CN112342241B

CN112342241B - 一种光控骨形成蛋白受体系统OptoBMPR及其构建方法和应用

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Publication number: CN112342241B
Application number: CN202010267510.0A
Authority: CN
Inventors: 张翠萍; 胡文治; 马奎; 付小兵
Original assignee: Fourth Medical Center General Hospital of Chinese PLA
Current assignee: Fourth Medical Center General Hospital of Chinese PLA
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2040-04-08
Also published as: CN112342241A

Abstract

本发明提供了一种光控骨形成蛋白受体系统OptoBMPR及其制备方法和应用，属于细胞生物学技术领域；所述光控骨形成蛋白受体系统包括表达骨形成蛋白I型受体OptoBR1的第一重组质粒和表达骨形成蛋白II型受体OptoBR2的第二重组质粒。本发明中，OptoBR1和OptoBR2分别定位于细胞膜和细胞浆，在460nm蓝光作用下，胞浆OptoBR2特异性结合于胞膜的OptoBR1，并磷酸化OptoBR1活性位点，导致下游Smad1/5/8信号通路激活，从而实现对BMP/Smad1/5/8信号通路的精确调控。

Description

一种光控骨形成蛋白受体系统OptoBMPR及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种光控骨形成蛋白受体系统OptoBMPR及其制备方法和应用。

背景技术

转换生长因子-β(TGF-β)家族成员是一大类可分泌的细胞因子，参与调节多种生物功能，包括细胞的增殖、迁移、生存和分化。骨形成蛋白(BMP)作为TGF-β家族的主要成员，BMP2/4/5/6/7/8主要介导I型受体(BMPR1a和BMPR1b)与II型受体(ACVR2a、ACVR2b和BMPR2)的相互作用，通过磷酸化下游pSmad1/5/8信号通路，启动特定的转录组，进而发挥生物学功能。BMP/Smad1/5/8信号通路，在多种生物过程中扮演重要角色，其在时间和空间上分布的特异性，直接影响干细胞分化和组织器官的发生，在组织工程的研究中具有重要意义。然而由于BMP的稳定性与扩散性，传统的研究方法很难在时间与空间维度上对BMP/Smad1/5/8信号通路进行精确的调控。

发明内容

本发明的目的在于提供一种光控骨形成蛋白受体系统OptoBMPR及其制备方法和应用，本发明的光控骨形成蛋白受体系统能够利用460nm蓝光精准调控细胞内BMP/Smad1/5/8信号通路。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种光控骨形成蛋白受体系统OptoBMPR，所述光控骨形成蛋白受体系统包括表达骨形成蛋白I型受体OptoBR1的第一重组质粒和表达骨形成蛋白II型受体OptoBR2的第二重组质粒；所述骨形成蛋白I型受体OptoBR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述骨形成蛋白II型受体OptoBR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述骨形成蛋白I型受体OptoBR1的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；所述骨形成蛋白II型受体OptoBR2的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述第一重组质粒和第二重组质粒的构建用骨架载体分别包括腺病毒。

优选的，所述光控骨形成蛋白受体系统还包括腺病毒包装细胞。

优选的，所述腺病毒包装细胞包括胚胎肾细胞。

本发明提供了上述方案所述光控骨形成蛋白受体系统的构建方法，包括以下步骤：

1)将表达骨形成蛋白I型受体OptoBR1的编码基因插入第一构建用骨架质粒，得到第一重组质粒；

2)将表达骨形成蛋白II型受体OptoBR2的编码基因插入第二构建用骨架质粒，得到第二重组质粒；

所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序限制。

本发明提供了上述方案所述光控骨形成蛋白受体系统在激活细胞内BMP/Smad1/5/8信号通路中的应用。

优选的，所述应用包括以下步骤：利用光控骨形成蛋白受体系统中的第一重组质粒和第二重组质粒共转染表皮干细胞，得到转基因细胞，采用460nm蓝光对转基因细胞辐射30s～24h，激活转基因细胞内BMP/Smad1/5/8信号通路。

优选的，所述460nm蓝光的辐射强度为0.1～100μW·cm^-2。

本发明提供了上述方案所述光控骨形成蛋白受体系统在制备激活细胞内BMP/Smad1/5/8信号通路的制剂中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种光控骨形成蛋白受体系统OptoBMPR，所述光控骨形成蛋白受体系统包括表达骨形成蛋白I型受体OptoBR1的第一重组质粒和表达骨形成蛋白II型受体OptoBR2的第二重组质粒。本发明中，OptoBR1和OptoBR2分别定位于细胞膜和细胞浆，在460nm蓝光作用下，胞浆OptoBR2特异性结合于胞膜的OptoBR1，并磷酸化OptoBR1活性位点，导致下游Smad1/5/8信号通路激活，从而实现对BMP/Smad1/5/8信号通路的精确调控。

附图说明

图1为本发明光控骨形成蛋白(OptoBMPR)I/II型受体作用的机理；

图2-A为在黑暗条件下，绿色荧光蛋白标记的OptoBR1锚定于细胞膜上，红色荧光蛋白标记的OptoBR2分布于胞浆中，蓝光刺激30s后，OptoBR2聚集于细胞膜上，结合到锚定于细胞膜的OptoBR1，避光后15min，OptoBR2重新分散到胞浆中；

