细胞凋亡、增殖、分化等多种生物学过程中都具有非常重要的调控功能。例如，近来人们发现了一个长链非编码RNA，称为PU.1-AS，它可以通过阻断PU.1基因的表达，从而促进间充质干细胞的成脂分化。再如另一个长链非编码RNA，称为ANCR，它可以通过调节RUNX2基因的表达，来调控间充质干细胞的成骨分化。这些研究表明，长链非编码RNA在干细胞向特定的细胞方向分化的过程中有着重要的调控作用。因此，通过改变细胞中某些重要的长链非编码RNA的表达量，能够达到诱导干细胞向特定方向分化的目的，从而为组织损伤修复等医学难题找到新的解决方案。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复中的应用。

本发明的另一个目的在于，提供长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复检测中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复中的应用，所述长链非编码RNA-NKILA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

一种用于骨组织损伤修复的过表达载体pLV-NKILA，其由NKILA基因片段与慢病毒空载体pLV构建而成；所述NKILA基因片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述慢病毒空载体pLV的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

所述过表达载体pLV-NKILA的构建方法，包括以下步骤：采用限制性内切酶BamH I和Xba I分别对慢病毒载体pLV以及NKILA基因片段进行双酶切，并采用T4DNA连接酶体系对酶切后的NKILA基因片段及线性慢病毒载体pLV进行连接反应，然后转化感受态细胞，筛选阳性菌落，提取阳性菌落的质粒，得到所述的过表达载体pLV-NKILA。

进一步地，所述NKILA基因片段的制备方法，包括以下步骤：依据所述长链非编码RNA-NKILA的核苷酸序列，采用DNA合成仪，根据固相亚磷酰胺三酯法原理对NKILA基因片段进行双链合成，同时在其5’末端和3’末端上分别添加BamH I和Xba I酶切位点，得到含有特异性酶切位点的NKILA基因片段。

一种用于骨组织损伤修复的诱导型细胞，其由所述的过表达载体pLV-NKILA转染细胞载体构建而成。

所述诱导型细胞的构建方法，包括以下步骤：采用脂质体转染试剂，将过表达载体pLV-NKILA以及慢病毒包装质粒pSPAX2、pMD2G共同转染到包装细胞中，经培养后收集慢病毒上清液；然后将慢病毒上清液加入到细胞载体中，经培养后得到稳定表达长链非编码RNA-NKILA的诱导型细胞。

长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复检测中的应用，所述长链非编码RNA-NKILA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

一种用于骨组织损伤修复检测的试剂盒，其含有用于检测NKILA表达量的特异性引物；所述特异性引物包括：

上游引物：5’-AACCAAACCTACCCACAACG-3’，

下游引物：5’-ACCACTAAGTCAATCCCAGGTG-3’。

一种骨组织损伤修复检测方法，包括以下步骤：

1)取待测样品，采用RNA提取试剂盒，提取其总RNA；

2)采用逆转录试剂盒，对所提取的总RNA进行逆转录反应，获得cDNA；

3)以逆转录反应得到的cDNA为模板，采用所述的特异性引物，进行荧光定量PCR反应，测定样品中的NKILA表达量。

进一步地，采用2^-ΔΔCT相对定量法计算待测样品中的NKILA表达量。

本发明提供了长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复，及其在骨组织损伤修复检测中应用。实验证明，过表达NKILA能够显著促进间充质干细胞中的钙离子沉积，显著增强间充质干细胞中的碱性磷酸酶活性，并显著提高间充质干细胞中成骨分化标志物RUNX2、SP7、SPP1基因的表达量。因此，长链非编码RNA-NKILA不仅可以作为临床上骨组织损伤修复、再生的诱导剂，而且还可以成为骨组织损伤修复、再生的重要分子标志物。

本发明所提供的过表达载体pLV-NKILA以及含有该过表达载体pLV-NKILA的诱导型细胞，能够特异地表达长链非编码RNA-NKILA，可应用于骨组织损伤的修复和再生。

