CN100355889C - 基因工程重组二连体骨形成蛋白的设计构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程重组二连体骨形成蛋白的设计构建方法，其特征是用基因工程手段构建“重组人BMP成熟肽二连体”，基本方法是将编码BMP成熟肽的cDNA放在大肠杆菌中表达，使BMP成熟肽在内部正确形成3对双硫健，在BMP成熟肽的链间以肽健相连接而成为BMP二连体以及经在体外纯化复性后折叠成为有活性的BMP；半胱氨酸突变的过程需要加入限制性核酸内切酶位点序列和起始码，并需要PCR的扩增引物；引物根据需要可设计为不同DNA序列；本发明提供了用基因工程的手段使大肠杆菌直接表达类似二聚体结构的有活性的重组二连体骨形成蛋白及其制备方法，以期用廉价的大肠杆菌基因工程系统去大量生产具有良好生物活性的各种BMP。

Description

基因工程重组二连体骨形成蛋白的设计构建方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及基因工程重组二连体骨形成蛋白的设计构建方法。

背景技术

(一)国内外相关研究技术综述

1、骨形成蛋白概述

美国Urist在1965年首先报道：将牛的脱钙骨基质植入小鼠肌肉，能诱导形成新的软骨和骨组织[1]，经过20多年的研究证明骨基质中存在一种能够诱导骨组织生成的活性蛋白，命名为骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein，简称BMP)，这就在理论上证实了骨形成学说，并为临床骨修复的治疗提出了新途径[2，3]。其后发现不仅在动物及人的骨和牙组织中有BMP[4-9]，而且在胚胎和成年动物许多组织中也有BMP[10-11]。至今发现的至少有20种不同的BMP[2-16]，组成BMP家族。

对BMP生物学功能的研究表明：BMP不是一般的生长因子，而是一类多功能的分化因子。由于BMP是研究骨形成机制中发现的，因而对BMP诱导成骨的作用研究得最早最充分，目前世界上BMP医学临床应用的热点也还是在其成骨的作用，每年发表几百篇BMP的研究论文内容也主要集中在BMP诱导成骨的机制和实际应用上，至今已经开发投放市场有BMP-2和BMP-7，都是用于骨疾病的治疗上。虽然BMP对骨疾病的治疗应用也还会有更多的发展，但骨形成蛋白的功能是多方面的，不仅能够诱导骨组织的生成，而且在造血组织、神经组织、以及一些器官组织的诱导发生上都起重要作用。因此BMP有着更多方面的临床应用和广阔市场前景。对BMP结构的研究[17，18]表明：除BMP-1外，其他BMPs都属于转化生长因子β(Transforming growth factor-β，简称TGF-β)超家族的成员，各种BMP都具有这个超家族的共性，也有其自身的特性，归纳如下：

(1)大多数BMP成员基因转录生成的mRNA都大于1.4-1.8kb，有的则长约4kb。有的BMP有长短不同的转录物，反映BMP有不同的拼接方式，或者有不同的组织特异性与功能。

(2)属于分泌性蛋白。所有的BMP在细胞内刚合成时N端都带有分泌蛋白质所特有的信号肽段，BMP加工后分泌到细胞外。

(3)BMP蛋白的成熟都经过加工过程。不同的BMP cDNA编码约400-700个氨基酸组成的前原BMP(pre-pro-BMP)，翻译形成的这个较大的BMP前体蛋白，经切去N端信号肽段，再受内切蛋白酶切去前肽段，才生成C段100多个氨基酸组成的成熟肽。(4)不同的成熟BMP的N端同源性性较低，长短也各不相同，但共同的特点是N端含碱性氨基酸较多(这是与其它TGF-β超家族不同的)，使它容易吸附在细胞外的基质上。且成熟BMP的疏水性强，溶解度差，这些都给BMP的提取、分离、制备和生产带来困难。

(5)BMP的活性形式是二聚体(dimer)。BMP的成熟肽一般有7个半胱氨酸(个别如BMP-8成熟肽有9个半胱氨酸)，在同一肽链内部6个半胱氨酸形成3个链内的双硫键，余下一个半胱氨酸与另一肽的半胱氨酸形成链间的双硫键，从而构成二聚体，才能与细胞表面的受体相结合，发挥生物学活性。同种BMP之间形成的二聚体，称同源二聚体(homodimer)，如BMP-2与BMP-2成熟肽间形成的二聚体。不同种BMP之间形成的二聚体，称异源二聚体(heterodimer)。异源二聚体的活性往往高于同源二聚体，例如：BMP-4/7异源二聚体的生物学活性比BMP-7同源二聚体高3倍、比BMP-4同源二聚体高7倍。[19，20]

(6)不同的BMP间的序列有较多的差别，但同一种BMP在不同种族间却高度同源，提示BMP在生物进化中具有共同的重要作用。

以上所述的BMP特征，都是制备有良好生物学活性BMP应该考虑的问题。

2、骨形成蛋白的制备和存在的问题

(1)从新鲜骨骼组织提取BMP及困难

早期用于临床治疗的BMP是从新鲜骨骼组织提取获得的，所用的方法基本上是Urist等经过20多年努力所建立的提取方案。但从骨组织提取BMP存在着许多问题如：材料来源困难：要获得大量新鲜的动物骨组织是没有问题的，但提取所得的动物BMP对人有免疫原性，在人体内会引起排斥反应，不适合在人体使用，但要取得大量新鲜的人骨组织就很困难；提取步骤繁杂、收获量低、纯度不好：由于组织中的BMP溶解度差，因此Urist等采用盐酸胍等变性剂、设计了繁杂的步骤，需要花费大量人力和时间，即使如此，一般10kg骨组织提取不到10mg BMP，难以满足临床需要，而且得到的BMP仍然不是纯品，电泳分析仍然有许多杂蛋白带；重复性差：各批提取所获得的BMP的纯度和生物学活性差别很大。上述这些问题经过多年的努力，仍然没有解决。因而从骨组织提取BMP的生产难以有严格的质量控制，至今国外从来没有批准过从骨组织提取来生产BMP的药品投放市场。

(2)用培养的哺乳类细胞去表达、制备BMP及存在的问题

由于从动物或人组织提取得不到合格的BMP，因而用基因工程的手段去获得重组人骨形成蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein，简称rhBMP)成为大量生产合格的人BMP的必由之路。1988年美国的Wozney等[2]率先报道将人BMP-1、-2、-3 cDNA插入真核表达载体，转染培养的C03-1细胞株，能分泌产生有活性的人BMP-1、-2、-3蛋白，开辟了用基因工程的手段去制备BMP的道路。1991年美国Wang等用培养的CHO细胞株也成功表达得到具有诱骨活性的人BMP-2，人BMP-4、人BMP-7也都在培养的哺乳动物细胞中成功表达[21-23]。经过15年的努力研究，美国用培养的哺乳动物细胞来表达生产rhBMP-2和rhBMP-7通过了临床试验，分别都在2003年以医疗器械的形式被批准投放市场，用于骨缺损修复和脊椎骨融合等临床治疗。但美国用培养的哺乳动物细胞来表达生产rhBMP表达水平低(＜细胞总蛋白量的1％)、纯化步骤复杂、产量低、成本昂贵，市场价格10μg BMP约500美元，而临床一次使用量却要以10mg计，即使是美日欧等富裕国家的人民都用不起。

