CN101166546A - 允许靶细胞长期暴露于治疗性和预防性核酸的局部施用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于预防或抑制受试者中过度增生性病变的扩展的组合物和方法，所述组合物和方法包括包含在固体或半固体制剂中或透皮或经皮递送装置中的核酸。也公开了能够预防或抑制受试者中的过度增生性病变的扩展的核酸的组合物，该组合物包含粘合剂。也公开了能够预防或抑制受试者中过度增生性病变的扩展的核酸的组合物，所述组合物包含核酸吸收增强剂。也公开了预防或抑制受试者中过度增生性病变的扩展的方法，该方法涉及这些治疗性组合物和装置。

Description

允许靶细胞长期暴露于治疗性和预防性核酸的局部施用

发明背景

本申请涉及2005年1月21日提交的美国临时专利申请60/645,826，和2005年6月21日提交的美国临时专利申请60/692,481，其两者在此以其全文引用作为参考。

1.发明领域

本发明总体说来涉及基因转移、基因治疗、药理学和药剂学的领域。更特别地，其涉及可被施用以检测、预防或治疗受试者的疾病的核酸的新药物组合物和使用这些药物组合物检测、预防或治疗疾病的方法。将药物组合物配制为用于给受试者的身体表面例如皮肤表面或粘膜表面局部施用的液体、半固体或固体。本发明也涉及用于递送诊断性或治疗性核酸的经皮肤或透皮给药装置以及使用这些装置在受试者中诊断、预防和治疗疾病的方法。

2.相关领域的描述

基因转移是相对新的方法，其包括递送特定的基因至受试者的特定靶细胞。用于治疗目的的基因转移(即，基因疗法)包括将治疗性基因转移至受试者中的靶细胞。尽管最初被设想为单基因病症的治疗，但大多数基因治疗试验适合癌症和血管疾病的治疗。

因为在美国和其他地方癌症是死亡的首要原因，因此癌症的基因治疗的鉴定存在极大的吸收力。与癌症相关的高发病率和死亡率的一个重要原因是在目前可获得的诊断和治疗措施中存在相当大的局限性的事实。

许多诊断措施是可获得的，实例包括目测(例如，鉴定皮肤损伤的身体检查和鉴定结肠癌的结肠镜检查)、成像研究例如乳腺造影法、CT和MRI和验血(例如，作为前列腺癌标记的PSA)。通常，这些测量不能鉴定疾病的小病灶。在其他情况下，疾病在诊断时已发展至很晚期。

癌症的常规治疗包括手术、化学治疗和/或放射治疗。这些治疗法通常是不成功的：手术可能不能切除所有的癌症；一些癌症对化学治疗和放射治疗具有抗性；且抗化学治疗的肿瘤经常发生。

基因疗法已在癌症的治疗中显现出希望。癌症治疗中的基因疗法的目的是重新建立对细胞增殖的正常控制或清除正在进行异常增殖的细胞。存在多种策略，通过所述策略体内遗传修饰可导致治疗益处。示例性策略包括对异常细胞的免疫原性的增强，对导致异常表型的遗传缺陷的修正和递送基因，所述基因的产物对受体细胞具有毒性或可经改造对受体细胞具有毒性。

可被当作用于癌症的基因治疗的治疗性基因的示例性种类包括肿瘤抑制基因。肿瘤抑制基因是正常地限制细胞生长但，当因突变导致缺失或失活时，允许细胞不受限制地生长的基因。最为人所知的一个肿瘤抑制基因是p53，该基因在细胞周期进程中起着中心作用，其使生长停止从而使响应DNA损害的修复或编程性细胞死亡可发生。如果DNA损伤经证明是不可修复的，其也可启动编程性细胞死亡。

无论使用哪个基因恢复细胞周期进程的调控，该方法的原理和实际的适用性都是一致的。即，获得基因转移的高效率，从而表达治疗量的重组产物。

癌症或其他疾病的成功的基因治疗的一个方面是影响相当大部分的异常细胞的能力。病毒载体可用于该目的。重组腺病毒具有优于逆转录病毒和其他基因递送方法的显著的有利方面(综述于Siegfried，1993)。从未显示过腺病毒在人中诱导肿瘤且其一直被安全地用作活疫苗(参见Straus，1984)。可通过用靶基因替代复制所必需的E1区产生复制缺陷型重组腺病毒。作为感染的正常结果腺病毒不整合入人基因组，因此大大减少了插入诱变的风险。可产生稳定的高滴度的重组腺病毒，从而使得能够产生足量的材料以治疗巨大的患者群体。此外，腺病毒载体能够在体内高效地将基因转移入广泛的组织和肿瘤细胞类型。

尽管病毒载体提供了优于基因递送载体的其他模式的几个有利方面，但其仍然展现对其体内有效用途加以限制的一些特征。这些限制主要导致所述载体有效地将治疗性基因递送和靶向异常细胞的有限能力。一直以来在进行通过将大量病毒载体直接注射入包含靶细胞的区域来克服该问题的尝试。目前的病毒载体的局部施用是通过将大约1×10¹²个病毒颗粒注射入包含靶细胞的区域。不幸的是，高比例的该材料未保持留在注射的区域，却很快地通过循环和淋巴系统被清除，因此阻止了靶细胞的感染。

除了病毒介导的基因递送系统外，还存在用于基因递送的几种非病毒选择。一种非病毒方法包括使用脂质体运送治疗性基因。另一种在应用中受到限制的方法是将治疗性DNA直接导入靶细胞。

除了作为治疗形式的基因转移外，少数研究已描述了基因转移在成像中的应用。在过去十年中发展的成像的新形式包括报告基因的原位或体内成像。报告基因技术首先被应用于组织切片的原位成像(综述于Blasberg等人，2003)。例如，Hooper等人(1990)描述了萤光素酶基因在单个哺乳动物细胞中的表达。报告基因成像已被描述为基于磁共振、核成像(PET，γ射线照相)和/或体内光学成像系统(综述于Blasberg等人，2003)的成像。例如，通过正电子成像术(PET)(Alauddin等人，1996；Alauddin和Conti，1998；Gambhir等人，1998；MacLaren等人，1999；Tjuvajev等人，1998)已检测到单纯疱疹病毒-1胸苷激酶或多巴胺受体2型的转移。相比这下，通过γ射线照相成像已检测到碘化钠共输送体(Mandell，1999)、多巴胺转运蛋白(Auricchio等人，2003)或生长激素释放抑制激素受体2型(Kundra，2002；Sun等人，2001)的转移。仍需确定这些测量中的任一种是否可用于诊断人的疾病。

因此，存在对在疾病例如癌症的诊断和治疗中用于基因转移的新的和改进的组合物以及方法的需要。例如，允许核酸与合适的靶细胞长时间接触的治疗性核酸的组合物将提高制剂的治疗功效。递送报告基因至受试者的患病细胞的方法可提供得到更大提高的靶向和检测患病细胞的能力。

发明概述

本发明已鉴定了核酸的某些新制剂和将这些制剂用于诊断、治疗和预防疾病的方法。此处所示制剂的核酸可以是可用于诊断、预防或治疗疾病的任何核酸。例如，所述核酸可以是编码能够在受试者中促进伤口愈合或治疗过度增生性病灶(hyperproliferative lesion)扩大的氨基酸序列的核酸。

核酸的这些新制剂促进目的核酸至受试者中的靶细胞的更有效递送和靶向。例如，用粘合剂配制一些组合物以造成治疗性核酸与目的靶细胞的长时间接触。

本发明者也已发现用于递送诊断性或治疗性核酸序列的新的透皮或经皮肤给药装置。例如，所述装置可经设计用于递送编码能够抑制受试者中过度增生性病灶的扩大的蛋白的核酸。

也已鉴定了适合基因治疗的疾病的诊断、预防或治疗中使用这些新制剂和装置的方法。

更特别地，本发明的某些实施方案通常涉及包含经配制用于受试者的表面的治疗性核酸和/或诊断性核酸的药物组合物。所述受试者可以是任何受试者，例如哺乳动物或鸟类物种。在特定的实施方案中，所述受试者是人，例如患有癌症的人。

所述受试者的表面可以是任何表面。按照其在生物体背景中平常和普通的意思使用术语“表面”，意思是“动物身体的外表、或其任何部分的外表；体壁(integument)的外侧界面；还有，空腔或管部分的内部界面”。例如，所述表面可以是皮肤表面、粘膜表面、病灶表面、伤口表面或空腔脏器表面。所述皮肤表面可以是正常皮肤，或其可以是皮肤病灶例如皮肤癌(例如，基底细胞癌、鳞状细胞癌)的表面。粘膜表面可以是身体的任何粘膜表面，例如，口腔表面、食管表面、肺粘膜表面、胃、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、阴道或膀胱的表面。所述粘膜表面可以是正常粘膜，或其可以是粘膜病灶例如嘴的粘膜白斑病、结肠息肉或肿瘤的粘膜。病灶表面可以是任何病灶，无论是良性的、恶化前的还是恶性的。所述表面可以是伤口表面，例如外伤性伤口或手术后伤口例如肿瘤的手术切除后的伤口。所述表面可以是内脏器官的表面，例如胃肠道的表面、膀胱、阴道、子宫颈或子宫的表面。如下面详细描述的，可预处理例如刮擦表面以使得能够更有效地转移至下面的组织。用于表面的制剂并不意味着所述制剂以后不可能适用于通过其他方法例如静脉内给药的方法进行应用。此外，此处所示的某些核酸制剂可以是适合用于一种表面例如伤口表面但不适用于其他表面例如胃的表面的制剂。

在此处所示的组合物和装置可包含任何类型的核酸，其包括例如DNA、所有类型的RNA例如siRNA、RNAi、microRNA、核酶和CpG寡核苷酸。

此处定义的“治疗性核酸”是指已知或怀疑在疾病或健康相关性状况(health-related condition)的治疗或预防中有益的核酸。例如，所述“治疗性核酸”可以是编码已知或怀疑在疾病或健康相关性状况的治疗中有益的蛋白或多肽的核酸。转录第二核酸的核酸(例如，转录成核酶或siRNA的DNA)也包含在“治疗性核酸”的定义中，所述第二核酸已知或怀疑在病症或健康相关性状况的治疗中是有益的。可选择地，所述“治疗性核酸”可以是已知或怀疑无需进行转录即可提供治疗性益处的核酸(例如，siRNA或核酶)。

治疗性益处可作为例如通过核酸改变特定基因的表达的结果产生。特定基因表达的改变可以是抑制特定基因的表达或增强特定基因的表达。在本发明的特定实施方案中，所述治疗性核酸编码可用于治疗或预防受试者中的疾病或健康相关性状况的一种或多种蛋白或多肽。

“疾病”定义为由任何原因例如感染、遗传缺陷或环境应激(stress)，导致的身体部分、器官或系统的病理状况。“健康相关性状况”在此定义为可以不是病理性的但要求治疗的身体部分、器官或系统的状况。例子包括要求进行美容治疗的状况，例如皮肤皱纹、皮肤瑕疵等。所述疾病可以是任何疾病，非限定性实例包括过度增生性疾病例如癌症和癌前病灶、伤口和感染。

按照其普通和常用的意思，所用的“预防”和“防止”表示“在....前作用”或此等作用。在特定疾病或健康相关性状况的背景中，这些术语是指为了阻止疾病或健康相关性状况的发生而对受试者施用或使用药剂、药物或治疗剂或对受试者进行治疗法或用药程式。

治疗性核酸可编码治疗性蛋白，例如肿瘤抑制剂、促凋亡蛋白(Proapoptotic protein)(是指促进编程性细胞死亡的蛋白)、细胞因子、生长因子、激素、肿瘤抗原或酶。肿瘤抑制基因的实例包括mda 7、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、Uteroglobin、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)或编码SEMA3多肽的基因。在特定的实施方案中，所述肿瘤抑制剂是p53和/或FUS1。促凋亡基因的实例包括CD95、caspase-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK和BID。细胞因子的实例包括GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32 IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、TGF-α、TGF-β、VEGF和mda 7。在特定的实施方案中，所述细胞因子是mda 7。

所述核酸可以编码肿瘤抗原。所述肿瘤抗原可以是本领域技术人员已知的任何肿瘤抗原。肿瘤抗原的实例包括：MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头状瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、和MAGE基因家族的其他成员、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-Catenin、CDK 4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C关联蛋白(cyclophilin C-associated protein))、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、ING1、乳腺珠蛋白(mamaglobin)、细胞周期蛋白B1、S100、BRCA1、BRCA2、肿瘤免疫球蛋白独特型、肿瘤T细胞受体克隆型、MUC-1、或表皮生长因子受体、肿瘤抑制剂或前述肿瘤关联抗原、癌基因或pep.的任一种的肽。所述核酸可包含肿瘤抑制基因、或癌基因或肿瘤抑制基因的野生型或突变形式。肿瘤抗原的实例包括由染色体易位或癌基因/肿瘤抑制基因突变(例如，bcr/abl、ras)形成的抗原；发育/分化抗原(例如.MUC-1、MAGE、酪氨酸酶、melan-A和gp75)；在恶性转化中上调的抗原(胎性癌抗原-癌胚抗原/CEA、甲胎蛋白/AFP、生长因子受体-Her2/neu、端粒酶和p53)以及与肿瘤发病相关的病毒抗原(肝炎病毒、乳头状瘤病毒和EB病毒)和di(MUC-1、Melan-A)。

生长因子的实例包括表皮生长因子、角质形成细胞生长因子和肝细胞生长因子。在下面在说明书中描述其他治疗性蛋白(包括激素和酶)的实例。明确地指出该段落中鉴定的任何蛋白可以被认为是本发明的部分；此外，明确地指出这些蛋白中的一种或多种在一些实施方案中也不被当作本发明的部分。

“诊断性核酸”是已知或怀疑在鉴定疾病或健康相关性状况的存在或不存在中是有益的核酸，或已知或怀疑在鉴定处于发生特定疾病或健康相关性状况风险中的受试者中有益的核酸。编码一种或多种报告蛋白的核酸也包含在“诊断性核酸”的定义中。“报告蛋白”是指氨基酸序列，当所述氨基酸序列存在于细胞或组织中时，可被检测到且可与存在于细胞中的其他遗传序列或被编码的多肽区别。报告蛋白可以是天然发生的蛋白或非天然发生的蛋白。如果是天然发生的，其可作为基因转移后表达的量的结果被检测到，或其可以是可检测的标签可附着的蛋白。这些报告蛋白的实例包括荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(gfp)、青色荧光蛋白(cfp)、红色荧光蛋白(rfp)或蓝色荧光蛋白(bfp)或这些蛋白的衍生物或酶蛋白例如β-半乳糖苷酶、化学发光蛋白例如萤光素酶、生长抑素受体氨基酸序列、碘化钠共输送体氨基酸序列、萤光素酶氨基酸序列和胸苷激酶氨基酸序列。在下面在说明书中更详细地描述这些和其他报告蛋白。

此处所示的一些新药物组合物涉及治疗性核酸和/或诊断性核酸的组合物，其中所述制剂是水性制剂。水性制剂的实例包括漱口剂、口腔清洗剂、灌洗剂、灌肠剂、喷雾剂和气雾剂。

其他制剂包括分散剂、乳剂、微乳剂、混悬剂、基质、微粒、微型胶囊剂(microcapsule)、乳剂、微乳剂或分散剂。

其他组合物配制为固体或半固体。固体和半固体制剂是指除了水性制剂以外的任何制剂。在特定的实施方案中，固体或半固体不是丸剂或片剂，例如用于口服施用。实例包括凝胶、基质、泡沫、乳膏、软膏、锭剂、棒棒糖(lollipop)、冰棒(popsicle)、口胶剂、粉剂、凝胶条(gel strip)、膜剂、水凝胶、溶解条(dissolving strip)、糊剂、牙膏剂或固体棒(solid stick)。在某些实施方案中，本发明明确不包括一种或多种锭剂、棒棒糖、冰棒、口胶剂、凝胶条、膜剂、水凝胶、溶解条或固体棒。

对于固体或半固体制剂，作为固体或半固体的本发明的药物组合物的任何制剂包括在本发明中。在本说明书的其他地方对此进行详细描述。所述制剂可包含任何数目的下面更详细描述的其他赋形剂。实例包括胶原、甘油、PEG、含水二氧化硅、纤维素、黄原胶(xanthum gum)、聚糖卡波姆956(glycan carbomer 956)、吐温80、氟化物、角叉菜聚糖、粘合剂和/或核酸吸收增强剂。在一些实施方案中，所述赋形剂也可包含在下面更详细描述的美容组分。

如在下面更详细描述的，此处所示的药物组合物可包含任何数目的其他治疗剂和/或诊断剂。实例包括其他治疗剂、抗酸剂和藻酸盐筏形成(alginate-raft forming)组分。

在某些特定的实施方案，药物组合物包含治疗性和/或诊断性核酸，其中所述组合物配制为锭剂、棒棒糖、冰棒、口胶剂、凝胶条、膜剂、水凝胶、溶解条、乳膏、油膏剂、栓剂或固体棒。

此处所示的治疗性和/或诊断性核酸的药物组合物还可包含一种或多种粘合剂。此处定义的“粘合剂”通常是指促进或有助于核酸与表面的接触，或促进或有利于一个表面与另一个表面的接触的试剂或试剂的组合。本领域技术人员已知的用于制药目的的任何粘合剂用作可在本发明的药物组合物和装置中包含的粘合剂。例如，所述粘合剂可以是丙烯酸酯、水胶体、水凝胶、基于聚丙烯酸的凝胶基质、聚异丁烯、硅酮聚合物或其混合物。在下面在说明书中详细地描述了粘合剂。丙烯酸酯粘合剂的示例性类型包括氰基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或烷基丙烯酸酯。

本领域技术人员已知的任何核酸吸收增强剂包含在此处所示的本药物组合物中。此处定义的“核酸吸收增强剂”是指可用于细胞的表面或可与细胞的表面接触以促进吸收对于所述细胞是外来的核酸的任何试剂或超过一种试剂的组合物。示例性阳离子脂质包括季铵细胞转染剂(quaternary cytofectin)、二-胍-三烯-胆固醇(bis-guanidinium-tren-cholesterol)-1，2-二油酰-3-(三甲基铵)丙酸(DOTAP)。在下面在说明中更详细地描述这些试剂。

在一些实施方案中，将固体或半固体药物组合物配制为化妆品。所述化妆品可以以唇膏、油膏剂、乳膏、糊剂、凝胶或洗剂的形式存在。也可包含其他赋形剂，例如着色剂，例如蜡、油、保湿剂、防腐剂、抗氧化剂、紫外吸收剂、紫外散射剂、聚合物、表面活性剂、着色剂、色素、粉末、药物、醇、溶剂、芳香剂(fragrance)或香料。

药物组合物可配制为牙膏且可包含一种或多种通常存在于牙膏中的其他试剂，例如氟化物、香料和增白剂。

在一些其他的实施方案中，将所述药物组合物配制为口胶剂。所述口胶剂可以是口香糖(chewing gum)。其他赋形剂，例如增甜剂和香料，也可包含在制剂中。在一些实施方案中，口胶剂包括黄原胶。

在本发明的一些实施方案中，冷冻干燥所述药物组合物。本领域技术人员熟悉冷冻干燥法。

可在表达盒中包含核酸，所述表达盒包含有效地偶联至所述核酸的启动子，其中所述启动子在受试者的细胞中是有活性的。可在病毒载体中包含所述表达盒。本领域技术人员熟悉许多类型的可获得的病毒载体。例如，所述病毒载体可以是腺病毒载体、杆状病毒载体、细小病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、α病毒载体、细小病毒载体、新培斯病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体或痘病毒载体。在某些特定的实施方案中，所述病毒载体是腺病毒载体，例如包含编码p53、mda 7或FUS1的核酸的腺病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是溶瘤病毒(oncolytic virus)。在下面在说明书中详细地描述溶瘤病毒。溶瘤病毒的实例包括过表达ADP的病毒和病毒例如Ad5、dl327、pm734.1、dl309、dl01/07、KD1、KD2、KD3、dl1520和VRX-007。包含病毒载体的药物组合物可以被冷冻干燥或可以不被冷冻干燥。

在其他实施方案中，包含治疗性和/或诊断性核酸的药物组合物包括一种或多种递送试剂。此处定义的“递送试剂”是指除了病毒载体外促进核酸至目的靶细胞的递送的任何试剂或物质。本领域技术人员熟悉各种类型的可获得的递送试剂。例如，所述递送试剂可以是脂质。所述脂质可以包含在或可以不包含在脂质体中。脂质体制剂在本领域内是熟知的。在一些实施方案中，DOTAP：胆固醇纳米颗粒是递送试剂。

本发明的组合物和装置的表达盒可包含任何类型的启动子，只要所述启动子在受试者的细胞中是有活性的。例如，所述启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子或组织选择性启动子。此处定义的组织选择性启动子是指与其他组织类型相比在某些组织类型中相对更活跃的任何启动子。因此，例如，肝特异性启动子将是在肝中更活跃(与身体中其他组织相比)的启动子。组织选择性启动子的一种类型是肿瘤选择性启动子。此处定义的肿瘤选择性启动子是指与其他组织类型相比在肿瘤组织中更具活性的启动子。在其他组织类型中可具有一些功能，但与其他组织类型相比，所述启动子在肿瘤组织中相对更具活性。肿瘤选择性启动子的实例包括hTERT启动子、CEA启动子、PSA启动子、probasin启动子、ARR2PB启动子和AFP启动子。

在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物是非腺病毒组合物，所述组合物包含治疗性核酸和/或诊断性核酸，其中将所述组合物配制为凝胶、糊剂、泡沫剂、结晶浆液(slurry)、乳膏、软膏、栓剂或粉剂。在特定的方面，所述组合物包含编码p53、mda 7和/或FUS1的核酸的组合物。

可配制药物组合物以使其可通过透皮贴剂、条带(strip)、绷带、带、敷料或人造皮肤(synthetic skin)施用。在下面更详细地描述这些制剂。

本发明总的说来也涉及用于递送治疗剂或诊断剂至受试者的透皮给药或经皮肤递送装置，所述装置包括贴剂和包含核酸的药物组合物，所述核酸编码报告蛋白、肿瘤抑制剂、促凋亡蛋白、生长因子或细胞因子，其中将所述药物组合物施用于贴剂的至少一个表面。涉及药物组合物的上面的描述此处也适用于这些透皮或经皮肤的递送装置。在本说明书的其他地方描述示例性肿瘤抑制剂、促凋亡蛋白、生长因子、报告因子和细胞因子。如上所示，可在表达盒中包含核酸，所述表达盒包含有效地偶联至所述核酸的启动子，其中所述启动子在受试者的细胞中具有活性。涉及表达盒的上述描述此处也适用于该部分。在特定的实施方案中，所述表达盒是病毒载体，例如腺病毒载体。在一些实施方案中，所述核酸是编码p53、mda 7或FUS1的治疗性核酸。

本发明的实施方案也涉及检测、预防或治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括给所述受试者施用上面所示的任何药物组合物。此外，本发明的实施方案也涉及检测、预防或治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括将此处所示的一种或多种透皮或经皮肤递送装置用于所述受试者的身体表面。

在一些实施方案中，所述核酸可编码报告蛋白，且其中所述方法被进一步确定为在受试者中检测病灶的方法。

所述疾病可以是任何疾病。例如，所述疾病可以是过度增生性病灶。示例性过度增生性病灶包括恶化前病灶、癌症和肿瘤。过度增生性病灶、恶化前病灶或癌症可以是乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、子宫颈癌、宫颈发育异常、结肠癌、肾癌、皮肤癌、发育不良痣、头与颈癌、骨癌、食管癌、过度角化症、脊柱后凸、脂溢性角化病、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤、白血病或这些组织或器官的发育异常病变(dysplastic lesion)。其他疾病包括糖尿病性溃疡、静脉淤积性溃疡(venous stasis ulcer)、褥疮、烧伤、伤口和粘膜炎。

在某些实施方案中，过度增生性病变是可影响受试者的嘴的疾病。示例包括粘膜白斑病、鳞状上皮细胞增生性病变(squamous cellhyperplastic lesions)、恶化前上皮病变(premalignant epitheliallesion)、口腔发育异常(oral dysplasia)、上皮内瘤形成病变(intraepithelial neoplastic lesion)、局灶性上皮增生和鳞状细胞癌病变(squamous carcinoma lesion)。

所述受试者可以是任何受试者，例如哺乳动物。在某些实施方案中，所述哺乳动物是人。例如，人可以是患有癌前病变的患者或患有癌症的患者。在某些实施方案中，所述受试者正经历过度增生性病变的次级治疗(secondary treatment)例如次级抗癌治疗。在下面在说明书中更详细描述的这样的治疗的实例包括手术治疗、化学治疗、放射治疗和免疫治疗。

所述核酸可以是治疗性核酸，例如编码肿瘤抑制剂、促凋亡蛋白、细胞因子或生长因子的核酸。在上面和本说明书中其他地方更详细地描述了这些核酸。所述核酸还可以是诊断性核酸，例如编码上述报告蛋白的核酸。在其他实施方案中，特别地所述治疗性核酸明确地不编码此处描述的肿瘤抑制剂、促凋亡蛋白、细胞因子或生长因子或这些蛋白中的任一种。

在一些实施方案中，所述方法还被确定为促进受试者的伤口愈合的方法。在这些实施方案中，例如，所述核酸可编码生长子，例如上述生长因子。在其他实施方案中，所述核酸是治疗性核酸，所述方法还被确定为在受试者中预防或抑制过度增生性病变扩大的方法。例如，过度增生性病变可以是受试者的口腔发育异常(oral dysplasia)或粘膜白斑病。所述方法还可包括鉴定需要疾病或健康相关性状况的检测、治疗或预防的受试者。鉴定处于风险的受试者的方法的实例包括基于历史或检查的临床筛查、医生会诊或鉴定这些风险因子的问卷调查。

如上所示，表达盒可包含所述核酸并且包含有效连接至该核酸的启动子，其中所述启动子在所述受试者的细胞中是有活性的。在特定的实施方案中，所述表达盒包含在病毒载体例如腺病毒载体中。在更特定的实施方案中，所述表达盒包含在腺病毒载体中，所述核酸编码p53、mda 7或FUS1。

本方法包括施用本领域技术人员已知的药物组合物的任何方法。“施用”包括给受试者提供药物组合物。本领域技术人员熟悉许多通过其可施用药物的方法。例如，施用可包括给受试者的身体表面局部施用制剂。例如，可使用涂药器(applicator)施用凝胶或糊剂，例如使用棉头涂药器和刮勺施用凝胶或糊剂。所述涂药器可以是或可以不是一次性的。可由任何个体例如健康护理专业人员或被施以药物组合物的受试者施用组合物。“施用”的定义也包括开出药物组合物的处方，例如由健康护理专业人员开的处方。此处所示的药物组合物可以以包含一次性或可重复使用的涂药器和药物组合物的试剂盒的形式存在。可设计这样的试者盒以使保健人员或受试者能够施用药物组合物。

此处所示的治疗方法可包括给受试者施用一种或多种的次级治疗形式。次级治疗形式包括本领域技术人员已知的任何形式，其主要依赖于疾病过程。在下面在说明书中提供了实例。

此处所示的某些核酸对于此处所示的每种制剂并不都是适用的。因此，例如适合用于乳膏制剂的特定核酸可能不一定适合于锭剂形式的制剂。

所述关于本发明的一个方面的任何实施方案同样可用于本发明的其他方面。

实施例部分的实施方案理解为可用于本发明的所有方面的实施方案。

权利要求中的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出是指选择其一或选择方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持择一选择和“和/或”的定义。

在整个本申请中，术语“大约”用于表示这样的值，该值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准差。

如在本说明书中所用的，“a”或“an”可表示一个或多个。如此处在权利要求中所用的，当与词“包含”一起使用时，词“a”或“an”可表示一个或不止一个。如此处所用的，“另一个”可表示至少第二个或更多个。

根据详细的描述，本发明的其他目的、特征和有利方面将变得明显。然而，应当理解，详细的描述和特定的实施例，表示本发明的优选的实施方案，其只是以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，本发明的精神和范围内的各种改变和变化对于本领域技术人员将变得显然。

附图概述

下列附图形成本说明书的部分且用于进一步展示本发明的某些方面。通过参考与此处提供的特定实施方案的详细描述结合的这些附图中的一个或多个附图可更好地理解本发明。

图1.重组P53腺病毒的产生的示意图。在pXCJL.1的Xba I和Cla I位点之间插入p53表达盒。将p53表达盒(pEC53)和重组质粒pJM17共转染入293细胞。在培养基中保持转染的细胞直至细胞病变效应发生。使用从CPE上清液(所述上清液用蛋白酶K和酚抽提处理)制备的DNA模板，通过DNA的PCR分析鉴定新产生的p53重组腺病毒(AdCMV-p53)。

示例性实施方案的描述

本发明已鉴定了可用于诊断、治疗和/或预防受试者的疾病的核酸的某些新组合物。这些组合物包含经配制用于例如受试者的身体表面(例如皮肤、病变表面、粘膜表面、伤口表面、肿瘤表面或空腔脏器例如胃的衬里(lining))的核酸。在一些实施方案中，所述核酸编码可用于疾病的诊断的报告基因。也提供了诊断和治疗受试者的疾病的新方法，其包括使用此处所示的核酸的新制剂。此处提供的新组合物和方法可用于检测、预防或治疗许多疾病和健康相关性状况的任一种。这些疾病的实例包括癌症和感染以及伤口愈合。这些新组合物在疾病的诊断、治疗和预防中的应用代表了现有基因治疗技术的改进。

A.核酸

1.一般而言的核酸

本发明的药物组合物和方法包括已知或怀疑在受试者的疾病或健康相关性状况的诊断、治疗或预防中是有益的核酸。

术语“核酸”在本领域中是熟知的。此处所用的“核酸”一般是指DNA、RNA(包括RNAi siRNA和核酶)以及寡核苷酸的分子(即，链)、包含CpG位点的寡核苷酸或其包含核碱基(nucleobase)的衍生物或类似物。术语“核酸”包括术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，各作为术语“核酸”的亚类。术语“寡核苷酸”是指长度在大约3和大约100个核碱基之间的分子。术语“多核苷酸”是指至少一个长度大于大约100个核碱基的分子。

这些定义一般是指单链分子，但在特定的实施方案中也可包括另外的链。所述另外的链可以部分、基本上或完全与所述单链分子互补。因此，核酸可包括包含一个或多个互补链的双链分子或三链分子或包含分子的特定序列的“互补物”。如此处所用的，单链核酸可用前缀“ss”表示，双链核酸用前缀“ds”表示，而三链核酸用前缀“ts”表示。

a.核碱基

如此处所用的，“核碱基”是指杂环碱基，例如在至少一个天然发生的核酸(即DNA和RNA)中发现的天然发生的核碱基(即A、T、G、C或U)和这样的核碱基的天然或非天然发生的衍生物和类似物。核碱基通常可以以可替代天然发生的核碱基配对的方式与至少一个天然发生的核碱基形成一个或多个氢键(例如，A和T、G和C、以及A和U之间的氢键)(“退火”或“杂交”)。

“嘌呤”和/或“嘧啶”核碱基包括天然发生的嘌呤和/或嘧啶核碱基和其衍生物和类似物，包括但不限于，由一个或多个烷基、羧烷基、氨基、羟基、卤素(即，氟、氯、溴或碘)、巯基或烷硫基部分取代的嘌呤或嘧啶。优选的烷基(例如，烷基、羧烷基等)部分由大约1、大约2、大约3、大约4、大约5至大约6个碳原子组成。嘌呤或嘧啶的其他非限定性实例包括脱氮杂嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、溴胸腺嘧啶、8-氨基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、氮杂鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-乙基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、硫尿嘧啶、2-甲基腺嘌呤、甲基硫腺嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、氮杂腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫嘌呤、4-(6-氨基己基/胞嘧啶)等。表1显示嘌呤和嘧啶衍生物及类似物的非限定性实例。

可通过使用此处描述的或本领域技术人员已知的任何化学或天然合成方法将核碱基包含在核苷或核苷酸中。

b.核苷

如此处所用的，“核苷酸”是指包含共价地附着至核碱基连接体部分的核碱基的单个化学单位。“核碱基连接体部分”的非限定性实例是包含5-碳原子的糖(即，“5-碳糖”)，包括但不限于脱氧核糖、核糖、阿拉伯糖或五碳糖的衍生物或类似物。5碳糖的衍生物或类似物的非限定实例包括2′-氟-2′-脱氧核糖或碳环糖，其中用碳原子取代糖环中的氧原子。

不同类型的核碱基至核碱基连接体部分的共价附着在本领域内是已知的。以非限定性实例为例，包含嘌呤(即，A或G)或7-脱氮杂嘌呤核碱基的核苷一般将嘌呤或7-脱氮杂嘌呤的9位置共价地附着至5碳糖的1’位置。在另一个非限定性实例中，包含嘧啶核碱基(即，C、T或U)的核苷一般将嘧定的1位置共价地附着至5碳糖的1’位置(Kornberg和Baker，1992)。

c.核苷酸

如此处所用的，“核苷酸”是指进一步包含“主链部分”的核苷。主链部分一般将核苷酸共价地附着至包含核苷酸的另一个分子，或附着至另一个核苷酸，从而形成核酸。天然发生的核苷酸中的“主链部分”通常包含磷部分，该部分共价地附着至5碳糖。主链部分的附着一般发生在5碳糖的3′或5′位置。然而，附着的其他类型在本领域内是已知的，特别是当核苷酸包含天然发生的5碳糖或磷部分的衍生物或类似物时。

d.核酸类似物

核酸可包含，或可完全由可存在于天然发生的核酸中的核碱基、核碱基连接体部分和/或主链部分的衍生物或类似物组成。如此处所用的，“衍生物”是指天然发生的分子的化学修饰的或改变的形式，而术语“模拟物”或“类似物”是指结构上可与天然发生的分子或部分相似或不相似，但具有相似功能的分子。如此处所用的，“部分”一般是指更大的化学或分子结构的较小的化学或分子组分。核碱基、核苷和核苷酸类似物或衍生物在本领域内是熟知的，且已进行了描述(参见例如，Scheit，1980，此处引用作为参考)。本领域技术人员已知的核苷或核苷酸的任何衍生物或类似物可用于本发明的方法和组合物。非限制性实例是“聚醚核酸(polyethernucleic acid)”和“肽核酸”。

e.核酸的制备

可通过本领域技术人员已知的任何技术制备核酸。实例包括化学合成、酶促产生或生物产生。合成的核酸(例如合成的寡核苷酸)的非限定性实例，包括使用磷酸三酯、亚磷酸或亚磷酰胺化学药品以及固相技术通过体外化学合成来制备的核酸。酶促产生的核酸的非限制性实例包括由扩增反应例如PCR^TM和本领域内技术人员已知的其他技术(参见，例如，美国专利4,683,202和美国专利4,682,195，各自在此引用作为参考)或美国专利No.5,645,897(在此引用作为参考)中描述的寡核苷酸的合成中的酶产生的核酸。生物产生的核酸的非限定性实例包括活细胞中产生(即，复制的)的重组核酸，例如在细菌中复制的重组DNA载体(参见例如，Sambrook等人2001，在此引用作为参考)。

f.核酸互补物

本发明也包括与编码能够在患者中诊断、治疗或预防疾病的氨基酸序列的核酸互补的核酸。当核酸能够按照标准的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen结合互补法则(reverse Hoogsteen binding complementarity rule)与另一个核酸进行碱基配对时，其是所述另一个核酸的“互补物”或对于所述另一个核酸是“互补的”。如此处所用的，“另一个核酸”可以是指分开的分子或相同分子的空间上分开的序列。