图2-B为细胞膜附近荧光信号强度分析结果，可见在蓝光刺激下，细胞膜附近红色荧光信号显著增强；

图3为不同刺激条件下Smad1/5/8信号通路的磷酸化程度；其中图3中的A为不同浓度bmp2刺激下，Smad1/5/8磷酸化强度随bmp2浓度增高而增强，图3中的B为不同MOI感染条件下，Smad1/5/8光激活强度随MOI增高而增强，图3中的C为不同强度的蓝光刺激下，Smad1/5/8磷酸化强度随辐射能量增高而增强；

图4为蓝光辐射(100μW·cm^-2)对细胞活率的影响情况。

具体实施方式

本发明提供了一种光控骨形成蛋白受体系统OptoBMPR，所述光控骨形成蛋白受体系统包括表达骨形成蛋白I型受体OptoBR1的第一重组质粒和表达骨形成蛋白II型受体OptoBR2的第二重组质粒。本发明分别构建第一重组质粒和第二重组质粒，能够调控OptoBR1和OptoBR2的表达比例，在不同细胞系中优化信号通路强度、降低背景噪音。

本发明中，OptoBR1和OptoBR2分别定位于细胞膜和细胞浆，在460nm蓝光作用下，胞浆OptoBR2特异性结合于胞膜的OptoBR1，并磷酸化OptoBR1活性位点，导致下游Smad1/5/8信号通路激活，从而实现对BMP/Smad1/5/8信号通路的精确调控(作用机理示意图参见图1)。

本发明所述骨形成蛋白I型受体OptoBR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：MGCVQCKDKEATKLT【MYR结构域(P06241,1～15bp)】KHYCKSISSRGRYNRDLEQDEAFIPVGESLKDLIDQSQSSGSGSGLPLLVQRTIAKQIQMVRQVGKGRYGEVWMGKWRGEKVAVKVFFTTEEASWFRETEIYQTVLMRHENILGFIAADIKGTGSWTQLYLITDYHENGSLYDFLKCATLDTRALLKLAYSAACGLCHLHTEIYGTQGKPAIAHRDLKSKNILIKKNGSCCIADLGLAVKFNSDTNEVDIPLNTRVGTKRYMAPEVLDESLNKNHFQPYIMADIYSFGLIIWEMARRCITGGIVEEYQLPYYNMVPSDPSYEDMREVVCVKRLRPIVSNRWNSDECLRAVLKLMSECWAHNPASRLTALRIKKTLAKMVESQDVKI【Bmpr1a胞内部分(P36895,177～532bp)】NGAIGGDLLLNFPDMSVLERQRAHLKYLNPTFDSPLAGFFADSSMITGGEMDSYLSTAGLNLPMMYGETTVEGDSRLSISPETTLGTGNFKAAKFDTETKDCNEAAKKMTMNRDDLVEEGEEEKSKITEQNNGSTKSIKKMKHKAKKEENNFSNDSSKVTKELEKTDYI【CIB1N末端(Q8GY61,2～170bp)^a】。

本发明中，所述骨形成蛋白I型受体OptoBR1由N端到C端依次融合人酪氨酸受体蛋白激酶Fyn的豆蔻酰化位点(1～15bp)，小鼠骨形成蛋白受体1a(Bmpr1a)的胞内部分(177～532bp)和拟南芥隐花色素结合蛋白1N端(2～170bp，CIBN)，其中下划线部分为突变氨基酸，以减少OptoBR1的细胞核定位。

本发明中，Fyn豆蔻酰化位点将OptoBR1锚定于细胞膜；CIBN为光敏蛋白，在蓝光刺激下可特异性结合OptoBR2的PHR结构域；Bmpr1a通过删除胞外受体，避免了内源性配体(如bmp2等)激活信号通路。

本发明中，所述骨形成蛋白I型受体OptoBR1的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，具体为：atgggctgtgtgcaatgtaaggataaagaagcaacaaaactgacgaagcattattgtaagagtatctcaagcaggggtcgttacaaccgtgatttggaacaggatgaagcatttattccagtaggagaatcattgaaagacctgattgaccagtcccaaagctctgggagtggatctggattgcctttattggttcagcgaactattgccaaacagattcagatggttcggcaggttggtaaaggccgctatggagaagtatggatgggtaaatggcgtggtgaaaaagtggctgtcaaagtgttttttaccactgaagaagctagctggtttagagaaacagaaatctaccagacggtgttaatgcgtcatgaaaatatacttggttttatagctgcagacattaaaggcactggttcctggactcagctgtatttgattactgattaccatgaaaatggatctctctatgacttcctgaaatgtgccacactagacaccagagccctactcaagttagcttattctgctgcttgtggtctgtgccacctccacacagaaatttatggtacccaagggaagcctgcaattgctcatcgagacctgaagagcaaaaacatccttattaagaaaaatggaagttgctgtattgctgacctgggcctagctgttaaattcaacagtgatacaaatgaagttgacatacccttgaataccagggtgggcaccaagcggtacatggctccagaagtgctggatgaaagcctgaataaaaaccatttccagccctacatcatggctgacatctatagctttggtttgatcatttgggaaatggctcgtcgttgtattacaggaggaatcgtggaggaatatcaattaccatattacaacatggtgcccagtgacccatcctatgaggacatgcgtgaggttgtgtgtgtgaaacgcttgcggccaatcgtgtctaaccgctggaacagcgatgaatgtcttcgagcagttttgaagctaatgtcagaatgttgggcccataatccagcctccagactcacagctttgagaatcaagaagacacttgcaaaaatggttgaatcccaggatgtaaagattaatggagctataggaggtgaccttttgctcaattttcctgacatgtcggtcctagagcgccaaagggctcacctcaagtacctcaatcccacctttgattctcctctcgccggcttctttgccgattcttcaatgattaccggcggcgagatggacagctatctttcgactgccggtttgaatcttccgatgatgtacggtgagacgacggtggaaggtgattcaagactctcaatttcgccggaaacgacgcttgggactggaaatttcaaggcagcgaagtttgatacagagactaaggattgtaatgaggcggcgaagaagatgacgatgaacagagatgacctagtagaagaaggagaagaagagaagtcgaaaataacagagcaaaacaatgggagcacaaaaagcatcaagaagatgaaacacaaagccaagaaagaagagaacaatttctctaatgattcatctaaagtgacgaaggaattggagaaaacggattatatttaa；所述骨形成蛋白I型受体OptoBR1的编码基因优选的采用化学合成的方法获得。