(3)用大肠杆菌系统去表达、制备BMP及存在的问题

采用大肠杆菌系统去生产基因工程重组蛋白的突出优点是：表达水平高、成本低廉。但Wosney等1988年最早在<Science>发表的研究[2]认为大肠杆菌表达的人BMP-1、-2、-3蛋白都是没有生物学活性的，而且在真核细胞内合成大的前体蛋白后加工复杂，BMP成熟肽形成活性二聚体又涉及14个半胱氨酸正确配对成7对双硫键等空间构象问题，这些在大肠杆菌中不能完成，体外复性将十分困难，因而长时间没有人去研究用大肠杆菌系统表达生产rhBMP。第一个用大肠杆菌系统成功表达复性获得有良好活性rhBMP的是中国。第四军医大学课题组[24-32]、北京军事医学科学院赵明等[33]、上海生物化学研究所李伯良等[34]先后在1991-1994年用大肠杆菌系统高表达重组人骨形成蛋白-2成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein-2 matural peptide，简称rhBMP-2m)，并经过复性获得有良好诱骨活性的rhBMP-2m、rhBMP-3m等。1996年德国Ruppert等[35]也用大肠杆菌系统成功表达复性获得有良好活性rhBMP-2m，并就此在欧洲申请了专利。我国用大肠杆菌系统表达生产的rhBMP-2m于2004年通过临床试验，以医疗器械的形式被批准生产投放市场，用于骨缺损的治疗。但是用大肠杆菌表达系统去制备BMP也有明显的缺陷，主要问题是不会正确加工和折叠BMP使之成为有活性的蛋白质。因此，探讨BMP包涵体的体外复性就成为关键环节。一些研究报告就专门研究BMP体外复性[35，38-41]。多数复性的方案是先将BMP包涵体溶解在变性剂(如盐酸胍、尿素)中，然后用迅速稀释或在低蛋白质浓度下缓慢透析，在一些氧化还原剂(如氧化型和还原型谷胱甘肽等)、防聚合剂(如CHES、精氨酸等)等帮助下使BMP肽链形成合适的配对双硫键和合适的折叠。尽管探索了各种复性的条件，努力提高从BMP单体形成二聚体的量，但实际复性时要么大部分BMP不能形成二聚体、要么BMP会形成更多的三聚体、四聚体、五聚体、或更大的多聚体，真正能够生成有生物学活性的BMP二聚体的比例很低。根本原因是体外的复性无法控制使只能由BMP肽链中7个半胱氨酸中应该生成链间二硫键的那个半胱氨酸去生成链间二硫键，7个半胱氨酸中任何一个都有可能去与另外的BMP肽链中任一个半胱氨酸去形成链间二硫键，结果就会生成各种多聚体，即使产生一部分二聚体，也不都是由应该生成链间二硫键的那个半胱氨酸去生成的那种活性二聚体。因此，大肠杆菌系统虽然能够高水平表达并得到大量廉价的BMP成熟肽，但体外复性得到具有活性的BMP二聚体量却很少。所以，美国市场预测研究所说过：“BMP是最有市场前景的基因工程产品，也是难度最大的基因工程产品。”是不无道理的。

(二)同本发明最相关的技术

如上所述，德国的Ruppert等[35]、Vallejo LF等[39-41]从1996-2004年非常认真和反复研究探索过大肠杆菌表达的BMP包涵体的体外复性条件，确实也提高了BMP二聚体的收得量和活性，Vallejo LF等2004年的报道[41]复性时蛋白质浓度最高可以达到2.1mg/ml(通常复性只能用很低浓度的蛋白，常用是＜0.1mg/ml，以防止肽链间的相互作用聚合，但这给复性后的BMP分离浓缩带来很大的困难)，因此Vallejo LF等的工作应该说已经有了很大的突破，但是并没有从根本上克服上述的困难：“怎样使两个各自都带有7个半胱氨酸的BMP成熟肽，只选择其中正确的一个去形成链间的双硫键，其它12个半胱氨酸只去形成链内的双硫键。”因此，他们的工作提高都是有限的，不很理想。迄今为止，再没有任何大肠杆菌去直接高表达具有类似二聚体结构BMP的设计和研究报导。

发明内容

针对上述现有技术状况，本发明的目的在于，提供一种用基因工程的手段使大肠杆菌直接表达类似二聚体结构的有活性的重组二连体骨形成蛋白及其制备方法，以期用廉价的大肠杆菌基因工程系统去大量生产具有良好生物活性的各种BMP。现将本发明构思及技术解决方案叙述如下：

如上所述：BMP都是肽链合成后，由2条肽链上许多个半胱氨酸中特定的一对半胱氨酸之间形成链间双硫键而构成有活性的二聚体。廉价的大肠杆菌表达系统虽然能够大量合成BMP成熟肽，却不能正确地选择特定的一对半胱氨酸去形成二聚体，成为以大肠杆菌表达系统制备良好活性BMP的困难所在。本发明基因工程重组二连体骨形成蛋白的设计构建方法其特征在于：将2个BMP成熟肽间不以双硫键(-S-S-)连接、而是以肽键(-CO-NH-)相连接，使大肠杆菌基因工程表达系统能够直接合成类似二聚体结构BMP，命名其为BMP二连体(human bone morphogenetic protein duplex，dhBMP)，由2个人骨形成蛋白BMP成熟肽组成的二连体全名为“重组人BMP二连体”(recombinant human bone morphogeneticprotein duplex)简称为“rdhBMP”；此发明设计，既适用于构建表达同一种BMP组成的同源BMP二连体(homoduplex BMP)，也适用于构建表达由不同两种BMP组成的异源BMP二连体(heteroduplex BMP)，简称为rdhBMP-xmxm；其中x为构成二连体的BMP种类名号；两个x种类名号可相同，也可不同。构建的基本方法是：将编码截短BMP、BMP成熟肽或更短的BMP肽段[36，37]的cDNA放在大肠杆菌中表达，使BMP成熟肽在内部正确形成3对双硫键、在BMP成熟肽的链间正确形成1个肽键而成为BMP二连体、以及BMP空间构象的正确折叠和在体外纯化、复性后成为有活性的BMP。具体方法步骤如下：

步骤1：分析所拟构建的BMP二聚体构象及BMP肽链中应该用于形成链间双硫键的半胱氨酸位置；

步骤2：将两个BMP分子之间原本形成二聚体链间双硫键的半胱氨酸突变，使其变为不能形成双硫键的其它氨基酸；该突变可以用对BMP肽链编码的cDNA进行定位突变来完成、也可以用聚合酶链式反应(PCR)、或商售的定位突变试剂盒的方法来完成；

步骤3：在上述经过突变的第一个BMP肽链的羧基端(C端)连接上一段连接肽(linker)；这段连接肽应当富含甘氨酸，使相连的两段BMP肽链间有足够的空间距离和活动度；该工作可以靠限制性核酸内切酶或聚合酶链式反应(PCR)的设计，将编码第一个BMP肽链的cDNA和编码连接肽的DNA序列按读框连续的方式连接起来；

步骤4：再将上述经过突变的第二个BMP肽链按读框连续的方式连接在第一个BMP肽链-连接肽的羧基端(C端)；该工作同样可以靠限制性核酸内切酶或聚合酶链式反应(PCR)的设计将两个DNA序列连接起来；