如此处所用的，术语“互补的”或“互补物”也指核酸，该核酸包含连续核碱基或半连续核碱基(例如，一个或多个核碱基部分不存于该分子中)的序列，所述序列即使在并非所有核碱基都与对应的核碱基配对的情况下仍能够与另一个核酸链或双链体杂交。在某些实施方案中，“互补的”核酸包含序列，在所述序列中，核碱基序列的大约70％至大约100％(以及该范围内的任何值)能够在杂交过程中与单链或双链核酸碱基配对。在某些实施方案中，术语“互补的”是指可在严紧条件下与另一个核酸链或双链杂交的核酸，本领域技术人员对此是理解的。

在某些实施方案中，“部分互补的”核酸包含可在低严紧条件下与单链或双链核酸杂交的序列，或包含其中低于大约70％的碱基序列能够在杂交过程中与单链或双链核酸分子碱基配对的序列。

2.治疗性核酸

在此处所示的制剂的一些实施方案中，所述核酸是治疗性核酸。此处定义的“治疗性核酸”是指能够给患者施用以治疗或预防疾病的核酸。所述核酸是已知或怀疑在治疗受试者的疾病或健康相关性状况中是有益的核酸。在本说明书的其他部分详细地描述了疾病和健康相关性状况。

治疗性益处可作为例如通过核酸改变特定基因的表达的结果而产生。特定基因的表达的改变可以是特定基因的表达的抑制或提高。在本发明的某些实施方案中，治疗性核酸编码一种或多种可用于在受试者中治疗或预防疾病或健康相关性状况的蛋白或多肽。术语“蛋白”和“多肽”此处可互换使用。两个术语都指包含两个或更多个氨基酸残基的氨基酸序列。

本领域技术人员已知的已知或怀疑在疾病或健康相关性状况的治疗或预防中是有益的任何核酸被本发明当作治疗性核酸。术语“编码....的核酸序列”，如整个本申请中所提及的，是指指导特定蛋白或肽的表达的核酸。所述核酸序列包括转录成RNA的DNA链序列和翻译成蛋白的RNA序列。在一些实施方案中，所述核酸包括治疗性基因。术语“基因”用于表示编码功能性蛋白、多肽或肽编码性单位的核酸序列。

如本领域技术人员所理解的，术语“治疗性核酸”包括基因组序列、cDNA序列和更小的经基因工程改造的基因片段，所述序列或片段表达或经改造可适用于表达蛋白、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体。所述核酸可包含大约5至大约12000个或更多个核苷酸、核苷、或碱基对的连续核酸序列。

已证明在疾病或健康相关性状况的治疗或预防中具有益处的治疗性核酸的“生物功能等价物”包含在“治疗性核酸”的定义内。因此，本发明涉及具有与已知的核酸大约70％至大约99％的同源性的序列。

a.编码肿瘤抑制剂和促凋亡蛋白的核酸

在一些实施方案中，所述药物组合物的核酸包括编码可用于治疗或预防癌症或其他过度增生性疾病的蛋白或多肽的核酸序列。这些蛋白的实例包括，但不限于，Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11 IL-12、IL-13、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda 7、fus、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、胞嘧啶脱氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、Rb、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF或MCC。

“肿瘤抑制剂”是指多肽，当其存在于细胞中时，减少细胞的肿瘤形成性、恶性或过度增殖性表型。编码肿瘤抑制剂基因的氨基酸序列的核酸序列包括肿瘤抑制剂基因的全长核酸序列和来源该全长序列的任何长度的非全长序列。要进一步理解，所述序列包含天然序列或可被导入从而在特定宿主细胞中提供密码子偏爱的序列的简并密码子。

编码肿瘤抑制剂的核酸一般是指减少细胞的肿瘤形成性、恶性或过度增殖性表型的核酸序列。因此，健康细胞中肿瘤抑制基因的缺乏、突变或正常表达的破坏增加了该细胞获得致瘤性状态的可能性或导致获得致瘤性状态的细胞。相反地，当功能性肿瘤抑制剂基因或蛋白存在于细胞中时，其存在抑制了宿主细胞的肿瘤形成性、恶性或过度增殖性表型。肿瘤抑制剂的示例包括，但不限于，APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、子宫珠蛋白、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、scFV、ras、MMAC1、FCC、MCC、Gene 26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene 21(NPRL2)或编码SEM A3多肽和FUS1的基因。其他示例性肿瘤抑制剂基因描述于www.cise.ufl.edu/～yyl/HTML-TSGDB/Homepage.html中的肿瘤抑制基因的数据库中。该数据库明确地在本申请的该部分和所有其他部分引用作为参考。编码上述肿瘤抑制基因的核酸包括肿瘤抑制基因或由其衍生的核酸(例如，cDNAs、cRNA、mRNA和编码各肿瘤抑制剂氨基酸序列的活性片段的其亚序列)以及包含这些序列的载体。本领域技术人员熟悉可用于本发明的肿瘤抑制基因。

最为熟知的一个肿瘤抑制基因是p53。p53是许多细胞抗癌机制的中心。其可诱导生长抑制、编程性细胞死亡和细胞衰老。在正常的细胞中p53通常是无活性的，结合至蛋白MDM-2，这防止了其作用和促进了其降解。在各种致癌剂例如UV辐照、癌基因和一些DNA损伤药物的作用后活性p53被诱导。DNA损伤在细胞周期中被‘检查点’感觉到，然后使蛋白例如ATM、Chk1和Chk2在靠近p53蛋白的MDM2结合区域的位置磷酸化p53。癌基因也刺激由蛋白p14ARF介导的p53的激活。一些癌基因也可刺激结合MDM2且抑制其活性的蛋白的转录。一旦被活化，p53具有许多抗癌机制，最详尽证明的是其结合DNA的区域和激活基因(所述基因在细胞周期抑制、编程性细胞死亡、遗传稳定性和抑制血管发生中起着重要作用)的转录的能力(Vogelstein等人，2000)。研究已将p53和pRB肿瘤抑制剂途径通过蛋白p14ARF联结起来，产生了所述途径可相互调节的可能性(Bates等人，1998)。

编码促凋亡蛋白的核酸编码诱导或维持活性形式的编程性细胞死亡的蛋白。本发明包括编码本领域技术人员已知的促凋亡蛋白的任何核酸。示例性促凋亡蛋白包括CD95、caspase-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PERP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK、BID和mda 7。本领域技术人员熟悉促凋亡蛋白，包括此处未明确提及的促凋亡蛋白。

编码促凋亡蛋白氨基酸序列的核酸包括，例如cDNA、cRNA、mRNA和编码各自的促凋亡蛋白氨基酸序列的活性片段的其亚序列。

本领域技术人员理解存在编码蛋白或多肽的其他核酸，所述蛋白或多肽可用于治疗此处未明确提及的疾病或健康相关性状况。此外，要理解本说明书中其他地方提及的治疗性核酸的任一种例如编码细胞因子的核酸可用于癌症的治疗和预防。

b.编码细胞因子的核酸

在此处提供的药物组合物的一些实施方案中，所述核酸编码细胞因子。术语“细胞因子”是由一种细胞群体释放的以细胞间调节剂的形式作用于另一种细胞的蛋白的总称。所述核酸序列可编码细胞因子的全长核酸序列和从所述全长序列衍生的任何长度的非全长序列。要进一步理解，如上面所描述的，所述序列包含天然序列的简并密码子或可被导入从而在特定宿主细胞中提供密码子偏爱的序列。

这些细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子、生长因子和常规的多肽激素。在细胞因子中包括生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松弛素(relaxin)；前松弛素(prorelaxin)；糖蛋白类激素例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子(FGF)例如FGF-α和FGF-β；催乳激素；胎盘催乳激素、OB蛋白；肿瘤坏死因子α和β；苗勒氏抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素结合多肽(gonadotropin-associated peptide)；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)例如TGF-α和TGF-α；胰岛素样生长因子I和II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素例如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSFs)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)例如IL-1、IL-1.α.、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配体或FLT-3.

参与伤口愈合的生长因子细胞因子的非限定性实例包括：表皮生长因子、血小板衍生生长因子、角质形成细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子(TGFs)例如TGF-α和TGF-β、以及血管内皮生长因子(VEGF)。这些生长因子引发利用Ras、MAPK、PI-3K/Akt、PLC-γ和Rho/Rac/肌动蛋白信号转导的促有丝分裂、动力产生性(motogenic)和存活途径。缺氧通过HIF激活促血管生成(pro-angiogenic)基因(例如，VEGF、血管生成素)，而血清应答因子(SRF)对于VEGF诱导的血管发生、上皮再形成和肌肉恢复是至关重要的。EGF、其受体HGF和Cox2对于胃腺的上皮细胞增殖、迁移再上皮形成和重建是非常重要的。VEGF、血管生成素、一氧化氮、内皮素和金属蛋白酶对于溃疡内的血管发生、血管重构和粘膜再生是非常重要的(Tarnawski，2005)。

细胞因子的另一个实例是IL-10。IL-10是由免疫系统细胞和一些肿瘤细胞产生的多效同型二聚体细胞因子(Ekmekcioglu等人，1999)。其免疫抑制功能包括促炎细胞因子合成的有效抑制作用，包括IFNγ、TNFα和IL-6的合成的有效抑制(De Waal等人，1991)。IL-10样细胞因子的家族在染色体1q32上的小的195kb基因簇中被编码，且由许多与IL-10具有结构和序列同源性的细胞蛋白(IL-10、IL-19、IL-20、MDA-7)组成(Kotenko等人，2000；Gallagher等人，2000；Blumberg等人，2001；Dumoutier等人，2000；Knapp等人，2000；Jiang等人，1995a；Jiang等人，1996)。

最近发现的假定的所述细胞因子家族的成员是MDA-7。MDA-7已被表征为IL-10家族成员且也称为IL-24。染色体定位、转录调控、鼠类和大鼠的同源物表达以及假定的蛋白结构都暗示MDA-7为细胞因子(Knapp等人，2000；Schaefer等人，2000；Soo等人，1999；Zhang等人，2000)。与GM-CSF、TNFα和IFNγ转录物(其都在其3’UTR包含富含AU的元件以将mRNA靶向快速降解)相似，MDA-7在其3’UTR17具有三个ARE。已在人PBMC中鉴定了Mda-7 mRNA(Ekmekcioglu，等人，2001)，且尽管以前未报导过MDA-7蛋白的细胞因子功能，但基于基因和蛋白序列的特征(NCBI数据库检索号XM_001405)已将MDA-7称为IL-24。

c.编码酶的核酸

治疗性核酸的其他实例包括编码酶的核酸。实例包括，但不限于，ACP去饱和酶、ACP羟化酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、ATPase、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、触酶、纤维素酶、环氧合酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、透明质酸合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、GTPase、解旋酶、半纤维素酶、透明质酸酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂酶、脂肪氧化酶、裂解酶、溶菌酶、果胶脂酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白水解酶、肽酶、支链淀粉酶(pullanase)、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶、报道基因、白细胞介素或细胞因子。然而，在本发明的某些实施方案中，本发明明确地不包括在上面或下面的段落中鉴定的一种或多种酶。

治疗性基因的其他实例包括编码下列酶的基因，所述酶是氨甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α1-抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨酶、VIII因子、因子IX、胱硫醚β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧化酶、H蛋白、T蛋白、门克斯病铜转运三磷酸腺苷酶、威尔逊氏病铜转运三磷酸腺苷酶、胞嘧啶脱氨酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、1-磷酸半乳糖尿苷酸转移酶、苯丙氨酸羟化酶、葡萄糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖基转移酶、HSV胸苷激酶、或人胸苷激酶。

本发明的治疗性核酸可编码过氧化物歧化酶(SOD)。以几种同工型存在的SOD是将超氧自由基解毒成过氧化氢的金属酶。两种同工型是细胞内的：在细胞质中表达的Cu/Zn-SOD和在线粒体中表达的Mn-SOD(Linchey和Fridovich，1997)。已证明Mn-SOD在用MnSODcDNA转染的造血肿瘤细胞系中增加对辐射的抗性(Suresh等人，1993)。已证明Cu/Zn-SOD的腺病毒递送保护免受乙醇诱导的肝损伤的伤害(Wheeler等人，2001)。此外在温暖的局部缺血-再灌注模型中，Mn-SOD和Cu/Zn-SOD两者的腺病毒介导的基因递送在保护免受氧化应激的伤害中具有同样功效(Wheeler等人，2001)。

d.编码激素的核酸

治疗性核酸也包括编码激素的核酸。实例包括，但不限于，生长激素、催乳素、胎盘催乳激素、促黄体激素、促卵泡激素、绒毛膜促性腺激素、促甲状腺激素、瘦素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素I、血管紧张素II、β-内啡肽、β-黑素细胞刺激激素、胆囊收缩素、内皮素I、神经节肽、抑胃肽、胰高血糖素、胰岛素、促脂解激素、后叶激素运载蛋白、生长抑素、降钙素、降钙素基因相关肽、β-降钙素基因相关肽、高钙血综合征恶性肿瘤因子(hypercalcemia of malignancy factor)、甲状旁腺激素相关蛋白、甲状旁腺激素相关蛋白、胰高血糖素样肽、胰抑素、胰肽、肽YY、PHM、促胰液素、肠道血管活性肽、催产素、血管加压素、加压催产素、enkephalinamide、metorphinamide、α-黑素细胞刺激激素、心房钠尿肽、支链淀粉、淀粉样P物质、促肾上腺皮质素释放激素、生长激素释放因子、黄体生成激素释放激素、神经肽Y、K物质、P物质和促甲状腺激素释放激素。

治疗性基因的其他实例包括编码存在于病原体中的抗原或参与自身免疫的免疫效应子的基因。这些基因可用于例如制剂中，所述制剂可用于传染性疾病和自身免疫性疾病的免疫治疗或免疫预防的免疫接种。

在本发明的另一个实施方案中，单独地或与治疗性基因一起使用报告基因。报告基因的实例包括，但不限于编码荧光蛋白例如gfp、rfp或bfp、酶蛋白如β-半乳糖苷酶或化学发光蛋白例如萤光素酶的基因。

“生物等效性”治疗性基因包括在“报告基因”的定义内。因此，与所述报告基因的氨基酸相同或功能上等效的具有大约70％至大约99％的氨基酸同源性的序列可以是作为生物学功能等效的序列，只要所述蛋白的生物活性得到保持。

e.编码抗原的核酸

此处所示的药物组合物可包括编码一种或多种抗原的核酸。例如，所述治疗性基因可编码存在于肿瘤、病原体中的抗原或参与自身免疫的免疫效应子。这些基因可用于例如可用于接种的制剂，所述接种用于瘤形成、传染性疾病和自身免疫性疾病的免疫治疗或免疫预防。

i.肿瘤抗原

在某些实施方案中，所述治疗性核酸编码肿瘤抗原。肿瘤抗原对于本领域技术人员来说是熟知的。实例包括，但不限于，由Dalgleish(2004)，Finn(2003)，以及Hellstrom和Helstrom(2003)描述的肿瘤抗原，所述参考资料各自在此以其全文引用作为参考。其他实例可在http://www.bioinfo.org.cn/hptaa/search.php(其明确地在此引用作为参考)中查到。

ii.微生物抗原类

在一些实施方案中，所述核酸编码微生物抗原。术语“微生物”包括病毒、细菌、微观真菌(microscopic fungi)、原生动物和其他微观寄生虫。“微生物抗原”是指当由抗原呈递细胞(APC)呈递在细胞表面上时诱导免疫应答的多肽。该反应可诱导细胞毒性T细胞反应或抗体的产生或两者。

微生物病原体可从其衍生的病毒的实例包括：人疱疹病毒(HHVs)-1至8；疱疹B病毒；HPV-16、18、31、33和45；肝炎病毒A、B、C、δ；脊髓灰质炎病毒；轮状病毒；流感病毒；慢病毒；HTLV-1；HTLV-2；马传染性贫血病病毒；东方马脑炎病毒；西方马脑炎病毒；委内瑞拉马脑炎病毒；立夫特山谷热病毒；西尼罗病毒；黄热病病毒；克里米亚-刚果出血热病毒；登革病毒；SARS冠状病毒；天花病毒；猴痘病毒等。

病毒微生物的实例包括，但不限于：逆转录病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、小RNA病毒科(picornaviridae)、披膜病毒科、弹状病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、本扬病毒科、沙粒病毒科、呼肠孤病毒科、多瘤病毒科、乳头瘤病毒科、疱疹病毒科和嗜肝DNA病毒科。

逆转录病毒科的实例包括慢病毒例如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、Visna、CAEV、BIV和EIAV。由慢病毒编码的基因可包括gag、pol、env、vif、vpr、vpu、nef、tat、vpx和rev。逆转录病毒的其他实例包括α逆转录病毒例如禽白血病病毒、鸟成髓细胞白血病病毒、禽肉瘤病毒、藤浪肉瘤病毒和劳斯肉瘤病毒。由α逆转录病毒编码的基因可包括gag、pol和env。逆转录病毒的其他实例包括β逆转录病毒例如南非绵羊逆转录病毒(jaagsiekte sheepretrovirus)、叶猴病毒(langur virus)、梅森-菲舍猴病毒、小鼠乳房肿瘤病毒、猿猴逆转录病毒1和猿猴逆转录病毒2。由β逆转录病毒编码的基因可包括gag、pol、pro和env。逆转录病毒的其他实例包括δ逆转录病毒例如HTLV-1、HTLV-2、牛白血病病毒和狒狒T细胞白血病病毒。由δ逆转录病毒编码的基因可包括gag、pol、env、tax和rex。逆转录病毒的其他实例包括泡沫病毒例如牛、猫、马、猿和人泡沫病毒。由泡沫病毒编码的基因可包括gag、pol、env、bel-1、bel-2和bet。

黄病毒的实例包括但不限于：丙型肝炎病毒、蚊媒黄热病病毒(mosquito borne yellow fever virus)、登革病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨莱溪谷脑炎病毒、西尼罗病毒、库京病毒、中欧蜱媒病毒(Central European tick borne virus)、远东蜱媒病毒(Far Eastern tick borne virus)、科萨努尔森林病毒、跳跃病病毒(louping III virus)、波瓦桑病毒、鄂木斯克出血热病毒、风疹病毒属(风疹病毒)和瘟病毒属(粘膜病病毒、猪瘟病毒、边境病病毒)。由黄病毒编码的基因包括从其产生所有黄病毒蛋白的黄病毒多蛋白(polyprotein)。编码黄病毒多蛋白的核酸序列可包含编码最终加工的黄病毒蛋白产物例如C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5的序列。

冠状病毒科的实例包括但不限于：人呼吸道冠状病毒(respiratory coronaviruse)例如SARS和牛冠状病毒。由冠状病毒编码的基因可包括pol、S、E、M和N。

小RNA病毒科的实例包括但不限于肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒、柯萨基病毒A组和B组、埃柯病毒(enteric cytopathic humanorphan(ECHO)viruses)、甲型肝炎病毒、猿猴肠道病毒、鼠脑脊髓炎(ME)病毒、鼠脊髓灰质炎病毒、牛肠道病毒、猪肠道病毒、心病毒属(脑炎心肌炎病毒(EMC)、门戈病毒)、鼻病毒属(人鼻病毒，包括至少113种亚型；其他鼻病毒)和口蹄疫病毒属(口蹄疫(FMDV)。由小RNA病毒科编码的基因可包括小RNA病毒多蛋白。编码所述小RNA病毒多蛋白的核酸可包含编码最终加工的小RNA病毒蛋白产物例如VPg、VP0、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D的序列。

披膜病毒科的实例包括但不限于α病毒属(东方马脑炎病毒、塞姆利基森林病毒、辛德比斯病毒、基孔肯雅病毒、阿尼昂尼昂病毒、罗斯河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎东方马脑炎病毒)。由披膜病毒科病毒编码的基因的实例可包括编码nsP1、nsP2、nsP3、nsP4、C、E1和E2的基因。

弹状病毒科的实例包括，但不限于：水泡性病毒属(VSV)、钱迪普拉病毒、Flanders-Hart Park病毒)和狂犬病毒属(狂犬病毒)。由弹状病毒科病毒编码的基因的实例可包括N、P、M、G和L。

线状病毒科的实例包括埃博拉病毒和马尔堡病毒。由线状病毒科病毒编码的基因的实例可包括NP、VP35、VP40、GP、VP35、VP24和L。

副粘病毒的实例包括，但不限于：副粘病毒属(副流感病毒1型、仙台病毒，、血细胞吸附病毒、副流感病毒2至5型、新城疫病毒、腮腺炎病毒)、麻疹病毒属(麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎病毒、温热病病毒、牛瘟麻疹病毒)、肺病毒属(呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)。由副粘病毒科病毒编码的基因的实例包括N、P/C/V、P/C/V/R、M、F、HN、L、V/P、NS1、NS2、SH和M2。

正粘病毒科的实例包括流感病毒。由正粘病毒科编码的基因的实例可包括PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2。

布亚病毒的实例包括，但不限于：bunyvirus属(布尼雅科病毒和相关病毒、加利福尼亚脑炎病毒群(California encephalitisgroup viruse))、白蛉病毒属(白蛉热西西里病毒、立夫特山谷热病毒)、内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒、内罗毕绵羊病病毒)和吴孔病毒属(吴孔病毒和相关病毒)。由布亚病毒编码的基因的实例可包括N、G1、G2和L。

沙粒病毒的实例包括，但不限于：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、拉沙热病毒、阿根廷出血热病毒、玻利维亚出血热病毒和委内瑞拉出血热病毒。由沙粒病毒编码的基因的实例可包括NP、GPC、L和Z。

呼肠病毒的实例包括但不限于：正呼肠孤病毒属(哺乳动物和禽类逆转录动物的多个血清型)、环状病毒属(蓝舌病毒、Eugenangee病毒、克麦罗沃病毒、非洲马病病毒和科罗拉多蜱热病毒)和轮状病毒属(人轮状病毒、内布拉斯加牛腹泻病毒、鼠类轮状病毒、猿猴轮状病毒、牛或羊轮状病毒、禽类轮状病毒)。由呼肠病毒编码的基因的实例可包括以其对应的蛋白产物命名的基因组片段，例如VP1、VP2、VP3、VP4、NSP1、NSP3、NSP2、VP7、NSP4、NSP5和NSP6。

多瘤病毒属病毒的实例包括，但不限于BK和JC病毒。由多瘤病毒属病毒编码的基因的实例可包括Agno、P2、VP3、VP2、VP1、大T和小t。

乳头瘤病毒科病毒的实例包括，但不限于：HPV-16和HPV-18。由乳头瘤病毒科病毒编码的基因的实例可包括E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、L1和L2。

疱疹病毒科的实例包括，但不限于：人疱疹病毒(HHV)1、HHV2、HHV3、HHV4、HHV5、HHV6、HHV7和HHV8。由疱疹病毒科病毒编码的基因的实例可包括γ₁34.5、ORF P、ORF0、α0、U_L1至U_L56、α4、α22、U_S2至U_S12、Ori_STU和LATU。

嗜肝DNA病毒属病毒的实例包括但不限于乙型肝炎病毒。由嗜肝DNA病毒编码的基因的实例可包括S、C、P和X。

可从其产生抗原的真菌的实例包括：夹膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)、曲霉(aspergillus)、放线菌属(actinomyces)、念珠菌属(candida)、链霉菌属(streptomyces)等等。

可从其产生抗原的原生动物或其他微生物的实例包括恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、间日疟原虫(plasmodium vivax)、卵形疟原虫(plasmodium ovale)、三日疟原虫(plasmodiummalaria，)等。来源于疟原虫种的基因可包括PyCSP、MSP1、MSP4/5、Pvs25和Pvs28。

可从其产生微生物抗原的细菌的实例包括：结核分支杆菌(mycobacterium tuberculosis)、鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis；)、普瓦基克氏立克次氏体(rickettsia prowazekii)、立克氏立克次氏体(rickettsia rickettsii；)、土拉弗朗西斯菌(francisella tularensis)、炭疽杆菌(bacillus anthracis)、幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori)、伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)、博氏疏螺旋体(borrelia burgdorferi)、变形链球菌(streptococcus mutans)等。来源于结核分支杆菌的基因可包括85A、85B、85C和ESAT-6。来源于鼠疫耶尔森氏菌的基因可包括lcrV和caf1。来源于立克次体种类的基因可包括ospA、invA、ompA、ompB、virB、cap、tlyA和tlyC。来源于土拉弗朗西斯菌的基因可包括二磷酸核苷激酶、异柠檬酸脱氢酶、Hfq和ClpB。来源于炭疽杆菌的基因可包括PA、BclA和LF。来源于幽门螺旋杆菌的基因可包括hpaA、UreB、hspA、hspB、hsp60、VacA和cagE。来源于伤寒沙门氏菌的基因可包括mpC、aroC、aroD、htrA和CS6。来源于博氏疏螺旋体的基因可包括OspC。

可从其产生微生物抗原的真菌的实例包括：组织胞浆菌属(hitoplasma)；ciccidis；粗球孢子菌(immitis)；曲霉菌(aspargillus)；放线菌(actinomyces)；芽生菌(blastomyces)；念珠菌(candida)、链霉菌(streptomyces)等。

可从其产生抗原的原生动物或微生物的实例包括：恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、间日疟原虫(plasmodium vivax)、卵形疟原虫(plasmodium ovale)、三日疟原虫(plasmodiummalariae)、giadaria intestinalis等。

所述微生物抗原可以是来源于变形链球菌的葡萄糖基转移酶。所述葡萄糖基转移酶介导变形链球菌在牙齿表面上积累。已证明葡萄糖基转移酶的失活导致老年龋的减少(Devulapalle和Mooser，2001).

来源于变形链球菌的抗原的另一个实例是PAc蛋白。PAc是参与变形链球菌的集落化的190-kDa的表面蛋白抗原，其介导该生物至牙表面的初始附着。近年来，已报导编码融合蛋白(所述融合蛋白由变形链球菌的葡萄糖基转移酶B编码的氨基酸残基1185-1475与由变形链球菌的PAc基因编码的氨基酸残基222-965组成)的质粒DNA的体内施用引起了抗这些各个基因产物的免疫应答(Guo等人，2004)。

f.编码抗体的核酸

此处提及的核酸可编码抗体。术语“抗体”用于指具有抗原结合区域的任何抗体样分子，其包括抗体片段例如Fab′、Fab、F(ab′)₂、单结构域抗体(DABs)、Fv、scFv(单链Fv)等。用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术在本领域内是熟知的。用于制备和表征抗体的方法在本领域内也是熟知的。如此处所用的，术语“抗体”广义上是指任何免疫结合剂例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。一般地，IgG和/或IgM是优选的，因为其是生理状况中最普遍的抗体且因为其在实验室环境中最容易制备。

在本发明的某些实施方案中，此处提及的药物组合物的核酸编码单链抗体。单链抗体描述于美国专利4,946,778和5,888,773，其各自在此引用作为参考。

g.核酶

在本发明的某些实施方案中，此处所示的药物组合物的核酸编码或包含核酶。尽管常规地将蛋白用于核酸的催化，但在该尝试中已开始使用另一类大分子。核酶是以位点专一性的方式切割核酸的RNA-蛋白复合物。核酶拥有特定的具有内切核酸酶活性的催化结构域(Kim和Cook，1987；Gerlach等人，1987；Forster和Symons，1987)。例如，许多核酶以高度的特异性(通常只切割寡核苷酸底物中的几个磷酸酯中的一个)加速磷酸酯转移反应(Cook等人，1981；Michel和Westhof，1990；Reinhold-Hurek和Shub，1992)。该特异性归因于在化学反应之前通过特异性的碱基配对相互作用将底物结合至核酶的内在引导序列(“IGS”)的要求。

核酶催化作用主要作为涉及核酸的序列特异性切割/连接反应的部分被观察到(Joyce，1989；Cook等人，1981)。例如，美国专利5,354,855报导某些核酶可用作内切核酸酶，该酶具有大于已知的核糖核酸酶的序列特异性和接近DNA限制性内切酶的序列特异性。因此，基因表达的序列特异性核酶介导的抑制可特别适合治疗性应用(Scanlon等人，1991；Sarver等人，1990)。近年来，报导了核酶在一些施用核酶的细胞系中引起遗传改变；被改变的基因包括癌基因H-ras、c-fos和HIV的基因。本工作的大部分涉及靶mRNA的修饰，该修饰基于被特定核酶切割的特定突变密码子。

h.RNAi

在本发明的某些实施方案中，此处所示的药物组合物的治疗性核酸是RNAi。RNA干扰(也称作“RNA介导的干扰”或RNAi)是通过其可减少或消除基因表达的机制。已观察到双链RNA(dsRNA)介导减少，该反应是多步骤过程。dsRNA激活转录后基因表达监视机制，该机制表现出保护细胞免受病毒感染和转座子活性的侵害的功能(Fire等人，1998；Grishok等人，2000；Ketting等人，1999；Lin和Avery等人，1999；Montgomery等人，1998；Sharp和Zamore，2000；Tabara等人，1999)。这些机制的激活将成熟的、dsRNA互补性mRNA靶向破坏。RNAi对于研究基因功能具有很大的实验优势。这些优势包括非常高的特异性、易于运动穿过细胞膜和长时间下调被靶向的基因(Fire等人，1998；Grishok等人，2000；Ketting等人，1999；Lin和Avery等人，1999；Montgomery等人，1998；Sharp等人，1999；Sharp和Zamore，2000；Tabara等人，1999)。此外，已显示dsRNA在广泛的系统中沉默基因，所述系统包括植物、原生动物、真菌、美丽线虫(C.elegans)、锥虫(Trypanasoma)、果蝇(Drosophila)和哺乳动物(Grishok等人，2000；Sharp等人，1999；Sharp和Zamore，2000；Elbashir等人，2001)。通常认为RNAi在转录后起作用，将RNA转录物靶向降解。似乎细胞核和细胞质RNA都可被靶向(Bosher和Labouesse，2000)。

RNAi领域内的技术人员理解存在其他类型的RNAi，包括但不限于可类似地用于本发明的微RNA(microRNA)。微RNA描述于Du和Zamore，2005，其明确地以其全文在此引用作为参考。

已知内切核糖核酸酶Dicer产生两种类型的调节基因表达的小调控RNA：小干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNAs)(Bernstein等人，2001；Grishok等人，2001；Hutvagner等人，2001；Ketting等人，2001；Knight和Bass，2001)。在动物中，siRNA指导将mRNA靶向断裂(Elbashir等人，2001)，而miRNA阻止靶mRNA翻译(Reinhart等人，2000；Brennecke等人，2003；Xu等人，2003)。最近的数据表明siRNA和miRNA都整合入相似的甚至完全相同的蛋白复合物中，且mRNA的破坏和翻译调控的至关重要的决定子是小RNA和其mRNA靶之间的序列互补性的程度(Hutvagner和Zamore，2002；Mourelatos等人，2002；Zeng等人，2002；Doench等人，2003；Saxena等人，2003)。许多已知的miRNA序列和其在基因组或染色体中的位置可在http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/help/summary. shtml中查到。

必须这样设计siRNA以使其在抑制目的基因的表达中是特异性的且是有效的。选择靶序列(即存在于目的基因中的、被所述siRNA导向降解机制的序列)的方法要避免可干扰siRNA的导向功能的序列，同时要包含对于所述基因是特异性的序列。一般地长度大约21至23个核苷酸的siRNA靶序列是最有效的。该长度反映由上述长得多的RNA的加工产生的降解产物的长度(Montgomery等人，1998).

