CN110527698A - 一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法。该方法通过小分子化合物与CRISPR/Cas9系统共同作用于细胞来实现。具体地为，是在CRISPR/Cas9系统包含目的基因gRNA片段，可以定点识别目的基因，并使目的基因发生双链断裂，而在断裂处，小分子化合物发挥作用，进行同源重组修复，高效的完成基因组定点插入，经小分子化合物处理的细胞基因组定点插入效率显著提高。

Description

一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域。具体地说，本发明涉及一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法。

背景技术

随着越来越多物种基因组测序的完成，探索基因组功能或对基因组进行定点改造已成为科学研究的重点之一。传统的基因操作技术是将目的基因随机插入到基因组内，这种随机插入的方式会对后期基因编辑动物或人类疾病模型研究带来较大困难，而基因组定点修饰技术可以实现对特定基因进行改造，在研究基因功能或培育具有特定性状的动物群体，以及制备人类疾病动物模型和治疗药物研发等方面具有重要的应用价值，已成为基因组改造与基因功能研究的重要手段。

CRISPR/Cas9系统由一条外源单链向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白组成，sgRNA通过碱基互补配对原则识别基因组序列，并引导Cas9蛋白结合靶点处产生基因组双链断裂(Double strand break,DSB)。同时细胞激活体内非同源末端连接(Nonhomologousendjoining,NHEJ)或同源定向修复 (Homologous-directed repair,HDR)两种不同的修复机制，实现内源基因的敲除或外源基因的定点敲入。虽然CRISPR/Cas9产生DSB效率得到了一定的保障，但由HDR介导的定点插入效率仍然十分低下，因此迫切需要寻找提高基因组定点插入效率的方法。

发明内容

根据本公开的一个方面，提供了一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法，该方法通过小分子化合物与CRISPR/Cas9系统共同作用于细胞来实现。具体地为，是在CRISPR/Cas9系统包含目的基因gRNA 片段，可以定点识别目的基因，并使目的基因发生双链断裂，而在断裂处，小分子化合物发挥作用，进行同源重组修复，高效的完成基因组定点插入，经小分子化合物处理的细胞基因组定点插入效率显著提高。

在某些实施方式中，该方法通过如下步骤来实现：

CRISPR/Cas9载体和供体质粒的构建；

表达细胞系的培养；

CRISPR/Cas9系统表达载体与小分子化合物共转染表达细胞，筛选出可提高细胞基因组定点插入效率的小分子化合物；

将筛选出的小分子化合物与CRISPR/Cas9系统共处理细胞，来提高基因组定点插入效率。

由此，CRISPR/Cas9系统表达载体中的gRNA通过碱基互补配对原则识别报告载体上序列，使报告基因产生双链断裂，采用小分子化合物处理获得的表达细胞系，进行同源重组修复，对报告基因进行定点插入，可筛选出提高基因组定点插入效率的小分子化合物，将筛选出的小分子化合物与CRISPR/Cas9系统共处理目的细胞，可显著提高细胞的基因组定点插入效率。

在某些实施方式中，CRISPR/Cas9载体质粒为PX330-ACTB质粒。由此，CRISPR/Cas9系统切割ACTB基因产生DSB，为基因组的定点插入提供插入位点。

在某些实施方式中，PX330-ACTB质粒的序列为SEQ ID No:4。由此， CRISPR/Cas9系统切割序列SEQ ID No:4产生DSB，为基因组的定点插入提供插入位点。

在某些实施方式中，CRISPR/Cas9供体质粒为hACTB-T2A-GFP质粒。由此，CRISPR/Cas9系统切割目的基因组产生DSB，利用可剪切的T2A序列将绿色荧光蛋白(GFP)基因串联在细胞ACTB基因3’UTR前，根据GFP 的表达情况筛选出提高基因组定点插入效率的小分子化合物。

