CN107586779B - 使用crispr-cas系统对间充质干细胞进行casp3基因敲除的方法 - Google Patents

使用crispr-cas系统对间充质干细胞进行casp3基因敲除的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种采用CRISPR‑cas9系统针对间充质干细胞进行CASP3基因编辑,特别是涉及一种构建CASP3基因敲除的间充质干细胞细胞系的建立。其中使用了新的增效蛋白CREnhancer1.0,能够显著提高细胞内CRISPR/Cas9基因编辑效率。本发明提供的骨髓间充质干细胞CASP3敲除质粒具有较好的遗传稳定性。

Description

使用CRISPR-CAS系统对间充质干细胞进行CASP3基因敲除的 方法
技术领域
本发明提供一种采用CRISPR-cas系统针对间充质干细胞进行CASP3基因编辑,特别是涉及一种构建CASP3基因敲除的间充质干细胞细胞系的建立。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC),是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞,这种干细胞能够发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。间充质干细胞可以接受移植,而它们会成长为何种类型的细胞取决于其被注入的部位。例如,被注入心脏的间充质干细胞能够形成健康的新组织等。
间充质干细胞(MSCs)是一类多能干细胞,源于发育早期的中胚层和外胚层。主要存在于结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富,由于骨髓是其主要来源,因此统称为骨髓间充质干细胞。间充质干细胞属于非终末分化细胞,它既有间质细胞,又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。不论是自体还是同种异源的间充质干细胞,一般都不会引起宿主的免疫反应。由于间充质干细胞具备的这种免疫学特性,使其在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能,并且可避免免疫排斥反应。
间充质干细胞的临床研究已经在许多国家开展,美国批准了60余项临床试验,随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟,我国也批准了多项临床试验,走入了间充质干细胞核心技术研发的舞台。我国已经大力加强干细胞研究工作的开展,包括国家昂赛细胞基因工程有限公司、细胞产品国家工程研究中心在内的多家权威研究机构以及各地方脐带血库已将研究技术引向临床。对于间充质干细胞用于治疗十余种难治性疾病的治疗研究,除了用来促进恢复造血,与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等以外,还用于心脑血管疾病,肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗研究,已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。迄今的研究表明,脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物,而且具有更大的应用潜能。脐带间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标志,具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征,因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。
Caspase-3是一种蛋白酶,1994年Fernandez-Alnemri等在BenBank表达序列标记(expression sequence tag,EST)数据库中找到一段与ICE/CED-3活性中心同源的序列,用它合成探针后,筛选人Jurkat T淋巴细胞cDNA文库,从中克隆到一种新基因,因其编码分子量为32kD的半胱氨酸蛋白酶而称之为CPP32(cysteine protease protein,32kD)。随后,其他学者独立地将这一蛋白基因克隆出来,并分别命名为prICE、apopain(凋亡素)和Yama(印度传说中的死亡之神)。1996年这种蛋白酶被命名为caspase-3。现在一般认为caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。caspase-3最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose)polymerase),该酶与DNA修复、基因完整性监护有关。在细胞凋亡启动时,116kD的PARP在Asp216-Gly217之间被caspase-3剪切成31kD和85kD两个片段,使PARP中与DNA结合的两个锌指结构与羧基端的催化区域分离,不能发挥正常功能。结果使受PARP负调控影响的Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的活性增高,裂解核小体间的DNA,引起细胞凋亡。这种裂解过程可被caspase-3的特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO所抑制,但不能被CrmA抑制。
caspase-3还可以剪切U1-70K、DNA-PK、PKCd和PKCq。PKCd和PKCq都属于新型PKC(novel PKC,nPKC),当被caspase-3剪切后,可以切除调节区域,而成为活性形式的PKC,另外实验还证明,过量表达PKCd和PKCq均可以引起细胞凋亡,说明它们都参与了细胞凋亡的诱导是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。因此,针对caspase-3进行敲出变得尤为重要。
细胞凋亡在细胞的生理和病理中发挥着重要的作用。然而在生物工程中,细胞凋亡却有着负面的影响。在蛋白的表达或者病毒的包装中,尤其是在表达一些促凋亡蛋白或者包装携带促凋亡基因的病毒时,常常由于宿主细胞的凋亡无法获得高的蛋白或病毒产量。虽然已有一些方法可以对细胞凋亡产生一定的抑制效果,包括siRNA干扰Bax和Bak基因以及通过锌指核酸酶敲除Bax和Bak基因等,但是这些方法都不太彻底,效果并不理想。Caspase3是细胞凋亡途径中的最后的执行分子,因此通过敲除这个基因有可能使细胞获得抗凋亡效果。在哎现有技术中,CN107119018A中虽然公开了针对Caspase3进行sgRNA敲除,但是该方法敲除效率非常低,并不适宜大规模推广使用。
另外,基于间充质干细胞的多能性,为了研究敲除CASP3基因的间充质干细胞在癌症治疗方面的功能,建立敲除CASP3基因的间充质干细胞细胞系变得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种敲除CASP3基因的间充质干细胞,有效克服了现有技术使用siRNA进行干扰不能稳定遗传的技术缺陷。
为实现上述目的,本发明提供一种CRISPR-cas系统的靶标,根据CASP3的基因序列,设计的具体可选择的靶位点如下(划线部分表示PAM基序):
CASP3-sgRNA靶1:5’to 3’ttggaaccaaagatcatacatgg
CASP3-sgRNA靶2:5’to 3’ggaagcgaatcaatggactctgg
CASP3-sgRNA靶3:5’to 3’aatggactctggaatatccctgg