主要通过直接的化学合成来制备siRNA；通过将更长的双链RNA暴露于果蝇胚胎裂解物以加工所述RNA来制备siRNA；或通过来源于S2细胞的体外系统制备siRNA。使用细胞裂解物或体外加工可进一步包括随后从裂解物分离短的、21-23个核苷酸siRNA等，这使得该方法有些烦琐和昂贵。通过制备两个单链RNA寡聚物然后使两条单链寡聚物退火形成双链RNA来进行化学合成。化学合成的方法多种多样。在美国专利5,889,136、4,415,723和4,458,066(此处明确地引用作为参考)和Wincott等人(1995)中提供了非限定性实例。

为改变其稳定性或提高其功效已提出对siRNA序列的几种其他修饰。有人提出具有二核苷酸突出端的合成的互补21聚体RNA(例如，19个互补的核苷酸+3′非互补二聚体)可提供抑制的最大水平。这些方案主要使用两个(2′-脱氧)胸腺嘧啶核苷酸作为二核苷酸突出端的序列。这些二核苷酸突出端通常写作dTdT以将其与整合入RNA的一般核苷酸区分开。文献已指出dT突出端的使用主要受减少化学合成的RNA的成本的需要驱动。也提出所述dTdT突出端可能比UU突出端更稳定，尽管可获得的数据显示与具有UU突出端的siRNA相比，dTdT突变端只有轻微(＜20％)的提高。

发现当化学合成的siRNA以25-100nM浓度存在于细胞培养物中时，其工作最佳，但大约100nM的浓度已在哺乳动物细胞中获得有效的表达抑制。siRNA在哺乳动物细胞培养中以大约100nM的浓度最为有效。然而，在几种情况下，已使用更低浓度的化学合成的siRNA(Caplen，等人，2000；Elbashir等人，2001)。

WO 99/32619和WO 01/68836提出用于siRNA的RNA可以是化学合成的或酶促合成的。这两个文件都在此以其全文引用作为参考。这些参考资料中涉及的酶促合成是通过使用和产生本领域内已知的表达构建体，通过细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)进行的。例如，参见美国专利5,795,715。所述构建体提供产生RNA的模板，所述RNA包含与靶基因的部分同一的核苷酸序列。由这些参考资料提供的同一的序列的长度至少为25个碱基，且长度可多至400或更多个碱基。该参考资料的重要方面是作者提出用在体内将长dsRNA转变成siRNA的内源核酸酶复合物将更长的dsRNA降解为21-25聚体的长度。其不描述或提供用于体外合成和使用转录的21-25聚体dsRNA的数据。在RNA干扰的用途中，化学和酶促合成的dsRNA的预期的性质没有区别。

类似地，WO 00/44914，在此引用作为参考，提出可酶促或通过部分/总地有机合成产生RNA的单链。优选地，从DNA模板(优选地克隆的cDNA模板)的PCR^TM产物酶促合成单链RNA，所述RNA产物是所述cDNA的模板转录物，其可包含数百个核苷酸。WO 01/36646(此处引用作为参考)对合成siRNA的方式没有限制，只要所述RNA可使用人工和/或自动的方法在体外或体内合成。该参考资料也提出，体外合成可以是化学或酶促的，例如使用克隆的RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)以转录内源DNA(或cDNA)模板或两者的混合物。此外，在用于RNA干扰的想要的性质上，化学或酶促合成的siRNA之间没有区别。

美国专利5,795,715报导了在单个反应混合物中同时转录两个互补DNA序列，其中所述两个转录物立即杂交。使用的模板优选地在40和100个碱基对之间，且其在各末端配备启动子序列。优选地将所述模板附着至固体表面。在用RNA聚合酶转录后，所得的dsRNA片段可用于检测和/或测定核酸靶序列。

美国专利申请20050203047报导了通过RNA干扰调控基因表达的方法，通过将siRNA或miRNA序列整合入转运RNA(tRNA)编码序列进行所述RNA干扰。可将包含siRNA或miRNA序列的tRNA整合入核酸表达构建体，这样该序列可从表达的tRNA中被剪接出来。可将所述siRNA或miRNA序列置于与未加工的tRNA转录物连接的内含子中，或可置于所述tRNA转录物的任一末端。

i.其他治疗性核酸

治疗性核酸的其他实例包括包含CpG结构域的寡核苷酸(“CpG寡核苷酸”)。已证明细菌DNA在体外具有对外周血单核细胞的直接免疫刺激效应。(Messina等人，1991)。这些效应包括B细胞的增殖和增加的免疫球蛋白Ig的分泌。(Krieg等人，1995)此外，这些效应包括通过激活单核细胞、巨噬细胞和树突细胞分泌Th1细胞因子(包括IL-12)。(Klinman，等人，1996；Halpern等人，1996；Cowdery等人，1996)所述分泌的Th1细胞因子刺激天然杀伤(NK)细胞分泌γ干扰素和具有增加的裂解活性。(Klinman等人，1996，同上；Cowdery等人，1996，同上；Yamamoto等人，1992)这些刺激作用通常是未甲基化的CpG二核苷酸在特定序列(CpG-S)中存在的结果(Krieg等人，1995)。

通过CpG-S序列进行的B细胞激活是T细胞非依赖性的和抗原非特异性的。然而，CpG-S序列与通过B细胞抗原受体递送的信号具有很强的协同效应。与B细胞抗原受体的该相互作用不促进抗原特异性免疫应答，表明需要CpG序列作为免疫刺激佐剂。

CpG-S序列包含胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸且大小通常在2至100个碱基对之间。共有CpG-S序列由式：⁵′X₁X₂CGX₃X₄ ³′表示，其中X₁、X₂、X₃和X₄是核苷酸且GCG三核苷酸序列不存于5′和3′末端或其附近。CpG-S序列的实例包括GACGTT、AGCGTT、AACGCT、GTCGTT和AACGAT。

相反地，一些表现为免疫中和的微生物例如腺病毒血清2型包含CpG序列。在这些病毒中，发现大多数CpG序列以成簇的正向重复形式存在或在5′侧上具有C或在3′侧上具有G。似乎这样的CpG序列是免疫中和性的(CpG-N)，因为其在体外通过CpG-S序列阻止Th1型免疫激活作用。同样，当CpG-N和CpG-S序列与抗原一起施用，与单独使用CpG-S序列的情况相比，抗原特异性免疫应答被减弱。当在体内将单独的CpG-N序列与抗原一起施用时，Th2样抗原特异性免疫应答发生。

GpG-N序列也包含胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸且在长度上通常为2至100个碱基对之间。共有CpG-N序列由式：⁵′GCGX_nGCG³′表示，其中X是任意核苷酸，n在0-50的范围内变动。

因此，可操作核酸构建体中的核苷酸序列以增加CpG-S序列的数目。也可操作这些构建体以减少CpG-N序列的数目。例如，本领域技术人员可选择使用定点诱变来产生具有一个或多个CpG基序的想要的核酸序列。可选择地，可合成特定的CpG序列并将其插入核酸构建体。在美国专利5,889,136、4,415,723和4,458,066(明确地在此引用作为参考)中提供了非限定性实例。

美国专利6,194,388和美国专利6,207,646提出，可稳定用于免疫刺激的GpG寡核苷酸以提供对降解的抗性。这两份资料都以其全文在此引用作为参考。通过磷酸主链修饰来进行这些参考资料所描述的稳定方法。优选的稳定的寡核苷酸具有硫代磷酸酯修饰的主链。硫代磷酸酯寡核苷酸的药物动力学在啮齿目动物中显示48小时的全身性半衰期(Agrawal等人，1991)。可使用自动化技术利用亚磷酰胺或H磷酸化学药品合成这些硫代磷酸酯。可如美国专利4,469,863中所述制备芳基和烷基磷酸酯；其中带电荷的氧部分被烷基化的烷基磷酸三酯描述于美国专利5,023,243中，所述参考资料各自明确地在此以其全文引用作为参考。也描述了用于进行DNA主链修饰和替代的其他方法(Uhlmann，E.和Peyman，A.，1990，和Goodchild，1990)。

美国专利6,206,646报导了，已发现包含未甲基化CpG、具有硫代磷酸酯主链的核酸分子优先地激活B细胞的活性，而包含未甲基化CpG、具有磷酸二酯主链的核酸分子经发现优先地激活巨噬细胞、树突细胞、单核细胞和NK细胞。所述修饰优先地在核酸分子的5′和/或3′末端或其附近发生。

美国专利6,339,068报导了，可通过除去CpG-N序列改进并通过加入CpG-S序列进一步改进用于免疫刺激的DNA载体。此外，对于高水平和长效水平的表达，最优化的载体应当优选地包含启动子/增强子，所述启动子/增强子不被免疫刺激性CpG序列诱导的细胞因子下调。也报导了产生这样的基于质粒的DNA载体的方法，该载体编码乙型肝炎表面抗原基因。然而，该参考资料显示为了获得免疫刺激作用，必须同时或在相同的位置(即在编码抗原的质粒上)施用CpG-S序列。然而，其未显示所述修饰必须在抗原序列自身范围之内。

美国专利6,399,068也报导了NFκB是CpG效应的介导者。例如，在用CpG序列处理B细胞或单核细胞的15分钟内，NFκB结合活性的水平增加，而用未包含这些序列的DNA处理的相同细胞类型显示变化。所述参考资料也报导了NFκB激活的抑制阻止了通过CpG序列进行的淋巴细胞的刺激。此外，CpG DNA导致快速诱导活性氧簇B细胞和单核细胞的产生，这可通过Royall和Ischiropoulos，1993中描述的灵敏的荧光染料二氢核黄素123检测。此外报导了在用CpG DNA处理B细胞后产生活性氧簇要求所述DNA在内体中进行酸化步骤。基于使用5′放射性标记的具有或不具有CpG基序的寡核苷酸的电泳迁移率测定法(EMSA)，发现似乎代表对具有CpG序列的单链寡核苷酸特异性结合的蛋白的条带。据报导如果加入包含NFκB结合位点的寡核苷酸，该结合被阻止。

本发明的组合物和方法也包括未在此处明确地提及的在疾病或健康相关性状况的治疗或预防中是有益的任何其他核酸。此处所示的治疗性核酸还可包含或编码报告基因的序列。在下面更详细地描述报告基因的序列。

3.诊断性核酸

本发明的药物组合物可包含作为诊断性核酸的核酸。“诊断性核酸”是可用于诊断疾病或健康相关性状况的核酸。编码一种或多种报告蛋白的核酸序列也包括在“诊断性核酸”的定义中。“报告蛋白”是指当存在于细胞或组织中时可检测的和可与存在于细胞中的其他遗传序列或编码的多肽区分开的氨基酸序列。在一些实施方案中，治疗性基因可融合至报告基因或以分开的蛋白产生。例如，可通过共转染(共感染)在分开的递送载体中通过分开的启动子或通过相同的递送载体中的分开的启动子诱导目的基因和报告基因。另外，可通过例如内部核糖体进入位点或双向启动子将两个基因连接至相同的启动子。使用这些技术，使目的基因和报告基因的表达关联。因此，人们可精确估计目的基因表达的位置、量和持续时间。目的基因可以是例如抗癌基因例如肿瘤抑制基因或促凋亡基因(pro-apoptotic gene)。

因为可用报告基因转染细胞，因此报告基因可用于跟踪细胞运输。例如，在体外，可用报告基因转染特定的细胞，然后将其返回至动物以估计定位(homing)。在多发性硬化症的实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，Costa等人(2001)转移了经转导以表达IL-12p40和萤光素酶的髓鞘碱性蛋白特异性CD4+T细胞。在体内，萤光素酶被用于证明至中枢神经系统的运输。此外，IL-12 p40抑制炎症。在另一个系统中，使用正电子成像术(PET)，Koehne等人(2003)在体内证明了表达单纯疱疹病毒-1胸苷激酶(HSV-TK)的EB病毒(EBV)特异性T细胞选择性地运输至表达T细胞的限制性HLA等位基因的EBV+肿瘤。此外，这些T细胞保持其消除被靶向的肿瘤的能力。通过使用连续成像，Dubey等人(2003)证明表达HSV-TK的细胞至肿瘤的特异性定位由鼠类肉瘤病毒/莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MSV/M-MuLV)诱导。组织特异性启动子也可用于估量分化，例如干细胞分化或与肝细胞的融合以及吸收分化的细胞的特征例如II型肺细胞中的表面活性剂启动子(surfactant promoter)的激活。

优选地，报告序列编码通过其存在、其与可检测部分的结合或通过其导致可检测的信号产生的活性可容易地被检测的蛋白。在某些方面，可检测部分可包括放射性核素、荧光基团、发光基团、微粒、微球、酶、酶底物、多肽、多核苷酸、纳米颗粒和/或纳米球，所有这些可偶联至识别报告序列和/或与其相互作用的抗体或配体。

在各种实施方案中，本发明的核酸序列包含报告核酸序列或编码产生可检测的多肽的产物。报告蛋白能够直接或间接地产生可检测信号。一般地，尽管不是必需地，报告基因包括不由细胞产生的核酸序列和/或编码不由细胞产生的可检测多肽。已描述了许多报告基因，且一些报告基因可商购获得用于基因调控的研究(例如，Alam和Cook，1990，其公开内容在此引用作为参考)。可被检测的信号包括，但不限于颜色、荧光、发光、同位素或放射性同位素信号、细胞表面标记、细胞存活力、细胞营养需求的解除、细胞生长和药物抗性。报告序列包括，但不限于DNA序列，所述DNA序列编码β内酰胺酶、β半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶，膜结合蛋白，包括，例如，G蛋白偶联受体(GPCRs)、生长抑素受体、CD2、CD4、CD8、流感病毒血细胞凝集素蛋白(influenza hemagglutininprotein)、共输送体(例如NIS)和本领域内熟知的其他蛋白(存在或可通过常规的方法产生的针对所述蛋白的高亲和力的抗体或配体)和包含恰当地融合至来自(除其他以外)红细胞凝集素(hemagglutinin)或Myc的抗原标签结构域的膜结合蛋白的融合蛋白。Kundra等人，2002，演示了使用生物扰动研究和γ射线照相成像在体外和体内非侵入性监控生长抑素受体2型嵌合基因的转移。

在一些实施方案中，报告序列编码荧光蛋白。可根据本发明使用的荧光蛋白的实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、Renilla Reniformis绿色荧光蛋白、GFPmut2、GFPuv4、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)、增强的青色荧光蛋白(ECFP)、增强的蓝色荧光蛋白(EBFP)、来源于圆盘拟珊瑚海葵(discosoma)的柠檬色和红色荧光蛋白(dsRED)。

在各种实施方案中，与诊断性核酸的基线转录水平相比，至少一种报告序列的表达的想要的水平在报告序列的表达水平中增加、减少或无改变。在特定的实施方案中，与报告序列的基线转录水平相比，报告序列中的一个序列的想要的表达水平在报告序列的表达水平中是增加的。

在各种实施方案中，报告序列编码可被独立地、同时地或独立地和同时地分析的唯一的可检测的蛋白。在其他实施方案中，宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。示例性真核细胞包括酵母和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞包括展示病理表型的人细胞和各种细胞例如癌细胞。

例如，一些报告蛋白在细胞中诱导可容易地在可见光和/或紫外光下观察到的颜色改变。所述报告蛋白可以是本领域技术人员已知的任何报告蛋白。实例包括gfp、rfp、bfp和萤光素酶。

编码报告蛋白的核酸包括DNA、cRNA、mRNA和编码各自报告氨基酸序列的活性片段的其亚序列以及包含这些序列的载体。

报告蛋白的成像的示例性方法包括γ射线照相成像、CT、MRI、PET、SPECT、光学成像和超声。在一些实施方案中，诊断性核酸适于使用不止一种方式例如CT和MRI、PET和SPECT等进行成像。

在Kumar，2005；Kundra等人，2005；和Kundra等人，2002中列出了与报告蛋白在成像中的实例相关的其他信息，所述参考资料各自在此以其全文引用作为参考。

4.反义构建体

在此处所示的一些实施方案中，核酸编码反义构建体。反义方法学利用核酸倾向于与“互补”序列配对的事实。对于互补，其是指多核苷酸是能够根据标准的Watson-Crick互补法则进行碱基配对的多核苷酸。即，更大嘌呤将与更小的嘧啶碱基配对，从而形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对的组合(G:C)和在DNA的情况下腺嘌呤与胸腺嘧啶配对的组合(A:T)或在RNA的情况下腺嘌呤与尿嘧啶配对的组合(A:U)。在杂交序列中包含较不常见的碱基例如次黄嘌呤核苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤和其他碱基不干扰配对。

将双链(ds)DNA靶向多核苷酸导致三螺旋的形成；靶向RNA将导致双螺旋的形成。反义多核苷酸，当被导入靶细胞时，特异性地结合其靶核苷酸且干扰转录、RNA加工、转运、翻译和/或稳定性。反义RNA构建体或编码这些反义RNA的DNA，可在宿主细胞内(体外的宿主细胞或体内的宿主细胞例如宿主动物包括人受试者内的细胞)，例如用于抑制基因转录或翻译或抑制两者。

可设计反义构建体使之结合基因的启动子和其他控制区域、外显子、内含子或甚至外显子-内含子边界。最有效的反义构建体将包括与内含子/外显子剪接点互补的区域。因此，提出优选的实施方案包括具有与内含子-外显子剪接点的50-200个碱基内的区域互补的反义构建体。已观察到一些外显子序列可包含在构建体中而不会严重地影响其靶向选择性。包含的外来材料的量将依赖于所用的特定外显子和内含子序列而变化。可只通过体外检测构建体以确定正常的细胞功能是否受影响或具有互补序列的相关基因的表达是否受到影响就能容易地检测是否包含太多的外显子DNA。

如上面所提到的，“互补”或“反义”是指基本上在其整个长度上互补的多核苷酸序列并且具有非常少的碱基错配。例如，当长度为15个碱基的序列在13或14个位点上具有互补的核苷酸，那么其可被称为互补的。天然地，完全互补的序列是在其整个长度上完全互补的且不具有碱基错配的序列。也涉及具有较低程度的同源性的其他序列。例如，可设计具有有限的高同源性区域，同时也包含非同源区域的反义构建体(例如，核酶；参见下面)。这些分子，尽管具有低于50％的同源性，可在适当的条件下结合靶序列。

将基因组DNA的部分与cDNA或合成的序列组合以产生特定的结构可以是有利的。例如，当在最终的构建体中想要内含子时，需要使用基因组克隆。cDNA或合成的多核苷酸可为构建体的其余部分提供更方便的限制性位点，从而可用于序列的其他部分。

B.表达盒

1.概述

在本发明的某些实施方案中，此处提及的药物组合物和方法涉及治疗性核酸或诊断性核酸，其中所述核酸包含在“表达盒”中。在整个本说明书中，术语“表达盒”包括任何类型的包含编码基因产物的核酸的基因构建体，在所述构建体中，所述核酸编码序列的部分或全部能够被转录。

2.启动子和增强子

为了使表达盒实现转录物的表达，编码诊断性基因或治疗性基因的核酸在启动子的转录控制之下。“启动子”是控制序列，该序列是控制转录的起始和速率的核酸序列区域。其可包含调控蛋白和分子例如RNA聚合酶和其他转录因子可结合的基因元件。术语“有效地置于”、“有效地连接”、“在......控制下”和“在转录控制下”是指启动子相对于核酸序列处于正确的功能性位置和/或方向，从而控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可以与或可以不与“增强子”一起使用，所述增强子是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。

本领域技术人员已知的在受试者的任何细胞中具有活性的任何启动子被认为是可用于本发明的方法和组合物中的启动子。如其他地方所描述的，受试者可以是任何受试者，包括人和其他哺乳动物，例如小鼠或实验室动物。本领域技术人员熟悉可用于本方法和组合物的许多种类的启动子。在某些实施方案中，例如，所述启动子是组成型启动子、诱导型启动子或阻抑型启动子。启动子也可以是组织选择性启动子。此处定义的组织选择性启动子是指与其他组织类型相比在某些组织类型中相对更具活性的任何启动子。因此，例如，肝特异性启动子可以是与身体中的其他组织相比在肝中更具活性的启动子。一种类型的组织选择性启动子是肿瘤选择性启动子。此处定义的肿瘤选择性启动子是指与其他组织类型相比在肿瘤组织中更具活性的启动子。可能在其他组织类型中存在一些功能，但与其他组织类型相比，所述启动子在肿瘤组织中相对更具活性。肿瘤选择性启动子的实例包括hTERT启动子、CEA启动子、PSA启动子、probasin启动子、ARR2PB启动子和AFP启动子。

启动子可以是在特定的靶细胞具有活性的启动子。例如，当靶细胞是角质形成细胞时，启动子是在角质形成细胞中具有活性的启动子。类似的，当细胞是上皮细胞、皮肤细胞、粘膜细胞或可通过乳头瘤病毒进行转化的任何其他细胞时，用于所述实施方案的启动子是在该特定的细胞类型中具有活性的启动子。

启动子可以是天然地与基因或序列结合的启动子，这可通过分离位于编码区段和/或外显子的上游的5’非编码序列获得。这样的启动子可被称为“内源的”。类似地，增强子可以是天然地与核酸序列结合、位于该序列的下游或上游的增强子。可选择地，可通过将编码核酸区段置于重组的或异源的启动子的控制之下获得某些有利方面，所述启动子是指通常不与其天然环境中的核酸结合的启动子。重组增强子或异源增强子也指通常不与其天然环境中的核酸序列结合的增强子。这些启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子和从任何其他原核细胞、病毒或真核细胞分离的启动子或增强子以及非“天然发生的”即包含不同转录调控区域的不同元件和/或改变表达的突变的启动子或增强子。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列外，还可使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCR^TM)产生与此处公开的组合物相关的序列(参见美国专利4,683,202和美国专利5,928,906，各自在此引用作为参考)。此外，也可使用在非细胞核细胞器例如线粒体等内指导序列的转录和/或表达的控制序列。

自然地，使用有效地指导DNA片段在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中表达的启动子和/或增强子是非常重要的。分子生物学领域内的技术人员一般知道用于蛋白表达的启动子、增强子和细胞类型组合，例如，参见Sambrook等人(2001)，在此引用作为参考。使用的启动子可以是组成型、组织特异性、诱导型和/或在合适的条件下使用以指导导入的DNA片段的高水平表达的启动子，例如在重组蛋白和/或肽的大规模生产中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。

用于控制目的核酸的表达的特定启动子据认为不是至关重要的，只要其能够在被靶向的细胞中以足够的水平表达多核苷酸。因此，当人细胞被靶向时，优选地将多核苷酸编码区紧邻能够在人细胞中表达的启动子并在其控制之下。一般说来，这样的启动子包括人或病毒的启动子。

在各种实施方案中，可使用人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子和劳斯肉瘤病毒长末端重复。也涉及本领域内熟和的获得多核苷酸的表达的其他病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子的用途，只要所述表达水平足以产生生长抑制效果。

通过使用具有熟知的特性的启动子，可最优化转染后多核苷酸的表达水平和模式。例如，在特定的细胞中具有活性的启动子的选择，例如酪氨酸(黑色素瘤)、甲胎蛋白和白蛋白(肝肿瘤)、CC10(肺肿瘤)和前列腺特异性抗原(前列腺肿瘤)启动子将允许此处所示的治疗性核酸的组织特异性表达。表2列出了可在本发明的背景中用于调节抗癌基因的表达的启动子/元件的其他实例。该列表未穷举所有可能的启动子和增强子元件，但只是作为其的示例。

增强子最初作为增加从位于相同的DNA分子的远距离位点上的启动子的转录的基因元件被发现的。在较大距离上发挥作用的该能力在原核转录调控的经典研究中具有极少的先例。随后的工作显示具有增强子活性的DNA区域组织得非常象启动子。即，其由许多单个的元件组成，各个元件结合至一个或多个转录蛋白。

增强子与启动子之间的基本区别是可操作性。增强子区域作为整体必须能够以一定距离刺激转录；启动子区域或其组成元件则不一定要这样。在另一方面，启动子必须具有一个或多个在特定的位点和以特定的方向指导RNA合成起始的元件，而增强子缺少这些特异性。启动子和增强子常常交叠和相邻，通常似乎具有非常相似的模块组织。

此外，任何启动子/增强子组合(按照真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动诊断或治疗性基因的表达。T3、T7或SP6细胞质表达系统是另一个可能的实施方案。真核细胞可支持来自某些噬菌体启动子的细胞质转录，如果作为递送复合物的部分或作为另外的表达载体提供合适的噬菌体聚合酶。

响应特定的生理信号而被调节的启动子的其他选择可允许构建体的诱导型表达。例如，将多核苷酸置于人PAI-1启动子的控制之下，可通过肿瘤坏死因子诱导表达。表3提供了诱导型元件的实例，所述元件是可响应特定的刺激而被激活的核酸序列的区域。

3.报告基因

在本发明的某些实施方案中，可通过将报告基因包含在表达载体中在体外或体内鉴定表达盒的递送。所述报告基因将对转染的细胞产生可鉴定的改变，从而允许容易地鉴定表达。通常药物标记有助于转化子的克隆和选择。可选择地，可使用酶例如β-半乳糖苷酶(β-gal)单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)(真核生物)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)(原核生物)。也涉及荧光和化学发光标记。也可使用免疫学标记。所使用的可选择报告基因据认为不是非常重要的，只要其能够和治疗性核酸一起表达。可选择报告基因的其他实例对于本领域技术人员来说是熟知的。

4.起始信号

为了编码序列的有效翻译也可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或相邻的序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域技术人员可容易地确定该信号且提供必需的信号。众所周知，起始密码子必须与想要的编码序列的读框“符合读框”以确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可通过包含合适的转录增强子元件来增强表达的功效。

5.IRES

在本发明的某些实施方案中，内部核糖体进入位点(IRES)元件用于建立多基因或多顺反子信使RNA。IRES元件能够绕过5’甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模式并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已描述了来自小RNA病毒科的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌)的IRES(Pelletier和Sonenberg，1988)和来自哺乳动物信使RNA的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。可将IRES元件连接至异源可读框。可一起转录多个可读框，各可读框被IRES分隔，产生了多顺反子信使RNA。依靠IRES元件，核糖体可接近各可读框进行有效翻译。可使用单个启动子/增强子转录单个信使RNA来有效地表达多个基因(参见美国专利5,925,565和5,935,819)。本领域技术人员熟悉I RES在基因治疗中的应用。

6.多克隆位点

表达盒可包含多克隆位点(MCS)，所述多克隆位点是包含多个限制性酶切位点的核酸区域，所述位点的任一位点可与标准的重组技术一起使用以降解载体。参见Carbonelli等人(1999)；Levenson等人(1998)；Cocea(1997)。“限制性酶降解”是指用只在核酸分子的特定位置起作用的酶对核酸分子进行的催化切割。许多这些限制性酶是可商购获得的。本领域技术人员广泛地理解这些酶的用途。经常地，使用限制性内切酶线性化或片段化载体，所述酶在MCS内进行切割以使外源序列能够被连接至所述载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段互相之间可以连续或不连续。涉及限制性内切酶和连接反应的技术对重组技术学领域内的技术人员来说是熟知的。

大部分转录的真核生物RNA分子将进行RNA剪接以从原始转录物中除去内含子。包含基因组真核生物序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保用于蛋白表达的转录物的正确加工(参见Chandler等人，1997)。

7.多腺苷酸化信号

在表达中，通常包括多腺苷酸化信号以进行转录物的正确多腺苷酸化。多腺苷酸化信号的本质据信对于本发明的成功实践不是至关重要的，和/或可使用任何这样的序列。优选的实施方案包括在各种靶细胞中方便的和/或已知良好地发挥功能的SV40多腺苷酸化信号和/或牛生长激素多腺苷酸信号。也被当作表达盒的元件是转录终止位点。这些元件可用于增强信使RNA的水平和/或使从表达盒进入其他序列的通读减少至最小。

8.其他表达盒组件

在本发明的某些实施方案中，表达盒包含病毒或来源于病毒基因组的经基因工程改造的构建体。某些病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞和在某些情况下整合入宿主细胞染色体的能力已使其成为用于将基因转移入哺乳动物细胞的具有吸收力的候选者。然而，因为已证明裸露DNA的直接吸收以及DNA复合物的受体介导的吸收，表达载体可以不是病毒，相反地，可以是能够支持编码的基因在哺乳动物细胞表达的任何质粒、粘粒或噬菌体构建体例如pUC或Bluescript^TM质粒系列。

为了在宿主细胞中扩增载体，其可包含一个或多个复制起始位点(通常称“ori”)，其是在其上起始复制的特定核酸序列。可选择地，如果宿主细胞是酵母，则可使用自主复制序列(ARS)。

在本发明的某些实施方案中，可通过将报告基因包含在表达载体中在体外或体内鉴定受处理的细胞。这些报告基因给细胞提供可鉴定的变化，从而允许容易地鉴定包含表达载体的细胞。一般地，可选择的报告基因是提供允许进行选择的特性的基因。阳性的可选择报告基因是其中所述报告基因的存在允许其的选择的基因，而阴性可选择报告基因是其中其存在阻止其选择的基因。阳性可选择标记的实例是药物抗性标记。

通常包含药物选择标记有助于转化子的克隆和鉴定，例如提供对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标记。除了提供表型的标记(所述表型允许基于互补的条件分辨转化子)外，也可使用其他类型的报告蛋白，包括可筛选的报告蛋白例如GFP或萤光素酶。可选择地，可使用可筛选的酶例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也已知使用免疫报告基因(可能与FACS分析结合使用)的方法。使用的标记据认为不是非常重要的，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达。可选择和可筛选的报告基因的其他实例对于本领域技术人员是熟知的。

在本发明的某些实施方案中，可将报告基因有效地连接至组织特异性启动子以使报告基因产物例如GFP只在想要的组织类型的细胞中表达。例如，可将gfp报告基因有效地连接至复制选择性腺病毒载体内的hTERT启动子，从而通过端粒酶特异性GFP表达检测过度增生性病变(Umeoka等人，2004.)。

C.病毒载体

病毒载体是可将遗传物质从一个位置转移至另一个位置例如从使用的位点至目的靶细胞的病毒。在本发明的某些实施方案中，此处所示的组合物的核酸是“裸露”的核酸序列，该核酸序列不包含在病毒载体或递送试剂例如脂质或脂质体中。然而在本发明的其他实施方案中，所述核酸包含在病毒载体中。本领域技术人员熟悉可获得的用作用于将基因递送至目的靶细胞的载体的各种类型的病毒。这些病毒的每一种在本发明中用作载体。在下面描述示例性载体。

1.病毒载体

“病毒载体”包括包含病毒序列的构建体，所述序列足以(a)支持包含治疗性核酸序列的表达盒的包装和(b)足以最终表达已被克隆在其中的重组基因构建体。

a.腺病毒载体

本发明的药物组合物和方法可涉及包含在腺病毒载体中的治疗性核酸的表达构建体，所述腺病毒载体用于递送所述核酸。尽管已知腺病毒载体具有低的整合入基因组DNA的能力，但该特征被由这些载体提供的基因转移的高效率弥补。

腺病毒是目前在临床情况中最常使用的用于基因转移的载体。这些病毒的有利方面是其在将基因递送至不分裂和分裂的细胞中都是有效的且可大量产生。在针对癌症的许多临床试验中，局部瘤内注射已用于将载体导入疾病的位点，因为目前的载体不具有用于优先递送至肿瘤的机制。体内实验已证明腺病毒载体的施用全身性地导致口腔粘膜中的表达(Clayman等人，1995)。Ad-βgal和Ad-p53-FLAG在organotypic raft culture上的局部施用已证明通过多层细胞层的有效的基因转导和深入的细胞层穿透作用(Eicher等人，1996)。因此，使用腺病毒载体的基因转移策略在处于涉及p53的基因改变的病变和恶性肿瘤风险中的患者中是潜在可行的。

所述载体包括腺病毒的基因工程改造形式。基因组织或腺病毒的知识(腺病毒为36kb，线性双链DNA病毒)允许用多至7kb的外源序列取代大片段的腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，因为腺病毒可以附加体的方式复制腺病毒DNA而无潜在的遗传毒性。同样，腺病毒是结构稳定的，且在大量扩增后未检测到基因组重排。

因为其中等大小的基因组、易操作、高滴度、广泛的靶细胞范围和高感染性，腺病毒特别适合用作基因转移载体。病毒基因组的两个末端都包含100-200个碱基对的反向重复序列(ITRs)，该序列是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区域包含被病毒DNA的复制分开的不同的转录单位。E1区域(E1A和E1B)编码负责病毒基因和少数细胞基因的转录调控的蛋白。E2区域(E2A和E2B)的表达导致用于病毒DNA复制的蛋白的合成。这些蛋白参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(shut-off)(Renan，1990)。晚期基因的产物，包括大多数病毒衣壳蛋白，只在由主要晚期启动子(MLP)产生的单个原始转录物的有效加工后表达。MLP(位于16.8m.u.)在感染的晚期阶段是特别有效的，且由该启动子产生的所有mRNA都具有5′-三联前导序列(TPL)，该序列使其成为优选的用于翻译的mRNA。

在目前的系统中，从穿梭载体和前病毒载体之间的同源重组产生重组腺病毒。由于两种前病毒载体之间的可能的重组的原因，可从该过程产生野生型腺病毒。因此，从单个斑中分离病毒的单个克隆和检查其基因组结构是至关重要的。

目前的腺病毒载体(其为复制缺陷型)的产生和繁殖依赖于称为293的独特的辅助细胞系，该细胞系使用Ad 5DNA片段从人胚肾细胞转化而来并组成型表达E1蛋白(Graham等人，1977)。因为E3区域对于腺病毒基因是不重要的(Jones和Shenk，1978)，因此目前的腺病毒载体，在293细胞的帮助下，在E1、D3或两个区域上都携带外源DNA(Graham和Prevec，1991)。在自然界中，腺病毒可包装大约105％的野生型基因组(Ghosh-Choudhury等人，1987)，提供了大约2kb额外的DNA的容量。与大约5.5kb的在E1和E3区域中可替换的DNA组合，现有腺病毒载体的最大容量在7.5kb之下，或大约为载体的总长度的15％。超过80％的腺病毒基因组保留在载体主链中。

辅助细胞系可来源于人细胞例如人胚肾细胞、肌细胞、造血细胞或其他人胚间充质细胞或上皮细胞。可选择地，辅助细胞可来源于允许人腺病毒的其他哺乳动物种类的细胞。这些细胞包括，例如，Vero细胞或其他猴胚间充质细胞或上皮细胞。如上所述，优选的辅助细胞系是293。

Racher等人(1995)已公开了用于培养293细胞和繁殖腺病毒的改进的方法。在一种形式中，通过将单个细胞接种入1升装有100-200ml培养基的硅化处理的旋转培养瓶(Techne，Cambridge，UK)中来培养天然的细胞团块。在40rpm下进行搅拌后，用台盼蓝评估细胞的存活力。在另一种形式中，如下使用Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)。向250ml Erlenmeyer烧瓶中的载体(50ml)中加入重悬浮于5ml培养基中的细胞接种物，然后静置，偶尔搅拌，进行1至4小时。然后用50ml新配制的培养基替换培养基，然后开始振荡。对于病毒生产，允许细胞生长至大约80％的汇合，此后替换培养基(至25％的终体积)，加入MOI为0.05的腺病毒。将培养物静置过夜，之后将体积增加至100％并开始振荡，再进行72小时。

所述腺病毒载体可以是复制缺陷型，或至少是条件缺陷型，腺病毒载体的性质据认为对于本发明的成功实践不是至关重要的。腺病毒可以是已知的42种不同的血清型或亚群A-F中的任一种。为获得用于本发明的条件复制缺陷型腺病毒载体，亚群C的腺病毒5型是优选的起始材料。这是因为腺病毒5型是人腺病毒，关于该病毒的大量生物化学和遗传学信息都是已知的，且其历史上一直用于大多数使用腺病毒作为载体的构建体。

如上所述，本发明的一般载体是复制缺陷型且不具有腺病毒E1区域。因此，在已从其除去E1编码序列的位置上导入转化构建体是最方便的。然而，腺病毒序列内构建体插入的位置对于本发明不是至关重要的。也可将编码目的基因的多核苷酸插入如由Karlsson等人(1986)描述的E3置换型载体的缺失的E3区域位置，或其中辅助细胞系或辅助病毒能互补E4缺陷的E4区域中。

腺病毒的生长和操作对于本领域技术人员来说是已知的，且其在体外和体内展示广谱宿主性。可以高滴度例如每ml 10⁹-10¹¹个空斑形成单位获得该病毒群，且其具有高感染性。腺病毒的生活周期不需要整合入宿主细胞基因组。通过腺病毒载体递送的外源基因是附加体，因此具有低的对宿主细胞的遗传毒性。在使用野生型腺病毒的免疫研究(Couch等人，1963；Top等人，1971)中未曾报导过副作用，这证明其作为体内基因转移载体的安全性和治疗潜能。

腺病毒载体已被用于真核生物基因表达(Levrero等人，1991；Gomez-Foix等人，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。动物研究已表明重组腺病毒可用于基因治疗(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等人，1990；Rich等人，1993)。给不同的组织施用腺病毒的研究包括导管滴注法(tracheainstillation)(Rosenfeld等人，1991；Rosenfeld等人，1992)、肌肉注射(Ragot等人，1993)、外周静脉内注射(Herz和Gerard，1993)以及立体定向接种(stereotactic inoculation)入大脑(LeGal La Salle等人，1993)。

b.逆转录病毒载体

逆转录病毒是单链RNA病毒，其特征在于其通过逆转录过程在感染的细胞中将其RNA转变成双链DNA的能力(Coffin，1990)。然后将所得的DNA作为前病毒稳定地整合入细胞染色体并指导病毒蛋白的合成。所述整合导致病毒基因序列保留在受体细胞和其后代中。逆转录病毒基因组包含分别编码衣壳蛋白、聚合酶和被膜组分的三个基因gag、pol和env。在gag基因上游发现的序列包含用于将基因组包装入病毒体的信号。两个长末端重复(LTR)序列存在于病毒基因组的5′和3′末端。这些序列包含强启动子和增强子序列且也是整合入宿主细胞基因组所必需的(Coffin，1990)。

为了构建逆转录病毒载体，将编码目的基因的核酸插入病毒的基因组以取代某些病毒的序列，从而产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，可构建包含gag、pol和env基因但不包含LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等人，1983)。当将包含cDNA的重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列一起导入(例如通过磷酸钙沉淀法)该细胞系时，所述包装序列允许重组质粒的RNA转录物被包装入病毒颗粒，然后所述病毒颗粒被分泌入培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等人，1983)。然后收集包含重组逆转录病毒的培养基，任选地对其进行浓缩，然后用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染许多细胞类型。然而，整合和稳定的表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等人，1975)。