在某些实施方式中，hACTB-T2A-GFP质粒序列为SEQ ID No:13。

在某些实施方式中，hACTB-T2A-GFP质粒的构建包括获取细胞基因组 DNA和pcDNA3.1-GFP-neo载体为模板，得到目的片段，然后进行无缝克隆，获得hACTB-T2A-GFP质粒。由此，CRISPR/Cas9系统切割目的基因产生DSB，利用可剪切的T2A序列将GFP基因串联在细胞ACTB基因 3’UTR前，根据GFP的表达情况筛选出提高基因组定点插入效率的小分子化合物。

在某些实施方式中，小分子化合物包括Albendazole。由此，在培养液中加入Albendazole，可以显著提高细胞基因组定点插入效率。

在某些实施方式中，小分子化合物包括Tedizolid。由此，在培养液中加入Tedizolid，可以显著提高细胞基因组定点插入效率。

在某些实施方式中，小分子化合物Albendazole浓度为1-10μM。由此，在培养液中加入Albendazole浓度为1-10μM时，该小分子化合物都可提高细胞基因组定点插入效率，其中Albendazole浓度为5μM时，该小分子化合物提高细胞基因组定点插入效率效果最显著。

在某些实施方式中，小分子化合物Tedizolid浓度为1-10μM。由此，在培养液中加入Tedizolid浓度为1-10μM时，该小分子化合物都可提高细胞基因组定点插入效率，其中Tedizolid浓度为1μM时，该小分子化合物提高细胞基因组定点插入效率效果最显著。

附图说明

图1为一种实施例中EGFP基因定点插入HEK293T细胞模式图；

图2为一种实施例中PX330-ACTB和hACTB-T2A-GFP供体质粒图谱；

图3为一种实施例中高通量筛选小分子化合物结果图；

图4为一种实施例中两种候选的小分子化合物对细胞定点插入效率的结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本公开作进一步详细的说明。

实施例一：提高基因组定点插入效率的小分子化物的筛选(图1)

1PX330-ACTB质粒构建：

根据NCBI提供的ACTB(ENSG00000075624)基因序列，在其第六外显子，即终止密码子附近设计gRNA (https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html)，其引物序列如下所示：正向(F)SEQ ID No:1：5’-CACCCGTCCACCGCAAATGCTTCT-3’；反向(R) SEQ ID No:2：5’-AAACAGAAGCATTTGCGGTGGACG-3’。引物合成后浓度稀释成10μM，各取5μl轻轻混匀进行退火反应，反应过程如下：95℃， 3min→10℃，1min→95℃，3min→10℃，1min→95℃，3min→10℃， 1min→95℃，3min→4℃，10min。

质粒PX330(Addgene，#42230)按照ThermoFisher公司FastDigest BpiI (#FD1014)的说明书单酶切该质粒，酶切反应体系如表1所示：

表1酶切反应体系

按上表中酶切反应体系配好，轻轻混匀，在37℃水浴锅中处理30min 后，取3μl电泳，电泳检测确保质粒酶切完全。同时按照OMEGA公司的 Cycle Pure Kit(#D6492)纯化酶切产物。纯化过程如下：向60μl反应体系中加入250μl CP Buffer，混匀后向滤柱中每次加入700μl混合液离心 (13000g，1min)，弃掉滤液。将所有混合液过柱后，向滤柱中加700μlDNA Wash Buffer并离心(13000g，1min)，弃掉滤液，重复一次。最大转速空管离心2min，把滤柱转移到新的1.5ml离心管中，向滤柱中心加入30～50μl ddH2O(纯化浓度控制在50～100ng/μl左右)，在室温下放置2min后离心 (13000g，2min)，将纯化后的酶切产物与gRNA退火产物按照Takara公司T4 DNALigase(#2011A)的说明书进行T4连接，连接过程如下：按下表配好反应体系，在16℃下孵育2h即可。反应体系如表2所示：