CASP3-sgRNA靶4:5’to 3’atgtcgatgcagcaaacctcagg
CASP3-sgRNA靶5:5’to 3’tgtcgatgcagcaaacctcaggg
CASP3-sgRNA靶6:5’to 3’ggaataatttttggaacaaatgg
CASP3-sgRNA靶7:5’to 3’gatcgttgtagaagtctaactgg
CASP3-sgRNA靶8:5’to 3’acccaaacttttcattattcagg
CASP3-sgRNA靶9:5’to 3’cagtggtgttgatgatgacatgg
CASP3-sgRNA靶10:5’to 3’ggcgtgtcataaaataccagtgg
CASP3-sgRNA靶11:5’to 3’gtgtcataaaataccagtggagg
CASP3-sgRNA靶12:5’to 3’cagcacctggttattattcttgg
CASP3-sgRNA靶13:5’to 3’gaaattcaaaggatggctcctgg
CASP3-sgRNA靶14:5’to 3’aatttatgcacattcttacccgg
根据这些靶位点,设计具体的sgRNA如下:
CASP3-sgRNA1:5’to 3’ttggaaccaaagatcataca
CASP3-sgRNA2:5’to 3’ggaagcgaatcaatggactc
CASP3-sgRNA3:5’to 3’aatggactctggaatatccc
CASP3-sgRNA4:5’to 3’atgtcgatgcagcaaacctc
CASP3-sgRNA5:5’to 3’tgtcgatgcagcaaacctca
CASP3-sgRNA6:5’to 3’ggaataatttttggaacaaa
CASP3-sgRNA7:5’to 3’gatcgttgtagaagtctaac
CASP3-sgRNA8:5’to 3’acccaaacttttcattattc
CASP3-sgRNA9:5’to 3’cagtggtgttgatgatgaca
CASP3-sgRNA10:5’to 3’ggcgtgtcataaaataccag
CASP3-sgRNA11:5’to 3’gtgtcataaaataccagtgg
CASP3-sgRNA12:5’to 3’cagcacctggttattattct
CASP3-sgRNA13:5’to 3’gaaattcaaaggatggctcc
CASP3-sgRNA14:5’to 3’aatttatgcacattcttacc
为了提高基因编辑效率,包括向间充质干细胞中引入增效蛋白,所述增效蛋白CREnhancer1.0是由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质。
进一步地,所述增效蛋白包含a)或b):
a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质的多核苷酸序列;
b)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
进一步地,克隆增效蛋白CREnhancer1.0基因,构建EGFP标记的增效蛋白CREnhancer1.0慢病毒表达载体,用GP2-293T细胞包装慢病毒,修饰干细胞。
更进一步地,提供一种在间充质干细胞中采用CRISPR/Cas9进行基因编辑的系统,其特征在于所述系统包括:(1)用于表达SEQ ID NO:1所述的CREnhancer1.0基因的质粒;(2)sgRNA已经插入的表达PX330的质粒(其可以表达sgRNA和cas9)。
更进一步地,所述sgRNA和cas9表达载体也可以是本领域常用的其他表达载体。
为实现上述目的,本发明还提供一种构建CASP3基因敲除的间充质干细胞细胞系方法,包括将所述基因编辑系统导入间充质干细胞中,获得编辑阳性细胞,随后繁殖、收获所述干细胞。
具体的间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞(hMSCs)PC015,购买自上海艾研生物科技有限公司。
本发明提供了一种构建CASP3基因敲除的间充质干细胞细胞系方法,具有以下优点:本发明在间充质干细胞中,构建了CASP3基因敲除的细胞系,筛选并优化获得了最佳的sgRNA,敲除效率高,传代稳定。
下面通过附图和实施例,对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1PX330质粒图;
图2PX330中sgRNA插入位点图;
图314个sgRNA基因标记效率示意图;左侧为导入了增效蛋白的CRISPR编辑效率图,右侧为未导入增效蛋白的CRISPR编辑效率图;
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明提高基因组编辑效率的方法的技术方案。
实施例1、CRISPR表达载体的构建
gRNA的设计
根据靶基因的基因序列,通过申请人独特的优化设计方法,具体筛选得到具体的sgRNA的形式如下:
CASP3-sgRNA1:5’to 3’ttggaaccaaagatcataca
CASP3-sgRNA2:5’to 3’ggaagcgaatcaatggactc
CASP3-sgRNA3:5’to 3’aatggactctggaatatccc
CASP3-sgRNA4:5’to 3’atgtcgatgcagcaaacctc
CASP3-sgRNA5:5’to 3’tgtcgatgcagcaaacctca
CASP3-sgRNA6:5’to 3’ggaataatttttggaacaaa
CASP3-sgRNA7:5’to 3’gatcgttgtagaagtctaac
CASP3-sgRNA8:5’to 3’acccaaacttttcattattc
CASP3-sgRNA9:5’to 3’cagtggtgttgatgatgaca
CASP3-sgRNA10:5’to 3’ggcgtgtcataaaataccag
CASP3-sgRNA11:5’to 3’gtgtcataaaataccagtgg
CASP3-sgRNA12:5’to 3’cagcacctggttattattct
CASP3-sgRNA13:5’to 3’gaaattcaaaggatggctcc
CASP3-sgRNA14:5’to 3’aatttatgcacattcttacc
根据上述的gRNA,在其5'端加上CACC得到正向寡核苷酸序列,在其互补链的5'端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列,分别合成正向和反向寡核苷酸序列,然后将合成的序列变性、退火,得到具有BbsI粘性末端的双链DNA片段,如下:正向:5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN反向:NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’,变性、退火体系为:2μl正向寡核苷酸链(50μM)2μl反向寡核苷酸链(50μM)46μl l*NEB buffer在PCR仪中按以下程序运行:90℃,4min;72℃,10min;37℃,22min;25℃,25min。
退火后的双链寡核苷酸链含有BbsI的粘性末端,直接与被BbsI酶切过的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(以下简称PX330)(SEQ ID NO.3)载体进行连接,可以得PX330-gRNA-Cas9重组质粒。
酶切体系:水39.3μl,10*FD buffer 5μl,BbsI 2μl,PX3303.7μl(2μg)37℃水浴2h酶切后的质粒直接用胶回收试剂盒回收。