对缺陷型逆转录病毒的用途的担忧是野生型可复制病毒在包装细胞中的潜在出现。这可由重组事件产生，在所述重组事件中，来自重组病毒的完整序列插入来自整合入宿主细胞基因组中的gag、pol、env序列的上游。然而，能够极大地减少重组可能性的包装细胞系是可获得的(Markowitz等人，1988；Hersdorffer等人，1990)。

c.AAV载体

腺伴随病毒(AAV)是吸引人的用于本发明的载体系统，因为其具有高整合频率且其可感染不分裂细胞，从而使其能够在组织培养中用于将基因递送入哺乳动物细胞(Muzyczka，1992)。AAV在传染性方面具有广谱宿主性(Tratschin等人，1984；Laughlin等人，1986；Lebkowski等人，1988；McLaughlin等人，1988)，这意味着其可用于本发明。关于rAAV载体的产生和用途的详细内容描述于美国专利5,139,941和美国专利4,797,368，各自在此引用作为参考。

显示AAV在基因递送中的用途的研究包括LaFace等人(1988)；Zhou等人(1993)；Flotte等人(1993)；和Walsh等人(1994)。重组AAV载体已成功地用于标记基因(Kaplitt等人，1994；Lebkowski等人，1988；Samulski等人，1989；Shelling和Smith，1994；Yoder等人，1994；Zhou等人，1994；Hermonat和Muzyczka，1984；Tratschin等人，1985；McLaughlin等人，1988)和参与人疾病的基因(Flotte等人，1992；Ohi等人，1990；Walsh等人，1994；Wei等人，1994)的体外和体内转导。最近，已批准AAV载体用于进行囊性纤维化的治疗的I期人试验。

AAV是依赖性的细小病毒，因为其要求与另一种病毒(腺病毒或疱疹病毒科的成员)一起同时感染以在培养的细胞中进行有效感染(Muzyczka，1992)。在缺少与辅助细胞的同时感染的情况下，野生型AAV基因组通过其末端整合入人第19号染色体，在该染色体上其作为前病毒以潜伏状态存在(Kotin等人，1990；Samulski等人，1991)。然而，除非也表达AAV Rep蛋白(Shelling和Smith，1994)，否则rAAV不限于在染色体19上进行整合。当用辅助细胞超感染具有AAV前病毒的细胞时，AAV基因组被从染色体上或从重组质粒上“解救”出来，并建立正常的有效感染(Samulski等人，1989；McLaughlin等人，1988；Kotin等人，1990；Muzyczka，1992)。

一般地，通过共转染包含侧翼连接两个AAV末端重复的目的基因的质粒(McLaughlin等人，1988；Samulski等人，1989；各自在此引用作为参考)和包含无末端重复的野生型AAV编码序列的质粒例如pIM45(McCarty等人，1991；在此引用作为参考)来产生重组AAV(rAAV)病毒。也用携带AAV辅助功能所需的腺病毒基因的腺病毒或质粒感染或转染细胞。用腺病毒污染以该方式产生的rAAV病毒贮液，所述腺病毒在物理上必须与所述rAAV颗粒分开(例如，通过氯化铯密度离心)。可选择地，可使用包含AAV编码区的腺病毒载体或包含AAV编码区和腺病毒辅助者基因中的一些或所有基因的细胞系(Yang等人，1994；Clark等人，1995)。也可使用具有以前病毒的方式整合的rAAV DNA的细胞系(Flotte和Carter，1995).

d.疱疹病毒载体

单纯疱疹病毒(HSV)因为其对于神经细胞的向性的原因而在治疗神经系统病症中产生极大的吸引力，但由于其具有广泛的宿主范围，该载体也可被开发用于其他组织。使HSV成为具有吸引力的载体的另一个因素是其基因组的大小和组织。因为HSV很大，所以多个基因或表达盒的整合没有其他更小的病毒系统中的问题多。此外，具有不同的表现(短暂的、强度等)的不同病毒控制序列的可获得性使得其可能比在其他系统中更大限度地控制表达。病毒具有相对少的剪接信息，从而进一步使得基因操作简易也是有利方面。

HSV也相对容易操作且可被培养至高滴度。因此，在获得足够的MOI所需的体积方面以及在减少的对重复剂量给药的需要方面递送都不太成问题。关于HSV作为基因治疗载体的综述，参见Glorioso等人(1995)。

HSV(指明为亚型1和2)是有包膜病毒，所述病毒是人类遇到的最常见的感染剂，其感染世界范围内数百万的人受试者。大的复杂的双链DNA基因组编码许多不同的基因产物，其中一些来源于剪接的转录物。除了病毒体和被膜结构组分外，所述病毒编码许多其他蛋白，包括蛋白酶、核糖核苷酸还原酶、DNA聚合酶、ssDNA结合蛋白、解旋酶/引发酶、DNA依赖性ATP酶、dUTPase和其他酶。

HSV基因形成几个组群，所述组群的表达受到协同调节和以级联方式按顺序相继地进行(Honess和Roizman，1974；Honess和Roizman 1975)。通过病毒粒子蛋白第16号或α-反式诱导因子感染后表达的第一套基因α基因的表达(Post等人，1981；Batterson和Roizman，1983)。β基因的表达需要功能性α基因的产物，最著名的是ICP4，其由α4基因编码(DeLuca等人，1985)。γ基因，主要编码病毒体结构蛋白的异源基因组，为了最佳表达需要病毒DNA合成的起始(Holland等人，1980)。

与基因组的复杂性相符，HSV的生活周期相当复杂。除了裂解周期(该周期导致病毒颗粒的合成和最终细胞的死亡)外，该病毒还具有进入潜伏状态的能力，在该状态中基因组保留在神经节直至一些至今仍未确定的信号触发裂解周期再发生。已发展了HSV的无毒性变体且可容易地获得所述变体以用于基因治疗背景(美国专利5，672，344)。

e.痘苗病毒载体

痘苗病毒载体因其构建容易、获得相对高水平的表达、广泛的宿主范围和携带DNA的大容量而一直被广泛使用。痘苗病毒包含大约186kb的线性双链DNA基因组，所述基因组表现明显的“A-T”偏爱性。大约10.5kb的末端反向重复序列侧翼连接该基因组。中心区域内存在大部分必需基因，所述区域在痘苗病毒中是最高度保守的。据估计痘苗病毒中的可读框数目在150至200个之间。尽管两条链都编码，但可读框的广泛交叠却不常见。

痘苗病毒基因组至少可插入25kb(Smith和Moss，1983)。原型痘苗载体包含通过同源重组插入病毒胸苷激酶基因的转基因。基于tk-表型选择载体。由于包含了脑心肌炎病毒的非翻译前导序列，所以表达的水平比常规载体的水平高，在24小时内转基因积累了10％或更多的被感染细胞的蛋白(Elroy-Stein等人，1989)。

f.溶瘤病毒载体

溶瘤病毒也用作本发明中的载体。此处定义的溶瘤病毒通常是指杀死肿瘤或癌细胞的频率高于其杀死正常细胞的频率的病毒。示例性溶瘤病毒包括过度表达ADP的腺病毒。在美国专利申请公开号20040213764、美国专利申请公开号20020028785和美国专利申请系列号09/351,778中详细描述了这些病毒，所述参考资料各自明确地以其全文在本申请的该部分和本申请的所有其他部分引用作为参考。示例性溶瘤病毒在本说明书的其他部分进行描述。本领域技术人员熟悉可用于本发明的药物组合物和方法的其他溶瘤病毒。

g.其他病毒载体

可在本发明中用作载体的其他病毒载体包括可用于疫苗或复合疫苗(dual vaccine)以及免疫治疗应用的病毒载体。病毒载体和用于使用病毒载体的接种和免疫治疗的技术更详细地描述于PCT申请WO0333029、WO0208436、WO0231168和WO0285287，其各自明确地以其全文在本申请的该部分和本申请的所有其他部分引用作为参考。可用于在接种和复合免疫治疗/接种的技术中使用的其他载体包括上面所示的溶瘤病毒。

其他病毒载体也包括杆状病毒载体、微小病毒载体、小RNA病毒载体、α病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、辛德比斯病毒载体、慢病毒和逆转录病毒载体。可使用来源于病毒例如痘病毒的载体。委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒的分子克隆株系已通过基因工程改造为用于异源病毒蛋白表达的具有复制能力的疫苗载体(Davis等人，1996)。研究已证明VEE感染刺激有效的CTL反应并且表明VEE可以是用于免疫接种的非常有用的载体(Caley等人，1997)。在本发明中，VEE病毒可用于靶向树突细胞。

根据对缺陷型乙型肝炎病毒的最新认识，对不同病毒序列的结构功能相互关系获得了新的认识。体外研究显示尽管多至80％的其基因组缺失，但病毒可保留辅助细胞依赖性包装和逆转录的能力(Horwich等人，1990)。这暗示着大部分的基因组可用外源遗传物质置换。Chang等人最近将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因导入鸭乙型肝炎病毒基因组以替代聚合酶、表面和前表面(pre-surface)编码序列。将其与野生型病毒一起共转染入禽类肝癌细胞系。将包含高滴度的重组病毒的培养基用于感染原代小鸭肝细胞。在转染后检测到稳定的CAT基因表达至少维持24天(Chang等人，1991)。

用于本发明的组合物和方法中的其他病毒载体包括Tang等人，2004提及的载体，对于本申请的该部分和本申请的所有其他部分，所述文献明确地在此以其全文引用作为参考。

i.使用经修饰的病毒进行的基因递送

可将诊断性或治疗性核酸插入已经基因工程改造从而表达特定结合配体的病毒载体内。因而所述病毒颗粒可特异性地结合靶细胞的相关受体并将内容物递送至所述细胞。基于逆转录病毒的化学修饰发展了经设计允许逆转录病毒的特异性靶向的新方法，所述化学修饰通过以化学方法向病毒包膜加入乳糖残基来进行。该修饰可允许通过唾液酸糖蛋白受体进行的肝细胞的特异性感染。

设计用于重组逆转录病毒的靶向的另一个方法，在所述方法中使用生物素化的抗逆转录病毒包膜蛋白和抗特异性细胞受体的抗体。使用链霉抗生物素通过生物素组分偶联抗体(Roux等人，1989)。通过使用抗主要组织相容性复合物I类和II类抗原的抗体，其证明亲嗜性病毒在体外感染多种人细胞，所述细胞具有那些表面抗原(Roux等人，1989)。

D.递送剂

在本发明的某些实施方案中，编码氨基酸序列的核酸还可包含递送剂。此处定义的递送剂是指除了病毒载体以外帮助递送核酸至目的靶细胞的任何试剂或物质。示例性递送剂包括脂质和脂质制剂(包括脂质体)。在某些实施方案中，脂质包含在纳米颗粒中。纳米颗粒此处定义为亚微米颗粒(submicron particle)。例如，纳米颗粒可具有大约1至大约500纳米的直径。所述颗粒可由任何物质或化合物组成。在本发明中，例如，“纳米颗粒”可包含具有大约1至大约500纳米的直径的某些脂质体。

本领域技术人员熟悉使用脂质体或脂质制剂捕获核酸序列的用途。脂质体是特征在于磷脂双层膜和内部水性介质的泡状结构。多层脂质体具有多个由水性介质分开的脂层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时其自发地形成。在封闭的结构形成之前脂质组分进行自我重排并将水和溶解的溶质包含在脂双层之间(Ghosh和Bachhawat，1991)。

脂质介导的核酸递送和外源DNA在体外的表达已经非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987)。Wong等人(1980)证明了在培养的鸡胚、HeLa和肝细胞瘤细胞中进行脂质介导的递送和外源DNA的表达的可行性。

基于脂质的非病毒制剂提供了腺病毒基因疗法的另一种选择。尽管许多细胞培养研究已证明基于脂质的非病毒基因转移，但通过基于脂质的制剂进行的全身性基因递送受到限制。基于非病毒脂质的基因递送的主要限制是包含所述非病毒递送载体的阳离子脂质的毒性。脂质体的体内毒性部分地解释了体外和体内基因转移结果之间的差异。促成该矛盾的数据的另一个因素是在血清蛋白存在和不存在的情况下脂质体稳定性的差别。脂质体和血清蛋白之间的相互作用对脂质体的稳定性质具有很大的影响(Yang和Huang，1997)。阳离子脂质体吸引和结合带负电荷的血清蛋白。被血清蛋白包被的脂质体溶解或被巨噬细胞吸收，从而导致其从循环中清除。目前的体内脂质体递送方法使用皮下、皮内、瘤内或颅内注射以避免与循环中的阳离子脂质相关的毒性和稳定性问题。脂质体和血浆蛋白的相互作用解释了体外基因转移(Felgner等人，1987)和体内基因转移(Zhu等人，1993；Solodin等人，1995；Liu等人，1995；Thierry等人，1995；Tsukamoto等人，1995；Aksentijevich等人，1996)的功效之间的差异。

脂质体制剂的最新进展已提高了体内基因转移的功效(WO98/07408)。由等摩尔比例的1，2-二(油酰氧)-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)和胆固醇组成的新脂质体制剂显著增强了体内全身基因递送，增加了大约150倍。据认为DOTAP：胆固醇脂质制剂形成了称为“三明治脂质体(sandwich liposome)”的独特结构。据报导该制剂将DNA“夹”在内陷的双层或‘花瓶’结构之间。这些脂质体的有益特征包括正ρ、通过胆固醇产生的胶体稳定性、二维DNA包装和增加的血清稳定性。

通常在(I)反相蒸发法(II)脱水-再水化(III)去垢剂透析和(IV)薄膜水合作用后通过脂质体混合物的超声或系列挤出(serialextrusion)进行脂质体制剂的制备。在制备后，脂质结构可用于封装当在循环中时有毒的(化疗剂)或不稳定的(核酸)化合物。脂质体封装已导致这些化合物的更低的毒性和更长的血清半衰期(Gabizon等人，1990)。许多疾病疗法正使用基于脂质的基因转移策略来增强常规疗法或建立新疗法，特别是用于治疗过度增生性疾病的疗法。

可将脂质体与血凝病毒(HVJ)混合。已显示这有利于与细胞膜的融合，从而促进脂质体封装的DNA进入细胞(Kaneda等人，1989)。在另一个实施方案中，可将脂质体与细胞核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)混合或与其一起使用(Kato等人，1991)。在其他实施方案中，可将脂质体与HVJ和HMG-1两者混合或与其一起使用。

此外，本领域技术人员意识到其他纳米颗粒制剂适合用于基因递送。实例包括由Bianco(2004)，Doerr(2005)，和Lang等人(2005)描述的纳米颗粒制剂，所述参考资料各自明确地在此以其全文引用作为参考。

E.疗法

1.定义

此处定义的“治疗性核酸”是指已知或怀疑在疾病或健康相关性状况的治疗或预防中具有益处的核酸。编码已知或怀疑在疾病或健康相关性状况的治疗中具有益处的蛋白或多肽的核酸以及更直接地为例如核酶的核酸包括在“治疗性核酸”的定义之内。治疗性核酸也可以是转录已知或怀疑在疾病或健康相关性状况的治疗中具有益处的核酸的核酸(例如转录核酶的核酸)。

在整个本说明书中使用的术语“治疗”或“疗法”是指已知或可能提高或增强具有疾病或健康相关性状况的受试者的健康的任何事件。因此“治疗性核酸”是已知或怀疑提高患有疾病或健康相关性状况的受试者的健康的核酸。这些治疗益处的非穷举实例的目录包括使受试者寿命延长任何时间长度，或减少或延迟疾病的发展。在癌症的情况下，治疗性益处包括过度增殖的减少，肿瘤生长的减小，转移的延迟或转移灶数目的减少，癌症细胞的减少或肿瘤细胞增殖率的减少，从恶化前病症至瘤形成发展的进程的减少或延迟，和可归因于受试者的病症的受试者的疼痛的减轻。

“疾病”定义为由任何原因例如感染、遗传缺陷或环境应激造成的身体部分、器官或系统的病理状况。

此处定义的“健康相关性状况”是指可以是非病理性的但需要治疗的身体部分、器官或系统的状况。实例包括需要美容治疗的状况，例如皮肤皱纹、皮肤瑕疵等。

“预防”和“防止”按照其通常和平常的意思使用，表示“在.....之前作用”或这样的作用。在特定的疾病或健康相关性状况的背景中，这些术语是指为了阻止疾病或健康相关性状况的发生对受试者施用或使用药剂、药物或治疗剂或对受试者进行治疗方法。在本发明的某些实施方案中，所述治疗方法包括递送编码治疗性蛋白的核酸以在受试者中预防疾病或健康相关性状况。适合预防疾病或健康相关性状况的组合物的量是已知或怀疑阻止所述疾病或健康相关性状况的发生的量。

在整个本申请中使用的“诊断”是指已知或怀疑在受试者中鉴定疾病或健康相关性状况存在或不存在中具有益处的任何事件。已知或怀疑在鉴定处于发生特定疾病或健康相关性状况的风险中的受试者中是有益的任何事件也包括在该定义中。因此，诊断性核酸是已知或怀疑在鉴定疾病或健康相关性状况存在或不存在中具有益处或已知或怀疑在鉴定处于发生特定疾病或健康相关性状况的风险中的受试者中具有益处的核酸。例如，所述诊断性核酸可以是编码可检测的报告蛋白的核酸。这样的蛋白可以例如用于成像方法。

2.被诊断、预防或治疗的疾病

本发明涉及通过施用编码能够预防或抑制受试者的疾病的氨基酸序列的核酸来检测、预防、抑制或治疗受试者的疾病的方法。如上所示，可用于或给受试者施用以检测、预防或抑制或治疗疾病的任何核酸包含在此处所示的药物组合物中。

在某些实施方案中，所述疾病可以是可影响受试者的过度增生性疾病，所述受试者对于通过给该受试者施用核酸序列来进行的检测、治疗或预防是顺从的。例如，所述疾病可以是过度增生性疾病。过度增生性疾病是与细胞的异常生长或繁殖相关的疾病。所述过度增生性疾病可以是在受试者中表现为病变的疾病。示例性过度增生性病变包括下列：鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺瘤、腺癌、硬变性胃炎、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性肠肽肿瘤、胆管癌、肝细胞癌、腺样囊性癌、类癌瘤、催乳素瘤、嗜酸细胞瘤、嗜酸性细胞腺瘤、肾细胞癌、子宫内膜样腺瘤、囊腺瘤、腹膜假性粘液瘤、瓦尔信瘤、胸腺瘤、泡膜细胞瘤、粒层细胞瘤、男性细胞瘤、塞-莱细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、神经节细胞瘤、嗜铬细胞瘤、血管球瘤(glomus tumor)、黑色素瘤、软组织肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、粘液瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、肌瘤、肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、混合瘤、肾胚细胞瘤、布伦纳瘤(brenner tumor)、滑膜肉瘤、间皮瘤、无性细胞瘤、生殖细胞瘤(germcell tumors)、胚胎性癌(embryonal carcinoma)、卵黄囊瘤、畸胎瘤、皮样囊肿(dermoid cysts)、绒毛膜癌、中肾瘤、血管瘤、血管瘤、血管肉瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、血管内皮瘤、卡波西肉瘤、血管外皮细胞瘤、淋巴管瘤、囊性淋巴管瘤(cystic lymphangioma)、骨瘤、骨肉瘤、骨软骨瘤、软骨性外生软骨瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、巨细胞瘤、尤因氏肉瘤、牙源性肿瘤(odontogenic tumors)、成牙骨质细胞瘤、成釉细胞瘤(ameloblastoma)、颅咽管瘤、神经胶质瘤、混合性少突星形细胞瘤、室管膜瘤(ependymoma)、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤(glioblastomas)、少突神经胶质瘤(oligodendrogliomas)、神经上皮赘生物(neuroepitheliomatousneoplasms)、成神经细胞瘤、视网膜成神经细胞瘤(retinoblastoma)、脑脊膜瘤(meningiomas)、神经纤维瘤、神经纤维瘤病(neurofibromatosis)、神经鞘瘤、神经细胞瘤、神经瘤、粒细胞瘤(granular cell tumors)、软组织腺泡状肉瘤、淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、淋巴肉瘤、何杰金氏病(Hodgkin′s disease)、小淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、纵隔(胸腺)大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuselarge B-cell lymphoma)，血管内的巨大的B细胞淋巴瘤(intravascular large B-cell lymphoma)、伯基特淋巴瘤、脾的边缘区淋巴瘤(splenic marginal zone lymphoma)、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴样组织型边缘区B细胞淋巴瘤(MALT-淋巴瘤)、节边缘区B细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿(mycosis fungoides)，塞扎里氏综合征(Sezary syndrome)、周围T-细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤(subcutaneouspanniculitis-like T-cell lymphoma)、间变性大细胞淋巴瘤、肝脾的T细胞淋巴瘤(hepatosplenic T-cell lymphoma)、肠病型T细胞淋巴瘤(enteropathy type T-cell lymphoma)、淋巴瘤样丘疹病、原发性表皮的间变性大细胞淋巴瘤(primary cutaneousanaplastic large cell lymphoma)、结外NK/T细胞淋巴瘤、原始NK细胞淋巴瘤(blastic NK cell lymphoma)、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、肥大细胞瘤、肥大细胞肉瘤、肥大细胞增生病、肥大细胞白血病、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(langerhans cell histiocytosis)、组织细胞肉瘤、朗格汉斯细胞肉瘤树突细胞肉瘤(langerhans cell sarcoma dendritic cellsarcoma)、滤泡树突细胞肉瘤(follicular dendritic cellsarcoma)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、淋巴瘤样肉芽肿(ymphomatoid granulomatosis)、急性白血病、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、成人T细胞性白血病/淋巴瘤、浆细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病(T-cell large granular lymphocyticleukemia)、B细胞前淋巴细胞性白血病(B-cell prolymphocyticleukemia)、T细胞前淋巴细胞性白血病(T-cell prolymphocyticleukemia)、pecursor B lymphoblastic leukemia、前体T淋巴母细胞白血病、急性红细胞系统非白血性白血病(acute erythroidleukemia)、淋巴肉瘤细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocyticleukemia)、急性骨髓单核细胞性白血病、嗜碱细胞性白血病、嗜酸细胞性白血病、急性嗜碱细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞性白血病、单核细胞性白血病、急性成单核细胞和单核细胞性白血病、急性巨核细胞白血病(acute megakaryoblasticleukemia)、急性细胞样白血病和骨髓增生异常综合征、绿色瘤或髓样肉瘤、具有骨髓纤维化的急性全骨髓增殖症(acutepanmyelosis with myelofibrosis)、毛细胞性白血病、青少年慢性骨髓性白血病、进行性NK细胞白血病、真性红细胞增多症(polycythemia vera)、骨髓组织增生性疾病、慢性特发性骨髓纤维变性(chronic idiopathic myelofibrosis)、原发性血小板过多症、慢性中性粒细胞性白血病、慢性嗜酸细胞性白血病/嗜酸细胞过多综合征、移植后淋巴增生性障碍、慢性骨髓增生性疾病、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性骨髓单核细胞性白血病和骨髓增生异常综合征。在某些实施方案中，过度增生性病变是可影响受试者的嘴的疾病。实例包括粘膜白斑病、鳞状上皮细胞过度增生(squamous cell hyperplastic lesions)、恶化前上皮病变(premalignant epithelial lesions)、上皮内瘤形成病变(intraepithelial neoplastic lesion)、局灶性上皮增生和鳞状细胞癌病变。

在某些其他实施方案中，过度增殖性病变是可影响受试者皮肤的疾病。实例包括鳞状细胞癌、基底细胞癌、黑色素瘤、乳头状瘤(疣)和牛皮癣。也涉及与病毒相关的癌症的治疗，包括但不限于头与颈癌。所述病变可包括细胞例如角质细胞、上皮细胞、皮肤细胞和粘膜细胞。所述疾病也可以是影响肺粘膜的疾病。

所述疾病可以是癌前病变，例如口腔的粘膜白斑病或皮肤的光化性角化病。

被治疗或预防的疾病的其他实例包括传染病和炎性疾病，例如自身免疫性疾病。本发明的方法和组合物可用于递送可用于疾病的免疫治疗或免疫预防的抗原。其他示例性疾病包括损伤、烧伤、皮肤溃疡、脊柱后凸、皮肤病病症(综述于Burns等人，2004中)、牙疾病例如龈炎(综述于Neville等人，2001中)和眼疾病(综述于Yanoff等人，2003中)。伤口的基因疗法综述于Eriksson和Vranckx，2004；Atiyeh等人，2005；Ferguson和O’Kane，2004；Waller等人，2004；Simon等人，2004；和Bok和Bok，2004中，其各自明确地以其全文在此引用作为参考。本领域技术人员熟悉许多疾病，所述疾病可使用此处所示的药物组合物和方法预防或治疗。

3.定义的生长抑制

广义地定义过度增生性病变的“生长抑制”，其包括，例如，使病变的扩大减慢或停止。抑制病变的扩大也可包括减少病变的大小或诱导病变细胞的编程性细胞死亡。编程性细胞死亡的诱导是指其中药物、毒素、化合物、组合物或生物实体使细胞凋亡或程序性细胞死亡。在特定的实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在另一个实施方案中，所述肿瘤细胞是头与颈癌细胞、鳞状细胞癌、子宫颈癌细胞或肛门生殖器疣的细胞。在其他实施方案中，所述细胞是角质细胞、上皮细胞、皮肤细胞、粘膜细胞或可通过乳头瘤病毒进行转化的任何其他细胞。病变的扩大可被抗病变细胞的免疫反应的诱导所抑制。

F.药物组合物

1.定义

术语“药物组合物”和“配制的”是指当给哺乳动物或人(适当时)施用时不产生不利的、过敏性的或其他不想要的反应的分子实体和组合物。如此处所用的，“药物组合物”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些用于药物活性物质的介质和试剂的用途在本领域内是熟知的。除非任何常规介质或试剂不与活性组分相容，否则可将其用于治疗性组合物。也可将补充性活性成分整合入组合物。此外，所述组合物可包含补充性活性组分。例如，用作牙膏的组合物可包含香料或组合物可包含补充性成分以使制剂定时释放(timed-release)。在下面部分更详细地描述制剂。

配制用于口服递送的一些本发明的药物组合物。口服递送包括通过动物或其他哺乳动物(如果合适)的嘴施用。口服递送也包括对口腔的任何部分例如对牙龈、牙齿、口腔粘膜或对嘴中的病变例如肿瘤前病变或肿瘤病变进行局部施用。口服递送也包括至嘴伤口或嘴中肿瘤的递送。

在本发明的背景中，“局部施用”经定义包括对身体的表面例如皮肤、口腔粘膜、胃肠粘膜、眼、肛门、子宫颈或阴道的施用，或对这些区域的任何区域中的切除病变的床(即，切除的咽HNSCC或切除的宫颈癌的外科床)的表面的施用，或对空腔脏器例如膀胱表面的施用。

在本发明的另一个实施方案中，药物组合物是肠制剂。肠制剂经定义包括丸剂、具有保护性包衣的胶囊剂或经设计抗胃的低pH的混悬剂。这样的肠制剂使得能够递送治疗性或诊断性基因至小肠或大肠。

2.固体或半固体制剂

本发明的药物组合物可配制为固体或半固体。固体或半固体制剂是指除了水性制剂外的任何制剂。本领域技术人员熟悉以固体或半固体形式存在的试剂的配制。

实例包括凝胶、基质、泡沫、乳膏、软膏、锭剂、棒棒糖、口胶剂、粉剂、凝胶条、薄膜、水凝胶、溶解条、糊剂、牙膏或固体棒。如下更详细地描述这些制剂中的一些制剂。

a.凝胶

凝胶此处定义为从胶体溶液形成的外观呈固体、果冻样的材料。胶体溶液是其中以阻止其容易地过滤或快速沉积的方式精细地分开分散在连续介质内的颗粒的溶液。

涉及凝胶的配制的方法示于美国专利6,828,308、美国专利6,280,752、美国专利6,258,830、美国专利5,914,334、美国专利5,888,493和美国专利5,571,314中，所述专利各自明确地以其全文在此引用作为参考。

i.局部凝胶

将此处所示的一些药物组合物配制为局部凝胶。例如，可将核酸表达构建体配制为基于疏水凝胶的药物制剂。可通过将五聚体cyclomethacone组分(Dow Corning 245 fluid^tm)与核酸表达构建体的液体悬浮液、氢化蓖麻油、棕榈酸辛酯和环甲基硅酮与聚二甲基硅氧烷醇的混合物以8∶2的比例混合来配制疏水凝胶。优选地，五聚体环甲基硅酮组分占凝胶的大约40％，液体核酸表达构建体组分占凝胶的大约30.0％，氢化蓖麻油组分占凝胶的大约10％，棕榈酸辛酯组分占凝胶的大约10.0％以及环甲基硅酮/聚二甲基硅氧烷醇组分占凝胶的大约10.0％。可将上面所列的各组分混合在一起同时在真空下在大约80-90℃下加热。在将温度降低至例如37℃后，然后可加入核酸表达构建体组分，且应当使最终的凝胶组分冷却至环境温度。疏水凝胶制剂中的核酸表达构建体的终浓度依赖于所用的构建体类型和施用目的。

ii.口服凝胶制剂

也可使用本领域技术人员已知的任何方法制备用于递送核酸表达构建体的口服凝胶药物制剂。这些药物制剂可用于口腔。可通过例如混合水、山梨酸钾、苯甲酸钠、EDTA二钠、透明质酸和麦芽糖糊精来产生这样的凝胶。在上述组分溶解后，可在搅拌和真空例如30mm Hg的情况下加入聚乙烯吡咯烷酮直至完全溶剂化。可在仍处于真空条件下将其他组分，例如羟乙基纤维素和甜味剂例如糖精钠搅拌加入所述混合物直到完全溶剂化。然后，可在相同的条件下且按照所列的顺序向所述混合物中加入氢化蓖麻油、苯扎氯铵和丙二醇与甘草亭酸的混合物，直至组分完全溶解。该混合物通过在真空下再搅拌30分钟可形成凝胶。表4提供了优选浓度的上述组分的目录。

可选择地，可使用包含上述组分的商购可获得的口服凝胶制剂例如

(Helsinn Healthcare，Switzerland)。

表4

组分                按重量计算的％

透明质酸钠          0.1

甘草亭酸            0.06

聚乙烯吡咯烷酮      9.0

麦芽糖糊精          6.00

丙二醇              2.94

山梨酸钾            0.3

羟乙基纤维素        1.5

氢化蓖麻油PEG-40    0.27

EDTA二钠            0.1

苯扎氯铵            0.5

糖精钠              0.1

纯水                78.60

随后可将凝胶与一种或多种本发明的核酸表达构建体混合。例如，可将15ml前述凝胶与30-50ml核酸表达构建体的液体悬浮液混合。液体悬浮液和凝胶制剂中的核酸表达构建体的浓度依赖于所用的表达构建体的类型和治疗用途。

iii.眼用凝胶制剂

可通过本领域技术人员已知的任何方法配制用于眼部递送的凝胶。例如，可通过制备第一溶液和第二溶液，然后将各溶液混合来制备用于将核酸表达构建体局部递送至受试者的眼用凝胶。

第一溶液的一个实例包含大约200g纯水、906g硼酸、0.13g硼酸钠、1.0g乙二胺四乙酸二钠、0.1g苯扎氯铵、4.0g氯化钠和0.26g冻干的或液体悬浮核酸表达构建体。表达构建体的类型和治疗法以及治疗目的决定了第一溶液中核酸表达构建体的特定浓度。

第二溶液可包含例如760g纯水和35g羟丙基甲基纤维素。可将羟丙基甲基纤维素加入水中，通过将水加热至大约90℃直至羟丙基甲基纤维素均匀分散溶解在水中。

在混合第二溶液后，可降低温度，这样可在无菌的状况下加入第一溶液而不使核酸表达构建体失活。该方法只是示例性的。

b.基质

基质此处定义为其中包含其他物质例如药物组分的周围物质(surrounding substance)。涉及传导硅酮基质(conductingsilicone matrix)的配制的方法示于美国专利6,119,036，其在此明确地以其全文引用作为参考。也参考如Doukas等人，2001.，和Gu等人2004中所描述的涉及基于胶原的基质的配制方法。

c.泡沫

此处将泡沫定义为通过将许多气泡捕获在液体中而形成的组合物。涉及泡沫配制和施用的方法示于美国专利4,112,942、美国专利5,652,194、美国专利6,140,355、美国专利6,258,374和美国专利6,558,043，所述专利各自明确地以其全文在此引用作为参考。

可通过例如将气体导入凝胶或水性药物组合物中以使气泡存在于所述药物组合物中来构建一般的泡沫药物制剂。

如下描述包括使用压缩气体的泡沫药物制剂的制备的一个实例。简而言之，通过在轻微真空条件下搅拌大约30分钟将本发明的核酸(12％w/v)与矿物油混合，从而产生第一混合物。可在相同的条件下向第一混合物中加入矿物油中的鲸蜡基硬脂醇(6％w/v)溶液以形成终混合物。随后可将所述终混合物再搅拌10分钟。然后可将终混合物放入合适的金属罐并用推进气体压缩。金属罐可具有分配终混合物的机械装置，例如通常在压缩金属罐中见到的聚乙烯阀类型。该方法只是示例性方法。

d.乳膏和洗剂

乳膏此处定义为半固体乳剂，所述半固体在此处定义为包含一种或多种油和水的混合物的组合物。洗剂和乳膏被认为是相同类型的制剂。涉及乳膏的配制的方法示于美国专利6,333,194、美国专利6,620,451、美国专利6,261,574、美国专利5,874,094和美国专利4,372,944，其各自明确地在此以其全文引用作为参考。

e.软膏

软膏此处定义为局部用于多种身体表面的粘性半固体制剂。涉及软膏配制的方法示于美国专利5,078,993、美国专利4,868,168和美国专利4,526,899，其各自在此明确地以其全文引用作为参考。

作为例子，软膏药物制剂可包含大约23.75w/v％异十八烷基苯甲酸酯、23.85w/v％二(2-乙基己基)苹果酸酯、10.00w/v％环甲基硅酮、5.00w/v％硬脂醇、10.00w/v％微孔纤维素、15.00w/v％乙烯/醋酸乙烯共聚物、0.1w/v％对羟基苯甲酸丁酯、0.1w/v％对羟基苯甲酸丙酯和2.20w/v％的核酸表达构建体。表达构建体的类型以及治疗和施用目的决定了第一溶液中核酸表达构建体的特定浓度。

f.粉剂

粉剂此处定义为通过捣碎、碾磨或研制使任何无水物质减小成的精细颗粒。

g.凝胶条

凝胶条此处定义为具有弹性特征的凝胶薄层。可用或可以不用粘合剂配制所述凝胶。可配制在一段时间内慢慢溶解的凝胶。例如，可设计在施用后溶解的用于口服施用的凝胶。

适合用于本发明的用途的另一种口服递送系统是可溶解条。这样的装置的实例是Cool Mint Listerine

条，其为用在

Antiseptic(Thymol，Eucalyptol，MethylSalicylate，Menthol)中发现的组分浸渍的基于淀粉的微超薄膜剂。非活性条组分包括支链淀粉、香料、阿司帕坦、丁磺氨钾(potassium acesulfame)、葡萄糖酸铜、聚山梨醇酯80、角叉藻聚糖、油酸甘油酯、豆角胶、丙二醇和黄原酸胶。

h.膜剂

膜剂此处定义为包被选择的药物组分的柔韧性材料例如纤维素衍生物或热塑性树脂的薄层或带。棒棒糖是附着至用作把手的棍的一个末端的锭剂。

本发明的药物膜剂、锭剂或棒棒糖可由组分组成，所述组分可包括，例如，黄原酸胶、豆角胶、角叉藻聚糖和支链淀粉。可在纯水中水合所述组分，然后在4℃下贮存过夜，之后可向该混合物中加入着色剂、葡萄糖酸铜、甜味剂、香料和聚氧乙烯山梨醇酯例如聚山梨醇酯80和Atmos 300^TM(ICI Co.)，然后可向所述混合物中加入核酸表达构建体。