表2 T4连接反应体系

连接完成后，按照北京全式金公司的Trans5α说明书进行转化，转化过程如下：取储存在-80℃的100μl感受态细胞于冰上融化，加10μl上述连接产物后轻轻混匀，在冰上孵育30min，42℃水浴中热激45s，然后迅速冰浴 2min(该过程不摇动离心管)，向离心管中加入600μl无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于摇床培养1小时(37℃，200rpm)，使细菌复苏。取适当的已复苏菌液滴加于含AmpR抗性的LB培养板上，用三角板将细胞均匀涂开后置于37℃培养箱中至液体被吸收，倒置平板，37℃培养过夜。 AmpR抗性筛选阳性单克隆菌，挑3个单克隆，把每个挑起的单个菌落分别置于900μl LA培养液中，摇床培养3小时(37℃，200rpm)至菌液浓度符合测序要求，送华大基因进行测序。测序引物为U6-promoter(human)SEQ ID No:3:5’-CCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3’。测序结果正确后，命名为 PX330-ACTB，序列为SEQ ID No:4(图2)。

2供体hACTB-T2A-GFP质粒构建

以HEK293T细胞基因组DNA和市售的pcDNA3.1-GFP-neo载体为模板，分别扩增LA800、RA800、T2A-GFP和AmpR骨架构建供体质粒，引物如表3所示，反应体系如表4所示。

表3 PCR扩增引物序列信息

表4 PCR反应体系

将上述四段PCR产物按照OMEGA公司Gel Extraction Kit(D2500) 说明书进行切胶回收。切胶回收过程如下：进行琼脂糖凝胶/溴化乙锭电泳以分离DNA片段(用新鲜的TAE缓冲液或TBE缓冲液用作运行缓冲液)。当发生足够的条带分离时，使用干净的手术刀仔细切下目标DNA片段，并通过去除额外的琼脂糖来最小化凝胶切片的大小。把凝胶切片置于干净的 1.5mL离心管中称重，加入1体积Binding Buffer，在50～60℃孵育约7分钟直至凝胶完全融化。融化的过程中每隔2～3分钟小心涡旋或摇动管子，混匀后向滤柱中每次加入不多于700μl混合液离心(10000g，1min)，弃掉滤液。将所有混合液过柱完后，向滤柱中加入300μl XP2 Binding Buffer并离心(13000g，1min)，弃掉滤液。随后向滤柱中加入700μlSPWWash Buffer 离心(13000g，1min)，弃掉滤液，重复一次。最大转速空管离心2min，将滤柱转移到新的1.5ml离心管中，向滤柱中心加入15～30μl ddH2O(纯化浓度控制在50～100ng/μl左右)，在室温下放置2min后离心(13000g，2min)，将回收后的产物储存在-20℃备用。

将胶回收后的DNA片段按照Takara公司In-Fusion HD Cloning kit (#639648)说明书进行无缝克隆，克隆反应体系如表5所示：

表5克隆反应体系

无缝克隆过程如下：按上表配好反应体系，轻轻混合均匀后，将反应在50℃孵育15分钟，然后置于冰上，使用Trans5α转化该连接产物。经菌液PCR鉴定无误的送华大基因测序，测序正确的质粒命名为 hACTB-T2A-GFP，序列为SEQ ID No:13(图2)。

3HEK293T细胞培养

HEK293T细胞复苏：将含有1mL细胞悬液的冻存管置于37℃水浴锅中迅速摇晃解冻，随后加入预热的8mL含10％FBS，1/100双抗的高糖 DMEM培养基(完全培养基)的10cm细胞培养板中，37℃，5％CO2培养至细胞贴壁后更换新的完全培养基，细胞培养过程中每两天换一次新鲜的完全培养基。在显微镜观察下细胞密度达80％后，进行传代。传代过程如下：移除并丢弃培养基，轻轻用DPBS贴壁清洗两次，随后加入1～2mL胰蛋白酶-EDTA溶液消化20s，并在倒置显微镜下观察细胞直至细胞层分散 (为了避免结块，在等待细胞分离时，不要通过敲击或摇动培养皿来搅动细胞，难以分离的细胞可置于37℃以促进分散)。加入2～4mL完全培养基终止消化，轻轻吹打吸出细胞，170g离心5min。吸去上清，使用新鲜的完全培养基进行重悬，按照1：3～1：5的比例进行传代接种，随后放置于37℃， 5％CO2培养箱中进行培养。