附图说明

图1为慢病毒表达载体pLV-NKILA酶切产物的电泳图，其中，1、2、4为慢病毒空载体对照组，3为阳性质粒克隆实验组，Marker为标记物；

图2为慢病毒表达载体pLV-NKILA表达量的检测结果图，其中，vec为慢病毒空载体对照组，flag-NKILA为慢病毒表达载体实验组；

图3为MenSCs细胞中钙离子沉积的检测结果图，其中，vec为慢病毒空载体对照组，flag-NKILA为慢病毒表达载体实验组；

图4为MenSCs细胞中碱性磷酸酶活性的检测结果图，其中，vec为慢病毒空载体对照组，flag-NKILA为慢病毒表达载体实验组；

图5为MenSCs细胞中成骨分化标志物表达量的检测结果图，其中，vec为慢病毒空载体对照组，flag-NKILA为慢病毒表达载体实验组。

具体实施方式

实施例一：NKILA基因片段的获取

依据NCBI数据库中长链非编码RNA-NKILA的RNA核苷酸序列(RefSeq序列号：NR_131157.1，如序列表中SEQ ID NO:1所示)以及慢病毒载体pLV上的BamH I和Xba I特异性酶切位点，采用DNA chem192合成仪，根据固相亚磷酰胺三酯法原理对NKILA基因片段进行双链合成，并在5’末端和3’末端上分别添加两个特异性酶切位点BamH I(GGATCC)和Xba I(TCTAGA)，得到含有特异性酶切位点的NKILA基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:2所示。

实施例二：慢病毒表达载体pLV-NKILA的构建

采用限制性内切酶BamH I和Xba I，分别对慢病毒空载体pLV(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示)以及实施例一所获得的NKILA基因片段进行双酶切，采用T4 DNA连接酶体系对酶切后的NKILA基因片段和线性慢病毒空载体pLV进行连接反应，然后转化感受态细胞，筛选阳性菌落，提取阳性菌落的质粒，得到慢病毒表达载体pLV-NKILA。

1、酶切慢病毒空载体pLV

酶切反应体系如下(20μL)：

酶切反应条件：在37℃下反应4小时。

2、酶切NKILA基因片段

酶切反应体系如下(20μL)：

酶切反应条件：在37℃下反应4小时。

3、连接NKILA基因片段和慢病毒空载体pLV

连接反应体系如下(10μL)：

连接反应条件：16℃孵育过夜。

4、转化感受态细胞

将5μL上述连接反应产物加入到50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，置于冰上冷却5分钟后，置于42℃水浴锅中热击90秒，再置于冰上冷却10分钟；然后将转化产物涂布在含有氨苄青霉素抗性(终浓度为50μg/μL)的LB培养板上，37℃下培养过夜；挑取单克隆菌落，加入到含有氨苄青霉素抗性(终浓度为50μg/μL)的LB培养基中，在37℃、200转/分钟的摇床上培养过夜。

5、提取、鉴定阳性质粒

采用质粒提取试剂盒(购自北京天根生化科技公司，型号为DP116)，按照试剂盒的说明书进行操作，提取阳性菌落的质粒，并采用限制性内切酶BamH I和Xba I进行酶切鉴定。

酶切反应体系如下(20μL)：

酶切反应条件：在37℃下反应4小时。

取上述酶切反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳进行，鉴定阳性克隆。电泳结果如图1所示，电泳后在2.5kb处出现了目标条带，即为NKILA基因片段。鉴定结果表明，慢病毒表达载体pLV-NKILA构建成功。

实施例三：慢病毒包装

将HEK293T细胞接种于六孔培养板中进行培养，用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基，在37℃的细胞培养箱中进行培养，待细胞密度达到70％左右时，采用Lipofectamine 3000脂质体转染试剂(购自Thermo Fisher公司，型号为L3000015)，分别将慢病毒表达载体pLV-NKILA和慢病毒空载体pLV转染到HEK293T细胞中，进行慢病毒包装。具体步骤如下：

1)分别取两个1.5mL的EP管，各加入150μL无血清的DMEM培养基；

2)将1μg慢病毒表达载体pLV-NKILA、0.5μg慢病毒包装质粒pSPAX2、0.5μg慢病毒包装质粒pMD2G加入其中一个EP管中，混匀；

3)将Lipofectamine 3000脂质体转染试剂加入另一个EP管中，混匀；

4)将步骤2)得到的质粒溶液，快速加入到步骤3)的转染试剂溶液中，涡旋振荡5秒，使其充分混匀，然后室温静置10分钟；

5)将步骤4)得到的混合液，逐滴加入HEK293T细胞培养板中，轻轻摇晃混匀后，置于37℃培养箱中进行培养，6小时后更换新鲜的含10％FBS的DMEM完全培养基，继续进行培养；

6)培养48小时后，收集HEK293T细胞的上清液(慢病毒上清液)，离心，去除细胞碎片。

同样，按照上述操作步骤，将慢病毒空载体pLV转染到HEK293T细胞中，作为试验对照组。

实施例四：慢病毒表达载体pLV-NKILA的表达量测定

将实施例三所获得的慢病毒上清液，感染经血来源的间充质干细胞(MenSCs)，感染48小时后，采用Trizol试剂盒(购自Takara公司，型号为9109)提取MenSCs细胞中的总RNA，并对总RNA进行逆转录，然后通过荧光定量PCR(qRT-PCR)测定慢病毒表达载体pLV-NKILA的表达量。