步骤5：将连接好的编码[第一个BMP肽链--连接肽--第二个BMP肽链]的DNA序列克隆入大肠杆菌表达质粒，构建BMP二连体的表达载体；

步骤6：将BMP二连体的表达载体转化适当的大肠杆菌宿主菌；提取质粒，经限制性核酸内切酶消化和核酸序列测定鉴定；并鉴定带有BMP二连体的表达载体细菌的表达水平和稳定性；

上述步骤2中所述的将两个BMP肽链中的半胱氨酸突变的过程需要加入限制性核酸内切酶位点序列或起始码ATG，并需要聚合酶链式反应(PCR)的扩增引物；引物根据需要可设计为不同DNA序列；

上述步骤3中所述的连接肽(linker)是指根据要求设计的一段由特定DNA序列编码的富含甘氨酸的肽链化合物；

上述步骤5中所述的BMP二连体的表达载体是指BMP插入大肠杆菌质粒所构建的、能在大肠杆菌中表达BMP二连体的质粒；

上述步骤6中所述大肠杆菌宿主菌可为DH5α、TOP 10、或基因工程大肠杆菌宿主菌。

根据本发明所提供的基因工程大肠杆菌直接表达类似二聚体结构BMP的设计构建方法所得出的重组二连体骨形成蛋白BMP，可有多种具有大同小异DNA序列，其主体DNA序列经鉴定，实际测定结果与设计预期的完全一致。例如：要构建重组人BMP-2成熟肽同源二连体(recombinant human bone morphogenetic protein-2 matural peptide homoduplex，简称为rdhBMP-2m2m)，可将2个编码人BMP-2成熟肽(hBMP-2m)的基因插入大肠杆菌质粒pDH2，构建所得的BMP二连体的表达载体名称为pDH2-dhBMP-2m2m，实际测定出其全序列如下：

