CN110564775A - 一种提高基因组定点修饰效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及基因工程技术领域，特别涉及一种提高基因组定点修饰效率的方法。该方法通过CRISPR/Cas9系统与组蛋白去乙酰化酶抑制剂或细胞周期同步化合物共同作用于细胞来实现。具体地为，CRISPR/Cas9系统包含目的基因gRNA片段，可以定点识别目的基因，并使目的基因发生双链断裂，而在断裂处，组蛋白去乙酰化酶抑制剂或细胞周期同步化合物发挥作用，进行同源重组修复，高效的完成基因组定点修饰，经组蛋白去乙酰化酶抑制剂或细胞周期同步化合物处理的细胞基因组定点修饰效率显著提高。
Description
技术领域
本公开涉及基因工程技术领域，特别涉及一种提高基因组定点修饰效率的方法。
背景技术
基因编辑技术是指通过人为操作方式在基因组内实现特定碱基插入、缺失或替换等，是对基因组进行精确修饰和定向编辑的一种技术。其中CRISPR/Cas9技术是第三代人工核酸酶基因编辑技术，由识别特异向导RNA序列引导Cas9蛋白实现对基因组的高效切割。组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)是一类对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要作用的蛋白酶。HDAC抑制剂(Histone deacetylase inhibitors,HDACi)可以抑制组蛋白和非组蛋白的脱乙酰化。
CRISPR/Cas9可在基因组内高效引入DNA双链断裂(double strand break,DSB)，激活细胞的DNA修复机制，产生两种不同的修复途径，即非同源末端连接(non-homologousend joining,NHEJ)和同源介导修复(homology-directed repair,HDR)。由于NHEJ无需同源修复模板，只是NHEJ通路修复因子将DNA双链断裂的两端强行拼接起来，容易造成基因片段的缺失、突变或外源基因的插入等，不利于基因组的精确修饰。与NHEJ修复相比，HDR需要同源供体模板，修复过程产生错误的概率较低，是定向突变和定点敲入最为依赖的修复路径。但是，目前HDR基因组定点修饰效率较低。
发明内容
为了克服基因组定点修饰效率低的缺陷，本公开提供一种提高基因组定点修饰效率的方法，以解决此问题。
根据公开的一个方面，一种提高基因组定点修饰效率的方法，其特征在于，所述的方法通过CRISPR/Cas9系统与组蛋白去乙酰化酶抑制剂或细胞周期同步化合物共同作用于细胞来实现。具体地为，CRISPR/Cas9系统包含目的基因gRNA片段，可以定点识别目的基因，并使目的基因发生双链断裂，而在断裂处，组蛋白去乙酰化酶抑制剂或细胞周期同步化合物发挥作用，进行同源重组修复，高效的完成基因组定点修饰，经组蛋白去乙酰化酶抑制剂或细胞周期同步化合物处理的细胞基因组定点修饰效率显著提高。
在某些实施方式中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括TSA。由此，在培养液中加入浓度为0.5μM的TSA，可以提高细胞基因组定点修饰效率2.5倍。
在某些实施方式中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括PCI-24781。由此，在培养液中加入浓度为0.5μM的PCI-24781，可以提高细胞基因组定点修饰效率2.5倍。
在某些实施方式中，细胞周期同步化合物包括Nocodazole。由此，在培养液中加入Nocodazole，可以显著提高细胞基因组定点修饰效率。
在某些实施方式中，一种提高基因组定点修饰效率的方法通过在细胞培养液中加入TSA和PCI-24781来实现。由此，在培养液中加入TSA和PCI-24781，可以提高细胞基因组定点修饰效率，但是两种化合物的联合没有累加效应。
在某些实施方式中，一种提高基因组定点修饰效率的方法通过在细胞培养液中加入TSA和Nocodazole来实现。由此，在培养液中加入TSA和Nocodazole，TSA和Nocodazole组合比单独使用任一种化合物显著提高了定点修饰效率1.3倍和2倍。
在某些实施方式中，一种提高基因组定点修饰效率的方法通过在细胞培养液中加入PCI-24781和Nocodazole来实现。由此，在培养液中加入PCI-24781和Nocodazole，比单独使用任一种化合物显著提高了定点修饰效率1.2倍和1.6倍。
在某些实施方式中，一种提高基因组定点修饰效率的方法通过在细胞培养液中加入TSA、PCI-24781以及Nocodazole来实现。由此，在培养液中同时加入这3种化合物，可以显著提高了定点修饰效率。
在某些实施方式中，TSA的浓度为0.05-0.50μM。由此，使用浓度为0.05-0.50μM的TSA处理细胞，可以显著增强定点修饰效率，最高可达2.5倍。
在某些实施方式中，Nocodazole的浓度为0.05-0.50μM。由此，使用浓度为0.05-0.50μM的PCI-2478处理细胞，可以显著增强定点修饰效率，最高可达2.5倍。
在某些实施方式中，Nocodazole的的浓度为0.05-0.50μM。由此，使用浓度为0.05-0.50μM的Nocodazole处理细胞，可以显著增强定点修饰效率。
在某些实施方式中，一种提高基因组定点修饰效率的方法，包括以下步骤：
合成报告载体基因；