可通过例如将上述混合物倒入模具中并铸造为膜，然后可干燥该膜剂并依赖于药物组合物的想要剂量将其切成想要的大小来制备本发明的膜剂。例如如果制剂不用于口服施用，那么也可在不加甜味剂或香料的情况下配制膜剂。

i.锭剂

固体锭剂在药物递送领域是熟知的。锭剂是经设计当置于受试者嘴中时缓慢溶解的治疗剂和其他试剂例如粘合剂和甜味剂的小的固体形式。锭剂可包含在该剂型中已知的其他组分例如酸度调节剂、遮光剂(opacifier)、稳定剂、缓冲剂、调味剂、甜味剂、着色剂和防腐剂。例如，通过在真空下加热锭剂基质(例如，糖和液体葡萄糖的混合物)以除去过多水分，然后将剩余的组分混合成混合物可将固体制剂制备为锭剂。然后将所得的混合物拉成圆柱体，从所述圆柱体形成单个的锭剂。然后将锭剂冷却，接受目测，包装入合适的包装中。

合适的包装的一种形式是通过金属箔片密封的不透水塑料材料(例如聚氯乙烯)的泡眼包装。患者通过对泡眼施压以迫使锭剂破裂和穿过金属箔密封片来取出锭剂。锭剂通常通过患者吮吸来释放药物。可通过用于制备可咀嚼的糖果产品或口香糖的方法来制备可咀嚼的固体剂型。例如，可从挤压出的糖和葡萄糖浆的混合物制备咀嚼式固体剂型，已向所述混合物中加入了药物和任选地发泡剂、湿润剂、润滑剂、香料和着色剂。参见Pharmaceutical DosageForms：Tablets，第1，2版，Lieberman等人(Eds.)，1989。

j.棒棒糖

在另一个实施方案中，可以“棒棒糖”或“吮吸物”的形式口服递送所述核酸。一般地，棒棒糖和吮吸物定义为已将药物分散入其中的固体基质。其在室温下是固体或半固体，且通过与水环境即嘴接触而被溶解。可通过嘴中增加的温度(与环境或室温相比)增强基质的溶解(从而释放药物)。棒棒糖可以是给患者施用药物的方便载体，其与锭剂的不同在于棒棒糖可暂时从患者的嘴中取出。这使患者在需要时能够进行口头交流和控制递送的持续时间和程度。

本发明的棒棒糖(或膜剂或锭剂)可由组分组成，所述组分可包括，例如，黄原酸胶、豆角胶、角叉藻聚糖和支链淀粉。所述组分可以例如在纯水中进行水合，然后在4℃下贮存过夜，之后，可向该混合物中加入着色剂、葡萄糖酸铜、甜味剂、香料和聚氧乙烯山梨醇例如聚山梨醇酯80和Atmos 300^TM(ICI Co.)以及核酸表达构建体。

可通过将上述混合物倒入想要的大小的模具中，然后将其干燥来制备本发明的棒棒糖或锭剂制剂。在干燥之前，将常用的棒棒糖握棍(holding stick)插入用于棒棒糖制备的模具中。

k.水凝胶

水凝胶此处定义为聚合物链的网络，该聚合物链网络有时发现为其中水为分散介质的胶态凝胶。通过使用说明书中的教导和本领域技术人员的知识，也可将药物制剂组装为水凝胶，这样其可与核酸表达构建体混合，以用于局部递送至受试者。下面显示用于递送病毒载体中的核酸的水凝胶制剂的实例。

例如，可将牛I型胶原(可从例如Collagen Corporation，Fremont，Calif.获得)、藻酸钠和病毒载体的液态悬浮物混合在一起以形成水凝胶前体。胶原∶藻酸盐的比例，基于干重，可以是从大约7∶3至大约4∶6。在形成水凝胶前体混合物后，通过固化该混合物从其形成水凝胶基质。可通过将所述混合物与多价阳离子例如Ca²⁺接触来固化其，从而产生水凝胶。优选地，Ca²⁺溶液应当至少为2.5毫摩尔。核酸表达构建体的浓度依赖于所用构建体的类型和施用目的。

l.溶解条(Dissolving Strip)

溶解条此处定义为在水环境例如体腔存在的情况下溶解的膜剂。

m.糊剂和牙膏

糊剂此处定义为在施加足够大的负荷或压力(在该点上其象液体一样流动)之前行为表现为固体的物质。牙膏此处定义为用于清除或提高牙的美观表现的糊剂或凝胶。糊剂牙膏(pastedentifrice)可包含水、粘合剂、磨料(abrasive)、香料、发泡剂和湿润剂。涉及牙膏配制的方法示于美国专利4,627,979、美国专利6,508,647、美国专利申请20020045148和美国专利申请20040018155，其各自明确地以其全文在此引用作为参考。

使用本说明书的教导和本领域技术人员的知识，可选择构建用于递送核酸表达构建体至受试者的口腔的牙膏药物制剂。本发明的牙膏可以例如具有下列配方：按重量计算1％的擦亮剂例如硅石或碳酸钙，按重量计算20-75％的多元醇例如甘油或聚乙二醇、按重量计算20-55％的碳酸氢钠、按重量计算0.001-40％的十二烷基硫酸钠、按重量计算0.001-20％的二氧化钛、按重量计算0.1-10％的增稠剂例如瓜尔胶或果胶、按重量计算0.001-5％的糖精钠和按重量计算10-30％的核酸表达构建体的液体制剂。表达构建体的类型以及治疗法和治疗目的决定了第一溶液中核酸表达构建体的具体浓度。

n.栓剂和阴道栓剂

适合于其他施用模式的其他制剂包括阴道栓剂和/或阴道栓(pessarie)。也可使用直肠栓(rectal pessary)和/或栓剂。栓剂是不同重量和/或形状通常含药的用于插入直肠、阴道和/或尿道的固体剂型。在插入后，栓剂变软、熔化和/或溶解在腔液中。一般地，对于栓剂，常规粘合剂和/或载体可包括，例如，聚烷基二醇和/或甘油三酯；可从包含0.5％至10％的，优选地1％-2％的活性组分的混合物形成这些栓剂。涉及栓剂的药物配制的方法示于美国专利6,982,091，其明确地在此以其全文引用作为参考。

可通过例如混合选择的核酸、羟丙基甲基纤维素、亲脂性载体和渗透促进剂来配制本发明的栓剂。例如，通过将羟丙基甲基纤维素(例如从Dow Chemical，Midland，Mich.获得的METHOCEL K，HPMCK15M)(8％/wt)和渗透促进剂聚氧乙烯烷基醚(例如，从Gattefossé获得的

)(17％/wt)溶解入从Gattefoss é，Westwood，N.J.获得的亲脂性载体SUPPOCIRE CS2(75％wt)来配制栓剂。可将选择的核酸搅拌入该混合物，然后倒入合适的栓剂模具中并在局部施用之前使其固化。

o.口胶剂

本发明也涉及本发明的基于口胶剂的药物制剂，该制剂经配制用于口服递送核酸至受试者。

作为例子，可冷冻口胶剂基质丸剂以增加硬度，然后通过机械碾磨成粉剂形式。随后，可将口胶剂粉剂提高至室温并与甜味剂例如果糖或阿司帕坦混合，其按重量计算构成大约20-65％的口胶剂-增甜剂组合物。然后可用本发明的核酸的液态悬浮剂添加入口胶剂-甜味剂组合物。例如，核酸液态悬浮液的量按重量计算可大致为口胶剂-甜味剂组合物的2％。然后可将口胶剂-甜味剂组合物与核酸的混合物压制成想要的形状并给受试者施用。本发明涉及将治疗剂配制在口胶剂中的其他方法，且所述方法对于本领域技术人员来说是熟知的。

3.稀释剂和载体

在某些确定的实施方案中，口服药物组合物通常包含惰性稀释剂和/或可同化食用的载体，和/或其可被封装入硬壳和/或软壳明胶胶囊中，和/或其可被压制成片剂，和/或可将其直接与饮食食物整合。对于口服治疗性施用，可将活性组分与赋形剂整合和/或以可摄入的片剂、口颊片剂(buccal table)、含片、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、华夫(wafer)等形式使用。

本发明也包括适合在局部使用之前溶解在或悬浮在液体中的固体形式。

本发明的固体或半固体制剂可包含下列物质：粘合剂，如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉和/或明胶；赋形剂，例如磷酸钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；香料和/或甜味剂，例如可加入蔗糖、乳糖和/或糖精和/或调味剂例如薄荷、冬青油和/或樱桃调味料(cherry flavoring)。当剂量单位剂型是胶囊时，除了上述类型的材料外，其还可包含液体载体。各种其他材料可以包衣的形式存在和/或修饰剂量单位的物理形式。例如，可用紫胶、糖和/或两者包被片剂、丸剂和/或胶囊剂。涉及本领域技术人员已知的防腐剂、染料和调味剂。

涉及用于皮肤表面的本发明的固体和半固体制剂可包含其他组分，所述组分通常混合在用于美容目的的组合物中。例如，这些化妆品组分包括：蜡、油、保湿剂、防腐剂、抗氧化剂、紫外吸收剂、紫外散射剂、聚合物、表面活性剂、着色剂、色素、粉剂、药物、醇、溶剂、芳香剂(fragrance)、香料等的各化妆品组分。化妆品组合物的特定实例包括但不限于：化妆美容剂例如口红、唇彩(lip-gloss)、唇膏、皮肤遮瑕剂(skin blemish concealer)和洗剂。涉及经设计用作药物载体的化妆品制剂的方法示于美国专利6,967,023、美国专利6,942,878、美国专利6,881,776、美国专利6,939,859和美国专利6,673,863，其各自明确地以其全文在此引用作为参考。

4.水性制剂

可将本发明的某些药物组合物配制成水性组合物。本发明的水性组合物包含有效量的溶解于或分散在药物可接受的载体或水性介质中的核酸。

可通过任何常用的途径施用此处所示的药物组合物的某些实施方案，只要靶组织可通过该途径到达。例如，所述途径包括经食管、胃、口、鼻、口颊、肛门、直肠、阴道、局部眼部的途径或对皮肤的施用。这些组合物通常以药物可接受的组合物的形式施用，所述药物可接受的组合物包括生理上可接受的载体、缓冲剂或其他赋形剂。其他赋形剂的实例包括芳香剂和香料。

所述制剂可以以液体形式或悬浮液形式存在。用于该目的的一般组合物包含药物可接受的载体。例如，所述组合物可包含每ml磷酸缓冲盐溶液10mg、25mg、50mg或多至大约100mg的人血清白蛋白。其他药物可接受的载体包括水性溶液，非毒性赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水性溶液、盐溶液、肠胃外媒介物例如氯化钠、林格尔葡萄糖等。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。根据熟知的参数调节药物组合物的各种组分的pH和确切浓度。

用于口服施用的水性组合物的实例包括漱口剂、口腔清洗剂、通过涂药器对嘴施用的包衣(coating)或口喷雾剂。漱口剂制剂对于本领域技术人员来说是熟知的。在例如美国专利6,387,352、美国专利6,348,187、美国专利6,171,611、美国专利6,165,494、美国专利6,117,417、美国专利5,993,785、美国专利5,695,746、美国专利5,470,561、美国专利4,919,918、美国专利申请20040076590、美国专利申请20030152530和美国专利申请20020044910中详细地描述了涉及漱口剂和口腔清洗剂的制剂，所述参考资料各自明确地在本说明书的该部分和本说明书的所有其他部分引用作为参考。

口服制剂包括这些通常使用的赋形剂如，例如，药物级的甘露糖、半乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液例如漱口剂和口腔清洗剂的形式存在。这些组合物和/或制剂应当包含至少0.1％的活性物质。当然组合物和/或制剂的百分比可以变化和/或可适宜地在单位的重量的大约2至大约75％之间，和/或优选地在25-60％之间。这些对治疗有用的组合物中活性物质的量是使得能够获得合适的剂量的量。

对于口服施用，可将本发明的表达盒与赋形剂组合并且以非可摄入的漱口剂和洁牙剂(dentifrice)的形式使用。可通过将活性组分以需要的量整合入合适的溶剂例如硼酸钠溶液(多贝尔氏液)来制备漱口剂。可选择地，可将活性组分整合入包含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的抗菌剂洗液。也可将活性组分分散在洁牙剂中，其包括：凝胶、糊剂、粉剂和膏剂。可以中性或盐形式配制本发明的组合物。药物可接受的盐包括酸加成盐(用蛋白质的游离氨基形成的)和用无机酸例如盐酸或磷酸或有机酸例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。也可从无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁和这样的有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等生成用游离羧基形成的盐。

关于口服施用，也可将本发明的表达盒与染料例如甲苯胺蓝O染料整合以帮助检测过度增生性病变和以非消化性的漱口剂类、口腔漱液和洁牙剂的形式使用。可通过将活性组分以所需要的量整合入口服施用的染料组合物(例如甲苯胺蓝O染料、缓冲液、香料、防腐剂、醋酸、乙醇和水的组合物)来制备漱口剂。可在例如美国专利4,321,251、美国专利5,372,801、美国专利6,086,852和美国专利申请20040146919中查找到关于甲苯胺蓝O染料在癌变前病变和癌性病变的染色中的用途的方法和配制。

用于局部表面的水性组合物的实例包括乳液或药物可接受的载体例如活性物质如游离碱或药物可接受盐的溶液、与水和表面活性剂混合的活性物质和乳液。乳液一般是一种液体以通常超过0.1um的直径的微滴的形式分散在另一种液体中的异质系统。(Idson，1988；Rosoff，1988；Block，1988；Higuchi等人，1985)。乳液通常是包含两种密切混合和相互分散的不混溶的液体相的两相系统。一般地，乳液可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)种类。涉及可与本发明的方法和组合物一起使用的乳液的方法示于美国专利6,841,539和美国专利5,830,499，其各自明确地以其全文在此引用作为参考。用于给皮肤施用的水性组合物也可包括甘油、液体聚乙二醇和其混合物中的分散相。在贮存和使用的常规条件下，这些制剂包含防止微生物生长的防腐剂。

本发明也涉及脂质体和/或纳米颗粒的使用。脂质体的形成和使用对于本领域技术人员来说一般是已知的，且也在下面进行描述。也在本说明书的其他部分描述脂质体。

纳米胶囊(Nanocapsule)一般可以稳定和可重复的方式捕获化合物。为避免由于细胞内多聚体过载引起的副作用，应当使用能够在体内降解的聚合物设计这些超微粒(大小大约0.1μm)。满足这些要求的生物可降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒可用于本发明，且这些颗粒可容易地制备。涉及可与本发明的方法和组合物一起使用的纳米颗粒的使用的方法包括美国专利6,555,376、美国专利6,797,704、美国专利申请20050143336、美国专利申请20050196343和美国专利申请20050260276，其各自明确地以其全文在此引用作为参考。

可用于食管和胃递送的水性组合物的实例包括液体抗酸剂和形成藻酸盐筏(alginate-raft)的液体组合物。液体抗酸剂和液体硫糖铝(sucralfate)或藻酸盐筏形成性组合物对于本领域技术人员来说是熟知的。藻酸盐通常被认为是安全的从而用于制备多种制药系统的药物赋形剂，在专利文献例如在美国专利6,348,502、美国专利6,166,084、美国专利6,166,043、美国专利6,166,004、美国专利6,165,615和美国专利5,681,827中详尽地描述了所述制药系统，所述专利各自明确地以其全文在本说明书的该部分和本说明书的所有其他部分引用作为参考。

用于食道或胃递送的口服制剂包含这些常用的赋形剂如药物级的羟基乙基纤维素、水、二甲基硅酮、碳酸钠、糖精钠、去水山梨醇等。也可使用香料。这些组合物和/或制剂应当包含至少0.1％的活性物质。当然，组合物和/或制剂的百分比可以变化和/或常规地可在大约2至大约75％的单位的重量之间，和/或优选地在25-60％之间。这些治疗有用的组合物中的活性物质的量是使得能够获得合适的剂量的量。

也可在本发明中使用溶液和/或喷雾剂、无针注射器(hypospray)、气雾剂和/或吸入剂进行施用。一个实例是用于给上呼吸消化道(aerodigestive tract)施用的喷雾剂。所述喷雾剂是等渗的和/或轻微缓冲的，从而保持5.5至6.5的pH。此外，如果需要，可在制剂中包含与眼制剂中使用的抗微生物防腐剂相似的抗微生物防腐剂和/或合适的药物稳定剂。关于喷雾施用的方法示于美国专利6,610,272、美国专利6,551,578、美国专利6,503,481、美国专利5,250,298和美国专利5,158,761中，其各自明确地在本申请的该部分和本申请的所有其他部分引用作为参考。

通过任何常用的途径施用此处所示的水性药物组合物的某些实施方案，只要通过该途径能够到达靶组织。例如，该途径可包括经口、鼻、口颊、肛门、直肠、阴道或眼睛局部的途径。通常以药物可接受的组合物形式施用这些组合物，所述药物可接受的组合物包含生理可接受的载体、缓冲液或其他赋形剂。其他赋形剂的实例包括芳香剂和香料。

a.漱口剂制剂

通过使用本说明书的教导和本领域技术人员的知识，可配制以用于给口腔施用的漱口剂的形式递送核酸表达构建体的药物制剂。例如，所述漱口剂制剂可包含一般的漱口剂溶液和选择的核酸表达构建体的悬浮液。可按照本发明使用的一般漱口剂溶液的一个配方示于表5中。

可将漱口剂制剂与核酸表达构建体例如腺病毒载体混合在一起。核酸表达构建体的浓度可依赖于所用的特定构建体和治疗目的。随后可将该制剂用于受试者的口腔。例如，可通过刷子、漱口或含漱(swishing)进行施用。也可重复施用一次或数次。

可选择地，通过使用本说明书的教导和本领域技术人员的知识，可配制整合了癌变前和癌性病变检测染料的漱口剂药物制剂，该药物制剂用于将核酸表达构建体递送至口腔。例如，可将核酸构建体和包含染料的漱口剂混合。下面显示一个这样的方法和制剂，所述方法和制剂涉及包含能够检测口腔中癌变前和癌性病变的染料的漱口剂。

例如可将甲苯胺蓝O染料(1％w/v)、香料(0.2％w/v)和醋酸钠三水合物缓冲溶液溶解在水、冰醋酸和乙醇的溶液中，从而形成包含染料的漱口剂溶液。随后可将本发明的核酸以合适的量加入至该漱口剂溶液中。核酸在漱口剂中的浓度依赖于使用的核酸构建体的类型和施用的目的。

作为例子，可使用下列步骤给受试者施用药物制剂：1)受试者含漱大约15ml包含1％的醋酸和苯甲酸钠防腐剂水溶液的漱洗溶液，进行20秒，然后吐出，2)受试者含漱大约15ml水，进行20秒，然后吐出，3)受试者含漱大约30ml药物制剂，进行60秒，然后吐出，4)重复步骤1两次，和5)重复步骤2两次。涉及施用这些组合物的其他方法，且所述方法对本领域技术人员来说是熟知的。

在施用药物制剂后即刻可在合适的放大镜和合适的光下观察口腔，就被染色的癌变前和癌变细胞的存在检查口腔。可在一段时间后对口腔进行随后的观察以使能够用本发明的核酸转导口腔细胞。可在合适的放大镜和合适的光下进行这些观察。

b.灌洗剂和灌肠剂制剂

还可将核酸配制为灌洗剂或灌肠剂。例如，可将选择的核酸表达构建体与本领域技术人员熟知的常用灌洗剂或灌肠剂混合。常用的灌洗剂或灌肠剂的配方示于表6。

根据本说明书的教导和本领域技术人员的知识，可将常用的灌洗剂或灌肠剂(例如表6中所示的制剂)与选择的核酸构建体混合。灌洗剂或灌肠剂中的核酸表达构建体的浓度依赖于使用的表达构建体的类型和施用目的。随后可经肛门、阴道、或通过导管给受试者施用所述制剂。

5.非离子型表面活性剂制剂

药物制剂可以是用于局部递送的非离子表面活性剂。这样的制剂可由例如三种分开的组分组成。第一组分可以是形成非离子层的表面活性剂。第二组分可以是另一种表面活性剂。最后的组分可以是核酸表达构建体例如腺病毒载体。可将核酸表达构建体冻干或悬浮在经蒸馏的磷酸盐缓冲生理盐水和10％甘油(pH 7.4)中。可使用的形成层的表面活性剂的实例见于表7。

第二表面活性剂的实例见于表8。

可通过例如以获得最终的包含5wt％的水性分散相所需要的量混合蔗糖月桂酸酯(L-595)和POE(7)十二烷基醚(C12EO7)来配制用于腺病毒载体局部递送的非离子表面活性剂的制剂。所述混合物可以是例如第一和第二表面活性剂各自的比例为0.3∶0.7或0.2∶0.8或0.1∶0.9的混合物。可首先将这些表面活性剂溶解在氯仿对甲醇为3∶1的溶液中，之后，可蒸发溶剂。然后可通过加入核酸表达构建体的液体悬浮液例如大约5ml这样的悬浮液来水化剩下的干燥的膜。

6.抗酸剂制剂

在本发明的一些实施方案中，药物组合物还包含一种或多种抗酸剂。本发明涉及配制抗酸剂的任何方法。在根据本说明书的教导和本领域技术人员的知识制备抗酸剂制剂中，可能首先希望在液体制剂中悬浮核酸表达构建体。例如，可将腺病毒载体悬浮在蒸馏磷酸缓冲生理盐水和10％的甘油pH 7.4的水性制剂中。腺病毒载体或任何核酸表达构建体的量将依赖于治疗目的。这些液体制剂的其他组分可以是抗酸剂，该抗酸剂可在给受试者施用之后使胃粘膜的pH暂时升高。抗酸剂，例如，可包含组分例如氢氧化铝或氢氧化镁。此外，可向这样的药物制剂中加入通常可见于商购可获得的液体抗酸剂制剂中的其他组分。这些组分通常包括，但不限于：对羟基苯甲酸丁酯、羟丙基甲基纤维素、维晶纤维素、对羟苯甲酸丙酯、羧甲基纤维素钠、糖精钠、山梨醇、蒸馏水和香料。

7.藻酸盐筏制剂

本发明也涉及藻酸盐筏制剂。此处定义的藻酸盐筏是指通过在胃酸存在的情况下沉淀海藻酸而形成的具有气体的凝胶。例如，可在腺病毒载体中包含核酸表达构建体。

在按照本说明书的教导和本领域技术人员的知识制备藻酸盐筏制剂中，可将核酸表达构建体悬浮于形成藻酸盐筏的液体组合物中。包含在形成藻酸盐筏的药物组合物中的这样的核酸表达构建体的实例可以是，例如，腺病毒载体。可将所述腺病毒载体与形成藻酸盐筏的液体混合。这样的形成藻酸盐筏的液体可包含见于商购可获得的该类型的制剂中的组分，例如氢氧化铝、碳酸镁、碳酸氢钠和海藻酸。商购可获得的藻酸盐筏制剂

(Glaxo SmithKline)是优选实例。在胃酸存在的情况下，海藻酸沉淀，形成了凝胶。形成藻酸盐筏的组合物也可包含碳酸氢钠或碳酸氢钾；在胃酸存在的情况下，碳酸氢盐被转化成二氧化碳，所述二氧化碳被捕获在凝胶沉淀中，从而将其转化成‘漂浮’在胃内容物的表面上的泡沫。筏形成在给药的几秒钟内发生，并且筏可在胃中保留数小时。

可通过例如混合海藻酸钠(500mg)、碳酸氢钠(250mg)、碳酸钙(150mg)、对羟基苯甲酸甲酯(40mg)、对羟基苯甲酸丙酯(6mg)和交联的聚丙烯酸例如

(Noveon)来配制形成藻酸盐筏的组合物。可将组分混合在一起，然后溶解在包含腺病毒载体的水性制剂中，形成10ml终体积。随后可由受试者吞食本发明的海藻酸筏药物制剂。形成海藻酸筏的制剂的其他实例可见于美国专利6,348,502、美国专利5,681,827和美国专利5,456,918中，其各自明确地在本说明书的该部分和本说明书的所有其他部分引用作为参考。

8.使用病毒载体的组合物

当涉及本发明的病毒表达载体的临床使用时，必需制备作为适合用于想要的用途的药物组合物的复合物。一般地，这将使得必需制备基本上不含热原以及可对人和其他哺乳动物有害的任何其他杂质的药物组合物。人们一般也想使用合适的盐和缓冲液使所述复合物稳定并使复合物能够被靶细胞吸收。

9.乳剂制剂

通过使用本说明书的教导和本领域技术人员的知识，也可配制作为用于局部递送核酸表达构建体的乳剂的药物制剂。例如，所述核酸表达构建体可以是病毒载体，例如腺病毒载体。用于递送病毒载体中的核酸的乳剂的一个实例如下：

可将聚(乳酸-羟乙酸)(PLGA)溶解在二氯甲烷中，然后与病毒载体的水性悬浮液混合。例如，可使用1ml二氯甲烷和0.05ml病毒的水性悬浮液。然后可涡旋该溶液大约30秒以形成油包水乳剂。然后可向该乳剂中加入1ml 1％的聚乙烯醇，随后再涡旋30秒。在第二轮涡旋后，然后可向100ml 0.1％聚乙烯醇溶液中加入该乳剂并再搅拌30分钟。接下来，可在搅拌的同时对乳剂使用真空进行2.5小时来除去二氯甲烷。在除去二氯甲烷后，然后可用0.2μm尼龙滤器过滤乳剂并用500ml磷酸缓冲生理盐水进行洗涤。在乳剂包含病毒的情况下，可使用保护剂防止病毒蛋白的变性。常用的保护剂包括，例如，甘油、蔗糖和牛血清白蛋白。

10.纳米颗粒脂质体制剂

本发明也包括用于局部递送核酸表达构建体的纳米颗粒脂质体制剂。例如，所述脂质体制剂可包含DOTAP和胆固醇。下面显示这些包含核酸表达构建体的制剂的实例。

可以等摩尔浓度将阳离子脂质(DOTAP)与中性脂质胆固醇(Chol)混合(Avanti Lipids)。可将混合的粉末状脂质溶解在1L圆底烧瓶中的HPLC级的氯仿(Mallinckrodt，Chesterfield，Mo.)中。溶解后，将该溶液在30℃下置于Buchi旋转式蒸发仪上旋转30分钟以形成薄膜。然后在真空下将装有薄膜的烧瓶干燥15分钟。一旦干燥完成，可在5％葡萄糖水溶液(D5W)中水化薄膜，从而产生20mM DOTAP和20mM胆固醇的终浓度，称为20mM DOTAP：Chol。可将水化的脂质膜在水浴中在50℃下旋转45分钟，然后在35℃下进行10分钟。然后使混合物在室温下在石蜡膜覆盖的烧瓶中静置过夜，之后在50℃下以低频率进行超声(Lab-Line，TranSonic820/H)，进行5分钟。超声后，将混合物转移至试管中并在50℃下加热10分钟，然后使用注射器通过不断减小的大小：1.0、0.45、0.2和0.1μm的Whatman(Kent，UK)过滤器进行连续挤压。可使用0.2μm和0.1μm的Whatman Anotop过滤器。在挤压后，可在4℃下在氩气气氛下贮存脂质体。

可在D5W中稀释例如150μg以质粒DNA的形式存在的核酸表达构建体。也可在分开的D 5W溶液中稀释贮存的脂质体。然后可将等体积的DNA溶液和脂质体溶液混合，从而产生例如150μg DNA/300μl体积(2.5μg/5μl)的终浓度。可在室温下进行稀释和混合。然后使用Pipetman移液器尖头将DNA溶液快速加在脂质体溶液的表面。然后可在移液器尖头中上下颠倒两次快速混合DNA：脂质体混合物以形成DOTAP：胆固醇核酸表达构建体复合物。

通过使用本说明书的教导和本领域技术人员的知识，可进行确定DOTAP：Chol-核酸表达复合物的颗粒大小的检测。例如，可使用N4-Coulter颗粒大小分析仪(Beckman-Coulter)确定DOTAP：Chol-核酸表达构建体复合物的颗粒大小。关于该确定，在确定颗粒大小之前应当将5μl新配制的复合物稀释在1ml水中。此外，也可将O.D.400nm处的复合物的分光光度计测量计数用于分析。关于该分析，可将5μl样品稀释在95μl D5W中以产生100μl的终体积。使用上述配制技术和大小分析方法应当证明复合物的大小在374至400nm之间。

11.冰棒制剂

通过使用本说明书的教导和本领域技术人员的知识，可配制用于递送以给口腔或胃肠道施用的冰棒形式存在的核酸表达构建体的药物制剂。此处将冰棒定义为包含手持放样器例如棒或鞘的冻结的液体制剂。例如，冰棒制剂可包含冰棒制剂和选择的核酸表达构建体的悬浮物。因此，冰棒制剂可由糖(20％w/v)、调味剂(1.0％w/v)、着色剂(0.5％w/v)和包含本发明的核酸的水溶液(80％w/v)的冰冻溶液组成。可将以液体形式存在的制剂的组分混合在一起，然后在冰棒模具中冰冻。冰棒制剂的其他实例可见于例如美国专利5,194,269和美国专利5,660,866中，其各自明确地在此以其全文引用作为参考。

12.透皮或经皮肤递送装置

本发明的某些实施方案涉及透皮或经皮肤递送装置，所述装置用于递送包含贴布(patch)和编码氨基酸序列的核酸的治疗剂，所述氨基酸序列能够预防或抑制受试者中的疾病例如受试者中的过度增生性病变的扩展。将所述治疗剂与贴布的表面接触。如上所示，所述治疗剂包含编码能够预防或抑制受试者中的疾病例如过度增生性病变扩展的氨基酸序列。

所述贴布可由本领域技术人员已知的任何材料组成。此外，可设计用于通过将贴布贴在受试者的身体表面(例如皮肤表面、口腔粘膜表面、伤口表面或瘤床表面)来递送治疗剂的贴布。可将贴布设计为任何形状或构形，可包括，例如，条带、绷带、带子、敷料(例如伤口敷料)或人造皮肤。在例如，美国专利5,770,219，美国专利6,348,450，美国专利5,783,208，美国专利6,280,766和美国专利6,555,131中详细地描述了透皮或经皮肤贴布的配制，所述专利各自明确地在本说明书的该部分和所有其他部分引用作为参考。

在一些实施方案中，可设计具有膜的装置以控制治疗剂的液体或半固体制剂通过皮肤和进入血流的速度。装置的组分可包括，例如，溶解或分散在贮器或惰性聚合物基质中的治疗剂；纸、塑料或箔的外侧衬背膜；和将贴布固定在皮肤上的压感胶粘剂(pressure-sensitive adhesive)。所述胶粘剂可以或可以不用释放衬里覆盖，必需在将贴布用于皮肤前将该释放衬里剥去。在一些实施方案中，将治疗剂装入水凝胶基质中。

在一些实施方案中，想要将治疗剂运输通过皮肤。因此，局部贴布制剂可包含皮肤渗透机制例如：氢氧化物释放剂和亲脂性共增强剂、用于电穿孔的经皮肤促吸剂、穿透增强剂和水性佐剂、包含甘油一酯和棕榈酸乙酯的皮肤渗透促进剂、来自刺胞动物门、腰鞭毛目和粘原虫门动物的刺细胞等。在例如美国专利6,835,392、在美国专利6,721,595、在美国专利6,946,144、在美国专利6,267,984和在美国专利6,923,976中详细描述了涉及皮肤渗透性机制的制剂，所述专利各自明确地在本说明书的该部分和所有其他部分引用作为参考。也涉及的是：如Bramson等人(2003)中所述，通过对皮肤使用很小的电阻元件使皮肤产生微孔，然后施用包含腺病毒载体的贴布；如Tuqan等人(2005)所述通过冷冻剂喷雾冷却增加皮肤的渗透性的方法；如Baxter等人(2005)所述的喷射诱导的皮肤穿刺；如Akomeah等人(2004)所述的皮肤的热处理；和刮擦皮肤以增加渗透性。

在其他实施方案中，设计贴布以使用低功率电流将治疗剂运输通过皮肤。在其他实施方案中，设计用于将药物被动传递通过皮肤或粘膜的贴布。在其他实施方案中，设计使用用于递送治疗剂的离子电渗疗法的装置。

所述装置可包含贮液器，其中将治疗剂包含在衬背层和控制治疗剂的递送速度的膜之间的溶液或悬浮液中。在其他实施方案中，所述装置包含含有治疗剂的基质，其中所述治疗剂存在于分散在胶原基质、聚合物或棉花垫的溶液或悬浮液中，从而使治疗剂与皮肤接触。在一些实施方案中，将胶粘剂用于递送系统的外侧边缘以使其能够附着至受试者的表面。

在一些实施方案中，所述装置由可在一段时间后在受试者皮肤上溶解的物质组成。例如，所述装置可以是可用于嘴粘膜表面的file或皮肤(skin)，其中所述装置在一段时间后溶解在嘴中。这些实施方案中的治疗剂可以用于装置的单个表面(即，与受试者接触的表面)，或浸溃入组成该装置的物质中。

在一些实施方案中，设计整合了超过一种治疗剂的装置。所述装置可包含分开的用于各治疗剂的贮器，或可在单个贮器中包含多种治疗剂。

此外，可设计基于受试者的身体的改变例如温度或排汗的变化而改变治疗剂的递送速度的装置。例如，可在覆盖在治疗剂的膜中包含某些试剂，所述膜响应温度变化从而允许改变药物通过所述膜的水平。在其他实施方案中，可通过改变(通过将温度控制型装置整合入该装置中)贴布的温度来改变治疗剂的透皮或经皮肤递送。

本领域技术人员熟悉通过使用贴布进行药物的透皮和经皮肤递送的方法和技术。

通过使用本说明书的教导和本领域技术人员的知识，可选择使用透皮递送贴布局部递送核酸表达构建体。在按照本说明书的教导和本领域技术人员的知识制备透皮贴布的过程中，可将核酸表达构建体、胶粘剂和渗透促进剂混合在一起，然后分配在硅化处理的聚酯释放衬里(Release Technologies，Inc.，W.Chicago，I11.)上。例如，所述透皮贴布制剂可由占组合物大约88％的丙烯酸共聚物粘合剂、2％的核酸表达构建体和10％的去水山梨糖醇单油酸酯渗透增强剂例如ARACEL 80^TM(ICI Americas，Wilmington，Del.)组成。然后可干燥和贮存混合物以用于治疗受试者。

13.胶粘剂

在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种胶粘剂。此处定义的胶粘剂一般是指促进或有利于核酸与表面接触或促进或有利于一个表面与另一个表面的接触的试剂或试剂的混合物。

用于药物制剂和药物的胶粘剂对于本领域技术人员来说是熟知的，其包括局部皮肤胶粘剂例如无菌的、液体胶以及固体或半固体胶粘剂。用于本发明的胶粘剂也包括在施用时是液体，但很快就干成固体粘胶的胶粘剂。

用于本发明的组合物和方法的示例性胶粘剂包括丙烯酸酯例如氰基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯和烷基丙烯酸酯。其他示例性胶粘剂包括水胶体、水凝胶、聚异丁烯和基于凝胶基质的胶粘剂例如基于聚丙烯酸的凝胶基质胶粘剂。