  1 AGATCTCTCT CACCTACCAA ACAATGCCCC CCTGCAAAAA ATAAATTCAT ATAAAAAACA

    TCTAGAGAGA GTGGATGGTT TGTTACGGGG GGACGTTTTT TATTTAAGTA TATTTTTTGT

 61 TACAGATAAC CATCTGCGGT GATAAATTAT CTCTGGCGGT GTTGACATAA ATACCACTGG

    ATGTCTATTG GTAGACGCCA CTATTTAATA GAGACCGCCA CAACTGTATT TATGGTGACC

121 CGGTGATACT GAGCACATCA GCAGGACGCA CTGACCACCA TGAAGGTGAC GCTCTTAAAA

    GCCACTATGA CTCGTGTAGT CGTCCTGCGT GACTGGTGGT ACTTCCACTG CGAGAATTTT

181 ATTAAGCCCT GAAGAAGGGC AGCATTCAAA GCAGAAGGCT TTGGGGTGTG TGATACGAAA

    TAATTCGGGA CTTCTTCCCG TCGTAAGTTT CGTCTTCCGA AACCCCACAC ACTATGCTTT

                                           M  Q   A  K  H   K  Q  R  K

241 CGAAGCATTG GTTAAAAATT AAGGAGAATT AATTCATGCA AGCCAAACAC AAACAGCGGA

    GCTTCGTAAC CAATTTTTAA TTCCTCTTAA TTAAGTACGT TCGGTTTGTG TTTGTCGCCT

    ·  R  L  K   S  S  C   K  R  H  P   L  Y  V   D  F  S   D  V  G  W

301 AACGCCTTAA GTCCAGCTGT AAGAGACACC CTTTGTACGT GGACTTCAGT GACGTGGGGT

    TTGCGGAATT CAGGTCGACA TTCTCTGTGG GAAACATGCA CCTGAAGTCA CTGCACCCCA

    ·  N  D  W   I  V  A   P  P  G  Y   H  A  F   Y  C  H   G  E  C  P

361 GGAATGACTG GATTGTGGCT CCCCCGGGGT ATCACGCCTT TTACTGCCAC GGAGAATGCC

    CCTTACTGAC CTAACACCGA GGGGGCCCCA TAGTGCGGAA AATGACGGTG CCTCTTACGG

    ·  F  P  L   A  D  H   L  N  S  T   N  H  A   I  V  Q   T  L  V  N

421 CTTTTCCTCT GGCTGATCAT CTGAACTCCA CTAATCATGC CATTGTTCAG ACGTTGGTCA

    GAAAAGGAGA CCGACTAGTA GACTTGAGGT GATTAGTACG GTAACAAGTC TGCAACCAGT

    ·  S  V  N   S  K  I   P  K  A  S   C  V  P   T  E  L   S  A  I  S

481 ACTCTGTTAA CTCTAAGATT CCTAAGGCAA GCTGTGTCCC GACAGAACTC AGTGCTATCT

    TGAGACAATT GAGATTCTAA GGATTCCGTT CGACACAGGG CTGTCTTGAG TCACGATAGA

      ·  M  L  Y   L  D  E   N  E  K  V   V  L  K   N  Y  Q   D  M  V  V

 541  CGATGCTGTA CCTTGACGAG AATGAAAAGG TTGTATTAAA GAACTATCAG GACATGGTTG

      GCTACGACAT GGAACTGCTC TTACTTTTCC AACATAATTT CTTGATAGTC CTGTACCAAC

      ·  E  G  C   G  C  R   G  G  G  G   S  G  G   G  G  S   G  G  G  G

 601  TGGAGGGTTG TGGGTGTCGC GGTGGAGGCG GTTCAGGCGG AGGTGGCAGC GGCGGTGGCG

      ACCTCCCAAC ACCCACAGCG CCACCTCCGC CAAGTCCGCC TCCACCGTCG CCGCCACCGC

      ·  S  Q  A   K  H  K   Q  R  K  R   L  K  S   S  C  K   R  H  P  L

 661  GATCGCAAGC CAAACACAAA CAGCGGAAAC GCCTTAAGTC CAGCTGTAAG AGACACCCTT

      CTAGCGTTCG GTTTGTGTTT GTCGCCTTTG CGGAATTCAG GTCGACATTC TCTGTGGGAA

      ·  Y  V  D   F  S  D   V  G  W  N   D  W  I   V  A  P   P  G  Y  H

 721  TGTACGTGGA CTTCAGTGAC GTGGGGTGGA ATGACTGGAT TGTGGCTCCC CCGGGGTATC

      ACATGCACCT GAAGTCACTG CACCCCACCT TACTGACCTA ACACCGAGGG GGCCCCATAG

      ·  A  F  Y   C  H  G   E  C  P  F   P  L  A   D  H  L   N  S  T  N

 781  ACGCCTTTTA CTGCCACGGA GAATGCCCTT TTCCTCTGGC TGATCATCTG AACTCCACTA

      TGCGGAAAAT GACGGTGCCT CTTACGGGAA AAGGAGACCG ACTAGTAGAC TTGAGGTGAT

      ·  H  A  I   V  Q  T   L  V  N  S   V  N  S   K  I  P   K  A  S  C

 841  ATCATGCCAT TGTTCAGACG TTGGTCAACT CTGTTAACTC TAAGATTCCT AAGGCAAGCT

      TAGTACGGTA ACAAGTCTGC AACCAGTTGA GACAATTGAG ATTCTAAGGA TTCCGTTCGA

      ·  V  P  T   E  L  S   A  I  S  M   L  Y  L   D  E  N   E  K  V  V

 901  GTGTCCCGAC AGAACTCAGT GCTATCTCGA TGCTGTACCT TGACGAGAAT GAAAAGGTTG

      CACAGGGCTG TCTTGAGTCA CGATAGAGCT ACGACATGGA ACTGCTCTTA CTTTTCCAAC

      ·  L  K  N   Y  Q  D   M  V  V  E   G  C  G   C  R

 961  TATTAAAGAA CTATCAGGAC ATGGTTGTGG AGGGTTGTGG GTGTCGCTAA TCTAGAGTCG

      ATAATTTCTT GATAGTCCTG TACCAACACC TCCCAACACC CACAGCGATT AGATCTCAGC

1021  ACCTGCAGGC ATGCAAGCTT CTGTTTTGGC GGATGAGAGA AGATTTTCAG CCTGATACAG

      TGGACGTCCG TACGTTCGAA GACAAAACCG CCTACTCTCT TCTAAAAGTC GGACTATGTC

1081  CTTAAATCAG AACGCAGAAG CGGTCTGATA AAACAGAATT TGCCTCCCGG CAGTAGCGCG

      GAATTTAGTC TTGCGTCTTC GCCAGACTAT TTTGTCTTAA ACGGAGGGCC GTCATCGCGC

1141  GTGGTCCCAC CTGACCCCAT GCCGAACTCA GAAGTGAAAC GCCGTAGCGC CGATGGTAGT

      CACCAGGGTG GACTGGGGTA CGGCTTGAGT CTTCACTTTG CGGCATCGCG GCTACCATCA

1201  GTGGGGTCTC CCCATGCGAG AGTAGCCAAC TGCCAGGCAT CAAATAAAAC GAAAGGCTCA

      CACCCCAGAG GGGTACGCTC TCATCGGTTG ACGGTCCGTA GTTTATTTTG CTTTCCGAGT

1261  GTCGAAAGAC TGGGCCTTTC GTTTTATCTG TTGTTTGTCG GTGAACGCTC TCCTGAGTAG

      CAGCTTTCTG ACCCGGAAAG CAAAATAGAC AACAAACAGC CACTTGCGAG AGGACTCATC

1321  GACAAATCCG CCGGGAGCGG ATTTGAACGT TGCGAAGCAA CGGCCCGGAG GGTGGCGGGC

      CTGTTTAGGC GGCCCTCGCC TAAACTTGCA ACGCTTCGTT GCCGGGCCTC CCACCGCCCG

1381  AGGACGCCCG CCATAAACTG CCAGGCATCA AATTAAGCAG AAGGCCATCC TGACGGATGG

      TCCTGCGGGC GGTATTTGAC GGTCCGTAGT TTAATTCGTC TTCCGGTAGG ACTGCCTACC

1441  CCTTTTTGCG TTTCTACAAA CTCTTTGTTT ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCC

      GGAAAAACGC AAAGATGTTT GAGAAACAAA TAAAAAGATT TATGTAAGTT TATACATAGG