构建CRISPR/Cas9载体；
获得可表达报告载体的细胞；
采用乙酰化酶抑制剂或细胞周期同步化合物处理获得的可表达报告载体的细胞系，筛选出提高基因组定点修饰效率的化合物；
将筛选出的化合物与CRISPR/Cas9载体共处理细胞。
由此，CRISPR/Cas9系统表达载体中的gRNA通过碱基互补配对原则识别报告载体上序列，使报告基因产生双链断裂，采用乙酰化酶抑制剂或细胞周期同步化合物处理获得的可表达报告载体的细胞系，进行同源重组修复，对报告基因进行定点修饰，可筛选出提高基因组定点修饰效率的化合物，将筛选出的化合物与CRISPR/Cas9系统共处理目的细胞，可显著提高细胞的基因组定点修饰效率。
在某些实施方式中，报告载体包括：ACTB-GFP或GAPDH-GFP报告载体、SSA-GFP报告载体或ssODN-GFP报告载体。由此，ACTB-GFP或GAPDH-GFP报告载体、SSA-GFP报告载体或ssODN-GFP报告载体都可以对培养液中加入的化合物进行识别，筛选出提高基因组定点修饰效率的化合物。
在某些实施方式中，报告载体包括ACTB-GFP报告载体。由此，ACTB-GFP报告载体可以对培养液中加入的化合物进行识别，筛选出提高基因组定点修饰效率的化合物。
在某些实施方式中，报告载体包括GAPDH-GFP报告载体。由此，GAPDH-GFP报告载体可以对培养液中加入的化合物进行识别，筛选出提高基因组定点修饰效率的化合物。
在某些实施方式中，报告载体包括SSA-GFP报告载体。由此，SSA-GFP报告载体可以对培养液中加入的化合物进行识别，筛选出提高基因组定点修饰效率的化合物。
在某些实施方式中，报告载体包括ssODN-GFP报告载体。由此，ssODN-GFP报告载体可以对培养液中加入的化合物进行识别，筛选出提高基因组定点修饰效率的化合物。
在某些实施方式中，构建CRISPR/Cas9载体步骤包括：根据定点基因序列，设计并合成sgRNA引物，进行PCR扩增，然后将PCR产物连接、转化，挑菌和测序验证，构建成功的CRISPR/Cas9载体保存备用。由此，将构建好的CRISPR/Cas9载体与筛选出的提高基因组定点修饰效率的化合物共处理目的细胞，可显著提高细胞的基因组定点修饰效率。
在某些实施方式中，构建成功的CRISPR/Cas9载体包括PX330-ACTB，其序列为SEQID No:8。由此，PX330-ACTB作为CRISPR/Cas9载体与筛选出的提高基因组定点修饰效率的化合物共处理目的细胞，可以提高细胞的基因组定点修饰效率2倍。
在某些实施方式中，构建成功的CRISPR/Cas9载体包括PX330-GAPDH，其序列为SEQID No:9。由此，PX330-GAPDH作为CRISPR/Cas9载体与筛选出的提高基因组定点修饰效率的化合物共处理目的细胞，可以提高细胞的基因组定点修饰效率2倍。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本公开作进一步说明，附图中：
图1为HDACi对细胞进行不同DNA修复方式效率的统计结果图；
图2为不同HR修复方式的模式图与HDACi处理后的细胞检测结果图；
图3为Nocodazole对不同DNA修复方式的统计结果图；
图4为HDACi与Nocodazole联合处理对HR效率的检测结果图；
图5为为囊胚DNA PCR产物HindIII酶切电泳图与测序结果图；
图6为HDACi处理的免疫共沉淀结果图；
图7为本公开实施例的HDACi处理的细胞同步化结果图；
图8为HDACi提高CRISPR/Cas9介导的基因组定点整合效率的机制图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本公开的技术方案，下面结合附图和实施例作详细说明。
实施例1利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂或细胞周期同步化合物提高基因组定点修饰效率的方法，包含以下步骤：
1、EGFP报告载体基因合成
EGFP报告载体基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，作用模式包括ACTB-GFP或GAPDH-GFP报告载体模式、SSA-GFP报告载体的模式、ssODN-GFP报告载体模式。具体如图2A所示：ACTB-GFP或GAPDH-GFP报告载体模式图：CRISPR/Cas9切割ACTB或GAPDH基因产生DSB后，细胞发生同源重组(HR)修复，串联的绿色荧光蛋白基因可以表达。SSA-GFP报告载体的模式图：CRISPR/Cas9切割SSA基因产生DSB后，在单链退火修复下，同源的200bp重复序列发生同源重组，GFP表达框修复完整，细胞可以检测到绿色荧光信号，而没有发生同源重组的质粒则被第一个重复序列最后的终止密码子终止表达。ssODN-GFP报告载体模式图：报告载体EGFP序列中间插入了一段与ROSA26基因同源的序列、一个终止密码子和一个BamH Ⅰ酶切位点。CRISPR/Cas9切割目的基因产生DSB后，细胞以140nt的ssODN作为同源模版，发生同源修复，使EGFP修复完整，细胞可以检测到绿色荧光信号，而没有发生同源修复的则被终止表达。
2、CRISPR/Cas9载体构建
使用在线网站https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html，设计并合成基因ACTB和GAPDH的sgRNA引物(表1)。合成得到的退火双链引物按下表体系配制混合，在PCR仪中退火形成双链DNA。