本发明所述骨形成蛋白II型受体OptoBR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：MRHHKMAYPPVLVPTQDPGPPPPSPLLGLKPLQLLEVKARGRFGCVWKAQLLNEYVAVKIFPIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHENILQFIGAEKRGTSVDVDLWLITAFHEKGSLSDFLKANVVSWNELCHIAETMARGLAYLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGLALKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELASRCTAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQEVVVHKKKRPVLRDYWQKHAGMAMLCETIEECWDHDAEARLSAGCVGERITQMQRLTNIITTEDIVTVVTMVTNVDFPPKESSL【Acvr2a胞内部分(P27038,162～513bp)】KMDKKTIVWFRRDLRIEDNPALAAAAHEGSVFPVFIWCPEEEGQFYPGRASRWWMKQSLAHLSQSLKALGSDLTLIKTHNTISAILDCIRVTGATKVVFNHLYDPVSLVRDHTVKEKLVERGISVQSYNGDLLYEPWEIYCEKGKPFTSFNSYWKKCLDMSIESVMLPPPWRLMPITAAAEAIWACSIEELGLENEAEKPSNALLTRAWSPGWSNADKLLNEFIEKQLIDYAKNSKKVVGNSTSLLSPYLHFGEISVRHVFQCARMKQIIWARDKNSEGEESADLFLRGIGLREYSRYICFNFPFTHEQSLLSHLRFFPWDADVDKFKAWRQGRTGYPLVDAGMRELWATGWMHNRIRVIVSSFAVKFLLLPWKWGMKYFWDTLLDADLECDILGWQYISGSIPDGHELDRLDNPALQGAKYDPEGEYIRQWLPELARLPTEWIHHPWDAPLTVLKASGVELGTNYAKPIVDIDTARELLAKAISRTREAQIMIGAA【Cryptochrome2PHR结构域(Q96524,2～498bp)】。

本发明中，所述骨形成蛋白II型受体由N端到C端，依次融合小鼠激活素受体2a(Acvr1a)的胞内部分(162～513bp)与拟南芥隐花色素N端(2～498bp，PHR)。

本发明中，PHR结构域在蓝光刺激下，可特异性结合OptoBR1的CIBN结构域；Acvr1a的胞内部分，通过删除胞外及跨膜区域，使得OptoBR2分布于胞浆。

本发明中，所述骨形成蛋白II型受体OptoBR2的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，具体为：atgagacatcacaagatggcctaccctcctgtacttgttcctactcaagacccaggaccacccccaccttccccattactagggttgaagccattgcagctgttagaagtgaaagcaaggggaagatttggttgtgtctggaaagcccagttgctcaatgaatatgtggctgtcaaaatatttccaatacaggacaaacagtcctggcagaatgaatatgaagtctatagtctacctggaatgaagcatgagaacatactacagttcattggtgcagagaaaagaggcaccagtgtggatgtggacctgtggctaatcacagcatttcatgaaaagggctcactgtcagactttcttaaggctaatgtggtctcttggaatgaactttgtcatattgcagaaaccatggctagaggattggcatatttacatgaggatatacctggcttaaaagatggccacaagcctgcaatctctcacagggacatcaaaagtaaaaatgtgctgttgaaaaacaatctgacagcttgcattgctgactttgggttggccttaaagttcgaggctggcaagtctgcaggtgacacccatgggcaggttggtacccggaggtatatggctccagaggtgttggagggtgctataaacttccaaagggacgcatttctgaggatagatatgtacgccatgggattagtcctatgggaattggcttctcgttgcactgctgcagatggacccgtagatgagtacatgttaccatttgaggaagaaattggccagcatccatctcttgaagatatgcaggaagttgttgtgcataaaaaaaagaggcctgttttaagagattattggcagaaacatgcaggaatggcaatgctctgtgaaacgatagaagaatgttgggatcatgatgcagaagccaggttatcagctggatgtgtaggtgaaagaattactcagatgcaaagactaacaaatatcattactacagaggacattgtaacagtggtcacaatggtgacaaatgttgactttcctcccaaagaatctagtctaaagatggacaaaaagactatagtttggtttagaagagacctaaggattgaggataatcctgcattagcagcagctgctcacgaaggatctgtttttcctgtcttcatttggtgtcctgaagaagaaggacagttttatcctggaagagcttcaagatggtggatgaaacaatcacttgctcacttatctcaatccttgaaggctcttggatctgacctcactttaatcaaaacccacaacacgatttcagcgatcttggattgtatccgcgttaccggtgctacaaaagtcgtctttaaccacctctatgatcctgtttcgttagttcgggaccataccgtaaaggagaagctggtggaacgtgggatctctgtgcaaagctacaatggagatctattgtatgaaccgtgggagatatactgcgaaaagggcaaaccttttacgagtttcaattcttactggaagaaatgcttagatatgtcgattgaatccgttatgcttcctcctccttggcggttgatgccaataactgcagcggctgaagcgatttgggcgtgttcgattgaagaactagggctggagaatgaggccgagaaaccgagcaatgcgttgttaactagagcttggtctccaggatggagcaatgctgataagttactaaatgagttcatcgagaagcagttgatagattatgcaaagaacagcaagaaagttgttgggaattctacttcactactttctccgtatctccatttcggggaaataagcgtcagacacgttttccagtgtgcccggatgaaacaaattatatgggcaagagataagaacagtgaaggagaagaaagtgcagatctttttcttaggggaatcggtttaagagagtattctcggtatatatgtttcaacttcccgtttactcacgagcaatcgttgttgagtcatcttcggtttttcccttgggatgctgatgttgataagttcaaggcctggagacaaggcaggaccggttatccgttggtggatgccggaatgagagagctttgggctaccggatggatgcataacagaataagagtgattgtttcaagctttgctgtgaagtttcttctccttccatggaaatggggaatgaagtatttctgggatacacttttggatgctgatttggaatgtgacatccttggctggcagtatatctctgggagtatccccgatggccacgagcttgatcgcttggacaatcccgcgttacaaggcgccaaatatgacccagaaggtgagtacataaggcaatggcttcccgagcttgcgagattgccaactgaatggatccatcatccatgggacgctcctttaaccgtactcaaagcttctggtgtggaactcggaacaaactatgcgaaacccattgtagacatcgacacagctcgtgagctactagctaaagctatttcaagaacccgtgaagcacagatcatgatcggagcagcataa；所述骨形成蛋白II型受体OptoBR2的编码基因优选的采用化学合成的方法获得。