1501  GCTCATGAGA CAATAACCCT GATAAATGCT TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTATGAG

      CGAGTACTCT GTTATTGGGA CTATTTACGA AGTTATTATA ACTTTTTCCT TCTCATACTC

1561  TATTCAACAT TTCCGTGTCG CCCTTATTCC CTTTTTTGCG GCATTTTGCC TTCCTGTTTT

      ATAAGTTGTA AAGGCACAGC GGGAATAAGG GAAAAAACGC CGTAAAACGG AAGGACAAAA

1621  TGCTCACCCA GAAACGCTGG TGAAAGTAAA AGATGCTGAA GATCAGTTGG GTGCACGAGT

      ACGAGTGGGT CTTTGCGACC ACTTTCATTT TCTACGACTT CTAGTCAACC CACGTGCTCA

1681  GGGTTACATC GAACTGGATC TCAACAGCGG TAAGATCCTT GAGAGTTTTC GCCCCGAAGA

      CCCAATGTAG CTTGACCTAG AGTTGTCGCC ATTCTAGGAA CTCTCAAAAG CGGGGCTTCT

1741  ACGTTTTCCA ATGATGAGCA CTTTTAAAGT TCTGCTATGT GGCGCGGTAT TATCCCGTAT

     TGCAAAAGGT TACTACTCGT GAAAATTTCA AGACGATACA CCGCGCCATA ATAGGGCATA

1801 TGACGCCGGG CAAGAGCAAC TCGGTCGCCG CATACACTAT TCTCAGAATG ACTTGGTTGA

     ACTGCGGCCC GTTCTCGTTG AGCCAGCGGC GTATGTGATA AGAGTCTTAC TGAACCAACT

1861 GTACTCACCA GTCACAGAAA AGCATCTTAC GGATGGCATG ACAGTAAGAG AATTATGCAG

     CATGAGTGGT CAGTGTCTTT TCGTAGAATG CCTACCGTAC TGTCATTCTC TTAATACGTC

1921 TGCTGCCATA ACCATGAGTG ATAACACTGC GGCCAACTTA CTTCTGACAA CGATCGGAGG

     ACGACGGTAT TGGTACTCAC TATTGTGACG CCGGTTGAAT GAAGACTGTT GCTAGCCTCC

1981 ACCGAAGGAG CTAACCGCTT TTTTGCACAA CATGGGGGAT CATGTAACTC GCCTTGATCG

     TGGCTTCCTC GATTGGCGAA AAAACGTGTT GTACCCCCTA GTACATTGAG CGGAACTAGC

2041 TTGGGAACCG GAGCTGAATG AAGCCATACC AAACGACGAG CGTGACACCA CGATGCCTGT

     AACCCTTGGC CTCGACTTAC TTCGGTATGG TTTGCTGCTC GCACTGTGGT GCTACGGACA

2101 AGCAATGGCA ACAACGTTGC GCAAACTATT AACTGGCGAA CTACTTACTC TAGCTTCCCG

     TCGTTACCGT TGTTGCAACG CGTTTGATAA TTGACCGCTT GATGAATGAG ATCGAAGGGC

2161 GCAACAATTA ATAGACTGGA TGGAGGCGGA TAAAGTTGCA GGACCACTTC TGCGCTCGGC

     CGTTGTTAAT TATCTGACCT ACCTCCGCCT ATTTCAACGT CCTGGTGAAG ACGCGAGCCG

2221 CCTTCCGGCT GGCTGGTTTA TTGCTGATAA ATCTGGAGCC GGTGAGCGTG GGTCTCGCGG

     GGAAGGCCGA CCGACCAAAT AACGACTATT TAGACCTCGG CCACTCGCAC CCAGAGCGCC

2281 TATCATTGCA GCACTGGGGC CAGATGGTAA GCCCTCCCGT ATCGTAGTTA TCTACACGAC

     ATAGTAACGT CGTGACCCCG GTCTACCATT CGGGAGGGCA TAGCATCAAT AGATGTGCTG

2341 GGGGAGTCAG GCAACTATGG ATGAACGAAA TAGACAGATC GCTGAGATAG GTGCCTCACT

     CCCCTCAGTC CGTTGATACC TACTTGCTTT ATCTGTCTAG CGACTCTATC CACGGAGTGA

2401 GATTAAGCAT TGGTAACTGT CAGACCAAGT TTACTCATAT ATACTTTAGA TTGATTTAAA

     CTAATTCGTA ACCATTGACA GTCTGGTTCA AATGAGTATA TATGAAATCT AACTAAATTT

2461 ACTTCATTTT TAATTTAAAA GGATCTAGGT GAAGATCCTT TTTGATAATC TCATGACCAA

     TGAAGTAAAA ATTAAATTTT CCTAGATCCA CTTCTAGGAA AAACTATTAG AGTACTGGTT

2521 AATCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG AGCGTCAGAC CCCGTAGAAA AGATCAAAGG

     TTAGGGAATT GCACTCAAAA GCAAGGTGAC TCGCAGTCTG GGGCATCTTT TCTAGTTTCC

2581 ATCTTCTTGA GATCCTTTTT TTCTGCGCGT AATCTGCTGC TTGCAAACAA AAAAACCACC

     TAGAAGAACT CTAGGAAAAA AAGACGCGCA TTAGACGACG AACGTTTGTT TTTTTGGTGG

2641 GCTACCAGCG GTGGTTTGTT TGCCGGATCA AGAGCTACCA ACTCTTTTTC CGAAGGTAAC

     CGATGGTCGC CACCAAACAA ACGGCCTAGT TCTCGATGGT TGAGAAAAAG GCTTCCATTG

2701 TGGCTTCAGC AGAGCGCAGA TACCAAATAC TGTCCTTCTA GTGTAGCCGT AGTTAGGCCA

     ACCGAAGTCG TCTCGCGTCT ATGGTTTATG ACAGGAAGAT CACATCGGCA TCAATCCGGT

2761 CCACTTCAAG AACTCTGTAG CACCGCCTAC ATACCTCGCT CTGCTAATCC TGTTACCAGT

     GGTGAAGTTC TTGAGACATC GTGGCGGATG TATGGAGCGA GACGATTAGG ACAATGGTCA

2821 GGCTGCTGCC AGTGGCGATA AGTCGTGTCT TACCGGGTTG GACTCAAGAC GATAGTTACC

     CCGACGACGG TCACCGCTAT TCAGCACAGA ATGGCCCAAC CTGAGTTCTG CTATCAATGG

2881 GGATAAGGCG CAGCGGTCGG GCTGAACGGG GGGTTCGTGC ACACAGCCCA GCTTGGAGCG

     CCTATTCCGC GTCGCCAGCC CGACTTGCCC CCCAAGCACG TGTGTCGGGT CGAACCTCGC

2941 AACGACCTAC ACCGAACTGA GATACCTACA GCGTGAGCAT TGAGAAAGCG CCACGCTTCC

     TTGCTGGATG TGGCTTGACT CTATGGATGT CGCACTCGTA ACTCTTTCGC GGTGCGAAGG

3001 CGAAGGGAGA AAGGCGGACA GGTATCCGGT AAGCGGCAGG GTCGGAACAG GAGAGCGCAC

     GCTTCCCTCT TTCCGCCTGT CCATAGGCCA TTCGCCGTCC CAGCCTTGTC CTCTCGCGTG

3061 GAGGGAGCTT CCAGGGGGAA ACGCCTGGTA TCTTTATAGT CCTGTCGGGT TTCGCCACCT

     CTCCCTCGAA GGTCCCCCTT TGCGGACCAT AGAAATATCA GGACAGCCCA AAGCGGTGGA

3121 CTGACTTGAG CGTCGATTTT TGTGATGCTC GTCAGGGGGG CGGAGCCTAT GGAAAAACGC

     GACTGAACTC GCAGCTAAAA ACACTACGAG CAGTCCCCCC GCCTCGGATA CCTTTTTGCG

3181 CAGCAACGCG GCCTTTTTAC GGTTCCTGGC CTTTTGCTGG CCTTTTGCTC ACATGTTCTT

     GTCGTTGCGC CGGAAAAATG CCAAGGACCG GAAAACGACC GGAAAACGAG TGTACAAGAA

3241 TCCTGCGTTA TCCCCTGATT CTGTGGATAA CCGTATTACC GCCTTTGAGT GAGCTGATAC

     AGGACGCAAT AGGGGACTAA GACACCTATT GGCATAATGG CGGAAACTCA CTCGACTATG

3301 CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGAGCGCAG CGAGTCAGTG AGCGAGGAAG CGGAAGAGCG

     GCGAGCGGCG TCGGCTTGCT GGCTCGCGTC GCTCAGTCAC TCGCTCCTTC GCCTTCTCGC

3361 CCCTTATCTT TCCCTTTATT TTTGCTGCGG TAAGTCGCAT AAAAACCATT CTTCATAATT