1、总RNA的提取

将MenSCs细胞接种于六孔培养板中，用含10％FBS的DMEM完全培养基，在37℃的细胞培养箱中进行培养，待细胞密度达到50％左右时，弃掉原培养基，取实施例三所获得的慢病毒空载体上清液、慢病毒表达载体上清液各1mL，分别加入MenSCs细胞中，并分别加入1mL新鲜的DMEM完全培养基，然后分别加入2μL浓度为4μg/μL的聚凝胺进行感染。待感染8小时后，更换新鲜的DMEM完全培养基，并继续在37℃的细胞培养箱中培养48小时。最后采用Trizol试剂盒，按照试剂盒的说明书进行操作，对MenSCs细胞进行裂解，并提取其总RNA。

2、逆转录cDNA

采用DNA酶和RNA酶抑制剂对所提取的总RNA进行消化处理，以除去所提取的总RNA中残留的DNA成分，并采用分光光度计测定所提取的总RNA的浓度。然后采用逆转录试剂盒(购自Takara公司，型号为2641A)，按照试剂盒的说明书进行操作，对所提取的总RNA进行逆转录，获得cDNA。

逆转录反应体系如下：

总RNA 1.0μg，

随机引物(25μM) 2.0μL，

DEPC水 加至总体积12μL；

将上述反应物加入DNA合成仪中，于70℃下反应10分钟，以打开RNA结构，然后随即置于冰上反应3～5分钟，使RNA模板结合上随机引物(Random Primer)。

随后在上述反应体系中加入：

将上述反应体系混匀后，加入DNA合成仪中，于30℃下反应10分钟，然后于42℃下反应1小时，再于70℃下反应15分钟。

3、测定长链非编码RNA-NKILA的表达量

依据NCBI数据库中长链非编码RNA-NKILA的RNA核苷酸序列(RefSeq序列号：NR_131157.1，如序列表中SEQ ID NO:1所示)，设计能够检测出NKILA表达量的特异性引物，其引物序列如下：

NKILA上游引物：5’-AACCAAACCTACCCACAACG-3’，

NKILA下游引物：5’-ACCACTAAGTCAATCCCAGGTG-3’。

以逆转录反应得到的cDNA作为模板，采用qPCR试剂盒(购自Thermo Fisher公司，型号为K0251)，按照试剂盒的说明书进行操作，进行荧光定量PCR(qRT-PCR)反应，测定长链非编码RNA-NKILA的表达量。

qRT-PCR反应体系如下(20μL)：

qRT-PCR两步法反应条件如下：95℃预变性7分钟；95℃变性10秒，60℃退火、延伸30秒，40个循环。

采用2^-ΔΔCT相对定量法，对慢病毒表达载体pLV-NKILA以及慢病毒空载体pLV的NKILA表达量差异进行比较分析，结果如图2所示。测定结果显示，与慢病毒空载体pLV相比，慢病毒表达载体pLV-NKILA的NKILA表达量显著增高(***P值﹤0.001，具有统计学意义)，表明慢病毒表达载体pLV-NKILA能够有效过表达NKILA。

2^-ΔΔCT相对定量法：以GAPDH作为内参基因、以慢病毒空载体pLV作为对照组，分别采用qPCR试剂盒进行荧光定量PCR反应；并分别测定GAPDH内参基因的CT值(荧光阈值循环数)，以及慢病毒表达载体pLV-NKILA、慢病毒空载体pLV中NKILA基因的CT值。将慢病毒表达载体pLV-NKILA的CT值减去GAPDH内参基因的CT值，得到△CT1；将慢病毒空载体pLV的CT值减去GAPDH内参基因的CT值，得到△CT2；慢病毒表达载体pLV-NKILA与慢病毒空载体pLV的NKILA表达量之差为2^-ΔΔCT，其中：

△△CT＝△CT1－△CT2。

GAPDH内参基因的荧光定量PCR反应特异性引物如下：

GAPDH上游引物：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，

GAPDH下游引物：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’。

实施例五：长链非编码RNA-NKILA对间充质干细胞成骨分化的影响

1、长链非编码RNA-NKILA对间充质干细胞中钙离子沉积的影响

将MenSCs细胞接种于六孔培养板中，用含10％FBS的DMEM完全培养基，在37℃的细胞培养箱中进行培养，待细胞密度达到50％左右时，弃掉原培养基，取实施例三所获得的慢病毒空载体上清液、慢病毒表达载体上清液各1mL，分别加入MenSCs细胞中，并分别加入1mL新鲜的DMEM完全培养基，然后分别加入2μL浓度为4μg/μL的聚凝胺进行感染。待感染8小时后，更换新鲜的DMEM完全培养基，然后继续在37℃的细胞培养箱中进行培养，每隔两天更换一次新鲜的DMEM完全培养基，持续三周。培养结束后，先用PBS缓冲液洗涤细胞，再加入1mL浓度为70％的乙醇固定细胞30分钟，然后用浓度为1％的茜素红染色1分钟。在显微镜下拍照，观察过表达NKILA对MenSCs细胞中钙离子沉积的影响，结果如图3所示。