连接体系:退火产物0.5μl,线性化的PX330质粒2μ1,5*ligationbuffer2μl,T4DNALigase(3units/μ1),1μl,水4.5μl,16℃水浴2h将上述步骤得到的连接产物转化JM109感受态细胞,涂布于Amp+的LB平板,挑取阳性克隆接菌,37℃摇床摇菌过夜,质粒抽提试剂盒提取质粒并进行测序鉴定,得到PX330-gRNA质粒。
实施例2克隆增效蛋白CREnhancer1.0及构建载体
克隆增效蛋白CREnhancer1.0基因,通过全基因合成的方法,获得SEQ ID NO:1所述的基因序列,以该序列为模板,根据上下游引物序列分别为5'-ATGCAGGAGAACCTGGCCCCCTG-3',5'-CAGGCAGCTCACGCTCCTCTCG-3',引物和全基因组由上海生工有限公司合成。PCR反应扩增CREnhancer1.0基因目的基因片段,扩增反应体系如下:95℃、40s,57℃、1min,72℃、1min,72℃、10min,循环35次,PCR产物由上海生工有限公司进行测序,通过测序,结合与SEQ ID NO:1完全匹配。随后,将PCR扩增的目的基因连接在空载体慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。结合证明重组慢病毒载体构建成功。随后将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染人骨髓间充质干细胞(hMSCs)PC015,通过重组而包装成能表达CREnhancer1.0基因的人骨髓间质干细胞。通过PCR筛选鉴定,将稳定转染的干细胞用于后续基因编辑应用。
实施例3CRISPR/Cas9在骨髓间质干细胞中的应用
基于含BSD-fsEGFP融合基因pBGN质粒的CRISPR/Cas9编辑载体
(1)BSD-fsEGFP融合基因:利用常规PCR,扩增公知的BSD基因,5’-PCR引物带HindIII位点,3’-PCR引物引入I-SceI和EcoRI位点。将PCR产物(BSD)插入EGFP质粒(EGFP核苷酸序列为本领域公知的序列,例如CN105647968A中的序列1和序列2所示)中CMV驱动子和EGFP编码区的之间的HindIII和EcoRI位点,生成含BSD-fsEGFP融合基因的质粒pBGN,BSD-fsEGFP融合基因核苷酸序列为如CN105647968A中的序列3和序列4所示)。该融合基因由CMV驱动子或PGK驱动子驱动,但EGFP由于移码而无活性,因此称fsEGFP。
5’-PCR引物为CTCAAGCTTAACTAAACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG,
3’-PCR引物为AGAATTCCAGTAGGGATAACAGGGTAATGCCAGGTCCGCCCTCCCACACATAACCAGAG。
(2)将测试质粒pBGN,实施例1制备的表达质粒共转染骨髓间质干细胞。以未转染实施例2的增效基因的干细胞作为阳性对照,同时,将常规用的GFP表达质粒平行转染细胞以测定转染效率,利用转染效率校正获取的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。
(4)转染2-3天后,利用流式细胞仪测量GFP+细胞的频率。
(5)计算特定sgRNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑相对效率。这个相对效率由GFP阳性细胞频率与转染效率的比值代表,结果如图3所示。我们发现未转染实施例2的增效蛋白的干细胞中GFP阳性细胞频率明显低于转染了实施例2的增效蛋白的细胞。其中在14个sgRNA中,只有CASP3-sgRNA6具有较好的基因编辑效果,效率达到90%以上,这也是申请人付出了艰辛的劳动才筛选得到的具有较好编辑效果的sgRNA。采用空载体制备的阴性对照没有GFP阳性细胞,其中P值均小于0.01,具有统计学意义。
将骨髓间质干细胞CASP3-sgRNA6(即采用CASP3-sgRNA6进行CRISPR编辑后获得的干细胞)和将骨髓间质干细胞CASP3-sgRNA6进行稳定传代培养,培养43代之后,通过针对CASP3PCR测序,发现该基因仍然是突变失活的,保持了基因被敲除的效果。这充分说明,本发明的敲出系统具有较好的稳定性。
最后所应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 洛阳轩智生物科技有限公司
<120> 使用CRISPR-CAS系统对间充质干细胞进行CASP3基因敲除的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atgcaggaga acctggcccc ctggggcgag ctggccaccg acaacatcat cctgaccgtg 60
cccaccacca acctgcaggc cctgaaggac cccgagcccg tgctgaggct gtgggacgag 120
atgatgcagg ccgtggccag gctggccgcc gagcccttcc ccttcaggag gcccgagagg 180
atcgtggccg acgtgcagat cagcgccggc tggatgcaca gcggctaccc catcatgtgc 240
cacctggaga gcgtgaagga gatcatcaac gagatggaca tgaggagcag gggcgtgtgg 300
ggccccatcc acgagctggg ccacaaccag cagaggcacg gctgggagtt ccccccccac 360
accaccgagg ccacctgcaa cctgtggagc gtgtacgtgc acgagaccgt gctgggcatc 420
cccagggccc aggcccacga ggccctgagc ccccccgaga gggagaggag gatcaaggcc 480
cacctgggca agggcgcccc cctgtgcgac tggaacgtgt ggaccgccct ggagacctac 540
ctgcaggtgc tgagcaggaa cagcggcagg aggggcgtgg acggcaggct ggtgcacacc 600
tgcatcaagg ccggcgccgt gaggtggctg gccaggggcc agaccggcaa ggtgggcgtg 660
aacaccaacc tgaaggacct gtgccccctg ctgagcgagc acggcctgca gtgcagcctg 720
gagccccacc tgaacagcga cctgtgcgtg tactgctgca aggcctacag cgacaaggag 780
gccaagcagc tgcaggagtt cgtggccgag ggcggcggcc tgctgatcgg cggccaggcc 840
tggtggtggg ccagccagaa ccccggccac tgccccctgg ccggcttccc cggcaacatc 900
atcctgaact gcttcggcct gagcatcctg ccccagaccc tgaaggccgg ctgcttcccc 960
gtgcccaccc ccgagatgag gagctaccac ttcaggaagg ccctgagcca gttccaggcc1020
atcctgaacc acgagaacgg caacctggag aagagctgcc tggccaagct gagggtggac1080
ggcgccgcct tcctgcagat ccccgccgag ggcgtgcccg cctacatcag cctgcacagg1140