4FDA小分子化合物库流式细胞术筛选

当细胞汇合度长至80-90％时，使用上海英潍捷基Lipofectamine 3000 Reagent(#L3000015)将PX330-ACTB和hACTB-T2A-GFP质粒共转染至 HEK293T细胞中，过程如下：准备2管1.5mL离心管，其中一管依次加入 500μl Opti-MEM、43.4μl Lipofectamine 3000并混匀，另一管依次加入两种质粒各14μg、500μl Opti-MEM、56μl P3000并混匀，将前者加入后者中轻轻混匀并在室温孵育10～15min，取1mL复合物加入10mL新的细胞完全培养基(不含双抗)中。转染6h后将细胞均匀接种至24孔板中，培养12h 后添加10μM浓度的市售FDA小分子化合物库。继续培养48h后使用流式细胞仪检测绿色荧光细胞数量，统计FDA小分子化合物库对细胞定点插入效率的影响。结果显示，流式细胞技术可有效筛选出提高细胞定点插入 EGFP的小分子化合物，其中提高定点插入效率50％以上的有97种，它们主要来自于细胞周期/DNA损伤、自噬、抗感染和其它通路(图3)。

实施例二：利用小分子化合物提高基因组定点插入效率

实施例中质粒构建，细胞培养具体实施步骤参照实施例一的步骤1-3。

4小分子化合物提高基因组定点插入效率的验证

同时进一步验证2种候选小分子化合物对HEK293T细胞系定点插入效率的最佳浓度，两种非细胞周期/DNA损伤化合物：Albendazole和Tedizolid。当步骤3中的细胞汇合度长至80-90％时，使用上海英潍捷基Lipofectamine 3000 Reagent(#L3000015)将PX330-ACTB和hACTB-T2A-GFP质粒共转染至HEK293T细胞中，过程如下：准备2管1.5mL离心管，其中一管依次加入500μl Opti-MEM、43.4μl Lipofectamine 3000并混匀，另一管依次加入两种质粒各14μg、500μl Opti-MEM、56μl P3000并混匀，将前者加入后者中轻轻混匀并在室温孵育10～15min，取1mL复合物加入10mL新的细胞完全培养基(不含双抗)中。转染6h后将细胞均匀接种至24孔板中，培养 12h后添加不同浓度梯度的Albendazole或Tedizolid。继续培养48h后使用流式细胞仪检测绿色荧光细胞数量，统计这两种小分子化合物提高的细胞定点插入效率。结果显示，Albendazole化合物在降低浓度至1μM时仍有极好的定点插入效果，且浓度在5μM时提高效率最明显，而Tedizolid随着浓度的增加有下降的趋势，在1μM时获得最佳的定点插入效率(图4)。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 温氏食品集团股份有限公司

<120> 一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法

<130> 2019.08.21

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacccgtcca ccgcaaatgc ttct 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaacagaagc atttgcggtg gacg 24

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgtaacttg aaagtatttc g 21

<210> 4

<211> 8486

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat 60

ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca 120

aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 180

ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat 240

ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccc gtccaccgca aatgcttctg 300

ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg 360

gcaccgagtc ggtgcttttt tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 420

ccgtttttag cgcgtgcgcc aattctgcag acaaatggct ctagaggtac ccgttacata 480

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 540

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 600

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 660

cggtaaatgg cccgcctggc attgtgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 720

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg 780

cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta 840

attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cggggcgagg ggcggggcgg 900

ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt 960

tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt 1020

cgctgcgcgc tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg 1080

gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg 1140

ctgtaattag ctgagcaaga ggtaagggtt taagggatgg ttggttggtg gggtattaat 1200

gtttaattac ctggagcacc tgcctgaaat cacttttttt caggttggac cggtgccacc 1260

atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat 1320

gacgataaga tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc 1380

gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 1440

accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 1500

agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 1560

acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 1620

ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 1680

gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 1740

atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 1800

ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 1860

atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 1920

gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 1980

aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 2040

ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 2100

attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 2160

gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 2220

atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 2280

ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 2340

atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 2400

cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 2460

tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 2520

aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 2580

cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 2640

attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 2700

aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 2760

ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 2820

gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 2880

ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 2940

aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 3000

ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 3060

aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 3120

ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 3180

aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 3240

accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 3300

ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 3360

ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 3420

ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 3480

ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 3540

gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 3600

aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 3660

gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 3720

aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 3780

gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 3840

atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 3900

gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 3960

aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 4020

tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 4080

aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 4140

gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 4200

aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 4260

ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 4320

caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 4380

cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 4440

atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 4500

atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 4560

ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 4620

accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 4680

acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 4740

agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 4800

tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 4860

gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 4920

ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 4980

tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 5040

aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 5100

tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 5160

cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 5220

ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 5280

atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 5340

gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 5400

gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 5460

ctgtctcagc tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 5520

aagaaaaagt aagaattcct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc 5580

agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 5640

ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 5700

ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagag aatagcaggc 5760

atgctgggga gcggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg 5820

ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg 5880

cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc 5940

tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc 6000

ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 6060

tgccagcgcc ttagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 6120

cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 6180

acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 6240

ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 6300

gttccaaact ggaacaacac tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat 6360

tttgccgatt tcggtctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 6420

ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 6480

tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 6540

ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 6600

tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct 6660

atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg 6720

gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 6780

gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 6840

tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt 6900

tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt 6960

gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga 7020

acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat 7080

tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga 7140

gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag 7200

tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg 7260

accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg 7320

ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt 7380

agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg 7440

gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc 7500

ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg 7560

tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac 7620

ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact 7680

gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa 7740

acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 7800

aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg 7860

atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 7920

gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 7980

tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca 8040

ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 8100

ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 8160

ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 8220

aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 8280

cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 8340

gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 8400

ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 8460

cagcaacgcg gcctttttac ggttcc 8486

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaattcccta gaagcatttg cggtggacga gatcttggac ctggctgg 48

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggagaagttg gtagctccgc tgccgaattc gaagcatttg cggtggacga t 51

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acaagtagta agcttaaggc ttgcggacta tgact 35

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagcttccta gaagcatttg cggtggacgc tcgagaggaa cagagacctg a 51

<210> 9

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gctaccaact tctccctgct gaagcaggct ggcgacgtgg aggagaaccc aggaccaatg 60

gtgagcaagg gcgag 75

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aagcttacta cttgtacagc tcgtccatgc 30

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcttctagga agcttatcgg aaagaacatg tgagcaaaag gcc 43

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcttctaggg aattcatcat tgggacgtca ggtggcactt ttcg 44

<210> 13

<211> 4311

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccaatgatga attccctaga agcatttgcg gtggacgaga tcttggacct ggctggccgg 60