试验结果表明，与慢病毒空载体对照组相比，过表达长链非编码RNA-NKILA能够显著促进MenSCs细胞中钙离子的沉积，即能够促进MenSCs细胞的成骨分化。

2、长链非编码RNA-NKILA对间充质干细胞中碱性磷酸酶活性的影响

将MenSCs细胞接种于六孔培养板中，用含10％FBS的DMEM完全培养基，在37℃的细胞培养箱中进行培养，待细胞密度达到50％左右时，弃掉原培养基，取实施例三所获得的慢病毒空载体上清液、慢病毒表达载体上清液各1mL，分别加入MenSCs细胞中，并分别加入1mL新鲜的DMEM完全培养基，然后分别加入2μL浓度为4μg/μL的聚凝胺进行感染。待感染8小时后，更换新鲜的DMEM完全培养基，然后继续在37℃的细胞培养箱中进行培养，每隔两天更换一次新鲜的DMEM完全培养基，持续三周。培养结束后，先用PBS缓冲液洗涤细胞，再加入1mL浓度为70％的乙醇固定细胞30分钟，然后采用BCIP/NBT底物显色试剂盒(购自Sigma公司，型号为B1911)，按照试剂盒的说明书进行操作，检测MenSCs细胞中碱性磷酸酶的活性，结果如图4所示。

试验结果表明，与慢病毒空载体对照组相比，过表达长链非编码RNA-NKILA能够显著增强MenSCs细胞中碱性磷酸酶的活性，即能够促进MenSCs细胞的成骨分化。

3、长链非编码RNA-NKILA对间充质干细胞中成骨分化标志物基因表达量的影响

依据NCBI数据库中成骨分化标志物RUNX2、SP7、SPP1的mRNA核苷酸序列(其RefSeq序列号分别为：NM_001024630.3、NM_001300837.1、NM_001251830.1)，设计能够检测出RUNX2、SP7、SPP1基因表达量的特异性引物，其引物序列如下：

RUNX2上游引物：5’-GGACGAGGCAAGAGTTTCAC-3’，

RUNX2下游引物：5’-GAGGCGGTCAGAGAACAAAC-3’。

SP7上游引物：5’-CACAGCTCTTCTGACTGTCTG-3’，

SP7下游引物：5’-CTGGTGAAATGCCTGCATGGAT-3’。

SPP1上游引物：5’-AGCCAATGATGAGAGCAATG-3’，

SPP1下游引物：5’-TCCTTACTTTTGGGGTCTAC-3’。

将MenSCs细胞接种于六孔培养板中，用含10％FBS的DMEM完全培养基，在37℃的细胞培养箱中进行培养，待细胞密度达到50％左右时，弃掉原培养基，取实施例三所获得的慢病毒空载体上清液、慢病毒表达载体上清液各1mL，分别加入MenSCs细胞中，并分别加入1mL新鲜的DMEM完全培养基，然后分别加入2μL浓度为4μg/μL的聚凝胺进行感染。待感染8小时后，更换新鲜的DMEM完全培养基，然后继续在37℃的细胞培养箱中进行培养，每隔两天更换一次新鲜的DMEM完全培养基，持续三周。培养结束后，采用Trizol试剂盒，按照试剂盒的说明书进行操作，对MenSCs细胞进行裂解，并提取其总RNA。

按照实施例四的逆转录方法，采用逆转录试剂盒，对所提取的总RNA进行逆转录反应，获得cDNA。以逆转录反应得到的cDNA作为模板，进行荧光定量PCR(qRT-PCR)反应，以测定成骨分化标志物RUNX2、SP7、SPP1基因的表达量。

RUNX2基因的qRT-PCR反应体系如下(20μL)：

SP7基因的qRT-PCR反应体系如下(20μL)：

SPP1基因的qRT-PCR反应体系如下(20μL)：

上述的qRT-PCR反应条件如下：95℃预变性7分钟；95℃变性10秒，60℃退火、延伸30秒，40个循环。

采用2-ΔΔCT相对定量法，对成骨分化标志物RUNX2、SP7、SPP1基因的表达量进行检测，结果如图5所示。测定结果显示，与慢病毒空载体对照组相比，过表达长链非编码RNA-NKILA，能够显著提高MenSCs细胞中成骨分化标志物RUNX2、SP7、SPP1基因的表达量(*P值﹤0.05，**P值﹤0.01，具有统计学意义)，即能够促进MenSCs细胞的成骨分化。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序 列 表