表1 sgRMA引物序列
表2 双链退火体系
在PCR管中配制好如上体系混均后，在PCR仪中运行如下程序：95℃，5min→10℃，1min→95℃，5min→10℃，1min→95℃，5min→10℃，3min。结束后将退火产物与Bbs I线性化后的PX330进行T4连接(参考Takara T4DNA Ligase说明书)。连接产物进行转化，挑菌和hU6-F(SEQ ID No:7)：GAGGGCCTATTTCCCATGATT测序验证，构建成功的菌种分别命名为PX330-ACTB(SEQ ID No:8)和PX330-GAPDH(SEQ ID No:9)保存备用。
3、猪胎儿成纤维细胞的培养
从液氮罐中取出冻存管，立即投入37℃水浴。将解冻后的细胞悬液，转移至离心管中，加入3倍DMEM培养液，1000rpm/min，离心5-7min后除去上清，用新鲜的完全培养基悬浮沉淀细胞，接种到新的培养皿中，并置于39℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养培养。待培养的细胞长至80％-90％汇合时，可进行后续实验。其中HDAC抑制剂TSA、PCI-24781和细胞周期同步化化合物Nocodazole培养细胞浓度从低到高均为0.05μM，0.1μM，0.25μM，0.5μM。
4、流式细胞术检测不同DNA修复方式效率
猪胎儿成纤维细胞复苏后，汇合度达到50％～80％时，使用0.05％Trytin-EDTA消化，终止消化后细胞计数，吸取含有1X106个细胞的悬浮液至新的离心管中，90xg离心5min；弃上清，使用电转仪Nucleofector 2b(LONZA)，按Amaxa Basic Nucleofector Kit forPrimary Mammalian Fibroblasts(Lonza)说明书进行电转染(表3)，转染程序为A-033。然后均匀铺至24孔板(12％FBS完全培养基1mL/孔)，培养12小时后加入不同浓度梯度的TSA、PCI-24781和Nocodazole继续培养48h，流式细胞术检测细胞荧光数的百分比。结果如图1A、图2B和表4所示，0.5μM TSA或0.25μM PCI-24781处理后，GAPDH-GFP报告载体的细胞荧光数量增加约2倍；0.5μM TSA或0.5μM PCI-24781处理后，细胞HR介导的ACTB-GFP报告载体同样增加了2倍。同时流式细胞术检测SSA和ssODN介导其他定点修饰途径，结果表明HDACi处理后这两种途径以剂量依赖性方式增加ssODN和SSA介导的EGFP修复效率，其中0.5μM TSA或0.5μM PCI-24781产生最佳的ssODN介导的修复率，表达EGFP的细胞百分比增加约2.5倍；而0.25μM或0.5μM TSA，SSA效率增加至约2倍，0.25和0.5μM PCI-24781，SSA效率增加1.5倍。如图2所示，联合使用0.5μM TSA和0.5μM PCI-24781处理猪胎儿成纤维细胞，TSA和PCI-24781对HR介导的定点修饰效率没有累加效应。如图3所示，同时使用HDACi和细胞周期同步化化合物Nocodazole处理细胞，结果表明Nocodazole可以显著增强定点整合效率。如图4所示，与HADCi联合处理猪胎儿成纤维细胞后，TSA和Nocodazole组合比单独使用任一种化合物显著提高了GAPDH-GFP报告载体的定点修饰效率1.3倍和2倍，而PCI-24781和Nocodazole组合显著提高了1.2和1.6倍，并且在ACTB-GFP报告载体上也观察到类似的结果。
表3 不同EGFP报告载体电转染
表4 不同浓度TSA或PCI-24781处理细胞的效率增加结果
实施例2：体外转录及猪孤雌胚胎胞浆显微注射
使用T7 Quick High Yield RNA Syntheis Kit(NEB)体外转录ROSA26-gRNA，序列如表1。利用显微注射仪对电激活后2-10h的胚胎进行注射。Cas9 protein(NEB)和ROSA26-gRNA(浓度分别为150ng/ul，50ng/ul)与ROSA26-ssODN供体模板(50ng/ul)预混液用于注射胚胎(1细胞期)每组注射约200枚胚胎，每枚胚胎注射10pL预混液。随后分别添加0.5μMTSA、0.5μM PCI-24781和0.25μM Nocodezole至胚胎培养液处理24h。48h/168h后，体视显微镜下观察记录细胞卵裂情况，168h后，挑取囊胚期细胞抽提细胞DNA，并进行PCR扩增目的序列，使用HindⅢ酶切和测序PCR产物，计算修复效率。结果如表5和图5所示，TSA(0.5μM)处理后猪胚胎的定点修饰效率显著提高，达到最高的定点整合效率14.29％(6/42)。同时也表明PCI-24781(0.5μM)或Nocodazole(0.25μM)也可以显著提高定点整合效率。
表5 不同化合物胚胎胞浆显微注射结果
实施例3：免疫共沉淀(Immunoprecipitation，IP)及蛋白印迹(Western Blot)