ctgctgagga agatgctgag gggcagcggc ctgcccgccg tgagcaggga gaaccccgtg1200
gccagcgaca gctacgaggc cgccgtgctg agcctggcca ccggcctggc ccacagcggc1260
accgactgca gccagctggc ccagggcctg ggcacctgga cctgcagcag cagcctgtac1320
cccagcaagc accccatcac cgtggagatc aacggcatca accccggcaa caacgactgc1380
tgggtgagca ccggcctgta cctgctggag ggccagaacg ccgaggtgag cctgagcgag1440
gccgccgcca gcgccggcct gagggtgcag atcggctgcc acaccgacga cctgaccaag1500
gccaggaagc tgagcagggc ccccatggtg acccaccagt gctggatgga caggaccgag1560
aggagcgtga gctgcctg 1578
<210> 2
<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Met Gln Glu Asn Leu Ala Pro Trp Gly Glu Leu Ala Thr Asp Asn Ile
1 5 10 15
Ile Leu Thr Val Pro Thr Thr Asn Leu Gln Ala Leu Lys Asp Pro Glu
20 25 30
Pro Val Leu Arg Leu Trp Asp Glu Met Met Gln Ala Val Ala Arg Leu
35 40 45
Ala Ala Glu Pro Phe Pro Phe Arg Arg Pro Glu Arg Ile Val Ala Asp
50 55 60
Val Gln Ile Ser Ala Gly Trp Met His Ser Gly Tyr Pro Ile Met Cys
65 70 75 80
His Leu Glu Ser Val Lys Glu Ile Ile Asn Glu Met Asp Met Arg Ser
85 90 95
Arg Gly Val Trp Gly Pro Ile His Glu Leu Gly His Asn Gln Gln Arg
100 105 110
His Gly Trp Glu Phe Pro Pro His Thr Thr Glu Ala Thr Cys Asn Leu
115 120 125
Trp Ser Val Tyr Val His Glu Thr Val Leu Gly Ile Pro Arg Ala Gln
130 135 140
Ala His Glu Ala Leu Ser Pro Pro Glu Arg Glu Arg Arg Ile Lys Ala
145 150 155 160
His Leu Gly Lys Gly Ala Pro Leu Cys Asp Trp Asn Val Trp Thr Ala
165 170 175
Leu Glu Thr Tyr Leu Gln Val Leu Ser Arg Asn Ser Gly Arg Arg Gly
180 185 190
Val Asp Gly Arg Leu Val His Thr Cys Ile Lys Ala Gly Ala Val Arg
195 200 205
Trp Leu Ala Arg Gly Gln Thr Gly Lys Val Gly Val Asn Thr Asn Leu
210 215 220
Lys Asp Leu Cys Pro Leu Leu Ser Glu His Gly Leu Gln Cys Ser Leu
225 230 235 240
Glu Pro His Leu Asn Ser Asp Leu Cys Val Tyr Cys Cys Lys Ala Tyr
245 250 255
Ser Asp Lys Glu Ala Lys Gln Leu Gln Glu Phe Val Ala Glu Gly Gly
260 265 270
Gly Leu Leu Ile Gly Gly Gln Ala Trp Trp Trp Ala Ser Gln Asn Pro
275 280 285
Gly His Cys Pro Leu Ala Gly Phe Pro Gly Asn Ile Ile Leu Asn Cys
290 295 300
Phe Gly Leu Ser Ile Leu Pro Gln Thr Leu Lys Ala Gly Cys Phe Pro
305 310 315 320
Val Pro Thr Pro Glu Met Arg Ser Tyr His Phe Arg Lys Ala Leu Ser
325 330 335
Gln Phe Gln Ala Ile Leu Asn His Glu Asn Gly Asn Leu Glu Lys Ser
340 345 350
Cys Leu Ala Lys Leu Arg Val Asp Gly Ala Ala Phe Leu Gln Ile Pro
355 360 365
Ala Glu Gly Val Pro Ala Tyr Ile Ser Leu His Arg Leu Leu Arg Lys
370 375 380
Met Leu Arg Gly Ser Gly Leu Pro Ala Val Ser Arg Glu Asn Pro Val
385 390 395 400
Ala Ser Asp Ser Tyr Glu Ala Ala Val Leu Ser Leu Ala Thr Gly Leu
405 410 415
Ala His Ser Gly Thr Asp Cys Ser Gln Leu Ala Gln Gly Leu Gly Thr
420 425 430
Trp Thr Cys Ser Ser Ser Leu Tyr Pro Ser Lys His Pro Ile Thr Val
435 440 445
Glu Ile Asn Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Asp Cys Trp Val Ser Thr
450 455 460
Gly Leu Tyr Leu Leu Glu Gly Gln Asn Ala Glu Val Ser Leu Ser Glu
465 470 475 480
Ala Ala Ala Ser Ala Gly Leu Arg Val Gln Ile Gly Cys His Thr Asp
485 490 495
Asp Leu Thr Lys Ala Arg Lys Leu Ser Arg Ala Pro Met Val Thr His
500 505 510
Gln Cys Trp Met Asp Arg Thr Glu Arg Ser Val Ser Cys Leu
515 520 525
<210> 3
<211> 8506
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420
aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 900
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 960
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgacgc1020
tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg1080
accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag1140
ctgagcaaga ggtaagggtt taagggatgg ttggttggtg gggtattaat gtttaattac1200
ctggagcacc tgcctgaaat cacttttttt caggttggac cggtgccacc atggactata1260
aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat gacgataaga1320
tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt1380
acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt1440
acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga1500
agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga1560
agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga1620
tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct1680
tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg1740
aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca1800
gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc1860
ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt1920
tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg1980
gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc2040
tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga2100
gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc2160
agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc2220
agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca2280
tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat2340
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agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg2460
gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg2520
gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct2580
tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc2640
ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga2700
ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga2760
tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg2820
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aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga3060
aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag3120
atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg3180
acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac3240
tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg3300
acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga3360
agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt3420
ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta3480
aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg3540
ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg3600
acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca3660
gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg3720
aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc3780
agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg3840
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agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga4080
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gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact4500
ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga4560
caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga4620
aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct4680
tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg4740
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acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg5220
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aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca5340
agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg5400
ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc5460
tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagt5520
aagaattcct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt5580
tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc5640
ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg5700
tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagag aatagcaggc atgctgggga5760
gcggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct5820
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gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca5940
tctgtgcggt atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc6000
gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc6060
ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc6120
cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc6180
gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg6240
gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact6300
ggaacaacac tcaaccctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt6360
tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa6420
atattaacgt ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag6480
ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc6540
ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt6600
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cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga6780
caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat6840
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acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta7440
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ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca7560
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gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat7680
tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt7740
taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa7800
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga7860
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg7920
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc7980
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag8040
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc8100
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg8160
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac8220
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga8280
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt8340
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag8400
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg8460
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 8506
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
atgcaggaga acctggcccc ctg 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
caggcagctc acgctcctct cg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
ggaataattt ttggaacaaa 20

Claims (4)

1.一种用于人骨髓间充质干细胞基因编辑的CRISPR-CAS系统,其特征在于:系统的组成包括:(1)用于表达SEQ ID NO:1所示的CREnhancer1.0基因的质粒;(2)表达SEQ ID NO:6所示sgRNA的PX330的质粒。
2.如权利要求1所述的系统,其特征在于:(1)的质粒提前导入到基因编辑细胞中,筛选得到阳性细胞后,再转入(2)的质粒。
3.权利要求1的系统在制备用于人骨髓间充质干细胞基因编辑的试剂中的用途。
4.如权利要求3所述的用途,其中人骨髓间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞(hMSCs)PC015。
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