<110> 新乡医学院

<120> 长链非编码RNA-NKILA在骨组织损伤修复中的应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2615

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 长链非编码RNA-NKILA

<400> 1

agacccggca cccgcgcaac ggaggagggg cgctgtgccc tctccccaac 50

ggcggtcagc ttggaacgcc tgcccggcgc acgcccgggg ccggggagcc 100

gaactcggtg ccagccgcac ccgggcgggt tgctggtgcg ccctcccctc 150

gcccccgtcc ctggggtcct tgacccaggc tcttggggct agcctatctt 200

ctgaggagca caaggtccct gggggctcag ggaagagaaa ttggagaaag 250

ggggaggaag cccccaagat ggatcaccca ttgcctggtt tcgcaggaga 300

ctgtccgcct tcagttctcc agcagctcgg ggatcatggc ccactgaacc 350

cccaagcgct ttcacccgaa cccaaggagg acgaccagga aagacgggaa 400

ctcgcgtaga cacgcccgga agcccttgtc atgtaaatag ctgtcgggga 450

ctggtgtatt gtcgccgccc cagccggcgg gacctggggc gaatccacac 500

ccattgtctg ctgcccaagg ggcctccggc tggggggcgc ggctgcggag 550

ttcaaaaggg gtatgagcag gaggggtgta cttttagttc attaagtttt 600

aattacagga gtgctacaag aacacattct tcaggtttaa aaagatatta 650

aaatattaca taagagacct cccctccctg gcccacctcc agcctcttaa 700

aaatttagtg tgtcgccttt tagacacttt ctcaaagctt cacttattta 750

acaggcactt aaggagcacc tacctgtgcc agaaactctc caaatattaa 800

ctcaacctga caccgactca gtgtggccga atattactct ccccatttta 850

cagagcgggc agctggtcaa ggaagtcgct tgttgaaagt cacacagtgg 900

tggagcctgt gtgccaaccc aggaccctgg ggagctgcct ccccctctcc 950

cacgtagtcc tgattcttta agtgtccaca tattcctgta atgcctggag 1000

tttcagtaat tagcagggac ttagtgtgtt cagagaaaaa aaaagctttt 1050

aaaaattatt gttactgtgt ttgtaacagt ttggatagag aaggaaaagc 1100

tggaatttgg gaagtgaagg tggcctcggg gtagaactta cctagaccag 1150

agcgaattca tcctgaagaa ctcagagaaa gccggtgcag gaagtgggtt 1200

cccgctctcc ctgcacaggc acagtgatgc tgccagagct ctcccagaaa 1250

gaccaggagg cttgttctgg agaagtcaag cccagggatg tggctcaggc 1300

tggtccaagc tctttggagg agtccaagcg tgcccagccc agagggaggt 1350

tcagaggcac tgaccgtctt ctgtttggga ggagaagctc actcttggag 1400

ccacagccag cactaggtca ggacccaggc cccggcccag gagtggggca 1450

atacccagcg tctaccccag atggcaccct gctgtgaact gggcgccctc 1500

agcccctgcc ttgaggaagg ggcaatacca ccagcgtgtc ttttatcagg 1550

gaagatattg ctgcagtttg gccgctgcaa cttaagagaa aagctaaggg 1600

gtcccccagc atcccttggg gtgccactgc aaatactggc tgggcctgga 1650

gatgacctgg gtcccattca cttcctaggg tgaaggaggt catcattacc 1700

acccctgctt tcagccattt cttcattcat tcaatcaaca aactggctga 1750

gctgcaaccc tgagccgggg aattcagcca ctccagacac agcccctgcc 1800

ctccgggaag tctcgggaga cctggctagt ctggctggga gaagtcacac 1850

gttgattgtc ttggaagtga gatggcattt acacaatgga ggctgcactg 1900

ccagcaggca aaaataacca gttaattcag tggcttaaag aaaccaaacc 1950

tacccacaac gcttgacctc ccattgatcc atctgcgaca ccggcagtgg 2000

ctaccattta ttgagtgctg atggtgtcac ctgggattga cttagtggtc 2050

tctggcgcta gttccgaagt tgattctgtc tggagagctt aatgcagtgt 2100

tcagacctca gggtccgaac ctgagggtca cccaaagatg agtgggacat 2150

agctgtgtga cctcggctga gtgctttcac ctctccaacc tcagtttcct 2200

cttctgcaaa atggggtggc ttcatggcac cttcacgtgg tgtgattgcg 2250

aggaatgaag ggatcgatgc cttgcaagta gaggagaagg ggccggatac 2300

atcttagttg ttatgttatt taatcatctt ggcaaccccg ggagggagga 2350

accactatca ttttattttc cattttgcag ttgaggacaa tgatgattcc 2400

agcacagaca gggcccctga cggggcagta ggaaaggaga attgctttgg 2450

aaggagcata ggctggactg ccagcactca taggaggctt cgtgtgtgcc 2500

caggactgcg agaattaaat acaggacacc cagttcagtt tgaatttcag 2550

ataaactatg aataatgatt agtgtaagta tatctcaatt taactggaaa 2600

aaaaaaaaaa aaaaa 2615

<210> 2

<211> 1066

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 含有特异性酶切位点的NKILA基因片段

<400> 2

cgcggatcca gacccggcac ccgcgcaacg gaggaggggc gctgtgccct 50

ctccccaacg gcggtcagct tggaacgcct gcccggcgca cgcccggggc 100

cggggagccg aactcggtgc cagccgcacc cgggcgggtt gctggtgcgc 150

cctcccctcg cccccgtccc tggggtcctt gacccaggct cttggggcta 200

gcctatcttc tgaggagcac aaggtccctg ggggctcagg gaagagaaat 250

tggagaaagg gggaggaagc ccccaagatg gatcacccat tgcctggttt 300

cgcaggagac tgtccgcctt cagttctcca gcagctcggg gatcatggcc 350

cactgaaccc ccaagcgctt tcacccgaac ccaaggagga cgaccaggaa 400

agacgggaac tcgcgtagac acgcccggaa gcccttgtca tgtaaatagc 450

tgtcggggac tggtgtattg tcgccgcccc agccggcggg acctggggcg 500

aatccacacc cattgtctgc tgcccaaggg gcctccggct ggggggcgcg 550

gctgcggagt tcaaaagggg tatgagcagg aggggtgtac ttttagttca 600

ttaagtttta attacaggag tgctacaaga acacattctt caggtttaaa 650

aagatattaa aatattacat aagagacctc ccctccctgg cccacctcca 700