也涉及用于本发明的药物组合物和方法的组织胶粘剂。在美国专利申请20040199207、美国专利申请20030119985、美国专利申请20020116026、美国专利申请20020037323、美国专利6,723,114、美国专利6,596,318、美国专利6,329,337、美国专利6,310,036、美国专利6,299,631和美国专利6,251,370中详细描述了涉及组织胶粘剂的组合物，所述专利申请各自明确地在此引用作为参考。

通过使用本说明书的教导和本领域技术人员的知识，可用胶粘剂药物制剂局部地递送核酸表达构建体。例如，可通过混合基于氰基丙烯酸酯的胶粘剂例如甲氧基丙基氰基丙烯酸酯和共聚物来构建胶粘剂药物制剂。例如，所述共聚物可以是ε-己内酯-乙交酯/丙交酯-乙交酯共聚物。

通过混合例如0.13摩尔的乙交酯与1.18摩尔的ε-己内酯和催化剂量的辛酸亚锡(0.262mmole)和1-癸醇(3.275mmole)来构建ε-己内酯-乙交酯/丙交酯-乙交酯共聚物。将所述混合物加热至170℃的温度并搅拌大约30分钟，然后将所述混合物冷却至120℃以使能够加入大约0.65摩尔的乙交酯和0.52摩尔的d1-丙交酯。然后再加热所述混合物至170℃的温度并再搅拌6.5小时。然后通过在例如130℃的温度下在减小的压力下搅拌混合物1.5小时来从共聚物溶液中除去任何未反应的单体。

可将甲氧基丙基氰基丙烯酸酯、共聚物和核酸表达构建体的药物制剂混合在一起，然后用于受试者的局部表面。例如，所述混合物可以是大约90％的甲氧基丙基氰基丙烯酸酯、5％的共聚物和5％的核酸表达构建体。然而，本领域技术人员将认识到，表达构建体的确切浓度依赖于使用的表达构建体的类型，例如腺病毒载体，和使用目的。

通过使用本说明书的教导和本领域人员的知识，可选择使用粘性绷带(adhesive bandage)局部递送核酸表达构建体。可与粘性绷带一起使用的核酸表达构建体的实例是腺病毒载体。为了通过绷带转导皮肤，可用移液器将液体悬浮液形式的核酸表达构建体滴入粘性绷带的垫子。

可预处理局部表面以增强表达构建体的递送。例如，可剃除局部表面的毛发，或可用热、微孔、电穿孔、刮擦或化学方法预处理局部表面。如果需要，可使例如绷带保持与皮肤接触18小时或更长时间以达到治疗目的。

14.核酸吸收促进剂(nucleic acid uptake enhancer)

此处定义的“核酸吸收促进剂”是指可用于细胞的表面或与细胞的表面接触以促进对于所述细胞是外源的核酸的吸收的任何试剂或超过一种试剂的组合物。示例性试剂包括阳离子脂质。在美国专利6,670,332、美国专利6,399,588、美国专利6,147,055、美国专利5,264,618、美国专利5,459,127、美国专利5,994,317和美国专利5,861,397中更详细地描述了作为核酸吸收促进剂的阳离子脂质，所述专利各自明确地在此以其全文引用作为参考。可用于本发明的方法和组合物的阳离子脂质的实例包括季铵细胞转染剂(参见美国专利5,994,317和美国专利5,861,397。

15.剂量

基于想要的目的确定治疗剂或预防剂的有效量，所述想要的目的是例如(i)抑制过度增生性病变的扩大或(ii)诱导抗过度增生性病变的免疫应答。

本领域技术人员很好地认识到将基因递送至体内或离体状况的方法。对于病毒载体，人们一般制备病毒载体贮液。依赖于病毒的种类和可获得的滴度，可将1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹或1×10¹²个感染颗粒递送至患者。通过比较相对吸收效率可推断出脂质体或其他非病毒制剂的相似数据。下面描述作为药物可接受组合物的制剂。

施用的量(根据治疗的次数和剂量)依赖于被治疗的受试者、受试者的状况和想要的保护作用。治疗性组合物的精确量也依赖于医生的判断且对于各个体是独特的。

在某些实施方案中，给患者提供连续的治疗性组合物供给可以是想要的。对于局部施用，可使用重复施用。关于各种方法，可使用提供有限的但在长时期内提供恒定量的治疗剂的缓释制剂。对于体内施用，目的区域的连续灌注可以是优选的。这可通过在一些情况下在手术后插入导管，然后施用治疗剂来实现。针对特定患者和状况由临床医生来选择灌注的时间长度，但时间可在从大约1-2小时至2-6小时、至大约6-10小时、至大约10-24小时、至大约1-2天、至大约1-2周或更长的范围内变动。一般地，通过连续灌注的治疗性组合物剂量与由单次或多次注射提供的剂量相等，就施用药剂的时间段调整剂量。

J.受试者的表面的治疗

配制用于给受试者的表面施用的本发明的某些治疗性组合物。例如，所述表面可以是皮肤表面、病变表面、病变切除后的外科床、伤口表面、粘膜表面或空腔脏器的表面例如胃肠道的衬里。

可通过手术切除除去癌症，从而产生具有表面的“腔”。可在手术时或之后施用本发明的药物组合物。这基本上是腔的表面的“局部”治疗的一个实例。组合物的体积应当足以确保腔的整个表面被表达盒接触。

在此处所示的方法的一些实施方案中，使用敷贴施用药物组合物。涂药器(applicator)的实例包括海绵、刷子、棉花签敷料器等。在一些实施方案中，通过透皮或经皮肤的递送装置进行机械施用可以是想要的。通过刷子的施用可能需要刷子和局部表面之间的一种或多种相互作用。可通过反复地将刷子或海绵与所述表面接触或通过将刷子或海绵以直线、环形或组合运动的方式在皮肤上移动来将本发明的药物制剂用于局部表面。此外，可将刷子、海绵、透皮或经皮肤递送装置置于局部表面一段时间。可在肿瘤切除之后以及开始手术期间使用这些方法中的任一种。在另一个实施方案中，在手术进入位点闭合之前将导管插入腔中。然后连续灌注所述腔，进行想要的时间长度。在其他实施方案中，通过使用塞子样涂药器或泡沫分散涂药器(foamdispersion applicator)将本发明的药物制剂用于局部表面，例如阴道或直肠。涉及使用塞子样涂药器递送药物的方法见于美国专利6,588,043，涉及使用泡沫分散涂药器的方法见于美国专利4,112,942，所述专利各自明确地以其全文引用作为参考。

在该治疗的另一种形式中，诊断或治疗性组合物的“局部”施用被靶向天然的体腔例如嘴、咽、食道、喉、气管、胸膜腔、腹膜腔或中空器官腔包括膀胱、结肠、食道、胃或其他内脏器官。许多方法可用于实现至这些内脏器官或腔表面的“局部”施用。例如，只通过使用漱口剂或口腔清洗剂进行含漱就可影响到咽中的口腔。在一些施用中，重复多次口部含漱。在某些施用中，受试者可在吐出或吞咽之前将漱口剂或口腔清洗剂保持在口腔中进行一段时间。胃内的治疗可能需要提高酸性环境的pH。然而，咽和气管内的局部治疗可能需要内窥镜观察且治疗组合物的局部递送或施用需要通过喷雾或喷雾剂进行。内脏器官例如膀胱或结肠粘膜可能需要留置导管输注或再次用膀胱镜或其他内窥镜仪器直接观察。也可通过提供到达这些区域的留置导管或手术方法来进入体腔。

在其他实施方案中，为了增加屏障细胞(blocking cell)的渗透性和/或除去屏障细胞层可处理或预处理局部表面，从而提高核酸的吸收/病毒感染。所述治疗可包括使用洗剂，例如醋酸或其他膜透化剂。其他试剂包括低渗溶液、离子螯合剂、阳离子肽、闭合蛋白肽、经设计用于破坏连接复合体的细胞外部分的肽、细胞骨架破坏剂、抗体、醚、神经递质、甘油、FCCP、氧化剂和炎症介质。在其他特定的实施方案中，所述离子螯合剂可以是EGTA、BAPTA或EDTA；阳离子肽可以是聚L赖氨酸；细胞骨架破坏剂可以是细胞松弛素B或秋水仙素；神经递质可以是capsianoside；氧化剂可以是过氧化氢或臭氧；炎症介质可以是TNFα。抗体可以是抗E钙粘着蛋白抗体。

可选择地，可通过机械方法获得相同的效果。在某些实施方案中，所述治疗可包括刮除术以除去屏障细胞层。刮除可包括，例如除去0.1mm至超过3mm厚的屏障细胞。可用各种装置进行除去屏障细胞的局部表面刮除，所述装置是例如，但不限于医用刮铲(medicalspatul)、针、锐口牙刮匙、解剖刀、刀、皮肤摩擦装置或适合用于皮肤摩擦的颗粒制剂。用于皮肤刮除术的皮肤摩擦装置的实例见于美国专利6,629,091，其以其全文在此引用作为参考。

在一些实施方案中，所述治疗可包括使用激光消除局部表面的屏障细胞。在某些实施方案中，所述治疗可包括使用电极从局部表面除去屏障细胞。在其他实施方案中，所述治疗包括通过等离子气体电极除去屏障细胞。在其他实施方案中，所述治疗可包括用研磨清洁剂、冷冻处理(cryotreatment)或加热进行预处理。涉及使用激光从局部表面除去屏障细胞的方法见于美国专利5,423,803和美国专利6,273,884，通过电极除去屏障细胞的实例见于美国专利6,024,733和美国专利6,309,387，涉及通过等离子气体电极除去屏障细胞的实例见于美国专利6,629,974，所述专利各自以其全文在此引用作为参考。涉及使用加热来增加皮肤对于药物递送的透性的方法可见于美国专利4,898,592。

在某些实施方案中，肺粘膜的治疗可需要使用以喷雾剂的形式存在的吸入药物制剂。在一些实施方案中，可通过喷雾器装置将喷雾剂递送至肺粘膜。例如，本发明的药物制剂的递送可包括用于递送入受试者的肺的界面，例如烟嘴口、面罩(mask)、气管内插管、鼻管等。可将界面连接至吸入管(inhalation tube)。可将吸入管连接用于提供脉冲量的经过滤空气带来的药物制剂的装置。所述装置可包含具有脉冲空气的进气孔、具有扩散器挡板(diffuser baffle)和连接器的充气室的喷雾器，提供了对大气空气过滤的过滤器。涉及通过喷雾器递送药物制剂的方法可见于例如美国专利6,269,810和美国专利6,705,316，其各自在此以其全文引用作为参考。

K.预防性治疗

此处所示的方法的某些实施方案涉及在受试者中预防疾病或健康相关性状况的方法。预防性策略在今天的医疗中是至关重要的。例如，在治疗患有HNSCC的患者后，其有很大的机会(30-40％)获得第二个原发性肿瘤(Khuri等人，1997)。高风险群体的化学预防可减少第二原发性肿瘤的发展和提高存活率(Khuri等人，1997)。上呼吸消化道(UADT)的粘膜处于由于通过微小转移(Bedi等人，1996)或通过区域性癌变(Lydiatt等人，1998)而发生第二原发性肿瘤的风险中。因为在组织学和临床上表现正常的粘膜组织中发现基因改变，因此这些细胞可进一步形成第二原发性肿瘤。因此这些癌前细胞是治疗性基因转移的靶。阻止前癌细胞中的细胞周期的G1期可停止细胞进程。

预防性治疗的另一个实例是预防正常组织的感染或炎症，所述感染或炎症可由于活性氧簇例如由放射疗法诱导的活性氧簇效应原因而发生。例如，已知超氧化物歧化酶将超氧自由基解毒为过氧化氢。涉及编码超氧化物歧化酶的核酸的递送的方法和组合物见于例如美国专利5,599,712、美国专利6,221,712和美国专利6,887,856，其各自明确地以其全文在此引用作为参考。

可对其他疾病使用相同的策略。处于风险中的群体可包括具有危险度因子或以前曾被治疗的疾病的历史的受试者。

依照剂量、治疗次数和治疗的持续时间，被施用的药物组合物的量依赖于被治疗的受试者、受试者的状况、被预防的疾病的性质和想要的保护。治疗组合物的精确量也依赖于医生的判断且对于各个体是独特的。例如，组合物的施用频率可以是1天1次、1天2次、1周1次、1周2次或1月1次。治疗的持续时间可在1个月至1年或更长的时间范围内变化。此外，精确的预防方案将高度依赖于受试者、危险度因子的性质和医生的判断。

本发明的组合物也可在受试者中用于免疫预防疾病，例如通过接种或接种与免疫疗法的组合来进行。所述制剂可用于本领域技术人员已知的免疫接种方案。关于免疫预防和接种的方法示于Robinson等人(2003)和Plotkin等人(2003)，其各自在此明确地引用作为参考。

L.免疫反应的增强

在此处所示的方法的一些实施方案中，通过在受试者中增强免疫反应获得治疗性反应。可以为了疾病的免疫治疗或预防疾病的发生或进展的免疫预防目的增强免疫反应。在某些实施方案中，例如，所述疾病是癌症。在其他实施方案中，所述疾病是传染病或炎性疾病例如自身免疫性疾病。

因此，在某些实施方案中，可对受试者施用药物制剂以增强或诱导免疫反应。在某些实施方案中，治疗性核酸将编码或具有一个或多个免疫刺激剂例如，但不限于抗原佐剂和其他免疫调节剂。

在对受试者施用核酸后，靶受试者中包含的一个或多个细胞可表达由所述治疗性核酸编码的序列。示例性方案示于Robinson等人(2003)和Plotkin等人(2003)，其各自在此明确地引用作为参考。

在某些其他实施方案中，所述药物制剂自身可包含一种或多种其他的免疫刺激剂。在一些实施方案中，一种或多种其他的试剂以任何组合共价结合至抗原或其他免疫刺激剂。

抗原，可以是从例如癌基因、肿瘤抑制基因、其他自身基因例如酶和来源于微生物的基因产生的多肽序列。以前已公开了各种基因的核酸和蛋白、多肽和肽编码序列，所述序列可在本领域技术人员已知的计算机化的数据库中查找到。一个这样的数据库是美国国家生物技术信息基因库和GenPept数据库中心(Natioral Center forBiotechnology Information′s Genbank and GenPept databases)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)。可使用此处公开的技术或通过本领域技术人员已知的技术(例如，Sambrook等人，2001)扩增、组合和/或表达这些已知基因的编码区域。尽管核酸可在体外表达系统中表达，但在优选实施方案中所述核酸包含用于体内复制和/或表达的载体。

合适的佐剂包括所有可接受的免疫刺激物质，例如细胞因子、毒素或合成的组合物。可用于本发明的佐剂的非限定性目录包括：MDA-7、IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-干扰素、GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP化合物，例如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂质A(MPL)。包含从细菌中提取的三种组分MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和2％角鲨烯/Tween 80乳液中的细胞壁骨架(CWS)的RIBI、MHC抗原、完全弗氏佐剂(包含被杀死的结核分支杆菌的免疫反应非特异性刺激剂)、不完全弗氏佐剂、氢氧化铝、Adjumer^TM(即，PCPP盐；聚磷腈)；Adju-Phos(即，磷酸铝凝胶)；AlgalGlucan(即，b-葡聚糖；葡聚糖)；Algammulin(即，γ菊粉/铝混合物佐剂)；铝胶(即，氢氧化铝凝胶；铝)；抗原制剂(即，SPT、AF)；

(即，N，N-二(十八)烷基-N′，N′-二(2-羟乙基)丙二胺；CP20，961)；BAY R1005(即，N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-b-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基十二酰胺氢化乙酸)；钙三醇(即，la、25-二羟维生素D3；1，25-二(OH)2D3；1，25-DHCC；la、25-二羟胆钙化醇)；磷酸钙凝胶(即，磷酸钙)；霍乱全毒素(CT)和霍乱毒素B亚基(CTB)(即，CT；CTB亚基；CTB)；霍乱毒素A1-亚基-A蛋白D-片段融合蛋白(即，CTA1-DD基因融合蛋白)；CRL1005(即，嵌段共聚物P1205)；包含细胞因子的脂质体(即，包含细胞因子的脱水再水化的小泡)；DDA(即，二甲基二(十八)烷基溴化铵；二甲基二硬脂溴化铵(CAS注册号3700-67-2))；DHEA(即，脱氢表雄甾酮；雄甾烯二酮；普拉雄酮)；DMPC(即，二(十四)酰磷脂酰胆碱；1，2-二(十四)酰-sn-3-磷脂酰胆碱；(CAS注册号18194-24-6))；DMPG(即，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油；sn-3-磷脂酰甘油-1、2-二(十四)酰、钠盐(CAS注册号67232-80-8))；DOC/铝复合物(即，脱氧胆酸钠盐；DOC/Al(OH)3/矿物载体复合物)；弗氏完全佐剂(即，CIA；FCA)；弗氏不完全佐剂(即，IFA；FIA)；γ菊粉；Gerbu佐剂；GM-CSF(即，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；沙莫司亭(来源于酵母的rh-GM-CSF))；GMDP(即，N-乙酰氨基葡萄糖-(b1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CAS注册号70280-03-4))；咪喹莫特(即，1-(2-甲丙基)-IH-咪唑[4，5-c]喹林-4-胺；R-837；S26308)；ImmTherTM(即，N-乙酰氨基葡萄糖基-N-acetyhnuramyl-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-丙三醇二棕榈酸酯；DTP-GDP)；包含抗共刺激分子的抗体的免疫脂质体(即，从脱水-再水合小泡制备的免疫脂质体(DRVs))；干扰素-g(即，(rhIFN-γ，Genentech.Inc.)；免疫干扰素；IFN-g；γ-干扰素)；白细胞介素-1b(即，IL-10；IL-1；人白细胞介素1b成熟多肽117-259)；白细胞介素-2(即，IL-2；T细胞生长因子；阿地白介素(脱-丙氨酰基-1、丝氨酸-125人白细胞介素2)；

)；白细胞介素-7(即，IL-7)；白细胞介素-12(即，IL-12；天然杀伤细胞刺激因子(NKSF)；细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF))；ISCOM(s)TM(即，免疫刺激复合物)；Iscoprep 7.0.3.TM；脂质体(即，包含蛋白或Th-细胞和/或B细胞肽的脂质体(L)、或具有或不具有共捕获的白细胞介素、BisHOP或DOTMA的微生物；A，[L(抗原)])；罗唑利宾(即，7-烯丙基-8-氧代鸟嘌呤核苷)；LT-OA或LT口服佐剂(即，大肠杆菌不稳定性肠毒素原毒素)；MF59；MONTANIDE ISA 51(即，纯化的IFA；不完全弗氏佐剂)；MONTANIDEISA 720(即，可代谢的油佐剂)；MPLTM(即，3-Q-脱酰基-4′-单磷酰脂质A；3D-MLA)；MTP-PE(即，N-乙酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-(羟基-磷酰氧基))乙基酰胺、单钠盐)；MTP-PE脂质体(即，MTP-PE抗原呈递脂质体)；Murametide(即，Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3)；Murapalmitine(即，Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-二棕榈酰甘油)；D-Murapalmitine(即，Nac-Mur-D-Ala-D-isoGln-sn-二棕榈酰丙三醇)；NAGO(即，神经氨酸酶-半乳糖氧化酶)；非离子型表面活性剂小泡(即，NISV)；Pleuran(即，b-葡聚糖；葡聚糖)；PLGA、PGA和PLA(即，乳酸和羟基乙酸的同聚物和共聚物；丙交酯/乙交酯聚合物；聚乳酸共聚乙交酯)；Pluronic L121(即，泊洛沙姆401)；PMMA(即，聚甲基丙烯酸甲酯)；PODDSTM(即，类蛋白微球体)；Poly rA：Poly rU(即，聚腺苷酸聚尿嘧啶核苷酸复合物)；聚山梨醇酯80(即，吐温80；去水山梨糖醇单-9-十八烷酸酯聚(氧-1，2-乙二基)衍生物)；ProteinCochleate；QS-21(即，Stimulon^TM QS-21佐剂)；Quil-A(即，Quil-A皂角苷、Quillaja saponin)；Rehydragel HPA(即，高蛋白吸附剂氢氧化铝凝胶；铝)；Rehydragel LV(即，低粘度氢氧化铝凝胶；铝)；S-28463(即，4-氨基-八-二甲基-2-乙氧甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-乙醇)；SAF-1(即，SAF-m；Syntex佐剂制剂)；Sclavo肽(即，IL-1b 163-171肽)；Sendai蛋白脂质体、包含Sendai的脂质基质(即，包含Sendai糖蛋白的小泡；促融合蛋白脂质体；FPLs)；Span 85(即，Arlacel 85、去水山梨糖醇三油酸酯)；Specol；角鲨烷(即，鲨烯；

；2，6，10，15，19，23-六甲基二十四烷)；角鲨烯(角鲨烯；鲨烯；2，6，10，15，19、23-六甲基-2，6，10，14，18，22廿四碳六烯)；硬脂酰酪氨酸(即，十八烷基酪氨酸盐酸盐)；Theramide^TM(即，N-乙酰氨基葡萄糖基-N-acetylinuramyl-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-二棕榈酰氧丙酰胺(DTP-DPP))；苏氨酰基-MDP(即，Termurtide^TM；[thrl]-MDP；N-乙酰胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺)；Ty颗粒(即，Ty-VLPs、(病毒样颗粒))；Walter Reed脂质体(即，包含被吸附至氢氧化铝的脂质A的脂质体、[L(脂质A+抗原)+明矾])。

除了佐剂外，施用免疫调节剂例如反义RNA、RNAi、编码Cpg基元的核酸和生物反应修饰剂(BRMs)可以是想要的，已显示所述生物反应修饰剂上调T细胞免疫或下调抑制细胞的活性。这些BRM包括，但不限于，西米替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)；或低剂量的环磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)以及细胞因子例如g-干扰素、IL-2或IL-12或编码参与免疫辅助功能的蛋白例如B-7的基因。

在本发明的其他实施方案中，可给受试者施用编码或具有一个或多个免疫刺激剂的核酸，这样所述核酸的表达可在受试者中诱导体液或细胞介导的免疫反应。

该免疫反应可以是主动或被动免疫反应。可选择地，所述反应可以是过继免疫治疗方法的部分，在所述治疗方法中从动物(例如，患者)获得淋巴细胞，然后用包含抗原组分的组合物脉冲所述淋巴细胞。在该实施方案中，抗原组分可包含其他免疫刺激剂或编码这样的刺激剂的核酸。可从受试者的血液获得淋巴细胞，或可选择地从肿瘤组织获得淋巴细胞从而获得如Rosenberg等人，1986公开的肿瘤浸润淋巴细胞，所述参考资料在此引用作为参考。在特定的实施方案中，所述淋巴细胞是外周血淋巴细胞。在一个特定的实施方案中，可对相同的或不同的动物(例如，相同的或不同的供体)施用所述淋巴细胞。例如，所述动物(例如人)可具有或被怀疑具有癌症，例如乳腺癌或前列腺癌。在其他实施方案中，实施与癌症治疗法(例如，如在下面更详细描述的癌症疫苗疗法)相结合的增强免疫反应的方法。

靶受试者包含的一个或多个细胞可在对该受试者施用核酸后表达由该核酸编码的序列。示例性方案示于Robinson等人(2003)和Plotkin等人(2003)，其各自明确定地在此引用作为参考。

合适的肿瘤抗原的实例对于本领域技术人员来说是熟知的，其包括但不限于由Dalgleish，2004；Finn，2003；和Hellstrom和Hellstrom，2003描述的肿瘤抗原。其各自在此以其全文引用作为参考。

对粘膜表面局部施用编码肿瘤抗原的核酸可被当作预防性或防治性疗法，因此这些粘膜施用可产生抗过度增生性疾病例如癌症的随后发展的免疫保护。

在一些实施方案中，可在过度增生性疾病例如癌症的发展之前将编码肿瘤抗原的核酸用于粘膜表面。之前已报导了包含来源于微生物的一个或多个抗原的组合物的粘膜施用。这些研究表明这些抗原的粘膜施用可诱导抗感染这些表面的微生物的预防性免疫反应。(Gallichan等人，1993；Gallichan和Rosenthal，1995；Gallichan和Rosenthal，1996.)。相反地，已报导了在产生感染后经粘膜施用这些抗原可减少或消除重要的治疗益处。例如，在感染产生后施用目前可获得的脊髓灰质炎和肺炎球菌疫苗与在暴露于这些微生物之前施用相比可以说不具有治疗效应。

M.治疗的第二形式

1.概述

在本发明的某些实施方案中，本发明的方法涉及在受试者中检测、治疗或预防疾病，其中所述受试者接受一个或多个治疗的第二形式。

本发明的某些方面涉及对受试者例如人受试者施用人ACC的调节剂的方法。这些组合物可用于预防或治疗疾病，其中本领域技术人员已知或怀疑人ACC的调节剂的施用是有益的。

例如，如上所示，被治疗或预防的疾病或健康相关性状况可以是肥胖症、过度增生性疾病、心血管疾病、糖尿病或胰岛素抗性。人ACC的调节剂可与另一种药物或治疗方法一起施用。例如，用于在人受试者中治疗糖尿病的人ACC的调节剂的施用可在用于糖尿病的其他疗法(例如口服降血糖酸或胰岛素疗法)之前、之后或同时进行。可在血管成形术或冠状动脉旁路术后施用用于治疗急性心肌梗塞的人ACC的调节剂。在另一个实例中，可在用于治疗肥胖症的膳食干预或胃部手术之前或之后施用治疗或预防肥胖症的人ACC的调节剂。

对患者施用人ACC的调节剂将依照用于施用治疗剂的一般方案，且要考虑其他参数，包括，但不限于，患者的其他医疗状况和患者正在接受的其他疗法。预期必要时重复治疗周期。

可以数分钟至数周的范围内变动的间隔在其他疗法之前或之后进行使用本发明的人ACC的调节剂的治疗。在其中施用另一种药物的实施方案中，一般确保有效时段不超过每次递送的时间之间的间隔，这样所述试剂能够对细胞产生有利的组合效应。例如，可基本上同时(即，在少于大约1分钟内)与本发明的组合物一起施用2、3、4或更多剂量的一种药物。在其他方面，可在施用治疗量的本发明的组合物之前和/或之后大约1至大约48个小时或更多小时内或在此处未显示的任何时间长度之前和/或之后施用治疗剂或方法。在某些其他实施方案中，可在施用另一种治疗方式例如手术或药物治疗之前和/或之后大约1天至大约21天之内施用本发明的人ACC的调节剂。然而，在一些情况下，可能想要显著地延长治疗时间，其中在各个施用之间要间隔数周时间(例如，大约1至8周或更长时间)。

可使用各种组合，人ACC的调节剂被命名为“A”，而可以是任何其他治疗剂或方法的第二治疗命名为“B”：

A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/BB/A/B/B

B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A

B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A

2.第二抗癌疗法

可将本领域技术人员已知的许多癌症疗法与本发明的组合物一起使用。下面描述一些现有的癌症疗法和化学治疗剂。本领域技术人员认识到可与本发明的方法和组合物一起使用但不限于下面所示的治疗形式的其他抗癌疗法的存在和发展。

为了增加治疗性核酸的功效，将其与一种或多种在治疗过度增生性疾病方面有效的其他药剂或方案组合可以是想要的。可混合或分开施用治疗性组合物。治疗目的是杀死或抑制癌细胞的增殖。该方法可包括将细胞与表达构建体和药物或第二因子同时接触。这可通过将细胞与包含两种药物的单个组合物或药物制剂接触，或通过将所述细胞在相同的时间与两种不同的组合物或制剂接触来实现，其中一种组合物包含表达构建体而另一种包含第二药物。

可选择地，所述核酸疗法可以数分钟至数周范围内变化的间隔在其他治疗剂或方案之前或之后进行。在其中其他药剂和表达构建体分开使用的实施方案中，通常确保有效时段不超过各递送的时间之间的间隔，这样药剂和表达构建体仍然能够产生有利的组合治疗效应。在该情况下，可将细胞与两种治疗形式在相互之间相隔大约12-24小时之内，更优选地在相互之间相隔大约6至12小时之内接触。然而，在一些情况下，显著延长治疗的时段是想要的，其中各个施用之间要经过几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

可使用多种组合，例如，第一疗法为“A”，而第二疗法为“B”：

A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/BB/A/B/B

B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/AB/B/A/A

B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/AA/A/B/A

对患者施用本发明的治疗性核酸将依照用于施用化学治疗剂的一般方案，如果载体有毒性的话要考虑载体的毒性。预期必要时可重复治疗周期。各种标准的治疗法以及手术干预也可与所述的过度增生性细胞疗法一起使用。

a.放射疗法

放射疗法包括诱导DNA损伤的辐射和波例如γ辐射、X射线、紫外照射、微波、电子发射、放射性同位素等。可通过用上述形式的辐射照射被定位的肿瘤位置来获得治疗。所有这些因素最可能对DNA的前体、DNA复制和修复以及染色体的组装和维持造成广泛的DNA损伤。

X射线的剂量范围对于长时段(3至4周)在50至200伦琴的日剂量范围内变动，对于单一剂量为2000至6000伦琴。放射性同位素的剂量范围变化很广，且依赖于同位素的变衰期、发射的辐射的强度和种类以及被赘生性细胞的吸收。

在本发明的上下文中，放射疗法可在使用此处所示的治疗性核酸中的一种的治疗之前、期间或之后进行，且可按照标准的方案重复治疗。

b.手术

用于除去癌生长的手术治疗通常是用于治疗肿瘤和癌症的标准方法。该方法试图除去整个癌生长。然而，通常将手术与化学疗法和/或放射疗法一起使用以确保破坏任何残留的赘生性细胞或恶性细胞。因此，在本发明的上下文中，除了使用本发明的肿瘤细胞特异性肽外以获得细胞特异性癌症疗法，还可使用手术。

在手术干预的情况下，可在手术前使用本发明的组合物以使不能做手术的肿瘤受试者能够进行切除术。可选择地，可在手术时和/或之后使用本发明以检测或治疗残留或转移的疾病。例如，可通过使用本发明的一种药物组合物检测或治疗受试者口腔内切除的瘤床。所述施用可在术后继续进行。也涉及周期性术后治疗。

在某些实施方案中，被治疗的肿瘤可以是(至少在开始时)不可切除的。使用诊断性或治疗性病毒构建体的治疗可增加肿瘤的可切除性，这归因于边缘处的皱缩或某些特定侵袭性部分的消除。此外，包含报告基因的病毒构建体可帮助手术去除过度增生性细胞，所述报告基因具有导致特定组织类型颜色改变的能力。在进行治疗后，可能可以进行切除术。术后的其他治疗法将用于消除肿瘤位置上的微小残留疾病。

对于原发性肿瘤或术后瘤床，一般的疗程包括多剂给药。一般的原发性肿瘤治疗包括在两周的时间内施用6剂药物。可重复该两周方案1、2、3、4、5、6或更多次。在疗程中，可重新评估对完成计划的剂量给药的需要。

所述治疗可包括各种“单位剂量”。单位剂量定义为包含预先确定的量的治疗性组合物。被施用的量和特定途径以及制剂在临床域技内的技术人员的能力范围之内。单位剂量不一定以单次注射进行施，而且可包括在一段时间内连续输注。本发明的单位剂量可以根据病毒构建体的蚀斑形成单位(pfu)方便地进行描述。单位剂量在10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³pfu和更高的范围内变动。

c.化学治疗剂

癌症疗法也包括多种与基于化学和放射疗法组合的组合疗法。组合化学治疗剂包括，例如，顺铂(CDDP)、卡铂、甲基苄肼、双氯乙基甲胺、环磷酰胺、喜树碱、异磷酰胺、美法兰、氯氨布西、重硫酸盐、亚硝基脲(nitrosurea)、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、它莫西芬、紫杉酚、transplatinum、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱、苯并咪唑和甲氨蝶呤或其任何类似物或衍生变体。此处所用的术语“化学治疗剂”定义为使用可用于癌症的治疗的药物、毒素、化合物、组合物或生物实体。这些治疗剂可以是，例如直接与DNA交联的试剂、嵌入DNA的试剂、打断微管系统的试剂、导致肿瘤抑制蛋白积累的试剂和通过影响核酸合成导致染色体和有丝分裂异常的试剂。

此处设计和显示了直接交联核酸特别是DNA以产生DNA损伤，从而导致协同的抗瘤组合物的试剂。可使用药剂例如顺铂和其他DNA烷化剂。

破坏DNA的试剂也包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的物质。这些物质的实例包括阿霉素(也称作多柔比星)、VP-16(也称为依托泊苷)、维拉帕米、鬼臼毒素等。这些物质广泛用于治疗赘生物的临床环境，通过静脉内推注施用这些物质，对于阿霉素以21天的间隔以25至27mg/m²的浓度范围的剂量进行静脉内推注，对于依托泊苷以35-100mg/m²的浓度范围经静脉内或口服施用。

破坏细胞的微管系统的试剂包括例如苯并咪唑。苯并咪唑是广谱类型的驱虫药(antihelmintics)，该药展示了优秀的抗寄生线虫的活性和较低程度的抗绦虫和吸虫的活性。也已显示苯并咪唑是非常有效的抗原虫剂，其也具有抗真菌活性。目前认为，由于对微管系统的结合和破坏其功能，苯并咪唑产生了其细胞毒性效应(Lacey，1988；Friedman和Platzer，1980)。微管是苯并咪唑的靶的建议已受到使用蠕虫的富集提取物和哺乳动物微管蛋白的药物结合研究的结果(Lacey，1988)支持。此外，使用哺乳动物微管蛋白的竞争性药物结合研究已显示苯并咪唑在体外竞争秋水仙素的结合和抑制L1210鼠类白血病细胞的生长(Friedman和Platzer，1978；Lacey和Watson，1989)。然而，当作为驱虫药施用时苯并咪唑对线虫类具有选择性毒性而对宿主无毒性。相反地，苯并咪唑抑制哺乳动物微管蛋白的体外聚合。宿主和寄生虫大分子对于苯并咪唑的亲和力的差异(Russell等人，1992；Kohler和Bachmann，1981)和宿主与寄生虫之间的苯并咪唑的药物动力学之间的差异被认为是苯并咪唑的选择性毒性(Gottschall等人，1990)的原因，但该选择性毒性的实际分子基础仍然不清楚。

甲苯咪唑，或5-苯甲酰-2-苯并咪唑氨基甲酸甲酯是苯并咪唑类化合物的成员。最近，已发现甲苯咪唑通过在非小细胞肺癌细胞中解聚微管来诱导有丝分裂的停止和编程性细胞死亡。(Sasaki等人，2002)。也已发现甲苯咪唑在体外和体内都引发对人癌细胞的抗肿瘤效应(Mukhopadhyay等人，2002)。

作为由Brugmans等人(1971)进行的研究的结果，第一次引入甲苯咪唑治疗线虫感染。其是系列作为用于动物和人用途的广谱驱虫药(Van den Bossche等人，1982)的广泛用于动物和人的广谱驱虫药(Michiels等人，1982)的原型。具有驱虫特性的相关的苯并咪唑衍生物包括阿苯哒唑和氟苯达唑。其它的苯并咪唑是：芬苯达唑、阿苯哒唑、阿苯哒唑砜、奥苯达唑、rycobendazole、噻苯达唑、奥芬达唑、氟苯达唑和卡苯达唑。