本发明中，所述第一重组质粒和第二重组质粒的构建用骨架载体分别优选的包括腺病毒，更优选的包括Ad5/F35腺病毒骨架载体；本发明具体实施过程中，采用Ad5/F35腺病毒骨架载体pAV[Exp]/CMV>shuttle_empty vector(Position:1438-3063，Cyagen，美国)。当第一重组质粒和/或第二重组质粒的构建用骨架载体为腺病毒时，所述光控骨形成蛋白受体系统优选的还包括腺病毒包装细胞；所述腺病毒包装细胞优选的包括胚胎肾细胞。

1)将表达的骨形成蛋白I型受体OptoBR1的插入第一构建用骨架质粒，得到第一重组质粒；

2)将表达的骨形成蛋白II型受体OptoBR2的插入第二构建用骨架质粒，得到第二重组质粒；

所述第一重组质粒和所述第二重组质粒组合，得到光控骨形成蛋白受体系统；

所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序限制。

本发明将表达的骨形成蛋白I型受体OptoBR1的插入第一构建用骨架质粒，得到第一重组质粒；所述插入的过程优选的采用Gateway技术进行。

本发明将表达的骨形成蛋白II型受体OptoBR2的插入第二构建用骨架质粒，得到第二重组质粒；所述插入的过程优选的采用Gateway技术进行。

本发明制备得到第一重组质粒和第二重组质粒后，即得到光控骨形成蛋白受体系统。

本发明在制备得到第一重组质粒和第二重组质粒后，优选的还包括分别对第一重组质粒和第二重组质粒进行线性化处理。

本发明提供了上述方案所述光控骨形成蛋白受体系统在激活细胞内BMP/Smad1/5/8信号通路中的应用；所述应用优选的包括以下步骤：利用光控骨形成蛋白受体系统中的第一重组质粒和第二重组质粒共转染表皮干细胞，得到转基因细胞，采用460nm蓝光对转基因细胞辐射30s～24h，激活转基因细胞内BMP/Smad1/5/8信号通路；所述表皮干细胞广泛适用于哺乳动物；所述辐射的时间优选为1min～10h，更优选为1h；所述460nm蓝光的辐射强度优选为0.1～100μW·cm^-2，更优选为50～80μW·cm^-2。

本发明中，当所述第一重组质粒和第二重组质粒的构建用骨架载体为腺病毒时，以表皮干细胞(EpiSC)的细胞数为0.7×10⁶个为例，所述的第一重组质粒和第二重组质粒的MOI分别优选为20～200，更优选为50～100。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 OptoBR1/II腺病毒载体的构建及腺病毒的包装和细胞感染

1.OptoBR1腺病毒载体构建：由N端到C端，依次融合人酪氨酸受体蛋白激酶Fyn的豆蔻酰化位点(1～15)，小鼠骨形成蛋白受体1a(Bmpr1a)的胞内部分(177～532)和拟南芥隐花色素结合蛋白1N端(2～170，CIBN)，见表1。化学合成融合片段，采用Gateway技术将合成基因片段重组于Ad5/F35腺病毒骨架载体pAV[Exp]/CMV>shuttle_empty vector(Position:1438-3063，Cyagen，美国)，构建重组腺病毒载体pAd-Ex-OptoBR1。

表1 OptoBR1蛋白及核酸序列。

注：下划线部分为突变氨基酸以减少OptoBR1的细胞核定位。

2.OptoBR2腺病毒载体构建：由N端到C端，依次融合小鼠激活素受体2a(Acvr1a)的胞内部分(162～513)与拟南芥隐花色素N端(2～498，PHR)，见表2。化学合成融合片段，采用Gateway技术将合成基因片段重组于Ad5/F35腺病毒骨架载体pAV[Exp]/CMV>shuttle_empty vector(Position:1438-3990，Cyagen，美国)，构建重组腺病毒载体pAd-Ex-OptoBR2。