     GGGAATAGAA AGGGAAATAA AAACGACGCC ATTCAGCGTA TTTTTGGTAA GAAGTATTAA

3421 CAATCCATTT ACTATGTTAT GTTCTGAGGG GAGTGAAAAT TCCCCTAATT CGATGAAGAT

     GTTAGGTAAA TGATACAATA CAAGACTCCC CTCACTTTTA AGGGGATTAA GCTACTTCTA

3481 TCTTGCTCAA TTGTTATCAG CTATGCGCCG ACCAGAACAC CTTGCCGATC AGCCAAACGT

     AGAACGAGTT AACAATAGTC GATACGCGGC TGGTCTTGTG GAACGGCTAG TCGGTTTGCA

3541 CTCTTCAGGC CACTGACTAG CGATAACTTT CCCCACAACG GAACAACTCT CATTGCATGG

     GAGAAGTCCG GTGACTGATC GCTATTGAAA GGGGTGTTGC CTTGTTGAGA GTAACGTACC

3601 GATCATTGGG TACTGTGGGT TTAGTGGTTG TAAAAACACC TGACCGCTAT CCCTGATCAG

     CTAGTAACCC ATGACACCCA AATCACCAAC ATTTTTGTGG ACTGGCGATA GGGACTAGTC

3661 TTTCTTGAAG GTAAACTCAT CACCCCCAAG TCTGGCTATC CAGAAATCAC CTGGCTCAAC

     AAAGAACTTC CATTTGAGTA GTGGGGGTTC AGACCGATAG GTCTTTAGTG GACCGAGTTG

3721 AGCCTGCTCA GGGTCAACGA GAATTAACAT TCCGTCAGGA AAGCTCGGCT TGGAGCCTGT

     TCGGACGAGT CCCAGTTGCT CTTAATTGTA AGGCAGTCCT TTCGAGCCGA ACCTCGGACA

3781 TGGTGCGGTC ATGGAATTAC CTTCAACCTC AAGCCAGAAT GCAGAATCAC TGGCTTTTTT

     ACCACGCCAG TACCTTAATG GAAGTTGGAG TTCGGTCTTA CGTCTTAGTG ACCGAAAAAA

3841 GGTTGTGCTT ACCCATCTCT CCGAATCACC TTTGGTAAAG GTTCTCAGCT TAGGTGAGAA

     CCAACACGAA TGGGTAGAGA GGCTTAGTGG AAACCATTTC CAAGAGTCGA ATCCACTCTT

3901 CATCCCTGCC TGAACATGAG AAAAAACAGG GTACTCATAC TCACTTCTAA GTGACGGCTG

     GTAGGGACGG ACTTGTACTC TTTTTTGTCC CATGAGTATG AGTGAAGATT CACTGCCGAC

3961 CATACTAACC GCTTCATACA TCTCGTAGAT TTCTCTGGCG ATTGAAGGGC TAAATTCTTC

     GTATGATTGG CGAAGTATGT AGAGCATCTA AAGAGACCGC TAACTTCCCG ATTTAAGAAG

4021 AAGGCTAACT TTGAGAATTT TTGCAAGCAA TGCGGCGTTA TAAGCATTTA ATGCATTGAT

     TTCCGATTGA AACTCTTAAA AACGTTCGTT ACGCCGCAAT ATTCGTAAAT TACGTAACTA

4081 GCCATTAAAT AAAGCACCAA CGCCTGACTG GGCCATCCCC ATCTTGTCTG CGACAGATTC

     CGGTAATTTA TTTCGTGGTT GCGGACTGAC CCGGTAGGGG TAGAACAGAC GCTGTCTAAG

4141 CTGGGATAAG CCAAGTTCAT TTTTCTTTTT TTCATAAATI GCTTTAAGGC CACGTGCGTC

     GACCCTATTC GGTTCAAGTA AAAAGAAAAA AAGTATTTAA CGAAATTCCG GTGCACGCAG

4201 CTCAAGCTGC TCTTGTGTTA ATGGTTTCTT TTTTGTGCTC ATACGTTAAA TCTATGACCG

     GAGTTCGACG AGAACACAAT TACCAAAGAA AAAACACGAG TATGCAATTT AGATACTGGC

4261 CAAGGGATAA ATATCTAACA CCGTGCGTGT TGACTATTTT AGCTCTGGCG GTGATAATGG

     GTTCCCTATT TATAGATTGT GGCACGCACA ACTGATAAAA TCGAGACCGC CACTATTACC

4321 TTGCATGTAC TAAGGTTGTA TGGAACAACG CATAACCCTG AAAGATTATG CAATGCGCTT

     AACGTACATG ATTCCAACAT ACCTTGTTGC GTATTGGGAC TTTCTAATAC GTTACGCGAA

4381 TGGGCAAACC AAGACAGCTA AA

     ACCCGTTTGG TTCTGTCGAT TT

附图说明

图1：以hBMP1-hBMP2二连体为例的基因工程重组方法示意图

图2：编码二连体dhBMP-xmxm的基因插入质粒所构建的表达载体示例图

图3：pDH2表达载体示意图

图4：DH5α/pDH2-dhBMP-2m2m经42℃诱导和裂菌后包涵体洗涤过程的12％PAGE-SDS电泳图谱

图5：pDH2-dhBMP2m2m/DH5α42°诱导4h表达全菌液电泳道光密度扫描图

图6：包涵体洗涤4次后样品的12％PAGE-SDS电泳道激光光密度扫描图

图7：rdhBMP-2m2m HiTrap SP柱层析图谱

图8：rdhBMP-2m2m HiTrap SP柱层析纯化后12％PAGE-SDS电泳图谱

图9：rdhBMP-2m2m植入小鼠14天后局部组织切片放大100倍的显微镜照片

图10：rdhBMP-2m2m植入小鼠14天后局部组织切片放大400倍的显微镜照片

其中：

图1中：hBMP1和hBMP2分别是要构建二连体的编码第一和第二个BMP的DNA；mut标记为突变，红圆圈标出突变处；P1、P2、P3、P4、P5、P6分别为所设计的PCR扩增引物；E1、E2、E3为所设计的限制性核酸内切酶位点；Linker为所设计编码连接肽的DNA序列；ATG为DNA上的翻译起始码，TAA为DNA上的翻译终止码；pBD为质粒载体。该图清楚地显示了所发明的BMP二连体的构思及构建BMP二连体的技术解决方案。

图2中：PL为调控启动子；CI 875为编码阻遏蛋白的基因；pDH2可调控表达载体；Ampr为氨苄青霉素的抗性基因；dhBMP-xmxm为所插入的编码BMP二连体蛋白的基因。该图显示了以质粒pDH2为例所构建的pDH2-dhBMP-xmxm结构环型图。

图3中：MCS表示多克隆位点；pL为启动子：rmRT1T2为转录终止子，可以提高目的蛋白表达水平；Apr为氨苄青霉素抗性基因；ori表示质粒复制起始点；RNAprimer为编码质粒复制所需要的RNA引物的DNA序列；圆环图下的是MSC区的DNA序列，标出其中各种限制性内切酶位点。此图显示了图1中所举出的pDH2结构环型示意图。

图4中：PAGE-SDS是十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳的缩写(下同)。CU为pDH2/DH5α(空载体对照)30℃培养未诱导样品；CI为pDH2/DH5α(空载体对照)42℃诱导4h样品；BU为pDH2-dhBMP2m2m/DH5α 30℃培养未诱导样品；BI为pDH2-dhBMP2m2m/DH5α 42℃诱导4h样品，目的蛋白占76.7％；T1为STE悬浮的菌体沉淀样品；T2为STE洗涤1次后的菌体沉淀悬浮液样品；S1为裂菌离心后的上清样品；S2为包涵体洗涤1次的上清样品；I1为包涵体洗涤1次后的悬浮液样品；I2为包涵体洗涤2次后的悬浮液样品；I3为包涵体洗涤3次后的悬浮液样品；3S为包涵体洗涤3次的上清样品；I4为包涵体洗涤4次后的悬浮液样品，目的蛋白占90.6％；4S为包涵体洗涤4次的上清样品。该图说明了所构建的pDH2-dhBMP-2m2m转化大肠杆菌DH5α后，经诱导表达，目的蛋白rdhBMP-2m2m有很高的表达水平(占细菌总蛋白量的76.7％)，因而经裂菌后释放出来的目的蛋白rdhBMP-2m2m也就容易纯化，包涵体只经4次洗涤rdhBMP-2m2m的纯度就达到90.6％。

图5中：横坐标表示电泳距离，纵坐标表示激光扫描的光密度值。该图显示了DH5α/pDH2-dhBMP-2m2m诱导后所表达的目的蛋白rdhBMP-2m2m占细菌总蛋白量76.7％的高水平的结果。

图6中：横坐标表示距离，纵坐标表示激光扫描的光密度值。该图显示了包涵体经4次洗涤后rdhBMP-2m2m的纯度达到90.6％高水平的结果，说明包涵体洗涤的纯化效果很好。

图7中：纵坐标表示A₂₆₀吸光度值，横坐标表示记录纸移动距离。该图显示出HiTrapSP阴离子柱层析中蛋白质被洗脱分离的情况。

图8中：该图显示了经SP阳离子柱层析后，rdhBMP-2m2m的纯度已经达到电泳纯的程度。

图9中：为放大100倍照片；此图清楚地看到rdhBMP-2m2m植入小鼠后肢肌肉14天后局部异位成骨形成骨小梁和成骨细胞的情况，证明了所制备的rdhBMP-2m2m有很好的诱骨活性。

图10中：为放大400倍照片；此图清楚地看到rdhBMP-2m2m植入小鼠后肢肌肉14天后局部异位成骨形成骨小梁和成骨细胞的情况，证明了所制备的rdhBMP-2m2m有很好的诱骨活性。

具体实施方式

现结合附图，以主要采用PCR手段去构建BMP二连体的设计、构建rdhBMP-2m2m为例，对本发明做进一步说明：

(一)构建rdhBMP-2m2m的步骤(参见图1)：

步骤1：分析所拟构建的BMP二聚体构象、以及BMP肽链中应该用于形成链间双硫键的半胱氨酸位置是在人BMP-2成熟肽(hBMP-2m)肽链第78个氨基酸残基的位置上；

步骤2：设计聚合酶链式反应(PCR)方案，用PCR手段将hBMP-2m第78位半胱氨酸(C)突变为丙氨酸(A)，并在编码区前面加入限制性核酸内切酶EcoRI位点序列和起始码ATG。