甲苯咪唑导致受影响的蠕虫的皮层细胞和肠细胞中的细胞质微管的选择性消失。分泌物质在高尔基体区域积累，乙酰胆碱酯酶的分泌和葡萄糖的吸收被损害，且糖原被耗尽。甲苯咪唑的这些作用在宿主细胞中未出现。甲苯咪唑在体外具有对寄生虫微管蛋白的高亲和力，但其也结合宿主微管蛋白。因此其选择作用的生物化学基础还不清楚。(参见Van den Bossche，1981；Watts等人，1982)。

甲苯咪唑是高亲脂性的，具有小于1μg/ml的水溶解度。由此MZ的片剂吸收较差和不规律，血浆中药物的浓度非常低从而不能反映被摄入的剂量(Witassek等人，1981)。因此，甲苯咪唑的常规制剂导致较低的药物生物利用度和胃肠道的不稳定吸收。许多其他的苯并咪唑和苯并咪唑衍生物也是高度亲脂性的且被胃肠道无规律吸收。因此，苯并咪唑在用于口服或局部施用的药物制剂中可以是有利的。

可通过各种途径例如，但不限于：皮内、胃肠外、静脉内、肌内、鼻内和口服和局部施用来施用此处描述的各种化学治疗剂的施用途径。

d.免疫疗法

一般地，免疫疗法依赖于免疫效应细胞和分子靶向和破坏癌细胞的用途。免疫效应器可以是例如对于肿瘤细胞表面上的一些标记是特异性的抗体。所述抗体单独地可用作疗法的效应器或其可招募其他细胞以进行实际的细胞杀伤作用。也可将所述抗体缀合至药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)且只用作靶向试剂。可选择地，所述效应器可以是具有直接或间接地与肿瘤细胞靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。

因此免疫疗法可用作与此处所示的方法结合的组合疗法的部分。下面描述用于组合疗法的一般方法。一般地，肿瘤细胞必需具有易于靶向(即不存在于大部分其他细胞上的)一些标记。存在许多肿瘤标记且这些标记中的任一个可适合用于本发明的上下文中的靶向。常见的肿瘤标记包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿器官肿瘤相关性抗原(urinary tumor associated antigen)、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erbB和p155。

e.基因

在另一个实施方案中，第二疗法是另外的基因疗法，在所述疗法中，在此处所示的药物组合物施用之前、之后或同时施用其他形式的治疗性核酸(例如，用于静脉内递送的核酸制剂)。因此，例如，本发明涉及可使用不止一种此处所示的用于递送治疗性或预防性核酸序列的方法治疗受试者。在一些实施方案中，可使用同时编码两种基因的单个载体。

f.其他癌症疗法

其他癌症疗法的实例包括光疗法、冷冻疗法、毒素疗法或激素疗法。本领域技术人员知道该名单未穷举可获得的用于癌症或其他增生性病变的治疗模式的类型。

N.实施例

下列实施例用于展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当认识到后面的实施例中公开的技术代表了由本发明者发现在本发明的实施中良好地发挥功能的技术，因此可被认为组成了其实践的优选模式。然而，在本公开内容的教导下，本领域技术人员应当认识到可在公开的特定实施方案中进行许多改变且该改变仍能获得同样或相似的结果而不背离本发明的精神和范围。

实施例1

p53表达载体的构建

本实施例涉及用于构建p53表达载体的示例性技术。按所示构建该载体并将其用于取代腺病毒株系AdS基因组的E1区域(1.3-9.2m.u.)和用于构建下面在实施例2中描述的腺病毒病毒体。

将图1中显示的p53表达盒插入pXCJL1(由Dr.Frank L.Graham，McMaster University，Canada提供)的Xba I和Cla I位点之间，所述表达盒包含人巨细胞病毒(CMV)启动子(Boshart等人，1985)、p53 cDNA和SV40早期多腺苷酸化信号。所述基因组的大小为35.4kb，分成100个图谱单位(map unit)(1m.u.＝0.35kb)。p53表达盒取代Ad5基因组的E1区域(1.3-9.2m.u.)。

引物1具有序列5′-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3′(SEQ ID NO：1)且位于人CMV主要IE基因启动子(Boshart等人，1985)下游的第一内含子中。引物2具有序列5′-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3′(SEQ IDNO：2)且位于SV40早期多腺苷酸化信号中。两个引物与p53 cDNA插入子的两个末端相距15-20bp，其确定了1.40kb的PCR产物。引物3具有序列5′-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3′(SEQ ID NO：3)，引物4具有序列5′-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3′(SEQ ID NO：4)且分别位于Ad5基因组的11m.u.和13.4m.u.处，其确定了0.86kb的病毒基因组特异性PCR产物。使用本方法的变体构建这些载体的其他方法可用于构建p53表达载体。

实施例2

重组p53腺病毒的产生和增殖

本实施例描述了适合用于产生表达p53的辅助细胞非依赖性重组腺病毒的示例性方法。用于产生重组腺病毒的分子策略基于下列事实，该事实是：归因于腺病毒的包装限制，pJM17自身不能形成病毒。因此，在转染的细胞内p53表达载体质粒和pJM17之间的同源重组导致只可在表达必需的腺病毒蛋白的细胞中包装的有活力的病毒。

本实施例的方法使用293细胞作为增殖病毒的宿主细胞，所述病毒在E1或E3区域包含异源DNA表达盒替代。该方法需要将DNA共转染入293细胞。转染主要决定病毒增殖的功效。在本发明之前用于将DNA转染入293细胞的方法通常是磷酸钙/DNA共沉淀(Graham和van der Eb，1973)。然而，该方法，与噬菌斑测定一起使用时，相对较困难且通常导致病毒增殖的低效率。如在本实施例中举例说明的，当通过细胞病变效应(CPE)鉴定被转染的细胞时，通过使用脂质体介导的转染显著地提高被感染的细胞的转染和随后的鉴定。

将293细胞系保持在补充有10％热灭活的马血清的Dulbecco′s改良基本必需培养基中。按照厂商的方案(Boehringer MannheimBiochemicals，1992)通过DOTAP介导的转染将用于同源重组的p53表达载体和质粒pJM17(McGrory，等人，1988)共转染入293细胞。图1示意性地显示该方法。

在转染前在60mm培养皿或24孔板中温育293细胞(第35代，60％汇合度)24小时。用30.mu.l DOTAP、2.mu.g的p53表达载体和3.mu.g质粒pJM17转染各孔中的细胞。转染后，每隔2至3天用MEM培养基饲养细胞直至CPE开始。使用本领域技术人员熟知的这些技术和/或其他技术的变体产生和增殖腺病毒载体的其他方法也可用于此。

实施例3

通过转移的绿色荧光蛋白基因的端粒酶特异性扩增使用光学 成像进行肿瘤体内检测

本实施例提供了用于体内研究的示例性方案，可进行该方案以确定编码报告基因例如绿色荧光蛋白基因(gfp)的核酸表达构建体在鼠类模型中检测肿瘤的能力。在初始轮的体内试验中，可使用用人肺癌和结肠癌皮下注射的BALB/c nu/nu小鼠(Umeoka等人，2004)。例如，可用编码只能够在表达人端粒酶逆转录酶的细胞中表达gfp的核酸表达构建体治疗动物，所述端粒酶逆转录酶在＞85％的人癌细胞中具有活性但在大多数正常细胞中不具活性。因此，hTERT启动子优选地可作为驱动gfp表达的组织选择性启动子，因为hTERT表达的正常产物是人端粒酶逆转录酶。

例如，可在用人肺癌和结肠癌皮下注射的BALB/c nu/nu小鼠中就抗肿瘤活性的肿瘤检测对核酸表达构建体进行体内检测，所述构建体编码在hTERT启动子有效控制下的gfp。

然后可在荧光显微镜例如Eclipse TS-100荧光显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)下通过光学检查肿瘤组织样品估量核酸表达构建体的效果，所述核酸表达构建体编码在hTERT启动子有效控制下的gfp。

实施例4

使用编码肿瘤抑制基因的核酸表达构建体体内预防胃的肿瘤 发展

本实施例提供了体内研究的实例，可进行该体内研究以确定编码肿瘤抑制基因的核酸表达构建体在鼠类模型中抑制癌症的能力。在初始轮的体内试验中，可使用人胃和食管癌的小鼠模型(Dumon等人，2001)。例如，Fhit^-/-小鼠在暴露于致癌物N-亚硝基甲基苄胺(NMBA)后对致癌物诱导的食管和贲门窦中的肿瘤发展易感。可用编码人FHIT肿瘤抑制基因的核酸表达构建体处理动物以确定肿瘤发展的抑制。

例如，在暴露于NMBA的Fhit^-/-小鼠或本领域技术人员已知的癌症的任何其他鼠类模型中就抗肿瘤活性体内检测编码人FHIT肿瘤抑制基因的核酸表达构建体。与这些研究相结合，可在鼠类模型中估量编码人FHIT肿瘤抑制剂基因的核酸表达构建体的抗肿瘤活性。

简而言之，可在用致癌物例如NMBA预处理后，用编码人FHIT肿瘤抑制基因的核酸表达构建体处理合适的癌症模型的不同小鼠组。可检测编码人FHIT肿瘤抑制基因的核酸表达构建体的几个组合和浓度。对照小鼠应当只用NMBA进行预处理。

然后可通过肿瘤大小的检查和苏木精和伊红染色的肿瘤组织的组织病理学检查比较编码人FHIT肿瘤抑制基因的核酸表达构建体对处理小鼠相对于对照组的癌症发展的影响。也可通过将样品组织与抗人Fhit蛋白的C末端的兔抗人Fhit抗体一起温育，然后再与生物素化山羊抗兔抗体温育来进行免疫组织化学检查。

实施例5

AdCMV-p53：具有两周观察期的小鼠中的单剂口服生物分布研 究

方法

在施用8.3×10¹⁰(组2)、8.3×10¹¹(组3)或8.3×10¹²(组4)vp/kg的单次口服强饲剂量(oral gavage dose)后，在C57BL/6N小鼠中评估AdCMV-p53的生物分布。各处理组由6只雄性和6只雌性小鼠组成；相同大小的对照组(组1)只接受媒介物。在处理后第4或第15天，按下列顺序收集组织样品：卵巢/睾丸、肝脏、肾、肾上腺、脾、胃、淋巴结、回肠、直肠、心脏、肺、食管、肌肉、股骨、大脑和脊髓。将组织在液氮中快速冷冻并在-70±10℃下贮存。从眶后窦(retro-orbital sinus)抽取血液样品放入无菌EDTA血液收集管中，在4±2℃下贮存并在3天内进行处理以提取DNA。

从冷冻的组织样品中分离基因组DNA。各组DNA提取物包括来自单个动物的所有组织。首先对来自组1(对照)动物的组织进行提取，然后提取来自组2、3和4的组织。通过在260nm处的吸光率来定量组织和血液DNA样品并将其在低于-15℃的条件下贮存直至使用。

使用实时PCR(

PCR)进行定量PCR分析。引物产生包含CMV启动子和非翻译的p53 5’区域之间的接合处的70bp扩增产物。

PREYF：5’TTATGCGACGGATCCCGTAA 3’(SEQ ID NO：5)

PREYR：5’GCGTGTCACCGTCGTACGTA 3’(SEQ ID NO：6)

探针：5’CTTCGAGGTCCGCGGCCG 3’(SEQ ID NO：7)

测定灵敏度为0.5μg小鼠基因组DNA中100个载体DNA拷贝，且在模板在从10⁰至10⁵个拷贝的范围内变动时为线性。

各96孔PCR反应板包含不含DNA的负对照以鉴定污染的不存在，系列10倍稀释的AdCMV-p53 DNA用于产生标准曲线。以两份重复进行各PCR反应，其中一份掺入AdCMV-p53 DNA以确定不存在PCR抑制剂。

通过将未掺入的样品标绘在标准曲线上来定量阳性样品。PCR分析的结果表示为拷贝数/0.5μg小鼠组织DNA。值大于10个拷贝的样品被认为是阳性的。然而，因为不能恒定地获得10个拷贝的检测，10和100个拷贝之间的值可能是不精确的，因为其基于标准曲线被ABI 7700以内插入值替换。

结果

实时PCR分析恒定地检测0.5μg DNA中的100个拷贝的AdCMV-p53 DNA。10至100拷贝/0.5μg DNA的载体DNA水平被认为是低的(且不能被恒定地检测)，100-1000个拷贝/0.5μg DNA为中等水平，1000个拷贝以上/0.5μg DNA为高水平。低于10个拷贝/0.5μg DNA的Ad5CMV-p53 DNA水平被定义为不可计量的，因为假阴性可从样品中的少数拷贝的随机组合产生。

在高剂量组(8.3×10¹²vp/kg)中，对于剂量给药后第4天收集的组织和血液样品，在至少一个动物的肝、胃、肺、食管、肌肉、脑、脊髓和血液中检测到处于中等水平或更高水平(超过每0.5μgDNA 100拷贝)的AdCMV-p53 DNA(表9)。在第15天时，只有来自高剂量组的肺样品保持中等水平或高于中等水平的阳性。

在第4天在中等剂量组(8.3×10¹¹vp/kg)中，来自胃、肺、食管和血液的样品在中等水平或高于中等水平上呈阳性。在第15天时，在来自中等剂量动物的样品中，在肾上腺、心脏、肺、食管、肌肉和脊髓发现以中等水平或高于中等水平存在的AdCMV-p53DNA。

在低剂量组(8.3×10¹⁰vp/kg)中，在第4天只有来自受试的肺和血液样品对于中等水平或高于中等水平的AdCMV-p53 DNA呈阳性。在低剂量AdCMV-p53施用之后第15天，来自肺、食道和骨的样品在中等水平或更高水平上呈阳性。在任何对照样品中未检测到可定量的信号。下表列出了各种器官和组织中的AdCMV-p53 DNA平均量和在每0.5μg小鼠基因组DNA＞10个拷贝的AdCMV-p53上呈阳性的样品的数目。

绝大多数阳性样品是零星发生的。在给定的剂量和时间点所有样品都呈阳性的唯一器官是中等剂量动物(大约200拷贝/0.5ug)中的血液。其中6个样品中≥4个样品呈阳性的器官都在高剂量组中：肺(240,000个拷贝/0.5ug)、食管(900个拷贝/0.5ug)、血液(250个拷贝/0.5ug)和胃(110个拷贝/0.5ug)。

结论

在AdCMV-p53的单次口服剂量后，AdCMV-p53 DNA主要位于肺和食管中。在第4天，除了血液、肺和食管例外，AdCMV-p53 DNA的表现在大多数器官中呈零星的或阴性的。在第15天时，在低剂量和中等剂量动物中，对于Ad5CMV-p53 DNA呈阳性的器官比第4天时的多。在高剂量动物中，阳性器官的数目和器官中的AdCMV-p53DNA的绝对滴度从第4天至第15天减少。

本研究中AdCMV-p53 DNA PCR信号强度的剂量和时间依赖性不遵从在大多数其他生物分布研究中看到的趋势(剂量越高和时间越短则信号越强)。首先，在第15天检测到存在AdCMV-p53 DNA的器官比第4天的多(在低和中等剂量的组中)，表明使用口服施用途径的缓慢散播。第二，在第4天AdCMV-p53 DNA的水平和散播是剂量依赖性的，但在第15天不是。在第15天，AdCMV-p53 DNA的量在来自高剂量动物的器官中比来自中等剂量动物的器官(肺例外)中的低，且甚至在来自高剂量动物的许多器官中的量比来自低剂量动物的器官中的量更低。

实施例6

估量治疗性或诊断性核酸的制剂的功效的测定

通过使用本说明书的教导和本领域技术人员的知识，可估量核酸的各种制剂的功效。本领域技术人员理解作为治疗性或检测性试剂的特定核酸的制剂的功效依赖于许多因素，例如核酸的浓度、pH、制剂的温度、制剂的其他组分等。

例如，可通过本领域技术人员已知的许多技术中的任一技术就治疗功效检查特定核酸的各种制剂(其中这些因素中的任何因素或所有因素都是可改变的)。例如，如果被治疗或预防的疾病是过度增生性疾病例如癌症，那么可使用合适的人癌症的体内模型例如具有移植的肿瘤细胞的裸鼠评估这些制剂的治疗功效。例如，可确定特定的制剂是否显示在动物模型中减小肿瘤大小的功效。可在动物模型中评价制剂使用的频率和方法。可使用本领域技术人员熟知的信息估量治疗性反应和副作用的存在或不存在。

关于诊断性核酸例如编码报告蛋白的核酸，可使用本领域技术人员熟知的许多技术中的任一技术进行估量可检测蛋白在动物模型的细胞中存在或不存在的研究。例如，可进行使用技术例如实施例4中所示的技术进行的光学成像并与合适的对照比较。

实施例7

核酸制剂用于在疾病治疗的局部递送中的用途的临床试验 -一般考虑

本实施例总地来说涉及使用本发明的核酸制剂的人治疗方案的发展。特别地，这样的治疗可用于各种疾病的治疗，在所述各种疾病的治疗中，已知或认为施用核酸是有益处的。这些疾病的治疗实例包括过度增生性疾病例如癌症的治疗、伤口愈合和感染的治疗。在下面的实施例中描述关于癌症的更详细的实例。

进行临床试验的各种基础条件，包括临床患者的治疗和临控，在本公开内容的教导下对于本领域技术人员来说是已知的。下列信息可用作用于建立核酸制剂在临床试验中的用途的一般指导方针。

患有被靶向的疾病的患者可以是新诊断的患者或具有已有疾病的患者。具有已有疾病的患者可包括不能对常规治疗的至少一个疗程起反应的患者。

可单独地或与另一种治疗剂一起施用核酸制剂。可按照本说明书中所示的任何方法例如局部施用和口服施用来施用治疗性核酸。可在治疗的过程中例如除去患病组织的手术切除中施用所述药物。

起始剂量可以是，例如，0.5mg/kg体重。可在确定的毒性水平不存在的情况下在各剂量水平上治疗三个患者。可以100％的增量(例如，0.5mg、1mg、2mg、4mg)进行剂量增加直至特定水平的药物相关性毒性发生。此后可以25％的增量进行剂量增加。可分次进行施用的剂量。

可在数天或数周的时期内一次或多次施用核酸制剂。可单独地或与其他药物一起施用。

可在治疗之前和之后大约3-4周的间隔进行专门针对被治疗的疾病的体格检查、实验室检验和其他临床研究。实验室研究可包括确定疾病的程度或确定现有症状的原因的CBC、血小板分类计数(differential and platelet count)、尿检验、SMA-12-100(肝和肾功能检验)、凝血功能检查(coagulation profile)和任何其他合适的化学研究。

可按照本领域技术人员的任何方法确定对治疗的反应，所述反应极大地依赖于被治疗的病症。例如，当疾病是癌症时，可通过肿瘤大小的减少估量反应。可通过估量伤口大小和/或临床表现来估量伤口愈合。

实施例8

核酸制剂用于在癌症的治疗中的局部或口服递送的用途的临 床试验

本实施例描述了可用于使用此处所示的核酸制剂治疗人癌症患者的示例性方案。患者可以但不必已接受化学、放射或基因治疗疗法。最佳情况是患者可展示充分的骨髓功能(例如，＞2,000/mm3的外周粒细胞绝对计数和100,000/mm3的血小板计数，充分的肝功能(胆红素1.5mg/dl)和充分的肾功能(例如，肌酸酐1.5mg/dl)。

所述核酸制剂可以是此处所示的任何制剂，例如适合于局部或口服施用的制剂。所述制剂可在包含上面所示的任何媒介物、佐剂和载体的剂量单位制剂中包含一种或多种治疗性核酸。所述组合物可口服摄入或局部施用，例如使用涂药器。当使用组合疗法时，可在使用其他抗癌药之前、之后或同时施用所述组合物。

在一个实例中，疗程可包括在7至21天的时段中递送大约6剂药物。在临床医生选择后，所述方案在每三周或在更少频率(每月、每两月、每季等)的基础上继续使用6剂。当然，这些只是示例性的治疗次数，熟练的医生可容易地认识到也可能使用许多其他的时程(time-course)。

在一些实施方案中，施用可使核酸组合物局部用于皮肤或粘膜表面。在另一个实施方案中，可在肿瘤切除后将导管插入术后伤口内，可持续地对腔进行输注，进行想要的时间。

可通过本领域技术人员已知的可接受的度量确定临床反应。例如，可通过所有可测量的疾病消失至少一个月来定义完全反应。同时可通过所有可估量的肿瘤节(tumor nodules)的垂直直径的乘积总和的50％或更大的减少或至少一个月内没有显示肿瘤位点的扩大来定义部分反应。类似地，可通过所有可测量的病变的垂直直径的乘积减少50％或更多和一个或多位点的进程的减缓来定义混合反应。本领域技术人员可采用在本说明书中公开的信息来最优化治疗方案。

实施例9

核酸制剂用于伤口的治疗的用途的临床试验

通过使用本说明书的教导和本领域技术人员的知识，可设计可用于使用此处所示的一种核酸制剂(例如包含编码生长因子的核酸的制剂)在人受试者中促进伤口的治疗的方案。所述伤口可以是例如术后伤口(例如肿瘤切除后的伤口)或外伤性伤口。

通常可以包含上面所示的媒介物、佐剂和载体的单位剂量制剂将本发明的组合物局部施用至伤口。在某些情况下，所述制剂可包含编码抗癌药例如肿瘤抑制基因(除生长因子外)的核酸。此外，可以和或可以不和伤口的其他标准疗法例如抗生素疗法一起施用治疗性核酸。当使用组合疗法时，可在任何第二治疗剂施用之前、之后或同时施用治疗性核酸。当伤口是手术伤口时，可在手术方法之前、之后或同时施用疗法。

例如，疗程可包括在1至6天的时段递送大约6剂药物。在临床医生选择后，可在更多或更少频率的基础上持续进行该方案。当然，这些只是治疗的示例性次数，熟练的医生可容易地认识到可能使用许多其他时程。对治疗的反应可能是确定剂量方案的至关重要的因素。

在一个实施方案中，施用可仅使治疗性组合物局部用于伤口。在另一个实施方案中，可将导管插入伤口并持续输注伤口，进行想要的时间。

可通过本领域技术人员已知的任何可接受的度量确定临床反应，所述度量是例如伤口愈合迹象的目测，例如伤口大小的减小、炎症的减少等。

*  *  *  *  *  *  *  *

在本公开内容的教导下可产生和执行此处公开和声明的所有组合物和方法而无需过多的实验。尽管已以优选实施方案的方式描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员很明显的是可对此处描述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行改变但不背离本发明的概念、精神和范围。更特别地，很明显某些在化学和生理学上相关的试剂可用于替代此处描述的试剂但可获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员来说所有这些明显的相似的替代物和改变被认为在所附的权利要求确定的本发明的精神、范围和概念之内。

参考文献

下列参考文献，在其为此处提供示例性程序或其他详细内容补充的程度上，明确地在此引用作为参考。

美国专利6,348,502

美国专利4,112,942

美国专利4,321,251

美国专利4,372,944

美国专利4,415,723

美国专利4,458,066

美国专利4,469,863

美国专利4,526,899

美国专利4,627,979

美国专利4,682,195

美国专利4,683,202

美国专利4,797,368

美国专利4,868,168

美国专利4,898,592

美国专利4,919,918

美国专利4,946,778

美国专利5,023,243

美国专利5,078,993

美国专利5,139,941

美国专利5,158,761

美国专利5,194,269

美国专利5,250,298

美国专利5,264,618

美国专利5,354,855

美国专利5,372,801

美国专利5,423,803

美国专利5,456,918

美国专利5,459,127

美国专利5,470,561

美国专利5,571,314

美国专利5,599,712

美国专利5,645,897

美国专利5,652,194

美国专利5,660,866

美国专利5,672,344

美国专利5,681,827

美国专利5,695,746

美国专利5,770,219

美国专利5,783,208

美国专利5,795,715

美国专利5,830,499

美国专利5,861,397

美国专利5,874,094

美国专利5,888,493

美国专利5,888,773

美国专利5,889,136

美国专利5,914,334

美国专利5,925,565

美国专利5,928,906

美国专利5,935,819

美国专利5,993,785

美国专利5,994,317

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美国申请20050203047

美国申请20050260276

美国申请系列09/351,778

Agrawal，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：7595，1991.

Akomeah等人，Eur.J.Pharm.Sci.，21(2-3)：337-45，2004.

Aksentijevich等人，Hum.Gene Ther.，7(9)：1111-1122，1996.

Alam and Cook，Anal.Biochem.，188：245-254，1990.

Alauddin and Conti，Nucl.Med.Biol.，25(3)：175-180 1998.

Alauddin等人，Nucl.Med.Biol.，23(6)：787-792 1996.

Angel等人，Cell，49：729，1987b.

Angel等人，Mol.Cell.Biol.，7：2256，1987a.

Atchison和Perry，Cell，46：253，1986.

Atchison和Perry，Cell，48：121，1987.

Atiyeh等人，In：State of the Art in Burn Treatment，World J.Surgery，2005.

Auricchio等人，Hum.Gene Ther.，14(3)：255-261，2003.

Banerji等人，Cell，27(2 Pt 1)：299-308，1981.

Banerji等人，Cell，33(3)：729-740，1983.

Bates等人，Nature，395：124-125，1998.

Batterson和Roizman，J.Virol.，46(2)：371-377，1983.

Baxter和Mitragotri，J.Control.Release，106(3)：361-73，2005.

Bedi等人，Cancer Res.，56(11)：2484-2487，1996.

Berkhout等人，Cell，59：273-282，1989.

Bernstein等人，Nature，409：363-366，2001.

Bianco，Expert Opin.Drug Deliv.，1(1)：57-65，2004.

Blanar等人，EMBO J.，8：1139，1989.

Blasberg，Mol.Cancer Ther.，2(3)：335-343，2003.

Blasberg，Nucl.Med.Biol.，30(8)：879-888，2003.

Block，In：Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman等人(Eds.)，

Marcel Dekker，NY，1：335，1988.

Blumberg等人，Cell，104(1)：9-19，2001.

Bodine和Ley，EMBO J.，6：2997，1987.

Bok and Bok，In：Manual of Wound Management and Healing，

McGraw-Hill Professional，第1版，2004.

Boshart等人，Cell，41：521，1985.

Bosze等人，EMBO J.，5(7)：1615-1623，1986.

Braddock等人，Cell，58：269，1989.

Bramson等人，Gene Ther.，10(3)：251-60，2003.

Brennecke等人，Cell，113：25-36，2003.

Brugmans等人，JAMA，217：313-316，1971.

Bulla and Siddiqui，J.Virol.，62：1437，1986.

Burns等人，In：Dermatology--Rook′s Textbook of Dermatology，

Burns等人，(Eds.)，，Blackwell Publishers；7th Ed.，2004.

Caley等人，J.Virology，71(4)：3031-3038，1997.

Campbell和Villarreal，Mol.Cell.Biol.，8：1993，1988.

Campere和Tilghman，Genes and Dev.，3：537，1989.

Campo等人，Nature，303：77，1983.

Caplen等人，Gene，252(1-2)：95-105，2000.

Carbonelli等人，FEMS Microbiol.Lett.，177(1)：75-82，1999.

Celander和Haseltine，J.Virology，61：269，1987.

Celander等人，J.Virology，62：1314，1988.

Chandler等人，Cell，33：489，1983.

Chandler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(8)：3596-601，1997.

Chang等人，Hepatology，14：134A，1991.

Chang等人，Mol.Cell.Biol.，9：2153，1989.

Chatterjee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9114，1989.

Choi等人，Cell，53：519，1988.

Clark等人，Hum.Gene Ther.，6(10)：1329-1341，1995.

Clayman等人，Cancer Res.，55(14)：1-6，1995.

Cocea，Biotechniques，23(5)：814-816，1997.

Coffin，In：Virology，Fields等人(Eds.)，Raven Press，NY，1437-1500，1990.

Cohen等人，J.Cell.Physiol.，5：75，1987.

Cook等人，Cell，27：487-496，1981.

Costa等人，Mol.Cell.Biol.，8：81，1988.

Couch等人，Am.Rev.Resp.Dis.，88：394-403，1963.

Cowdery等人，J.Immunol.，156：4570-4575，1996

Cripe等人，EMBO J.，6：3745，1987.

Culotta and Hamer，Mol.Cell.Biol.，9：1376，1989.

Dalgleish，Expert Rev.Vaccines，3(6)：665-668，2004.

Dandolo等人，J.Virology，47：55-64，1983.

Davis et al，Curr.Biol.，6：146-148，1996.

De Villiers等人，Nature，312(5991)：242-246，1984.

de Waal等人，J.Exp.Med.，174：1209 1220，1991.

DeLuca等人，J.Virol.，56(2)：558-570，1985.

Deschamps等人，Science，230：1174-1177，1985.

Devulapalle and Mooser，J.Dent.Res.，80(2)：466-469，2001.

Doench等人，Genes Dev.，17：438-42，2003.

Doerr，Nat.Methods，2(11)：808，2005.

Doukas等人，Hum Gene Ther.，12(7)：783-98，2001.

Du and Zamore，Development，132(21)：4645-4652，2005.

Dubey等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100(3)：1232-1237，2003.

Dumon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98(6)：3346-3351 2001.

Dumoutier等人，J.Immunol.，164(4)：1814-1819.，2000.

Edbrooke等人，Mol.Cell.Biol.，9：1908，1989.

Edlund等人，Science，230：912-916，1985.

Eicher等人，Clin.Cancer Res.，2(10)：1659-1664，1996.

Ekmekcioglu等人，Int.J.Cancer，94(1)：54-59，2001.

Ekmekciouglu等人，Melanoma Res.，9(3)：261-272，1999.

Elbashir等人，EMBO，20(23)：6877-6888，2001.

Elbashir等人，EMBO，20(23)：6877-6888，2001.

Elbashir等人，Genes Dev.，5(2)：188-200，2001.

Elbashir等人，Genes Dev.，5(2)：188-200，2001.

Elroy-Stein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86(16)：6126-6130，1989.

Eriksson和Vranckx，Am.J.Surg.，188(1A Suppl)：36-41；2004.

Feng和Holland，Nature，334：6178，1988.

Ferguson and O’Kane，Biol.Sci.，359(1445)：839-850，2004.

Finn等人，Cancer Chemother.Biol.Response Modif.，21：223-233，2003.

Finn，Nat.Rev.Immunol.，3(8)：630-641，2003.

Firak and Subramanian，Mol.Cell.Biol.，6：3667，1986.

Fire等人，Nature，391(6669)：806-811，1998.

Flotte和Carter，Gene Ther.，2(6)：357-62，1995.

Flotte等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，7(3)：349-356，1992.

Flotte等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(22)：10613-10617，1993.

Foecking和Hofstetter，Gene，45(1)：101-105，1986.

Forster和Symons，Cell，49(2)：211-220，1987.

Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3348-3352，1979.

Friedman和Platzer，Biochim.Biophys.Acta，544：605-614，1978.

Friedman和Platzer，Biochim.Biophys.Acta，630：271-278，1980.

Fujita等人，Cell，49：357，1987.

Gabizon等人，Cancer Res.，50(19)：6371-6378，1990.

Gallichan等人，J Infect Dis.，168(3)：622-629，1993.

Gallichan和Rosenthal，J.Exp.Med.，194(5)：1879-1990，1996.

Gallichan和Rosenthal，Vaccine，13(16)：1589-1595，1995.

Gallagher等人，Genes Immun.，1(7)：442-450，2000.

Gambhir等人，J. Nucl.Med.，39(11)：2003-2011，1998.

Gerlach等人，Nature(London)，328：802-805，1987.

Ghosh and Bachhawat，In：Liver Diseases，Targeted Diagnosis andTherapy Using Specific Receptors and Ligands，Wu等人(Eds.)，Marcel Dekker，NY，87-104，1991.

Ghosh-Choudhury等人，EMBO J.，6：1733-1739，1987.

Gilles等人，Cell，33：717，1983.

Glorioso等人，Mol.Biotechnol.，4(1)：87-99，1995.

Gloss等人，EMBO J.，6：3735，1987.

Godbout等人，Mol.Cell.Biol.，8：1169，1988.

Gomez-Foix等人，J.Biol.Chem.，267：25129-25134，1992.

Goodbourn和Maniatis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：1447，1988.

Goodbourn等人，Cell，45：601，1986.

Goodchild，Bioconjugate Chem.，1：165□187，1990.

Gottschall等人，Endocrinology，127(1)：272-277，1990.

Graham和Prevec，In：Methods in Molecular Biology：GeneTransfer and Expression Protocol，Murray(Ed.)，Humana Press，NJ，7：109-128，1991.

Graham and Van Der Eb，Virology，52：456-467，1973.

Graham等人，J.Gen.Virl.，36(1)：59-74，1977.

Greene等人，Immunology Today，10：272，1989

Grishok等人，Cell，106：23-34，2001.

Grishok等人，Science，287：2494-2497，2000.

Grosschedl和Baltimore，Cell，41：885，1985.

Grunhaus和Horwitz，Seminar in Virology，3：237-252，1992.

Gu等人，Mol.Ther.，9(5)：699-711，2004.

Guo等人，J.Dent.Res.，83(3)：266-270，2004.

Halpern等人，Cell Immunol.，167(1)：72-78，1996.

Haslinger和Karin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：8572，1985.

Hauber和Cullen，J.Virology，62：673，1988.

Hellstrom和Hellstrom，Expert Rev.Vaccines，2(4)：517-532，2003.

Hen等人，Nature，321：249，1986.

Hensel等人，Lymphokine Res.，8：347，1989.

Hermonat和Muzycska，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6466-6470，1984.

Herr和Clarke，Cell，45：461，1986.

Hersdorffer等人，DNA Cell Biol.，9：713-723，1990.

Herz和Gerard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2812-2816，1993.

Higuchi等人，Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing  Co.，Easton，Pa.，301，1985.

Hirochika等人，J.Virol.，61：2599，1987.

Hirsch等人，Mol.Cell.Biol.，10：1959，1990.

Holbrook等人，Virology，157：211，1987.

Holland和Holland，J Biol Chem，255(6)：2596-605，1980.

Honess和Roizman，J.Virol.，14(1)：8-19，1974.

Honess和Roizman，J.Virol.，16(5)：1308-130826.1975.

Hooper等人，J.Biolumin.Chemilumin.，5(2)：123-130，1990.

Horlick和Benfield，Mol.Cell.Biol.，9：2396，1989.

Horwich，等人，J.Virol.，64：642-650，1990.

Huang等人，Cell，27：245，1981.

Hug等人，Mol.Cell.Biol.，8：3065，1988.

Hutvagner and Zamore，Science，297(5589)：2056-2060，2002.

Hutvagner等人，Science，293：834-838，2001.

Hwang等人，Mol.Cell.Biol.，10：585，1990.

Idson，In：Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman(Eds.)，1：199，1988.

Imagawa等人，Cell，51：251，1987.

Imbra和Karin，Nature，323：555，1986.

Imler等人，Mol.Cell.Biol.，7：2558，1987.

Imperiale和Nevins，Mol.Cell.Biol.，4：875，1984.

Jakobovits等人，Mol.Cell.Biol.，8：2555，1988.

Jameel和Siddiqui，Mol.Cell.Biol.，6：710，1986.

Jaynes等人，Mol.Cell.Biol.，8：62，1988.

Jiang等人，Nature，375：151-155，1995.

Jiang等人，Oncogene，11(12)：2477-2486，1995.

Jiang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(17)：9160-9165，1996.