表2 OptoBR2蛋白及核酸序列

3.重组腺病毒载体线性化：

(1)分别将上述pAd-OptoBR1和pAd-OptoBR2腺病毒载体，分别经由PacI限制性内切酶，37℃切割15min，65℃失活20min。

(2)450μL线性化重组腺病毒载体，加入50μL 3M乙酸钠溶液，混匀后添加1mL预冷无水乙醇，静置于-20℃30min后，12000g离心10min。弃去上清，应用750μL75％无水乙醇(无DNAase/RNAase)洗涤后，12000g离心10min。重复洗涤1次。加入50μL ddH₂O(无DNAase/RNAase)溶解沉淀的线性化质粒，并测定DNA浓度。

4.重组腺病毒包装

(1)人胚胎肾细胞293A(HEK293A)细胞系以1×10⁶细胞/孔的浓度接种于6孔板内，无菌条件下，以2mL/孔含5％胎牛血清的高糖DMEM为培养液(DMEM5)，培养于37℃、5％CO₂孵育箱内，接种后24h，转染线性化重组腺病毒质粒。

(2)脂质体预混液配置：125μL Opti-MEM培养基内，添加7.5μLlipofectamine3000吹打混匀。

(3)DNA预混液配置：125μL Opti-MEM培养基内，添加2.5μg线性化重组腺病毒载体，添加5μL P3000^TM，吹打混匀。

(4)DNA-脂质体混合物配置：将(2)和(3)混匀，室温静置15min。

(5)将DNA-脂质体混合物250μL，逐滴加入6孔板内，轻微震荡混匀，培养于37℃、5％CO₂孵育箱内。转染48h后，替换DMEM5培养基，继续培养7-10天。

(6)7～10天后，收集转染HEK293A细胞，反复冻融裂解细胞后，收集并扩增重组腺病毒。

5.表皮干细胞的培养(EpiSC)：无菌条件下培养人表皮干细胞，以含10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM为培养液(DMEM10)，在37℃、5％CO₂孵育箱内培养，24h后更换培养基,弃掉未贴壁细胞，以后每2d换液1次。待细胞达80％融合时，用0.25％的胰蛋白酶消化，给予传代培养。

6.腺病毒感染EpiSC：EpiSC以0.7×10⁶细胞/孔密度接种于6孔板，接种12h后，同时添加OptoBR1和OptoBR2腺病毒(MOI均为50)。感染EpiSC6h后，替换新鲜培养基DMEM10。感染后48h观察感染效果。

实施例2 OptoBMPR系统的功能及安全性验证

EpiSC感染OptoBR1/OptoBR2腺病毒48h后，以460nm蓝光(100μW·cm^-2)辐射转染细胞。辐射30s后可见，胞浆内的OptoBR2(红色)，显著向胞膜的OptoBR1(绿色)聚集，并在撤去蓝光辐射15min后逐渐解离(脱离细胞膜，扩散到胞浆中)(参见图2-A和图2-B，比例尺为25μm，其中图2-A为在黑暗条件下，绿色荧光蛋白标记的OptoBR1锚定于细胞膜上，红色荧光蛋白标记的OptoBR2分布于胞浆中，蓝光刺激30s后，OptoBR2聚集于细胞膜上，结合到锚定于细胞膜的OptoBR1，避光后15min，OptoBR2重新分散到胞浆中；图2-B为细胞膜附近荧光信号强度分析结果，可见在蓝光刺激下，细胞膜附近红色荧光信号显著增强)。

以0～100μW·cm^-2蓝光照射转基因细胞1h后收集蛋白，检测磷酸化Smad1/5/8信号通路激活情况，结果显示：无蓝光辐射情况下，磷酸化Smad1/5/8信号通路不被激活，而蓝光辐射后磷酸化Smad1/5/8信号显著增强，且磷酸化程度随辐射强度增加而增加(参见图3，其中图3中的A为不同浓度bmp2刺激下，Smad1/5/8磷酸化强度随bmp2浓度增高而增强，图3中的B为不同MOI感染条件下，Smad1/5/8光激活强度随MOI增高而增强，图3中的C为不同强度的蓝光刺激下，Smad1/5/8磷酸化强度随辐射能量增高而增强)。由图3中的A可以看出，随着Bmp2浓度的增加Smad1/5/8磷酸化强度逐渐增加。由图3中的B可以看出，不同腺病毒感染浓度(MOI)下，460nm蓝光(100μW·cm^-2)对细胞内Smad1/5/8磷酸化的情况。由图3中的C可以看出，不同强度(0～100μW·cm^-2)蓝光刺激下，Smad1/5/8磷酸化强度随光照强度增强。以上结果证实，OptoBMPR系统通过基因工程方法，可以利用蓝光信号，实时定量调控转基因细胞内的BMP/Smad1/5/8信号通路。