(1)设计并合成PCR引物P1和P2。其序列如下：

P1：CGGAATTCATGCAAGCCAAACACAAACAGCG

P2：CGGGACACAGCTTGCCTTAG

(2)以本课题组克隆的人BMP-2成熟肽编码序列为模板，P1、P2为引物，经PCR扩增，获得预期的254bp的PCR产物。

步骤3：在上述经过突变的第一个BMP肽链的羧基端(C端)连接上一段连接肽；即将编码富含甘氨酸(G)15肽的DNA序列加到编码第78位半胱氨酸突变了的人BMP-2成熟肽DNA后面，并加入限制性核酸内切酶KpnI位点序列。

(3)设计并合成PCR引物P3和P4。其序列如下：

P3：GCAAGCTGTGTCCCGACAG

P4：CCGGTACCGATCCGCCACCGCCGCTGCCACCTCCGCCTG

AACCGCCTCCACC GCGACACCCACAACCCTCC

(4)以本课题组克隆的人BMP-2成熟肽编码序列为模板，P3、P4为引物，经PCR扩增，获得预期的166 bp的PCR产物。

步骤4：用聚合酶链式反应(PCR)手段，获得编码完整的第78位半胱氨酸突变了的人BMP-2成熟肽及其后面的连接肽(15肽)的DNA

(5)以P1、P4为引物，(2)与(4)所得的PCR产物为模板，PCR扩增得到预期(2)与(4)所得产物连接长度的DNA，将两个DNA序列连接起来；

步骤5：将连接好的编码[第一个BMP肽链--连接肽--第二个BMP肽链]的DNA序列克隆入大肠杆菌表达质粒，构建BMP二连体的表达载体；即将编码完整的第78位半胱氨酸突变了的人BMP-2成熟肽及其后面的连接肽(Linker)的DNA插入本课题组构建的表达载体pDH2(见附图1)中，构建pDH2-hBMP-2m-Linker。

步骤6：将BMP二连体的表达载体转化适当的大肠杆菌宿主菌；提取质粒，经限制性核酸内切酶消化和核酸序列测定鉴定；并鉴定带有BMP二连体的表达载体菌株的表达水平和稳定性；即将：

(6)pDH2和从(5)所得的PCR产物，均先用限制性核酸内切酶EcoRI消化，再用Klenow聚合酶将粘端补平，然后用限制性核酸内切酶XbaI消化，回收片段。

(7)将由(6)回收的片段用连接酶连接，转化大肠杆菌宿主菌DH5α。经氨苄青霉素(Amp)筛选，提取质粒，经限制性核酸内切酶消化、琼脂糖电泳鉴定，证明获得了预期的pDH2-hBMP-2m-Linker。

步骤7：设计PCR方案，将限制性核酸内切酶Kpn1和Xba1位点序列分别加到另一编码完整的第78位半胱氨酸突变了的人BMP-2成熟肽DNA序列的两端。

(8)设计并合成PCR引物P5和P6。其序列如下：

P5：CCGGTAC CAAGCCAAACACAAACAGCG

P6：GCTCTAGAT TAGCGAGACCCACAACCCTC

(9)以(5)所得PCR产物为模板，P5和P6为引物，经PCR扩增，获得预期的360bp的PCR的产物。

步骤8：构建重组的同源人BMP-2成熟肽二连体(rdhBMP-2m2m)的表达载体pDH2-dhBMP-2m2m。

(10)pDH2-hBMP-2m-Linker和由(9)获得的360bp的PCR产物，均先用KpnI酶消化，再用T4聚合酶将粘端削平，然后用限制性核酸内切酶XbaI消化，回收片段。

(11)将由(10)回收的片段用连接酶连接，转化大肠杆菌宿主菌DH5α。经氨苄青霉素(Amp)筛选，提取质粒，经限制性核酸内切酶消化、琼脂糖电泳鉴定，证明获得了预期的pDH2-dhBMP-2m2m。

(二)表达载体pDH2-dhBMP-2m2m和菌珠的鉴定和测试结果

1、pDH2-dhBMP-2m2m的DNA序列测定：DNA序列实际测定结果与设计预期的完全一致。(见前所公开的DNA序列)

2、pDH2-dhBMP-2m2m/DH5α诱导表达rdhBMP-2m2m蛋白质：-70℃冻存的菌种pDH2-dhBMP-2m2m/DH5α，经30℃过夜培养复苏，转接入500ml LB-Amp培养液中30℃培育至测OD₆₀₀＝0.40，转入42℃水浴摇床诱导4h，离心，收菌。按照常规操作裂菌、洗涤包涵体4次。取样作SDS-PAGE电泳分析(电泳图谱见附图2)，并对相关泳道作激光光密度扫描(光密度扫描见附图3)。结果：pDH2-dhBMP-2m2m/DH5α经42℃诱导4h后，表达的rdhBMP-2m2m蛋白量占细菌总蛋白量高达76.7％(见附图3)。包涵体经4次洗涤纯化后，其中rdhBMP-2m2m蛋白纯度更高达90.6％。试验证明所构建的pDH2-dhBMP-2m2m表达载体菌株有极高的rdhBMP-2m2m蛋白量表达能力，给制备或生产rdhBMP-2m2m创造了极有利的条件。

3、pDH2-dhBMP-2m2m/DH5α菌种的稳定性：pDH2-dhBMP-2m2m/DH5α菌种经-70℃长期冻存，经50次传代培养，任意取单菌落提取质粒进行鉴定，证明pDH2-dhBMP-2m2m没有丢失。50次传代后，任意取单菌落进行诱导表达试验，结果表达rdhBMP-2m2m目的蛋白的强度没有减弱。试验证明DH5α/pDH2-dhBMP-2m2m菌种有很好的稳定性，适于用作大量生产的工程菌株。

(三)dhBMP-2m2m二连体蛋白的纯化和生物学活性

1、rdhBMP-2m2m蛋白的离子交换柱层析纯化：洗涤后的包涵体用尿素溶解后，经HiTrap-SP阳离子柱层析(层析图谱见附图4)，收集含rdhBMP-2m2m的峰液，取样作PAGE-SDS电泳分析(电泳图谱见附图5)。结果：经HiTrap-SP阳离子柱层析纯化后，rdhBMP-2m2m二连体蛋白纯度达到95％以上。表明rdhBMP-2m2m二连体蛋白的纯化比rhBMP-2m的单体更为容易。

2、rdhBMP-2m2m蛋白的分析：测定纯化rdhBMP-2m2m蛋白的氨基端20个氨基酸序列，结果与设计预期的结果完全一致，构建表达载体时放入的起始码ATG所编码的氨基端第一个蛋氨酸已被切除。

rdhBMP-2m2m蛋白质的氨基酸全序列：由243氨基酸组成

1 QAKHKQRKRL KSSCKRHPLY VDFSDVGWND WIVAPPGYHA FYCHGECPFP

 51 LADHLNSTNH AIVQTLVNSV NSKIPKASCV PTELSAISML YLDENEKVVL

101 KNYQDMVVEG CGCRGGGGSG GGGSGGGGSQ AKHKQRKRLK SSCKRHPLYV

151 DFSDVGWNDW IVAPPGYHAF YCHGECPFPL ADHLNSTNHA IVQTLVNSVN

201 SKIPKASCVP TELSAISMLY LDENEKVVLK NYQDMVVEGC GCR

肽链长度	243氨基酸
		分子量	26703.41
计算：1毫克＝	37.448皮克分子
		克分子消光系数	37000
A280吸光度1相当的蛋白浓度	0.72mg/ml
		1mg/ml的蛋白的A280吸光度为	1.39吸光单位
等电点	8.41
		pH 7时所带电荷	4.70