将0.25μM和0.5μM TSA处理的猪胎儿成纤维细胞在细胞裂解缓冲液中裂解，并通过离心收集细胞裂解物上清液。将来自每组的等量细胞裂解物与抗乙酰赖氨酸(AcK)兔多克隆抗体(#9441,CST)在4℃温育过夜。然后加入蛋白A琼脂糖磁珠(Thermo FisherScientific)以沉淀抗体结合蛋白。将沉淀物在细胞裂解缓冲液中洗涤，重悬并在SDS样品缓冲液中煮沸用于蛋白质印迹(也称免疫印迹)分析。通过SDS-PAGE分离IP样品并转移到PVDF膜上用于免疫印迹。在IP之前加入等量的总裂解物用于蛋白质印迹作为输入对照。将膜与KU70(10723-1-AP，Proteintech)、KU80(16389-1-AP，Proteintech)、PARP1(13371-1-AP，Proteintech)，LIG3(26583-1-AP，Proteintech)、Rad51(#8875，CST)和Rad52(28045-1-AP，Proteintech)的小鼠单克隆或兔多克隆抗体一起温育。用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(SA00001-2，Proteintech)显示免疫反应性蛋白，并通过ECL试剂(Thermo FisherScientific)显影。结果如图6所示，经典的NHEJ通路修复因子KU70、KU80和可选择性NHEJ通路修复因子PARP1的乙酰化水平随着TSA浓度的增加而显著增加，但是HDR通路修复因子Rad51、Rad52和可选择性NHEJ通路修复因子LIG3的乙酰化水平没有显著变化。
实施例3：流式细胞术检测细胞周期
待细胞长至80％-90％汇合时(6孔板)，加入不同浓度梯度的TSA、PCI-24781或Nocodazole至完全培养基(10％胎牛血清)中，放至38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养48h。用0.25％胰蛋白酶消化细胞，吸至1.5mL离心管，离心后弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。每管加入500ul预冷-20℃的70％乙醇，重悬，于4℃固定过夜。过夜的细胞250g离心5min，弃上清，收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500ul碘化丙啶(Propidium,Iodide，PI)染色液(500uL PBS含50ug/mLPI，100ug/mL RNaseA，0.2％Triton X-100含10ul的Triton-X 100)，充分振荡，4℃避光孵育30min，用流式细胞仪检测结果，使用软件Modifit5.0进行统计分析。结果如图7所示，TSA可诱导细胞同步化至有利于发生定点修饰的G2期，同时随着TSA浓度的增加，G2期阻滞的细胞数越多，显示出与Nocodazole相当的细胞周期同步化效应。此外，PCI-24781也可增加G2期细胞数量，其最佳剂量为0.1μM。
结合以上实施例，HDACi的作用机制如图8所示，HDACi可以通过抑制NHEJ因子的脱乙酰作用破坏NHEJ因子与DSB位点的结合，同时阻滞细胞周期，为定点整合提供有利环境。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于公开的保护范围。
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt 6960
gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga 7020
acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat 7080
tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga 7140
gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag 7200
tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg 7260
accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg 7320
ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt 7380
agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg 7440
gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc 7500
ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg 7560
tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac 7620
ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact 7680
gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa 7740
acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 7800
aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg 7860
atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 7920
gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 7980
tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca 8040
ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 8100
ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 8160
ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 8220
aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 8280
cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 8340
gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 8400
ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 8460
cagcaacgcg gcctttttac ggttcc 8486
Claims (10)
1.一种提高基因组定点修饰效率的方法，其特征在于，所述的方法通过CRISPR/Cas9系统与组蛋白去乙酰化酶抑制剂或细胞周期同步化合物共同作用于细胞来实现。
2.根据权利要求1所述的一种提高基因组定点修饰效率的方法，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括TSA或PCI-24781。
3.根据权利要求1所述的一种提高基因组定点修饰效率的方法，其特征在于，所述细胞周期同步化合物包括Nocodazole。
4.根据权利要求1所述的一种提高基因组定点修饰效率的方法，其特征在于，所述方法通过加入TSA、PCI-24781或Nocodazole中的至少一种来实现。
5.根据权利要求4所述的一种提高基因组定点修饰效率的方法，其特征在于，所述TSA的浓度为0.05-0.50μM、所述PCI-24781的浓度为0.05-0.50μM或所述Nocodazole的的浓度为0.05-0.50μM。
6.根据权利要求1所述的一种提高基因组定点修饰效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
合成报告载体基因；
构建CRISPR/Cas9载体；
获得可表达报告载体的细胞；
采用乙酰化酶抑制剂或细胞周期同步化合物处理获得的可表达报告载体的细胞系，筛选出提高基因组定点修饰效率的化合物；
将筛选出的化合物与CRISPR/Cas9载体共处理细胞。
7.根据权利要求6所述的一种提高基因组定点修饰效率的方法，其特征在于，所述报告载体包括：ACTB-GFP或GAPDH-GFP报告载体、SSA-GFP报告载体或ssODN-GFP报告载体。
8.根据权利要求6所述的一种提高基因组定点修饰效率的方法，其特征在于，所述构建CRISPR/Cas9载体步骤包括：根据定点基因序列，设计并合成sgRNA引物，进行PCR扩增，然后将PCR产物连接PX330、转化，挑菌和测序验证，构建成功的CRISPR/Cas9载体保存备用。
9.根据权利要求8所述的一种提高基因组定点修饰效率的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体包括PX330-ACTB，其序列为SEQ ID No:8。
10.根据权利要求8所述的一种提高基因组定点修饰效率的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体包括PX330-GAPDH，其序列为SEQ ID No:9。
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| CN201910782049.XA CN110564775A (zh) | 2019-08-23 | 2019-08-23 | 一种提高基因组定点修饰效率的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110527698A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-12-03 | 温氏食品集团股份有限公司 | 一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法 |
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| EP3489357A1 (en) * | 2017-11-24 | 2019-05-29 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Compounds for increasing genome editing efficiency |
-
2019
- 2019-08-23 CN CN201910782049.XA patent/CN110564775A/zh active Pending
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