OptoBR1/OptoBR2腺病毒感染细胞，在460nm蓝光辐射后，应用RIPA裂解液提取蛋白，以Western Blot法检测pSmad1/5/8磷酸化水平【参见(Zhang X,Liu D,He Y,Lou K,Zheng D,Han W.Branched Chain Amino Acids Protects Rat Mesangial Cells fromHigh Glucose by Modulating TGF-beta1 and BMP-7[J].Diabetes,metabolic syndromeand obesity:targets and therapy,2019,12(2433-2440.)】，验证OptoBMPR系统的光控性能。通过检测蓝光对细胞活率的影响，以测试蓝光照射的安全性，EpiSC及OptoBR1/II腺病毒感染EpiSC，连续辐射460nm蓝光(100μW·cm^-2)24h后，以避光细胞作为阴性对照，应用cck-8法检测细胞活率【参见(Cai C C,Zhu J H,Ye L X,Dai Y Y,Fang M C,Hu Y Y,Pan SL,Chen S,Li P J.Glycine Protects against Hypoxic-Ischemic Brain Injury byRegulating Mitochondria-Mediated Autophagy via the AMPK Pathway[J].Oxid MedCell Longev,2019,4248529)】，结果显示蓝光(100μW·cm^-2)连续照射24h不影响细胞活率。在OptoBMPR系统转基因表皮干细胞中，100μW·cm^-2460nm蓝光辐射24h还能在一定程度上增加细胞增殖(EpiSC：表皮干细胞；OptoBMPR EpiSC：OptoBMPR系统转基因表皮干细胞)(图4)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军总医院第四医学中心

<120> 一种光控骨形成蛋白受体系统OptoBMPR及其构建方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 1

Met Gly Cys Val Gln Cys Lys Asp Lys Glu Ala Thr Lys Leu Thr Lys

1 5 10 15

His Tyr Cys Lys Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg Tyr Asn Arg Asp Leu

20 25 30

Glu Gln Asp Glu Ala Phe Ile Pro Val Gly Glu Ser Leu Lys Asp Leu

35 40 45

Ile Asp Gln Ser Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu Leu

50 55 60

Val Gln Arg Thr Ile Ala Lys Gln Ile Gln Met Val Arg Gln Val Gly

65 70 75 80

Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg Gly Glu Lys

85 90 95

Val Ala Val Lys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser Trp Phe Arg

100 105 110

Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Thr Val Leu Met Arg His Glu Asn Ile Leu

115 120 125

Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly Ser Trp Thr Gln Leu

130 135 140

Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Asp Phe Leu

145 150 155 160

Lys Cys Ala Thr Leu Asp Thr Arg Ala Leu Leu Lys Leu Ala Tyr Ser

165 170 175

Ala Ala Cys Gly Leu Cys His Leu His Thr Glu Ile Tyr Gly Thr Gln

180 185 190

Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu

195 200 205

Ile Lys Lys Asn Gly Ser Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val

210 215 220

Lys Phe Asn Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Ile Pro Leu Asn Thr Arg

225 230 235 240

Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp Glu Ser Leu

245 250 255

Asn Lys Asn His Phe Gln Pro Tyr Ile Met Ala Asp Ile Tyr Ser Phe

260 265 270

Gly Leu Ile Ile Trp Glu Met Ala Arg Arg Cys Ile Thr Gly Gly Ile

275 280 285

Val Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asn Met Val Pro Ser Asp Pro

290 295 300

Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Val Val Cys Val Lys Arg Leu Arg Pro

305 310 315 320

Ile Val Ser Asn Arg Trp Asn Ser Asp Glu Cys Leu Arg Ala Val Leu

325 330 335

Lys Leu Met Ser Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala Ser Arg Leu Thr

340 345 350

Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Val Glu Ser Gln Asp

355 360 365

Val Lys Ile Asn Gly Ala Ile Gly Gly Asp Leu Leu Leu Asn Phe Pro

370 375 380

Asp Met Ser Val Leu Glu Arg Gln Arg Ala His Leu Lys Tyr Leu Asn

385 390 395 400

Pro Thr Phe Asp Ser Pro Leu Ala Gly Phe Phe Ala Asp Ser Ser Met

405 410 415

Ile Thr Gly Gly Glu Met Asp Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Gly Leu Asn

420 425 430

Leu Pro Met Met Tyr Gly Glu Thr Thr Val Glu Gly Asp Ser Arg Leu

435 440 445

Ser Ile Ser Pro Glu Thr Thr Leu Gly Thr Gly Asn Phe Lys Ala Ala

450 455 460

Lys Phe Asp Thr Glu Thr Lys Asp Cys Asn Glu Ala Ala Lys Lys Met

465 470 475 480

Thr Met Asn Arg Asp Asp Leu Val Glu Glu Gly Glu Glu Glu Lys Ser

485 490 495

Lys Ile Thr Glu Gln Asn Asn Gly Ser Thr Lys Ser Ile Lys Lys Met

500 505 510

Lys His Lys Ala Lys Lys Glu Glu Asn Asn Phe Ser Asn Asp Ser Ser

515 520 525

Lys Val Thr Lys Glu Leu Glu Lys Thr Asp Tyr Ile

530 535 540

<210> 2

<211> 850

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 2

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1 5 10 15

Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Leu Gly Leu Lys Pro Leu

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Gln Leu Leu Glu Val Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys

35 40 45

Ala Gln Leu Leu Asn Glu Tyr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Ile Gln

50 55 60

Asp Lys Gln Ser Trp Gln Asn Glu Tyr Glu Val Tyr Ser Leu Pro Gly

65 70 75 80

Met Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Ile Gly Ala Glu Lys Arg Gly

85 90 95

Thr Ser Val Asp Val Asp Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Glu Lys

100 105 110

Gly Ser Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ala Asn Val Val Ser Trp Asn Glu

115 120 125

Leu Cys His Ile Ala Glu Thr Met Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His

130 135 140

Glu Asp Ile Pro Gly Leu Lys Asp Gly His Lys Pro Ala Ile Ser His

145 150 155 160

Arg Asp Ile Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Asn Asn Leu Thr Ala

165 170 175

Cys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Leu Lys Phe Glu Ala Gly Lys Ser