gacctgactg actacctcat gaagatcctc accgagcgcg gctacagctt caccaccacg 120

gccgagcggg aaatcgtgcg tgacattaag gagaagctgt gctacgtcgc cctggacttc 180

gagcaagaga tggccacggc tgcttccagc tcctccctgg agaagagcta cgagctgcct 240

gacggccagg tcatcaccat tggcaatgag cggttccgct gccctgaggc actcttccag 300

ccttccttcc tgggtgagtg gagactgtct cccggctctg cctgacatga gggttacccc 360

tcggggctgt gctgtggaag ctaagtcctg ccctcatttc cctctcaggc atggagtcct 420

gtggcatcca cgaaactacc ttcaactcca tcatgaagtg tgacgtggac atccgcaaag 480

acctgtacgc caacacagtg ctgtctggcg gcaccaccat gtaccctggc attgccgaca 540

ggatgcagaa ggagatcact gccctggcac ccagcacaat gaagatcaag gtgggtgtct 600

ttcctgcctg agctgacctg ggcaggtcgg ctgtggggtc ctgtggtgtg tggggagctg 660

tcacatccag ggtcctcact gcctgtcccc ttccctcctc agatcattgc tcctcctgag 720

cgcaagtact ccgtgtggat cggcggctcc atcctggcct cgctgtccac cttccagcag 780

atgtggatca gcaagcagga gtatgacgag tccggcccct ccatcgtcca ccgcaaatgc 840

ttcgaattcg gcagcggagc taccaacttc tccctgctga agcaggctgg cgacgtggag 900

gagaacccag gaccaatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 960

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 1020

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 1080

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 1140

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 1200

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 1260

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 1320

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 1380

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 1440

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 1500

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 1560

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 1620

gagctgtaca agtagtaagc ttaaggcttg cggactatga cttagttgcg ttacaccctt 1680

tcttgacaaa acctaacttg cgcagaaaac aagatgagat tggcatggct ttatttgttt 1740

tttttgtttt gttttggttt tttttttttt tttggcttga ctcaggattt aaaaactgga 1800

acggtgaagg tgacagcagt cggttggagc gagcatcccc caaagttcac aatgtggccg 1860

aggactttga ttgcacattg ttgttttttt aatagtcatt ccaaatatga gatgcgttgt 1920

tacaggaagt cccttgccat cctaaaagcc accccacttc tctctaagga gaatggccca 1980

gtcctctccc aagtccacac aggggaggtg atagcattgc tttcgtgtaa attatgtaat 2040

gcaaaatttt tttaatcttc gccttaatac ttttttattt tgttttattt tgaatgatga 2100

gccttcgtgc ccccccttcc cccttttttg tcccccaact tgagatgtat gaaggctttt 2160

ggtctccctg ggagtgggtg gaggcagcca gggcttacct gtacactgac ttgagaccag 2220

ttgaataaaa gtgcacacct taaaaatgag gccaagtgtg actttgtggt gtggctgggt 2280

tgggggcagc agagggtgaa ccctgcagga gggtgaaccc tgcaaaaggg tggggcagtg 2340

ggggccaact tgtccttacc cagagtgcag gtgtgtggag atccctcctg ccttgacatt 2400

gagcagcctt agagggtggg ggaggctcag gggtcaggtc tctgttcctc tcgagcgtcc 2460

accgcaaatg cttctaggaa gcttatcgga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 2520

gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 2580

gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 2640

taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 2700

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 2760

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 2820

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 2880

agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 2940

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca 3000

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 3060

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 3120

acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 3180

cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 3240

acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 3300

acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 3360

tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 3420

ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 3480

ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 3540

tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 3600

aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 3660

ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 3720

ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 3780

gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 3840

gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 3900

cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 3960

actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 4020

ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 4080

tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 4140

ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 4200

agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 4260

aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt c 4311

Claims (10)

1.一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法，其特征在于，所述的方法通过小分子化合物与CRISPR/Cas9系统共同作用于细胞来实现。

2.根据权利要求1所述的一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法，其特征在于，所述的方法通过如下步骤来实现：

CRISPR/Cas9载体和供体质粒的构建；

表达细胞系的培养；

CRISPR/Cas9系统表达载体与小分子化合物共转染表达细胞，筛选出可提高细胞基因组定点插入效率的小分子化合物；

将筛选出的小分子化合物与CRISPR/Cas9系统共处理细胞，来提高基因组定点插入效率。

3.根据权利要求2所述的一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体为PX330-ACTB质粒。

4.根据权利要求3所述的一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法，其特征在于，所述PX330-ACTB质粒的序列为SEQ ID No:4。

5.根据权利要求2所述的一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9供体质粒为hACTB-T2A-GFP质粒。

6.根据权利要求5所述的一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法，其特征在于，所述hACTB-T2A-GFP质粒的序列为SEQ ID No:13。

7.根据权利要求5或6所述的一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法，其特征在于，所述hACTB-T2A-GFP质粒的构建包括获取细胞基因组DNA和pcDNA3.1-GFP-neo载体为模板，得到目的片段，然后进行无缝克隆，获得hACTB-T2A-GFP质粒。

8.根据权利要求1所述的一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法，其特征在于，所述的小分子化合物包括：Albendazole或Tedizolid。

9.根据权利要求8所述的一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法，其特征在于，所述的小分子化合物Albendazole浓度为1-10μM。

10.根据权利要求8所述的一种利用小分子化合物提高基因组定点插入效率的方法，其特征在于，所述的小分子化合物Tedizolid浓度为1-10μM。