Johnson等人，Mol.Cell.Biol.，9：3393，1989.

Jones and Shenk，Cell，13：181-188，1978.

Joyce，Nature，338：217-244，1989.

Kadesch和Berg，Mol.Cell.Biol.，6：2593，1986.

Kaneda等人，Science，243：375-378，1989.

Kaplitt等人，Nat Genet.，8(2)：148-154，1994.

Karin等人，Mol.Cell.Biol.，7：606，1987.

Karin等人，Mol.Cell.Biol.，7：606，1987.

Karlsson等人，EMBO J.，5：2377-2385，1986.

Katinka等人，Cell，20：393，1980.

Kato等人，J.Biol.Chem.，266：3361-3364，1991.

Kawamoto等人，Mol.Cell.Biol.，8：267，1988.

Ketting等人，Cell，99(2)：133-141，1999.

Ketting等人，Genes Dev.，15(20)：2654-2659，2001.

Khuri等人，J.Natl.Cancer Inst.，89(3)：199-211，1997.

Kiledjian等人，Mol.Cell.Biol.，8：145，1988.

Kim and Cook，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84(24)：8788-8792，1987.

Klamut等人，Mol.Cell.Biol.，10：193，1990.

Klinman，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(7)：2879-2883，1996.

Knapp等人，Atherosclerosis，152(1)：217-227，2000.

Knight and Bass，Science，2：2，2001.

Koch等人，Mol.Cell.Biol.，9：303，1989.

Koehne等人，Nat.Biotechhol.，21(4)：405-413，2003.

Kohler和Bachmann，Mol.Biochem.Parasitol.，4(5-6)：325-336，1981.

Kornberg 和Baker，DNA Replication，2nd Ed.，Freeman，SanFrancisco，1992.

Kotenko等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(4)：1695-1700，2000.

Kotin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87(6)：2211-2215，1990.

Krieg等人，Nature，374：546-549，1995.

Kriegler和Botchan，In：Eukaryotic Viral Vectors，Gluzman(Ed.)，Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1982.

Kriegler和Botchan，Mol.Cell.Biol.，3：325，1983.

Kriegler等人，Cell，38：483，1984.

Kriegler等人，Cell，53：45，1988.

Kuhl等人，Cell，50：1057，1987.

Kundra等人，J.Nucl.Med.，43(3)：406-412，2002.

Kundra等人，Q J Nucl.Med.Mol.Imaging，49(4)：325-338.2005.

Kunz等人，Nucl.Acids Res.，17：1121，1989.

Lacey和Watson，Biochem.Pharmacol.，34：1073-1077，1989.

Lacey，Int.J.Parasitol.，18(7)：885-936，1988.

LaFace等人，Virology，162(2)：483-486，1988.

Larsen等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA.，83：8283，1986.

Laspia等人，Cell，59：283，1989.

Latimer等人，Mol.Cell.Biol.，10：760，1990.

Laughlin等人，J.Virol.，60(2)：515-524，1986.

Le Gal La Salle等人，Science，259：988-990，1993.

Lebkowski等人，Mol.Cell.Biol.，8(10)：3988-3996，1988.

Lee等人，Nature，294：228，1981.

Lee等人，Nucleic Acids Res.，12：4191-206，1984.

Levenson等人，Hum.Gene Ther.，9(8)：1233-1236，1998.

Levinson等人，Nature，295：79，1982.

Levrero等人，Gene，101：195-202，1991.

Liang等人，Nucleic Acids Res.，3：33(19)：e170，2005.

Lin and Avery，Nature，402：128-129，1999.

Lin等人，Mol.Cell.Biol.，10：850，1990.

Linchey和Fridovich，Free Radic.Biol.Med.，23(4)：668-671，1997.

Liu等人，Cancer Res..，55(14)：3117-3122，1995.

Luria等人，EMBO J.，6：3307，1987.

Lusky and Botchan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：3609，1986.

Lusky等人，Mol.Cell.Biol.，3：1108，1983.

Lydiatt等人，Cancer，82(7)：1376-1380，1998.

Macejak和Sarnow，Nature，353：90-94，1991.

MacLaren等人，Gene Ther.，6：785-791，1999.

Majors和Varmus，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：5866，1983.

Mann等人，Cell，33：153-159，1983.

Markowitz等人，J.Virol.，62：1120-1124，1988.

McCarty等人，J.Virol.，65(6)：2936-2945，1991.

McGrory等人，Virology，163(2)：614-617，1988.

McLaughlin等人，J.Virol.，62(6)：1963-1973，1988.

McNeall等人，Gene，76：81，1989.

Messina等人，J.Immunol.，147(6)：1759-1764 1991.

Michel和Westhof，J.Mol.Biol.，216：585-610，1990.

Michiels等人，Arch.Int.Pharmacodyn Ther.，256(2)：180-191，1982.

Miksicek等人，Cell，46：203，1986.

Montgomery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：15502-15507，1998.

Mordacq和Linzer，Genes and Dev.，3：760，1989.

Moreau等人，Nucl.Acids Res.，9：6047，1981.

Mourelatos等人，Genes Dev.，16(6)：720-728，2002.

Muesing等人，Cell，48：691，1987.

Mukhopadhyay等人，Clin.Cancer Res.，8(9)：2963-2969，2002.

Muzyczka，Curr.Topics Microbiol.Immunol.，158：97-129，1992.

Neville等人，In：Dentistry--Oral&Maxillofacial Pathology，W B Saunders；2nd Ed.，2001.

Ng等人，Nuc.Acids Res.，17：601，1989.

Nicolas和Rubenstein，In：Vectors：A survey of mol ecularcloning vectors and their uses，Rodriguez and Denhardt(Eds.)，Stoneham：Butterworth，494-513，1988.

Nicolau和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190，1982.

Nicolau等人，Methods Enzymol.，149：157-176，1987.

Ohi等人，Gene，89(2)：279-282，1990.

Ondek等人，EMBO J.，6：1017，1987.

Ornitz等人，Mol.Cell.Biol.，7：3466，1987.

Palmiter等人，Nature，300：611，1982.

Paskind等人，Virology，67：242-248，1975.

PCT Appln.WO 00/44914

PCT Appln.WO 01/36646

PCT Appln.WO 01/68836

PCT Appln.WO 0208436

PCT Appln.WO 0231168

PCT Appln.WO 0285287

PCT Appln.WO 0333029

PCT Appln.WO 98/07408

PCT Appln.WO 99/32619

Pech等人，Mol.Cell.Biol.，9：396，1989.

Pelletier和Sonenberg，Nature，334(6180)：320-325，1988.

Perez-Stable和Constantini，Mol.Cell.Biol.，10：1116，1990.

Picard and Schaffner，Nature，307：83，1984.

Pinkert等人，Genes and Dev.，1：268，1987.

Plotkin等人，In：Vaccines，W.B.Saunders Company，第4版.，2003.

Ponta等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：1020，1985.

Porton等人，Mol.Cell.Biol.，10：1076，1990.

Pos t等人，Cell，24(2)：555-65，1981.

Queen和Baltimore，Cell，35：741，1983.

Quinn等人，Mol.Cell.Biol.，9：4713，1989.

Racher等人，Biotechnology Techniques，9：169-174，1995.

Ragot等人，Nature，361：647-650，1993.

Redondo等人，Science，247：1225，1990.

Reinhart等人，Nature，403：901-906，2000.

Reinhold-Hurek和Shub，Nature，357：173-176，1992.

Reisman和Rotter，Mol.Cell.Biol.，9：3571，1989.

Renan，Radiother.Oncol.，19：197-218，1990.

Resendez Jr.等人，Mol.Cell.Biol.，8：4579，1988.

Rich等人，Hum.Gene Ther.，4：461-476，1993.

Ripe等人，Mol.Cell.Biol.，9：2224，1989.

Rittling等人，Nuc.Acids Res.，17：1619，1989.

Robinson等人，In：Vaccine Protocols(Methods in MolecularMedicine)，Humana Press，第2版，2003.

Rosen等人，Cell，41：813，1988.

Rosenberg等人，Science，223：218-1321，1986.

Rosenfeld等人，Science，252：431-434，1991.

Rosenfeld，等人，Cell，68：143-155，1992.

Rosoff，In：Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，第2版，1：245，Lieberman等人(Eds.)，1989.

Roux等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9079-9083，1989.

Russell等人，Biochem Pharmacol.，43(5)：1095-1100，1992.

Sakai等人，Genes and Dev.，2：1144，1988.

Sambrook等人，In：Molecular cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001.

Samulski等人，J.Virol.，63：3822-3828，1989.

Sarver等人，Science，247：1222-1225，1990.

Sasaki等人，Mol.Cancer Ther.，1(13)：1201-1209，2002.

Satake等人，J.Virology，62：970，1988.

Saxena et al，J.Biol.Chem.，278(45)：44312-44319，2003.

Scanlon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10591-10595，1991.

Schaefer等人，Cell Signal，12(3)：143-151，2000.

Schaffner等人，J.Mol.Biol.，201：81，1988.

Scheit，In：Synthesis and Biological Function，Wiley-Interscience，NY，171-172，1980.

Searle等人，Mol.Cell.Biol.，5：1480，1985.

Sharp和Marciniak，Cell，59：229，1989.

Sharp和Zamore，Science，287：2431-2433，2000.

Sharp，Genes Dev.，13：139-141，1999.

Shaul和Ben-Levy，EMBO J.，6：1913，1987.

Shelling and Smith，Gene Therapy，1：165-169，1994.

Sherman等人，Mol.Cell.Biol.，9：50，1989.

Siegfried，Exp.Clin.Endocrinol.，101(1)：7-11，1993.

Simon等人，BMJ，328(7452)：1358-1362，2004.

Sleigh和Lockett，J.EMBO，4：3831，1985.

Smith和Moss，Gene，25(1)：21-8，1983.

Solodin等人，Biochemistry，34(41)：13537-13544，1995.

Soo等人，J.Cell.Biochem，，74(1)：1-10，1999.

Spalholz等人，Cell，42：183，1985.

Spandau和Lee，J.Virology，62：427，1988.

Spandidos和Wilkie，EMBO J.，2：1193，1983.

Stephens和Hentschel，Biochem.J.，248：1，1987.

Stratford-Perricaudet and Perricaudet，In：Human Gene Transfer，Eds，Cohen-Haguenauer and Boiron，John Libbey Eurotext，France，51-61，1991.

Stratford-Perricaudet等人，Hum.Gene.Ther.，1：241-256，1990.

Straus等人，J.Cell Biol.，99(5)：1838-1847，1984.

Stuart等人，Nature，317：828，1985.

Sullivan and Peterlin，Mol.Cell.Biol.，7：3315，1987.

Sun等人，Gene Ther.，8：1572-1579，2001.

Suresh等人，Exp.Hematology，21：18281993.

Swartzendruber和Lehman，J.Cell.Physiology，85：179，1975.

Tabara等人，Cell，99(2)：123-132，1999.

Takebe等人，Mol.Cell.Biol.，8：466，1988.

Tang等人，Blood，104(9)：2704-2713，2004.

Tarnawski，Dig.Dis.Sci.，50Suppl 1：S 24-33，2005.

Tavernier等人，Nature，301：634，1983.

Taylor and Kingston，Mol.Cell.Biol.，10：165，1990a.

Taylor and Kingston，Mol.Cell.Biol.，10：176，1990b.

Taylor等人，J.Biol.Chem.，264：15160，1989.

Temin，In：Gene Transfer，Kucherlapati(Ed.)，NY，Plenum Press，149-188，1986.

Thierry等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92(21)：9742-9746，1995.

Thiesen等人，J.Virology，62：614，1988.

Tjuvajev等人，Cancer Res.，58：4333-4341，1998.

Top等人，J.Infect.Dis.，124：155-160，1971.

Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.，4：2072-2081，1984.

Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.，5：3258-3260，1985.

Treisman，Cell，42：889，1985.

Tronche等人，Mol.Biol.Med.，7：173，1990.

Trudel和Constantini，Genes and Dev.，6：954，1987.

Tsukamoto等人，Nat.Genet.，9(3)：243-248，1995.

Tuqan等人，Lasers Med.Sci.，20(2)：80-6，2005.

Tyndell等人，Nuc.Acids.Res.，9：6231，1981.

Uhlmann和Peyman，Chem.Rev.，90：544-584，1990.

Umeoka et al，Cancer Res.，64：6259-6265，2004.

Van den Bossche等人，Chemother.，19：67-128，1982.

Van den Bossche，Ann.Soc.Belg.Med.Trop.，61：287-296，1981.

Vannice and Levinson，J.Virology，62：1305，1988.

Vasseur等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA，77：1068，1980.

Vogelstein等人，Nature，408(6810)：307-310，2000.

Waller等人，Microsurgery，24(3)：168-173，2004.

Walsh等人，J.Clin.Invest，94：1440-1448，1994.

Wang and Calame，Cell，47：241，1986.

Watts等人，Biochem.Pharmacol.，31：3035-3040，1982.

Weber等人，Cell，36：983，1984.

Wei等人，Gene Therapy，1：261-268，1994.

Weinberger等人Mol.Cell.Biol.，8：988，1984.

Wheeler等人，Gastrointerology，120：1241-1250，2001

Wheeler等人，Hum.Gene Ther.，12：2167-2177，2001

Wincott等人，Nucleic Acids Res.，23(14)：2677-2684，1995.

Winoto和Baltimore，Cell，59：649，1989.

Witassek等人，Eur.J.Clin.Pharmacol.，20：427-433，1981.

Wong等人，Gene，10：87-94，1980.

Xu等人，Curr.Biol.，13：790-795，2003.

Yamamoto等人，J.Immunol.，148：4072-4076，1992.

Yang and Huang，Gene Therapy，4(9)：950-960，1997.

Yang等人，J.Virol.，68：4847-4856，1994.

Yang等人，Radiology，235(3)：950-958，2005.

Yanoff等人，In：Opthalmology Ophthalmology，2^ND Bk&Cdr Ed.，2003.

Yoder等人，Blood，82(Supp.)：1：347A，1994.

Yutzey等人Mol.Cell.Biol.，9：1397，1989.

Zeng等人，Cancer Res.，62(13)：3630-3635，2002.

Zhang等人，Endocrinology，141：4698-4710，2000.

Zhou等人，Exp.Hematol，21：928-933，1993.

Zhou等人，J.Exp.Med.，179：1867-1875，1994.

Zhu等人，Science，261(5118)：209-211，1993.

序列表

<110>CLARKE，PETER

CHADA，SUNIL

MENANDER，KERSTIN

SOBOL，ROBERT E.

ZHANG，SHUYUAN

<120>允许靶细胞长期暴露于治疗性和预防性核酸的局部施用

<130>INGN：132WO

<140>PCT/US2006/002255

<141>2006-01-20

<150>60/645,826

<151>2005-01-21

<150>60/692,481

<151>2005-01-21

<160>7

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>1

ggcccacccc cttggcttc    19

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>2

ttgtaaccat tataagctgc    20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>3

tcgtttctca gcagctgttg    20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>4

catctgaact caaagcgtgg    20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>5

ttatgcgacg gatcccgtaa    20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>6

gcgtgtcacc gtcgtacgta    20

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>7

cttcgaggtc cgcggccg      18

Claims (179)

1.包含治疗性核酸和/或诊断性核酸的药物组合物，其中将所述组合物配制为锭剂、棒棒糖、冰棒、口胶剂、凝胶条、膜剂、水凝胶、溶解条或固体棒。

2.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物包含治疗性核酸。

3.权利要求2的药物组合物，其中所述治疗性核酸编码治疗性蛋白。

4.权利要求3的药物组合物，其中所述治疗性蛋白是肿瘤抑制剂、促凋亡蛋白、细胞因子、生长因子、激素、肿瘤抗原或酶。

5.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物包含编码报告蛋白的诊断性核酸。

6.权利要求5的药物组合物，其中所述报告蛋白是生长抑素受体、碘化钠共运输体、真核生物绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、萤光素酶、β半乳糖苷酶或胸苷激酶。

7.权利要求1的药物组合物，其中所述治疗性核酸包含或编码siRNA、核酶、mRNA、寡核苷酸或CpG寡核苷酸。

8.权利要求1的药物组合物，其中所述制剂还包含胶原、甘油、PEG、含水二氧化硅、纤维素、黄原酸胶、聚糖卡波姆956、吐温80、氟化物、角叉菜聚糖、粘合剂或核酸吸收增强剂。

9.权利要求8的药物组合物，其中所述粘合剂包含丙烯酸酯、水胶体、水凝胶、基于聚丙烯酸的凝胶基质、聚异丁烯、硅酮聚合物或其混合。

10.权利要求9的药物组合物，其中所述丙烯酸酯包括氰基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或烷基丙烯酸酯。

11.权利要求8的药物组合物，其中所述核酸吸收增强剂包括阳离子脂质。

12.权利要求11的药物组合物，其中所述阳离子脂质是bis-guanidinium-tren-chloesterol或1，2-二油酰-3-(三甲基铵)propate(DOTAP)。

13.权利要求1的药物组合物，其中将所述核酸配制为锭剂。

14.权利要求1的药物组合物，其中将所述核酸配制为溶解条。

15.权利要求1的药物组合物，其中将所述组合物配制为水凝胶。

16.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物是包含黄原凝胶的口胶剂。

17.权利要求1的药物组合物，其中一些或所有组合物已冻干。

18.权利要求4的药物组合物，其中所述肿瘤抑制剂是mda7、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、子宫珠蛋白、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)或SEMA3多肽。

19.权利要求18的药物组合物，其中所述肿瘤抑制剂是p53。

20.权利要求18的药物组合物，其中所述肿瘤抑制剂是FUS1、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)或SEM A3多肽。

21.权利要求4的药物组合物，其中所述促凋亡蛋白是CD95、caspase-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK或BID。

22.权利要求4的药物组合物，其中所述细胞因子是GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32 IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、TGF-α、TGF-β、VEGF或mda7。

23.权利要求22的药物组合物，其中所述细胞因子是mda7。

24.权利要求4的药物组合物，其中所述肿瘤抗原是Mel anA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C关联蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、ING1、乳腺珠蛋白(mamaglobin)、细胞周期蛋白B1、S100、BRCA1、BRCA2、肿瘤免疫球蛋白独特型、肿瘤T细胞受体克隆型、MUC-1、或表皮生长因子受体。

25.权利要求5的药物组合物，其中所述报告蛋白包括荧光蛋白。

26.权利要求25的药物组合物，其中所述荧光蛋白是蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白或其生物学活性衍生物。

27.权利要求1的药物组合物，其中所述核酸包含在表达盒中，所述表达盒包含有效地偶联至所述核酸的启动子，其中所述启动子在受试者的细胞中是有活性的。

28.权利要求27的药物组合物，其中病毒载体中包含所述表达盒。

29.权利要求28的药物组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体、杆状病毒载体、细小病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、新培斯病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、小RNA病毒载体、α病毒载体或痘病毒载体。

30.权利要求29的药物组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体。

31.权利要求28的药物组合物，其中所述病毒载体是溶瘤病毒。

32.权利要求31的药物组合物，其中所述溶瘤病毒过度表达ADP。

33.权利要求32的药物组合物，其中所述溶瘤病毒选自Ad5、d1327、pm734.1、d1309、d101/07、KD1、KD2、KD3和d11520以及VRX-007。

34.权利要求30的药物组合物，其中所述组合物包含编码p53的治疗性核酸。

35.权利要求30的药物组合物，其中所述组合物包含编码mda7的治疗性核酸。

36.权利要求30的药物组合物，其中所述组合物包含编码FUS1的治疗性核酸。

37.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物还包含递送剂。

38.权利要求37的药物组合物，其中所述递送剂是脂质。

39.权利要求38的药物组合物，其中所述脂质包含在脂质体中。

40.权利要求39的药物组合物，其中所述脂质体还定义为DOTAP：胆固醇纳米颗粒。

41.权利要求27的药物组合物，其中所述启动子是组成型启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子或组织选择性启动子。

42.权利要求41的药物组合物，其中所述组织选择性启动子选择性地在过度增生性细胞中具有活性。

43.权利要求42的药物组合物，其中所述启动子选自hTert启动子、CEA启动子、PSA启动子、probasin启动子、ARR2PB启动子和AFP启动子。

44.权利要求8的药物组合物，其中所述核酸吸收增强剂是阳离子脂质。

45.权利要求44的药物组合物，其中所述阳离子脂质是bis-guanidinium-tren-cholesterol或1，2-二油酰-3-(三甲基铵)propate(DOTAP)。

46.权利要求44的药物组合物，其中所述阳离子脂质是季铵细胞转染剂。

47.包含治疗性核酸和/或诊断性核酸的非腺病毒药物组合物，其中将所述组合物配制为凝胶、糊剂、泡沫、结晶浆液、乳膏、软膏、栓剂或粉剂。

48.权利要求47的药物组合物，其中所述核酸包含在表达盒中，所述表达盒包含有效地偶联至该核酸的启动子，其中所述启动子在受试者的细胞中具有活性。

49.权利要求48的药物组合物，其中所述表达盒包含在病毒载体中。

50.权利要求49的药物组合物，其中所述病毒载体是杆状病毒载体、细小病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、新培斯病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体或小RNA病毒载体、α病毒载体或痘病毒载体。

51.权利要求50的药物组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体。

52.权利要求51的药物组合物，其中所述组合物包含编码p53的治疗性核酸。

53.权利要求51的药物组合物，其中所述组合物包含编码mda7的治疗性核酸。

54.权利要求51的药物组合物，其中所述组合物包含编码p53的治疗性核酸。

55.权利要求51的药物组合物，其中所述组合物包含编码FUS1的治疗性核酸。

56.权利要求47的药物组合物，其中将所述组合物配制为糊剂。

57.权利要求56的药物组合物，其中所述糊剂进一步定义为牙膏。

58.包含治疗性和/或诊断性核酸和粘合剂的药物组合物。

59.权利要求58的药物组合物，其中所述组合物包含治疗性核酸。

60.权利要求59的药物组合物，其中所述治疗性核酸编码肿瘤抑制剂、促凋亡蛋白、细胞因子、生长因子、激素、肿瘤抗原或酶。

61.权利要求60的药物组合物，其中所述肿瘤抑制剂是mda7、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、子宫珠蛋白、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)或SEMA3多肽。

62.权利要求60的药物组合物，其中所述促凋亡蛋白是CD95、caspase-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bc1-2、MST1、bbc3、Sax、BIK或BID。

63.权利要求60的药物组合物，其中所述细胞因子是GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32 IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、TGF-α、TGF-β、VEGF或mda7。

64.权利要求60的药物组合物，其中所述肿瘤抗原是MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Me l-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C关联蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、ING1、乳腺珠蛋白(mamaglobin)、细胞周期蛋白B1、S100、BRCA1、BRCA2、肿瘤免疫球蛋白独特型、肿瘤T细胞受体克隆型、MUC-1、或表皮生长因子受体。

65.权利要求58的药物组合物，其中所述核酸是编码荧光蛋白的诊断性核酸。

66.权利要求65的药物组合物，其中所述荧光蛋白是蓝色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白或其生物学活性衍生物。

67.权利要求58的药物组合物，其中所述核酸包含在表达盒中，所述表达盒包含有效地偶联至该核酸的启动子，其中所述启动子在受试者的细胞中具有活性。

68.权利要求67的药物组合物，其中所述表达盒包含在病毒载体中。

69.权利要求68的药物组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体、杆状病毒载体、细小病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、新培斯病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体或痘病毒载体。

70.权利要求69的药物组合物，其中所述病毒载体是腺病毒载体。

71.权利要求70的药物组合物，其中所述组合物包含编码p53的治疗性核酸。

72.权利要求70的药物组合物，其中所述组合物包含编码mda7的治疗性核酸。

73.权利要求70的药物组合物，其中所述组合物包含编码FUS1的治疗性核酸。

74.权利要求68的药物组合物，其中所述病毒载体是溶瘤病毒。

75.权利要求74的药物组合物，其中所述溶瘤病毒选自Ad5、dl327、pm734.1、dl309，dl01/07、KD1、KD2、KD3和dl1520。

76.权利要求67的药物组合物，其中所述表达盒包含在递送剂中。

77.权利要求76的药物组合物，其中所述递送剂是脂质。

78.权利要求77的药物组合物，其中所述脂质包含在脂质体中。

79.权利要求78的药物组合物，其中所述脂质体进一步定义为DOTAP：胆固醇纳米颗粒。

80.权利要求67的药物组合物，其中所述启动子是组成型启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子或组织选择性启动子。

81.权利要求80的药物组合物，其中所述组织选择性启动子选择性地在过度增生性细胞中具有活性。

82.权利要求81的药物组合物，其中所述启动子选自hTert启动子、CEA启动子、PSA启动子、probasin启动子、ARR2PB启动子和AFP启动子。

83.权利要求58的药物组合物，其中所述粘合剂包含丙烯酸酯、水胶体、水凝胶、基于聚丙烯酸的凝胶基质、聚异丁烯、硅酮聚合物或其混合物。

84.权利要求83的药物组合物，其中所述丙烯酸酯包括氰基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或烷基丙烯酸酯。

85.权利要求58的药物组合物，其中组合物配制为可通过透皮贴布、条带、绷带、带子、敷料或人造皮肤施用。

86.权利要求58的药物组合物，其中将所述组合物配制为液体、半固体或固体。

87.权利要求58的药物组合物，其中所述组合物还包含核酸吸收增强剂。

88.权利要求87的药物组合物，其中所述核酸吸收增强剂是阳离子脂质。

89.权利要求88的药物组合物，其中所述阳离子脂质是bis-guanidinium-tren-chloesterol或1，2-二油酰-3-(三甲基铵)propate(DOTAP)。

90.用于递送治疗性或诊断性试剂至受试者的透皮或经皮递送装置，其包括：

a)贴布；和

b)包含编码报告蛋白、肿瘤抑制剂、促凋亡蛋白、生长因子、肿瘤抗原或细胞因子的核酸的用于贴布的至少一个表面的药物组合物。

91.权利要求90的装置，其中所述核酸编码肿瘤抑制剂，所述肿瘤抑制剂选自mda7、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、子宫珠蛋白、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zacl、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、Gene 26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene 21(NPRL2)或SEM A3多肽。

92.权利要求91的装置，其中所述肿瘤抑制剂是FUS1、Gene 26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene 21(NPRL2)或SEM A3多肽。

93.权利要求91的装置，其中所述核酸编码选自CD95、caspase-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK或BID的促凋亡蛋白。

94.权利要求90的装置，其中所述核酸编码细胞因子，其中所述细胞因子选自GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32 IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、TGF-α、TGF-β、VEGF和mda7。

95.权利要求90的装置，其中所述核酸编码肿瘤抗原。

96.权利要求90的装置，其中所述核酸包含在表达盒中，所述表达盒包含有效地连接至该核酸的启动子，所述启动子在所述受试者的细胞中具有活性。

97.权利要求96的装置，其中所述表达盒包含在病毒载体中。

98.权利要求97的装置，其中所述病毒载体是腺病毒载体、杆状病毒载体、细小病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、新培斯病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体或痘病毒载体。

99.权利要求98的装置，其中所述病毒载体是腺病毒载体。

100.权利要求99的装置，其中所述治疗性核酸编码FUS1。

101.权利要求99的装置，其中所述治疗性核酸编码mda7。

102.权利要求99的装置，其中所述治疗性核酸编码p53。

103.权利要求90的装置，其中所述药物组合物还包含核酸吸收增强剂。

104.权利要求103的装置，其中所述核酸吸收增强剂是阳离子脂质。

105.权利要求104的装置，其中所述阳离子脂质是bis-guanidinium-tren-cholesterol或1，2-二油酰-3-(三甲基铵)propate(DOTAP)。

106.权利要求104的装置，其中所述阳离子脂质是季铵细胞转染剂。

107.在受试者中检测、治疗或预防疾病的方法，其包括给所述受试者施用权利要求1或权利要求58中所示的药物组合物。

108.权利要求107的方法，其中所述核酸编码报告蛋白，且其中所述方法进一步定义为检测受试者中的病变的方法。

109.权利要求108的方法，其中所述病变是过度增生性病变。

110.权利要求109的方法，其中所述过度增生性病变是癌症。

111.权利要求110的方法，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、子宫颈癌、结肠癌、肾癌、皮肤癌、头与颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤或白血病。

112.权利要求107的方法，其中所述核酸是治疗性核酸。

113.权利要求112的方法，其中所述治疗性核酸编码肿瘤抑制剂、促凋亡蛋白、细胞因子或生长因子。

114.权利要求113的方法，其中所述肿瘤抑制剂选自mda7、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、子宫珠蛋白、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)或SEM A3多肽。

115.权利要求112的方法，其中所述肿瘤抑制剂是FUS1、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene 21(NPRL2)或SEM A3多肽。

116.权利要求113的方法，其中所述促凋亡蛋白是CD95、caspase-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK或BID。

117.权利要求113的方法，其中所述细胞因子是GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32 IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、TGF-α、TGF-β、VEGF或mda7。

118.权利要求112的方法，其中所述治疗性核酸编码肿瘤抗原。

119.权利要求112的方法，其中所述方法进一步被定义为在粘膜表面诱导免疫反应的方法，且其中将所述药物组合物施用于受试者的粘膜表面。

120.权利要求107的方法，其中所述组合物包含编码报告蛋白的诊断性核酸。

121.权利要求120的方法，其中所述报告蛋白是荧光蛋白。

122.权利要求121的方法，其中所述荧光蛋白是蓝色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白或其生物学活性衍生物。

123.权利要求107的方法，其中所述组合物包含编码生长因子的治疗性核酸。

124.权利要求123的方法，其中所述生长因子是表皮生长因子、角质形成细胞生长因子或肝细胞生长因子。

125.权利要求107的方法，其中所述方法进一步定义为促进受试者的伤口愈合的方法。

126.权利要求107的方法，其中所述核酸是治疗性核酸，且其中所述方法进一步定义为防止或抑制受试者中过度增生性病变的扩展的方法。

127.权利要求126的方法，其进一步定义为用于防止或抑制受试者中的口腔发育异常或粘膜白斑病的方法。

128.权利要求107的方法，其中所述核酸包含在表达盒中，所述表达盒包含有效地连接至该核酸的启动子，其中所述启动子在受试者的细胞中具有活性。

129.权利要求128的方法，其中所述表达盒包含在病毒载体中。

130.权利要求129的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体、杆状病毒载体、细小病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、新培斯病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体或痘病毒载体。

131.权利要求130的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体。

132.权利要求131的方法，其中所述治疗性核酸编码FUS1。

133.权利要求131的方法，其中所述治疗性核酸编码mda7。

134.权利要求131的方法，其中所述治疗性核酸编码p53。

135.权利要求107的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

136.权利要求135的方法，其中所述哺乳动物是人。

137.权利要求136的方法，其中所述人是癌症患者或具有癌前病变的患者。

138.权利要求107的方法，其中施用药物组合物包括使用涂药器将所述药物组合物施用于受试者的身体表面。

139.权利要求107的方法，其还包括鉴定需要疾病的检测、预防或治疗的受试者。

140.权利要求139的方法，其中所述核酸是治疗性核酸，且其中所述方法还包括给受试者施用一种或多种第二形式的治疗。

141.检测、治疗或预防受试者中的疾病的方法，其包括给所述受试者施用权利要求47中所示的药物组合物。

142.权利要求141的方法，其中所述核酸编码报告蛋白，且其中所述方法进一步定义为在受试者中检测病变的方法。

143.权利要求142的方法，其中所述病变是过度增生性病变。

144.权利要求143的方法，其中所述过度增生性病变是癌症。

145.权利要求144的方法，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、子宫颈癌、结肠癌、肾癌、皮肤癌、头与颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤或白血病。

146.权利要求141的方法，其中所述核酸是治疗性核酸。

147.权利要求146的方法，其中所述治疗性核酸编码肿瘤抑制剂、促凋亡蛋白、细胞因子或生长因子。

148.权利要求147的方法，其中所述肿瘤抑制剂选自mda7、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、子宫珠蛋白、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、Gene 26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)或SEMA3多肽。

149.权利要求148的方法，其中所述肿瘤抑制剂是FUS1、Gene26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、Gene21(NPRL2)或SEM A3多肽。

150.权利要求147的方法，其中所述促凋亡蛋白是CD95、caspase-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK或BID。

151.权利要求147的方法，其中所述细胞因子是GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32 IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、TGF-α、TGF-β、VEGF或mda7。

152.权利要求146的方法，其中所述治疗性核酸编码肿瘤抗原，所述肿瘤抗原选自MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C关联蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、ING1、乳腺珠蛋白(mamaglobin)、细胞周期蛋白B1、S100、BRCA1、BRCA2、肿瘤免疫球蛋白独特型、肿瘤T细胞受体克隆型、MUC-1和表皮生长因子受体。

153.权利要求146的方法，其中所述方法进一步定义为在粘膜表面诱导免疫反应的方法，且其中将所述药物组合物施用于受试者的粘膜表面。

154.权利要求141的方法，其中所述组合物包含编码报告蛋白的诊断性核酸。

155.权利要求154的方法，其中所述报告蛋白是荧光蛋白。

156.权利要求155的方法，其中所述荧光蛋白是蓝色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白或其生物学活性衍生物。

157.权利要求141的方法，其中所述组合物包含编码生长因子的治疗性核酸，且其中所述方法进一步定义为促进受试者的伤口愈合的方法。

158.权利要求157的方法，其中所述生长因子是表皮生长因子、角质形成细胞生长因子或肝细胞生长因子。

159.权利要求141的方法，其中所述核酸是治疗性核酸，且其中所述方法进一步定义为预防或抑制受试者中过度增生性病变的扩展的方法。

160.权利要求159的方法，其中所述过度增生性病变是嘴的粘膜白斑病或嘴的癌。

161.权利要求141的方法，其中所述核酸包含在表达盒中，所述表达盒包含有效地连接至该核酸的启动子，其中所述启动子在受试者的细胞中具有活性。

162.权利要求161的方法，其中所述表达盒包含在病毒载体中。

163.权利要求162的方法，其中所述病毒载体是杆状病毒载体、细小病毒载体、α病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、新培斯病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体或痘病毒载体。

164.权利要求163的方法，其中所述治疗性核酸编码FUS1。

165.权利要求163的方法，其中所述治疗性核酸编码mda7。

166.权利要求163的方法，其中所述治疗性核酸编码p53。

167.权利要求141的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

168.权利要求167的方法，其中所述哺乳动物是人。

169.权利要求168的方法，其中所述人是癌症患者或具有癌前病变的患者。

170.权利要求141的方法，其中施用所述药物组合物包括使用涂药器给受试者的身体表面施用所述药物组合物。

171.权利要求141的方法，其还包括鉴定需要疾病的检测、预防或治疗的受试者。

172.权利要求141的方法，其中所述核酸是治疗性核酸，且其中所述方法还包括给受试者施用一种或多种第二形式的治疗。

173.在受试者中检测、治疗或预防疾病的方法，其包括给受试者的表面施用权利要求90中所示的透皮或经皮递送装置。

174.权利要求173的方法，其中所述表达盒包含在病毒载体中。

175.权利要求174的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体、杆状病毒载体、细小病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、新培斯病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体或痘病毒载体载体。

176.权利要求175的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体。

177.权利要求176的方法，其中所述治疗性核酸编码FUS1。

178.权利要求176的方法，其中所述治疗性核酸编码mda7。

179.权利要求176的方法，其中所述治疗性核酸编码p53。

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