180 185 190

Ala Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro

195 200 205

Glu Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg

210 215 220

Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Ala Ser Arg

225 230 235 240

Cys Thr Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu

245 250 255

Glu Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Asp Met Gln Glu Val Val

260 265 270

Val His Lys Lys Lys Arg Pro Val Leu Arg Asp Tyr Trp Gln Lys His

275 280 285

Ala Gly Met Ala Met Leu Cys Glu Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His

290 295 300

Asp Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Gly Glu Arg Ile Thr

305 310 315 320

Gln Met Gln Arg Leu Thr Asn Ile Ile Thr Thr Glu Asp Ile Val Thr

325 330 335

Val Val Thr Met Val Thr Asn Val Asp Phe Pro Pro Lys Glu Ser Ser

340 345 350

Leu Lys Met Asp Lys Lys Thr Ile Val Trp Phe Arg Arg Asp Leu Arg

355 360 365

Ile Glu Asp Asn Pro Ala Leu Ala Ala Ala Ala His Glu Gly Ser Val

370 375 380

Phe Pro Val Phe Ile Trp Cys Pro Glu Glu Glu Gly Gln Phe Tyr Pro

385 390 395 400

Gly Arg Ala Ser Arg Trp Trp Met Lys Gln Ser Leu Ala His Leu Ser

405 410 415

Gln Ser Leu Lys Ala Leu Gly Ser Asp Leu Thr Leu Ile Lys Thr His

420 425 430

Asn Thr Ile Ser Ala Ile Leu Asp Cys Ile Arg Val Thr Gly Ala Thr

435 440 445

Lys Val Val Phe Asn His Leu Tyr Asp Pro Val Ser Leu Val Arg Asp

450 455 460

His Thr Val Lys Glu Lys Leu Val Glu Arg Gly Ile Ser Val Gln Ser

465 470 475 480

Tyr Asn Gly Asp Leu Leu Tyr Glu Pro Trp Glu Ile Tyr Cys Glu Lys

485 490 495

Gly Lys Pro Phe Thr Ser Phe Asn Ser Tyr Trp Lys Lys Cys Leu Asp

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515 520 525

Ile Thr Ala Ala Ala Glu Ala Ile Trp Ala Cys Ser Ile Glu Glu Leu

530 535 540

Gly Leu Glu Asn Glu Ala Glu Lys Pro Ser Asn Ala Leu Leu Thr Arg

545 550 555 560

Ala Trp Ser Pro Gly Trp Ser Asn Ala Asp Lys Leu Leu Asn Glu Phe

565 570 575

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Gly Asn Ser Thr Ser Leu Leu Ser Pro Tyr Leu His Phe Gly Glu Ile

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Ser Val Arg His Val Phe Gln Cys Ala Arg Met Lys Gln Ile Ile Trp

610 615 620

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625 630 635 640

Arg Gly Ile Gly Leu Arg Glu Tyr Ser Arg Tyr Ile Cys Phe Asn Phe

645 650 655

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660 665 670

Trp Asp Ala Asp Val Asp Lys Phe Lys Ala Trp Arg Gln Gly Arg Thr

675 680 685

Gly Tyr Pro Leu Val Asp Ala Gly Met Arg Glu Leu Trp Ala Thr Gly

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Trp Met His Asn Arg Ile Arg Val Ile Val Ser Ser Phe Ala Val Lys

705 710 715 720

Phe Leu Leu Leu Pro Trp Lys Trp Gly Met Lys Tyr Phe Trp Asp Thr

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Leu Leu Asp Ala Asp Leu Glu Cys Asp Ile Leu Gly Trp Gln Tyr Ile