氨基酸	数量	占质量	频率％
				带电荷氨基酸(RKHYCDE)酸性氨基酸(DE)碱性氨基酸(KR)极性氨基酸(NCQSTY)疏水性氨基酸(AILFWV)	8222267172	39.349.8812.9629.6329.11	33.749.0510.7029.2229.63

(四)rdhBMP-2m2m蛋白的复性及生物活性检测

1、rdhBMP-2m2m蛋白的复性：经纯化的rdhBMP-2m2m蛋白对4-8M尿素透析，再透析去除尿素。复性后的rdhBMP-2m2m蛋白在pH5中是可溶性的，水溶液完全无色透明。用还原和非还原的PAGE-SDS电泳分析复性结果(复性后rdhBMP-2m2m蛋白的还原和非还原PAGE-SDS电泳图谱见附图7)。结果：复性后的rdhBMP-2m2m蛋白带仍在原来的电泳位置，极少形成多聚体，提示经复性rdhBMP-2m2m中的半胱氨酸残基主要都形成了肽链内的双硫键。这结果还重要地表明使大肠杆菌直接表达rdhBMP-2m2m二连体，可以省却过去大肠杆菌表达rhBMP-2m单体、复性后要分离二聚体的困难步骤。

2、复性后的rdhBMP-2m2m蛋白生物学活性检测：采用了体外培养细胞株和整体小鼠肌袋诱导异位成骨2种方法进行检测。检测结果都显示：复性后的rdhBMP-2m2m二连体具有很好的生物学活性。具体的实验及结果如下。

(1)用本课题组建立并获得专利的C2C12-K4细胞(国家专利号：ZL 01 1 31813.9)测定BMP活性。此检测法的基本原理是：本课题组所建立的C2C12-K4细胞，细胞膜表面有BMP受体，细胞基因组内整合有接受BMP受体传递的信息而表达的荧光素酶(luciferase)报告基因。当加入有生物学活性的BMP时，BMP与细胞膜表面的BMP受体相互作用而向细胞发出信号，经信号传导，使荧光素酶表达，能够分解酶的底物发出荧光，荧光的强弱可以反映BMP的生物活性。

用复性后的rdhBMP-2m2m二连体蛋白进行试验，结果rdhBMP-2m2m蛋白浓度在纳克水平(ng/ml)就显示出很明显的活性，实验数据如下：

荧光读数	无外加BMP对照	加入rdhBMP-2m2m
			第1次读数	281.3	445.8
第2次读数	280.2	441.7
			平均数	280.8	443.7

(2)整体小鼠肌袋诱导异位成骨试验：此法是世界公认的整体BMP生物活性检测试验，一般将1-2mg不溶性BMP(或将BMP吸附在某些载体上)，植入小鼠肌肉，通常在2周左右局部会诱导生成软骨，3周左右会形成骨组织。将复性后的rdhBMP-2m2m沉淀吸附在小块猪皮胶元上，植入小鼠肌肉。结果2周时局部已经形成硬块，取局部组织做组织切片染色，显微镜下观察，证实已经有骨小梁的形成。证明复性后的rdhBMP-2m2m有良好的诱导异位成骨的活性。(显微镜照片见附图9)

Claims (7)

1、基因工程重组二连体骨形成蛋白的设计构建方法，其特征在于：用基因工程手段，将2个BMP成熟肽间的双硫键(-S-S-)改为以肽键(-CO-NH-)相连接，即将编码BMP成熟肽段的cDNA放在大肠杆菌中表达，使BMP成熟肽在内部正确形成3对双硫键，在BMP成熟肽的链间以肽键相连接而成为BMP二连体以及经在体外纯化、复性后折叠成为有活性的BMP；

所述的体外纯化包括下列步骤：洗济后的包涵体用尿素溶解后，经HiTrap-SP阳离子柱层析，收集含rdhBMP-2m2m的峰液，取样作PAGE-SDS电泳分析；

所述的复性包括以下步骤：经纯化的rdhBMP-2m2m蛋白对4-8M尿素透析，再透析去除尿素。

2、根据权利要求1说述的基因工程重组二连体骨形成蛋白的设计构建方法，其特征在于：具体方法步骤如下：

步骤1：分析所拟构建的BMP二聚体构象及BMP肽链中应该用于形成链间双硫键的半胱氨酸位置；

步骤2：将要原本应该形成二聚体链间双硫键的两个BMP肽链中的半胱氨酸突变，使其变为不能形成双硫键的其他氨基酸；可以用对编码BMP肽链的cDNA进行定点突变来完成；或用聚合酶链式反应PCR或商售定位突变试剂盒的方法来完成；

步骤3：在上述经过突变的第一个BMP肽链的羧基端连接上一段连接肽；这段连接肽富含甘氨酸，使相连的两段BMP肽链间有足够的空间距离和活动度；该工作可以靠限制性核酸内切酶或聚合酶链式反应PCR的设计，将编码第一个BMP肽链的cDNA和编码连接肽的DNA序列按读框连续的方式连接起来；

步骤4：再将上述经过突变的第二个BMP肽链按读框连续的方式连接在第一个BMP肽链-连接肽的羧基端；该工作同样可以靠限制性核酸内切酶或聚合酶链式反应(PCR)的设计将两个DNA序列连接起来；

步骤5：将连接好的编码[第一个BMP肽链--连接肽--第二个BMP肽链]的DNA序列克隆入大肠杆菌表达质粒，构建BMP二连体的表达载体；

步骤6：将BMP二连体的表达载体转化适当的大肠杆菌宿主菌；提取质粒，经限制性核酸内切酶消化和核酸序列测定鉴定；并鉴定带有BMP二连体的表达载体菌株的表达水平和稳定性。

3、根据权利要求1或2说述的基因工程重组二连体骨形成蛋白的设计构建方法，其特征在于：将2个BMP成熟肽间的双硫键(-S-S-)改为以肽键(-CO-NH-)相连接的2个BMP构成的产物命名为BMP二连体，由2个人骨形成蛋白BMP成熟肽组成的二连体全名为“重组人BMP成熟肽二连体rdhBMP-xmxm；其中x为构成二连体的BMP种类名号，m为成熟肽的代号；两个x种类名号可相同，也可不同。

4、根据权利要求1或2说述的基因工程重组二连体骨形成蛋白的设计构建方法，其特征在于：所述的将两个BMP肽链中的半胱氨酸突变的过程需要加入限制性核酸内切酶位点序列和起始码，并需要聚合酶链式反应(PCR)的扩增引物；引物根据需要可设计为不同DNA序列。

5、根据权利要求1或2说述的基因工程重组二连体骨形成蛋白的设计构建方法，其特征在于：所述的连接肽是指根据要求设计的一段具有特定DNA序列编码富含甘氨酸的肽链。

6、根据权利要求1或2说述的基因工程重组二连体骨形成蛋白的设计构建方法，其特征在于：所述的BMP二连体的表达载体是指BMP插入大肠杆菌质粒所构建的、能在大肠杆菌中表达BMP二连体的质粒。

7、根据权利要求1说述的基因工程重组二连体骨形成蛋白的设计构建方法，其特征在于：所述的大肠杆菌宿主菌可为DH5α、TOP 10或基因工程大肠杆菌宿主菌。

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