gcctcttaaa aatttagtgt gtcgcctttt agacactttc tcaaagcttc 750

acttatttaa caggcactta aggagcacct acctgtgcca gaaactctcc 800

aaatattaac tcaacctgac accgactcag tgtggccgaa tattactctc 850

cccattttac agagcgggca gctggtcaag gaagtcgctt gttgaaagtc 900

acacagtggt ggagcctgtg tgccaaccca ggaccctggg gagctgcctc 950

cccctctccc acgtagtcct gattctttaa gtgtccacat attcctgtaa 1000

tgcctggagt ttcagtaatt agcagggact tagtgtgttc agagaaaaaa 1050

aaagctttta aaaattattg ttactgtgtt tgtaacagtt tggatagaga 1100

aggaaaagct ggaatttggg aagtgaaggt ggcctcgggg tagaacttac 1150

ctagaccaga gcgaattcat cctgaagaac tcagagaaag ccggtgcagg 1200

aagtgggttc ccgctctccc tgcacaggca cagtgatgct gccagagctc 1250

tcccagaaag accaggaggc ttgttctgga gaagtcaagc ccagggatgt 1300

ggctcaggct ggtccaagct ctttggagga gtccaagcgt gcccagccca 1350

gagggaggtt cagaggcact gaccgtcttc tgtttgggag gagaagctca 1400

ctcttggagc cacagccagc actaggtcag gacccaggcc ccggcccagg 1450

agtggggcaa tacccagcgt ctaccccaga tggcaccctg ctgtgaactg 1500

ggcgccctca gcccctgcct tgaggaaggg gcaataccac cagcgtgtct 1550

tttatcaggg aagatattgc tgcagtttgg ccgctgcaac ttaagagaaa 1600

agctaagggg tcccccagca tcccttgggg tgccactgca aatactggct 1650

gggcctggag atgacctggg tcccattcac ttcctagggt gaaggaggtc 1700

atcattacca cccctgcttt cagccatttc ttcattcatt caatcaacaa 1750

actggctgag ctgcaaccct gagccgggga attcagccac tccagacaca 1800

gcccctgccc tccgggaagt ctcgggagac ctggctagtc tggctgggag 1850

aagtcacacg ttgattgtct tggaagtgag atggcattta cacaatggag 1900

gctgcactgc cagcaggcaa aaataaccag ttaattcagt ggcttaaaga 1950

aaccaaacct acccacaacg cttgacctcc cattgatcca tctgcgacac 2000

cggcagtggc taccatttat tgagtgctga tggtgtcacc tgggattgac 2050

ttagtggtct ctggcgctag ttccgaagtt gattctgtct ggagagctta 2100

atgcagtgtt cagacctcag ggtccgaacc tgagggtcac ccaaagatga 2150

gtgggacata gctgtgtgac ctcggctgag tgctttcacc tctccaacct 2200

cagtttcctc ttctgcaaaa tggggtggct tcatggcacc ttcacgtggt 2250

gtgattgcga ggaatgaagg gatcgatgcc ttgcaagtag aggagaaggg 2300

gccggataca tcttagttgt tatgttattt aatcatcttg gcaaccccgg 2350

gagggaggaa ccactatcat tttattttcc attttgcagt tgaggacaat 2400

gatgattcca gcacagacag ggcccctgac ggggcagtag gaaaggagaa 2450

ttgctttgga aggagcatag gctggactgc cagcactcat aggaggcttc 2500

gtgtgtgccc aggactgcga gaattaaata caggacaccc agttcagttt 2550

gaatttcaga taaactatga ataatgatta gtgtaagtat atctcaattt 2600

aactggaaaa aaaaaaaaaa aaaatctaga gca 2633

<210> 3

<211> 8865

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 慢病毒空载体pLV

<400> 3

aagcttaatg tagtcttatg caatactctt gtagtcttgc aacatggtaa 50

cgatgagtta gcaacatgcc ttacaaggag agaaaaagca ccgtgcatgc 100

cgattggtgg aagtaaggtg gtacgatcgt gccttattag gaaggcaaca 150

gacgggtctg acatggattg gacgaaccac tgaattgccg cattgcagag 200

atattgtatt taagtgccta gctcgataca taaacgggtc tctctggtta 250

gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 300

taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc 350

tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg 400

tggaaaatct ctagcagtgg cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg 450

aaaccagagg agctctctcg acgcaggact cggcttgctg aagcgcgcac 500

ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta 550

gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg 600

gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc cagggggaaa 650

gaaaaaatat aaattaaaac atatagtatg ggcaagcagg gagctagaac 700

gattcgcagt taatcctggc ctgttagaaa catcagaagg ctgtagacaa 750

atactgggac agctacaacc atcccttcag acaggatcag aagaacttag 800

atcattatat aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat caaaggatag 850

agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga agagcaaaac 900

aaaagtaaga ccaccgcaca gcaagcggcc gctgatcttc agacctggag 950

gaggagatat gagggacaat tggagaagtg aattatataa atataaagta 1000

gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt 1050

ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt 1100

tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg 1150

gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 1200

gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg 1250

gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag 1300

gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac 1350

cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct ctggaacaga 1400

tttggaatca cacgacctgg atggagtggg acagagaaat taacaattac 1450

acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa 1500

gaatgaacaa gaattattgg aattagataa atgggcaagt ttgtggaatt 1550

ggtttaacat aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt cataatgata 1600

gtaggaggct tggtaggttt aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt 1650

gaatagagtt aggcagggat attcaccatt atcgtttcag acccacctcc 1700

caaccccgag gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga agaaggtgga 1750

gagagagaca gagacagatc cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta 1800

tcggttaact tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac agtgcagggg 1850

aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa 1900

aaacaaatta caaaattcaa aattttatcg atgcctcccc gtcaccaccc 1950

cccccaaccc gccccgaccg gagctgagag taattcatac aaaaggactc 2000

gcccctgcct tggggaatcc cagggaccgt cgttaaactc ccactaacgt 2050

agaacccaga gatcgctgcg ttcccgcccc ctcacccgcc cgctctcgtc 2100

atcactgagg tggagaagag catgcgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg 2150

gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg 2200

caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 2250

atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat 2300

ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc 2350

cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta 2400

cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca 2450

gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt 2500

cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc 2550

tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc 2600

ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgat 2650

atcctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa 2700

gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 2750

ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc 2800

caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg 2850

cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc 2900

ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg 2950

ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt 3000

gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 3050

atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct 3100

cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg 3150

atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg 3200

gcacttgatg taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt 3250

ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt tcttccattt 3300

caggtgtcgt gaaaactacc cctgagctcc ttaaggttaa cgccaccatg 3350

gactacaaag acgatgacga caagtctaga gaattcggat ccaatattcc 3400

cgggctcgag ccatggaagc ttgatatcta actgactgaa ccggtggtac 3450

cgatccacgc gtctccggcc tagggataac agggtaatcc gctagcccct 3500

ctccctcccc cccccctaac gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc 3550

cggtgtgcgt ttgtctatat gttattttcc accatattgc cgtcttttgg 3600

caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg agcattccta 3650

ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg 3700

aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc 3750

gaccctttgc aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg 3800

gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag 3850

tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat ggctctcctc 3900

aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta ccccattgta 3950

tgggatctga tctggggcct cggtacacat gctttacatg tgtttagtcg 4000

aggttaaaaa aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct 4050

ttgaaaaaca cgatgataat atggccacac tagagatcca ccggtcgcca 4100

ccatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc 4150

cccagggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac 4200

gcgccacacc gtcgatccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc 4250

aagaactctt cctcacgcgc gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc 4300

gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg accacgccgg agagcgtcga 4350

agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc gagttgagcg 4400

gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac 4450

cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga 4500

ccaccagggc aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg 4550

cggccgagcg cgccggggtg cccgccttcc tggagacctc cgcgccccgc 4600

aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc accgtcaccg ccgacgtcga 4650

ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag cccggtgcct 4700

gagcggccgc gtcgacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat 4750

tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct 4800

gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt 4850

ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc 4900

ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 4950

cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt 5000

cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg 5050

cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg 5100

ttgtcgggga agctgacgtc ctttccatgg ctgctcgcct gtgttgccac 5150

ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc 5200

cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 5250

cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc 5300

cccgcctgga attcgagctc ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc 5350

agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc 5400

taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 5450

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa 5500

cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt 5550

gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt 5600

tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc atcttattat 5650

tcagtattta taacttgcaa agaaatgaat atcagagagt gagaggaact 5700

tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 5750

ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 5800

actcatcaat gtatcttatc atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac 5850

tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc 5900

atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc 5950

tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctagggac 6000

gtacccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacgcgcgct cactggccgt 6050

cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 6100

gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 6150

cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggga 6200

cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca 6250

gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc 6300

ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa 6350

tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc 6400

ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga 6450

tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg 6500

actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt 6550

ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag 6600

ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgcttac 6650

aatttaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 6700

atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 6750

gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 6800

ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt 6850

tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 6900

gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 6950

gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 7000

tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 7050

tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 7100

gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag 7150

tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 7200

cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 7250

catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 7300

aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 7350

gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 7400

atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc 7450

ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 7500

ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 7550

atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 7600

tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 7650

cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 7700

taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 7750

aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 7800

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 7850

ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 7900

agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 7950

taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 8000

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 8050

ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 8100

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 8150

acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 8200

gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 8250

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 8300

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 8350

ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 8400

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 8450

ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 8500

ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga 8550

ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc 8600

aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga 8650

caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga 8700

gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct 8750

cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 8800

ctatgaccat gattacgcca agcgcgcaat taaccctcac taaagggaac 8850

aaaagctgga gctgc 8865

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> NKILA上游引物

<400> 4

aaccaaacct acccacaacg 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> NKILA下游引物

<400> 5

accactaagt caatcccagg tg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> RUNX2上游引物

<400> 6

ggacgaggca agagtttcac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> RUNX2下游引物

<400> 7

gaggcggtca gagaacaaac 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> SP7上游引物

<400> 8

cacagctctt ctgactgtct g 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> SP7下游引物

<400> 9

ctggtgaaat gcctgcatgg at 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> SPP1上游引物

<400> 10

agccaatgat gagagcaatg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> SPP1下游引物

<400> 11

tccttacttt tggggtctac 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> GAPDH上游引物

<400> 12

catgagaagt atgacaacag cct 23

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> GAPDH下游引物

<400> 13

agtccttcca cgataccaaa gt 22

Claims (5)

1.一种过表达载体pLV-NKILA在制备骨组织损伤修复的试剂中的用途，其特征在于：所述过表达载体由NKILA基因片段与慢病毒空载体pLV构建而成；所述的NKILA基因片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示，所述的慢病毒空载体pLV的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 3所示。

2.权利要求1所述的用途，其中所述过表达载体pLV-NKILA的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：采用限制性内切酶BamH I和Xba I分别对慢病毒载体pLV以及NKILA基因片段进行双酶切，并采用T4 DNA连接酶体系对酶切后的NKILA基因片段以及线性慢病毒载体pLV进行连接反应，然后转化感受态细胞，筛选阳性菌落，提取阳性菌落的质粒，得到所述的过表达载体pLV-NKILA。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述NKILA基因片段的制备方法，包括以下步骤：依据长链非编码RNA-NKILA的核苷酸序列，采用DNA合成仪，根据固相亚磷酰胺三酯法原理对NKILA基因片段进行双链合成，同时在其5’末端和3’末端上分别添加BamH I和Xba I酶切位点，得到含有特异性酶切位点的NKILA基因片段。

4.一种诱导型细胞在用于骨组织损伤修复的试剂中的用途，其特征在于：所述诱导型细胞由权利要求1所述的过表达载体pLV- NKILA转染HEK293T细胞构建而成。

5.权利要求4所述的用途，其中所述诱导型细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：采用脂质体转染试剂，将过表达载体pLV- NKILA以及慢病毒包装质粒pSPAX2、pMD2G共同转染到包装细胞中，经培养后收集慢病毒上清液；然后将慢病毒上清液加入到细胞载体中，经培养后得到稳定表达长链非编码RNA-NKILA的诱导型细胞。

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