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Ala Ala

850

<210> 3

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 3

atgggctgtg tgcaatgtaa ggataaagaa gcaacaaaac tgacgaagca ttattgtaag 60

agtatctcaa gcaggggtcg ttacaaccgt gatttggaac aggatgaagc atttattcca 120

gtaggagaat cattgaaaga cctgattgac cagtcccaaa gctctgggag tggatctgga 180

ttgcctttat tggttcagcg aactattgcc aaacagattc agatggttcg gcaggttggt 240

aaaggccgct atggagaagt atggatgggt aaatggcgtg gtgaaaaagt ggctgtcaaa 300

gtgtttttta ccactgaaga agctagctgg tttagagaaa cagaaatcta ccagacggtg 360

ttaatgcgtc atgaaaatat acttggtttt atagctgcag acattaaagg cactggttcc 420

tggactcagc tgtatttgat tactgattac catgaaaatg gatctctcta tgacttcctg 480

aaatgtgcca cactagacac cagagcccta ctcaagttag cttattctgc tgcttgtggt 540

ctgtgccacc tccacacaga aatttatggt acccaaggga agcctgcaat tgctcatcga 600

gacctgaaga gcaaaaacat ccttattaag aaaaatggaa gttgctgtat tgctgacctg 660

ggcctagctg ttaaattcaa cagtgataca aatgaagttg acataccctt gaataccagg 720

gtgggcacca agcggtacat ggctccagaa gtgctggatg aaagcctgaa taaaaaccat 780

ttccagccct acatcatggc tgacatctat agctttggtt tgatcatttg ggaaatggct 840

cgtcgttgta ttacaggagg aatcgtggag gaatatcaat taccatatta caacatggtg 900

cccagtgacc catcctatga ggacatgcgt gaggttgtgt gtgtgaaacg cttgcggcca 960

atcgtgtcta accgctggaa cagcgatgaa tgtcttcgag cagttttgaa gctaatgtca 1020

gaatgttggg cccataatcc agcctccaga ctcacagctt tgagaatcaa gaagacactt 1080

gcaaaaatgg ttgaatccca ggatgtaaag attaatggag ctataggagg tgaccttttg 1140

ctcaattttc ctgacatgtc ggtcctagag cgccaaaggg ctcacctcaa gtacctcaat 1200

cccacctttg attctcctct cgccggcttc tttgccgatt cttcaatgat taccggcggc 1260

gagatggaca gctatctttc gactgccggt ttgaatcttc cgatgatgta cggtgagacg 1320

acggtggaag gtgattcaag actctcaatt tcgccggaaa cgacgcttgg gactggaaat 1380

ttcaaggcag cgaagtttga tacagagact aaggattgta atgaggcggc gaagaagatg 1440

acgatgaaca gagatgacct agtagaagaa ggagaagaag agaagtcgaa aataacagag 1500

caaaacaatg ggagcacaaa aagcatcaag aagatgaaac acaaagccaa gaaagaagag 1560

aacaatttct ctaatgattc atctaaagtg acgaaggaat tggagaaaac ggattatatt 1620

taa 1623

<210> 4

<211> 2553

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 4

atgagacatc acaagatggc ctaccctcct gtacttgttc ctactcaaga cccaggacca 60

cccccacctt ccccattact agggttgaag ccattgcagc tgttagaagt gaaagcaagg 120

ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgctcaatg aatatgtggc tgtcaaaata 180

tttccaatac aggacaaaca gtcctggcag aatgaatatg aagtctatag tctacctgga 240

atgaagcatg agaacatact acagttcatt ggtgcagaga aaagaggcac cagtgtggat 300

gtggacctgt ggctaatcac agcatttcat gaaaagggct cactgtcaga ctttcttaag 360

gctaatgtgg tctcttggaa tgaactttgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg 420

gcatatttac atgaggatat acctggctta aaagatggcc acaagcctgc aatctctcac 480

agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaatc tgacagcttg cattgctgac 540

tttgggttgg ccttaaagtt cgaggctggc aagtctgcag gtgacaccca tgggcaggtt 600

ggtacccgga ggtatatggc tccagaggtg ttggagggtg ctataaactt ccaaagggac 660

gcatttctga ggatagatat gtacgccatg ggattagtcc tatgggaatt ggcttctcgt 720

tgcactgctg cagatggacc cgtagatgag tacatgttac catttgagga agaaattggc 780

cagcatccat ctcttgaaga tatgcaggaa gttgttgtgc ataaaaaaaa gaggcctgtt 840

ttaagagatt attggcagaa acatgcagga atggcaatgc tctgtgaaac gatagaagaa 900

tgttgggatc atgatgcaga agccaggtta tcagctggat gtgtaggtga aagaattact 960

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gctcttggat ctgacctcac tttaatcaaa acccacaaca cgatttcagc gatcttggat 1320

tgtatccgcg ttaccggtgc tacaaaagtc gtctttaacc acctctatga tcctgtttcg 1380

ttagttcggg accataccgt aaaggagaag ctggtggaac gtgggatctc tgtgcaaagc 1440

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acgagtttca attcttactg gaagaaatgc ttagatatgt cgattgaatc cgttatgctt 1560

cctcctcctt ggcggttgat gccaataact gcagcggctg aagcgatttg ggcgtgttcg 1620

attgaagaac tagggctgga gaatgaggcc gagaaaccga gcaatgcgtt gttaactaga 1680

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ttgatagatt atgcaaagaa cagcaagaaa gttgttggga attctacttc actactttct 1800

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gagcaatcgt tgttgagtca tcttcggttt ttcccttggg atgctgatgt tgataagttc 2040

aaggcctgga gacaaggcag gaccggttat ccgttggtgg atgccggaat gagagagctt 2100

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aaacccattg tagacatcga cacagctcgt gagctactag ctaaagctat ttcaagaacc 2520

cgtgaagcac agatcatgat cggagcagca taa 2553

Claims

1.一种光控骨形成蛋白受体系统OptoBMPR，其特征在于，所述光控骨形成蛋白受体系统包括表达骨形成蛋白I型受体OptoBR1的第一重组质粒和表达骨形成蛋白II型受体OptoBR2的第二重组质粒；所述骨形成蛋白I型受体OptoBR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述骨形成蛋白II型受体OptoBR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的光控骨形成蛋白受体系统，其特征在于，所述骨形成蛋白I型受体OptoBR1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述骨形成蛋白II型受体OptoBR2的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求1或2所述的光控骨形成蛋白受体系统，其特征在于，所述第一重组质粒和第二重组质粒的构建用骨架载体分别包括腺病毒。

4.根据权利要求3所述的光控骨形成蛋白受体系统，其特征在于，所述光控骨形成蛋白受体系统还包括腺病毒包装细胞。

5.根据权利要求4所述的光控骨形成蛋白受体系统，其特征在于，所述腺病毒包装细胞包括胚胎肾细胞。

6.权利要求1～5任意一项所述光控骨形成蛋白受体系统的构建方法，包括以下步骤：

所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序限制。

7.权利要求1～5任意一项所述光控骨形成蛋白受体系统在激活细胞内BMP/Smad 1/5/8信号通路中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

利用光控骨形成蛋白受体系统中的第一重组质粒和第二重组质粒共转染表皮干细胞，得到转基因细胞，采用460nm蓝光对转基因细胞辐射30s～24h，激活转基因细胞内BMP/Smad1/5/8信号通路。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述460nm蓝光的辐射强度为0.1～100μW·cm^-2。

10.权利要求1～5任意一项所述光控骨形成蛋白受体系统在制备激活细胞内BMP/Smad1/5/8信号通路的制剂中的应用。